Phân tích giá trị sinh học của thực phẩm

GVHD: Trần Bích Lam Phân tích giá trị sinh học
I. XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ SINH HỌC CỦA THỰC PHẨM:
1. Xác định giá trị sinh học của glucid:
Phương pháp đo lường chất bột đường:
Đầu tiên là tách rời những hợp chất đường ra khỏi những hợp chất khác như: đạm, béo…
để tránh những sai lệch kết quả do sự tác động giữa các chất này . Phương pháp dùng rượu ethanol
hay 2- propanol 80% được coi là hữu dụng nhất vì nó làm cho các enzyme, nếu có trong mẫu, bị
ngưng hoạt động. Các đường đơn, amino acid, acid hữu cơ, muối cũng như các hợp chất khác
được hòa tan trong rượu. Sau đó các hợp chất khác ngoài đường đơn sẽ được tách rời bằng cách
cho trầm lắng bởi muối bạc hay tốt hơn nữa với ion exchangeresins. Phần bã lọc được dùng để đo
lượng tinh bột.
Sau đó dùng dung dịch muối chì trung tính để trầm lắng các hợp chất khác ngoài đường đơn
rồi đem lọc, tiếp theo dùng bột khô Natri oxalat để trầm lắng chì trong nước lọc trước khi lọc qua
giấy. Phần nước lọc được dùng cho phân tích.
a) Phương pháp định tính:
 Phản ứng Molisch: Tất cả các hợp chất đường (đơn và đa) đều cho phản ứng tạo
màu với nhiều hợp chất phenol, phản ứng giữa chất đường và phenol được gọi là
phản ứng Molisch cho ra hợp chất Fufural hay hydroxy methyl fufurol, sản phẩm
này sẽ cho ra màu đỏ thẫm khi tác dụng với acid sulfuric đậm đặc. Đây là một
trong những phản ứng tạo màu để định tính chất bột đường, nó tác dụng với tất cả
đường đơn và đường đa, nhưng không tác dụng với acid amin và carbohydrate
acid.
 Phản ứng Anthrone: Đây là phản ứng dùng định tính và định lượng hợp chất
đường, dùng dung dịch 0.2% anthrone trong acid sulfuric đậm đặc. Nếu có chất bột
đường dẽ cho ra màu xanh tươi rồi dần dần đậm hơn. Dùng một mẫu trắng hòa trộn
mẫu với acid sulfuric đậm đặc để so sánh với mẫu có tác dụng của anthrone, vì các
chất hữu cơ khác với acid sulfuric chỉ cho ra màu nâu.
 Phản ứng với dung dịch Feehling đo lường chất đường khử: Phản ứng này được
dùng nhiều trong chế biến thực phẩm để biết lượng đường khử trong sản phẩm.
Nhờ đó, nhà sản xuất điều chỉnh các phản ứng khác xảy ra trong chế biến. Nguyên
tắc của phương pháp này là dùng hợp chất đường khử để khử ion đồng trong dung

dịch alkaline copper tartrate để cho ra màu đỏ đến vàng đậm của oxyde đồng.
 Phản ứng Barfoed: Phản ứng này dùng để phân biệt đường đơn và đường đôi khử.
Mẫu trộn trong dung dịch đồng acetat trong nước và acid acetic, sau đó nung nóng
sẽ xuất hiện kết tủa màu đỏ, chứng tỏ mẫu có đường đơn, nhưng nó không cho
phản ứng với đường đôi. Chính vì vậy, phản ứng này được dùng với phản ứng
Feehling để xác định đường nhị khử trong mẫu.
b) Phương pháp định lượng:
GVHD: Trần Bích Lam Phân tích giá trị sinh học
Một số phản ứng tạo màu ở trên có thể sử dụng để định lượng những hợp chất đường, chẳng
hạn như phương pháp dùng phản ứng Anthrone hay những chất dẫn xuất rồi dùng máy quang phổ
để đo lường nồng độ của chất đường trong mẫu.
Ngoài những phương pháp đặc biệt, hiện nay người ta đang sử dụng rộng rãi các enzyme và
máy sắc ký. Hiện nay phần lớn các phương pháp hóa học để định lượng chất bột đường trong thực
phẩm đều dựa trên khả năng khử oxy của chất đường đối với những dung dịch kiềm có chứa
những kim loại như bạc, thủy ngân và đồng, trong đó đồng là kim loại được sử dụng nhiều nhất.
Sau đây là phương pháp hóa học đại diện cho rất nhiều phương pháp định lượng chất đường trong
các phòng nghiên cứu thực phẩm.
• Phương pháp của Munson và Walker: Đây là phương pháp dựa theo nguyên tắc của
dung dịch Feehling để định lượng những chất đường khử bằng cách đo lường trọng
lượng của hợp chất oxyde đồng được trầm lắng trong phản ứng rồi từ đó so sánh với
một bảng tiêu chuẩn để tính ra trọng lượng của chất đường khử trong mẫu. Mỗi loại
đường khử có khả năng khử và cho ra lượng oxyde đồng khác nhau. Đây là phương
pháp đo lường bằng trọng lượng.
• Phương pháp của Dubois: Phương pháp này đơn giản hơn, dùng máy quang phổ ở
490nm cho đường hexose và 480nm cho đường pentose để đo độ hấp thu của màu
vàng đỏ của dung dịch sau phản ứng. Mẫu lỏng được cho tác dụng với dung dịch
phenol 5% trước khi cho vào hỗn hợp một lượng acid sulfuric đậm đặc 96%, làm ấm
và khuấy đều khoảng 10 phút sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng trước khi cho máy
quang phổ đo độ hấp thu. Kết quả được tính ra bằng cách so sánh với đường chuẩn cho
từng loại đường khác nhau.

• Phương pháp sắc ký trên giấy: Có rất nhiều cách thức áp dụng cho phương pháp sắc ký
trên giấy, chẳng hạn như dùng đĩa sắc ký loại đặc biệt dành cho định lượng để tách rời
hợp chất đường được phân ly bởi dung dịch dẫn thấm sau đó đem vào máy quang phổ
để so sánh với đường chuẩn và tính ra số lượng đường có trong mẫu.
Nhưng phương pháp dùng máy đo mật độ phản hồi màu sắc ở ánh sáng có bước sóng 515nm được
coi là dễ dàng, chính xác và nhanh hơn cả. Dung dịch mẫu được trích trên một đĩa sắc ký, cho
thấm chạy bởi dung dịch dẫn thấm, chẳng hạn như hỗn hợp butanol – pyridine – nước với tỷ lệ 6:
4: 3. Rồi dùng chất chỉ thị gồm có aniline và trichloroacetic trong ethyl acetat phun lên đĩa sắc ký
để xác định màu sắc của mẫu trước khi đưa vào máy đo mật độ phản hồi vật thể màu sắc để đo
lường và so sánh với mức chuẩn của từng loại đường để suy ra kết quả.
• Phương pháp sắc ký bằng gas: Đây là một trong những phương pháp rất thông dụng
và được sử dụng gần như ở hầu hết các viện nghiên cứu trên thế giới vì những ưu
điểm: rất chính xác và có thể phân tích rất nhiều mẫu vật cùng lúc nhờ hệ thống tự
động. Nguyên tắc của phương pháp này là kết hợp chất đường với một chất bay hơi
như: O- methyl ete hay O- trimethylsilyl ete trước khi chích vào một cột chứa resin,
GVHD: Trần Bích Lam Phân tích giá trị sinh học
sau đó với sự giúp đỡ của nhiệt độ và áp suất người ta cho chạy qua một luồng gas
như helium để phân ly hợp chất đường trước khi ra khỏi cột, sau đó được thu nhận
bằng hệ thống thu nhận và được vẽ những cột trên giấy qua một máy thu nhận.
• Phương pháp sắc ký khác: Với sự phát triển của máy móc, ngày nay vấn đề chính xác
trong phân tích hợp chất đường đã trở nên đơn giản và đạt được mức chính xác nhanh
chóng… thỏa mãn hầu hết các nhà nghiên cứu, chẳng hạn như máy sắc ký dùng áp
suất cao HPLC.
• Phương pháp định lượng bằng enzyme: Mặc dù máy sắc ký có nhiều ưu điểm vượt
bậc nhưng phương pháp dùng enzyme để đo lường chất bột đường trong thực phẩm
cũng như trong y học vẫn được sử dụng rất rộng rãi. Phương pháp này rất tiện dụng
cho những phẩm vật đơn lẻ, không có tính đại trà. Có rất nhiều công ty hóa dược
phẩm đã sản xuất ra những dung dịch rất tiện lợi và sử dụng dễ dàng dùng cho các
phản ứng sinh học xảy ra trong phương pháp phân tích bằng enzyme đã làm cho công
việc đo lường trở nên đơn giản và mau chóng. Nguyên tắc là sử dụng enzyme để phá

vỡ những liên kết glucoside trong đường đa để phóng thích ra đường đơn, sau đó lại
dùng enzyme khác để tạo ra những hợp chất khác rồi dùng máy quang phổ để xác định
số lượng của hợp chất đường trong mẫu. Chỉ cần 15 – 20 phút có thể xác định chính
xác số lượng những hợp chất đường trong thực phẩm một cách dễ dàng.
2. Xác định giá trị sinh học của protein:
Giá trị sinh học của protein là thuật ngữ dùng để đánh giá chất lượng protein. Sự thiếu hụt
một số axit amin không thay thế trong khẩu phần hoặc sự mất cân đối về thành phần của các axit
amin so với nhu cầu, chẳng những làm rối loạn quá trình tổng hợp protein mà còn dẫn đến phá huỷ
quá trình trao đổi chất và tổng hợp enzym, hormon…Tất cả những điều đó là nguyên nhân kìm
hãm quá trình sinh trưởng, giảm năng suất và giảm hiệu quả sử dụng thức ăn. Giá trị sinh học của
protein không chỉ phụ thuộc vào thành phần các axit amin trong protein, mà còn phụ thuộc vào khả
năng tiêu hoá và hấp thu axit amin trong các loại nguyên liệu thức ăn khác nhau.
Phân tích protein để biết được:
 Hàm luợng thành phần protein.
 Thành phần axit amin.
 Hàm lượng protein đặc thù trong hỗn hợp.
 Hàm lượng protein trong quá trình tách và tinh sạch 1 loại protein.
 Nitơ phi protein.
 Giá trị dinh dưỡng của protein (sự tiêu hoá, tỉ lệ protein chức năng và sự cân bằng
Nitơ).
a) Xác định các chỉ số đánh giá giá trị sinh học protein
o Chỉ số hóa học (CS-Chemical Score)
GVHD: Trần Bích Lam Phân tích giá trị sinh học
Tỷ số các axit amin cần thiết trong protein nghiên cứu so với axit amin trong protein
chuẩn (thường dùng trứng hay mô hình axit amin mà tổ chức Nông Nghiệp và Lương Thực thế
giới (FAO) / Tổ chức Y Tế thế giới (WHO) đưa để làm protein tham khảo).
CS =
a
x 100
b

Trong đó:
a = hàm lượng axit amin có trong protein nghiên cứu ( mg/g protein)
b = hàm lượng axit amin cùng loại trong protein tham khảo ( mg/g protein)
Axit amin có chỉ số hoá học thấp nhất sẽ là “yếu tố hạn chế thứ nhất”. Axit amin hạn
chế phần nhiều là methionein + cysteine, lysine, tryptophan, threonine nên thường chỉ so sánh 4
loại axit amin này.
Đây là phương pháp phân tích đối chiếu các axit amin để tính tỉ lệ tận dụng protein
thức ăn, còn gọi là phân loại axit amin.
=> Việc xác định giá trị dinh dưỡng của protein giúp ta xác đinh được lượng protein đưa vào
cơ thể ,từ đó có sự điều chỉnh cho hợp lý
o Tỉ lệ tiêu hoá protein (TD):
Lượng hoặc mức độ protein thức ăn được hấp thụ sau khi đã qua tiêu hóa: tỉ lệ tiêu hoá
protein được tính dựa vào việc đo lượng nitơ trong phân và trong thức ăn
TD(%) =
I-(F-Fm)
x 100%
I
Trong đó:
I : Nitơ thức ăn
F : Nitơ phân
Fm : Nitơ chuyển hoá phân(Nitơ vi sinh vật đường ruột) – được đo trong phân trong
trường hợp cơ thể được nạp thức ăn đầy đủ năng lượng nhưng hoàn toàn không hấp thu protein)
Nếu bỏ qua Fm thì kết quả có được sẽ gọi là “ tỉ lệ tiêu hoá bề ngoài“, nếu tính cả Fm thì gọi
là “tỉ lệ tiêu hoá thực“ hay “tỉ lệ tiêu hoá“.
GVHD: Trần Bích Lam Phân tích giá trị sinh học
Ví dụ: Tỉ lệ tiêu hoá albumin trong trứng các loại là 98% nghĩa là: khi ăn 100 g protein trong
trứng các loại sẽ có 98g được hấp thu vào cơ thể thông qua tiêu hoá , 2g không được tiêu hoá hấp
thu, thải ra ngoài theo phân .
Lưu ý:
• Tỉ lệ tiêu hoá của protein động vật thường cao hơn thực vật.

• Tỉ lệ này phụ thuộc vào 2 yếu tố: cơ thể (trạng thái toàn thân,tinh thần, tình cảm,
cảm quan đối với thức ăn, tập quán ăn uống, chức năng tiêu hoá…) và thức ăn
(thuộc tính, cách chế biến, thức ăn ăn cùng…).
• Để xác định lượng nitơ trong các mẫu ta sẽ sử dụng phương pháp Kjeidahl
o Giá trị sinh học protein (BV-Biological Value):
Giá trị sinh học protein hay tỉ lệ tận dụng protein thức ăn: tỉ lệ phần trăm của Nitơ tích trữ
chiếm trong lượng Nitơ hấp thu.
BV = Lượng Nitơ tích trữ
Lượng Nitơ hấp thu
Trong đó:
Lượng Nitơ tích trữ = I - ( F - Fm) - ( U - Um)
Lượng Nitơ hấp thụ = I - ( F – Fm )
Với I, F, Fm giống như trên
U: Nitơ niệu
Um: Nitơ có từ trong nước tiểu (Nitơ niệu khi trong bữa ăn không có protein )
BV cao hay thấp phụ thuộc vào sự cấu thành các axitamin của prôtein (về chủng loại , số
lượng , tỉ lệ tương hỗ lẫn nhau của các axitamin cần thiết có trong đó). Nếu sự cấu thành các
axitamin gần hoặc tiếp cận với loại protein mà cơ thể đòi hỏi thì giá trị sinh học của nó cao,ngược
lại sẽ thấp.
BV chỉ phản ánh mức độ tận dụng protein sau khi được tiêu hoá hấp thu khi vào cơ thể ,
còn quá trình tiêu hoá hấp thu protein phải chịu ảnh hưởng của rất nhiều nhân tố .Vì thế ta lại có
thêm tỉ lệ tận dụng protein NPU.
=> Nguyên tắc : Nên dùng động vật làm đối tượng thử nghiệm, lấy protein được tính làm
nguồn nitơ duy nhất trong bữa ăn.
GVHD: Trần Bích Lam Phân tích giá trị sinh học
Bảng: Giá trị sinh học của protein thức ăn thường dùng.
Protein Giá trị sinh học Protein Giá trị sinh học
Protein trứng gà 94 Đậu nành sống 57
Lòng trắng trứng gà 83 Khoai lang 72
Lòng đỏ trứng gà 96 Khoai tây 67

Sữa bò tách bơ 85 Ngô 60
Cá 83 Đậu nành chín 64
Thịt bò 76 Lạc 59
Thịt lợn 74
o Tỉ lệ tận dụng protein (NPU-Net Protein Utilization):
Tỉ lệ lượng Nitơ giữ lại so với lượng Nitơ ăn vào hay tỉ lệ protein giữ lại so với protein
ăn vào, bao gồm cả giá trị sinh học BV và hệ số tiêu hoá D của protein.
NPU = BV. D =
Nitơ giữ lại
x 100%
Nitơ ăn vào

NPU gồm cả quá trình tiêu hoá và hấp thu.
Hiện nay khẩu phần ăn với protein có NPU xung quanh 70 được khuyến cáo là thích
hợp cho phần lớn đối tượng ,tuy nhiên ở trẻ em chất kượng protein đòi hỏi tốt hơn là do trong
những tháng đầu protein là từ sữa mẹ , sau đó mới chyển dần sang chế độ ăn bổ sung vì vậy chất
lượng proteincũng giảm dần ở những lứa tuổi lớn gần với chế độ ăn của người trưởng thành.
o Tỉ lệ hiệu quả của protein hay Hệ số tăng trọng (PER: Protein Efficiency Ratio):
Phản ánh tỉ lệ hiệu quả mà protein được tận dụng cho sự sinh trưởng của chuột theo những điều
kiện quy định ( hay hiểu đơn giản hơn : tỷ số phản ánh số g trọng lượng chuột tăng lên trên số gam
protein sử dụng ở chuột đang lớn ). Hệ số tăng trọng càng cao chứng tỏ protein càng tốt
PER =
Trọng lượng tăng thêm của động vật (g)
x 100
Protein đã ăn (g)
=> PER dùng để đánh giá chất lượng của protein.
o Phần trăm năng lượng protein được sử dụng (NDp Cals%: Net-Dietary calories
percent):
GVHD: Trần Bích Lam Phân tích giá trị sinh học
Các xét nghiệm trên chỉ đánh giá về chất lượng protein .

Để thể hiện về chất và lượng protein trong khẩu phần ăn, ta sẽ xem xét đến NDp Cals %
(phần trăm năng lượng protein được sử dụng )
NDp Cal% = ( NPU) . (% năng lượng do protein)
o Tỉ lệ protein tịnh NPR:
Tỉ số giữa nhóm động vật chênh lệch về cân nặng được nuôi lần lượt bằng protein thức ăn thử
nghiệm và bằng thức ăn không có protein có năng lượng tương đương với lượng protein ăn vào.
NPR =
Trọng lượng tăng bình quân (g) + Trọng lượng giảm bình quân (g)
Protein ăn vào (g)
NPR dùng để tính tỉ lệ tận dụng protein thức ăn .
b) Phương pháp phân tích thành phần acid amin:
Axit amin là đơn vị cấu tạo cơ sở của peptit và protein, các axit amin kết hợp với nhau qua
liên kết peptit (-CO-NH-) tạo thành peptit có chiều dài mạch khác nhau gọi là polypeptit, một phân
tử protein có một hay nhiều chuổi polypeptit. Như vậy thông qua liên kết peptit, các gốc axit amin,
nhóm amin tự do đầu N của chuỗi polypeptit ta có những phản ứng đặc trưng để định tính và định
lượng protein.
Hiện nay có nhiều phương pháp khác nhau để xác định giá trị protein của thức ăn. Một
protein thức ăn có giá trị cao khi nó được sử dụng hữu hiệu, nghĩa là protein ấy có một số lượng
đúng các axit amin thiết yếu và số lượng đầy đủ các axit amin không thiết yếu.
Đã từ lâu việc phân tích định tính và định lượng amino acid thường là sự kết hợp của nhiều
phương pháp hoá lí và sắc ký. Có thể dựa vào phổ hấp phụ các amino acid không giống nhau để
phân tích. Hoặc dựa và cấu trúc của amino acid tự do sau khi chuỗi polypeptide đã bị thuỷ phân,
có thể định lượng amino acid đầu N-tận cùng bằng phản ứng Sanger hoặc Edman. Cũng như vậy,
có thể xác định amino acid đầu C tận cùng nhờ phản ứng khử nhóm carboxyl với tác nhân khử
NaBH4, hoặc sử dụng enzyme carboxypepitdase..
 Sắc ký:
Người ta có thể dùng nhiều phương pháp sắc ký khác nhau, ở đây chỉ giới thiệu nguyên tắc
của một số phương pháp thông dụng để phân tích amino acid.
o Sắc ký giấy.
GVHD: Trần Bích Lam Phân tích giá trị sinh học

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự phân bố giữa hai pha dung môi: dung môi
cố định và dung môi di động. Dung môi cố định thường là nước giữ ở giấy sắc ký (trong điều kiện
bảo hoà hơi nước, giấy có thể giữ 15-22% nước tính theo trọng lượng giấy). Dung môi di động
thường là một dung môi hữu cơ bão hoà nước di chuyển trên tờ giấy theo mao dẫn kéo theo các
chất trong dung dịch. Tốc độ di chuyển của từng chất không giống nhau và mỗi chất được đặc
trưng bởi một trị số nhất định gọi là Rf.
Có nhiều kiểu sắc ký giấy khác nhau đó là sắc ký một chiều đi lên, sắc ký một chiều đi
xuống, sắc ký vòng nằm ngang và sắc ký hai chiều. Loại giấy thường dùng là Whatman số 1 và
Schleicher-Schull 2044 a và b, dung môi gồm các chất như 4 Butanol:1 Acetic acid: 5 Nước (dùng
cho chiều thư nhất); 3 Phenol: 1 Nước (dùng cho chiều thứ hai).
o Sắc ký lớp mỏng.
Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên lý thuyết của sắc ký giấy, nghĩa là cũng dựa trên
sự phân bố các chất giữa hai pha: chất hấp phụ được tráng rộng trên một phiến kính tạo thành một
lớp mỏng và pha di động là dung môi thích hợp. Dung môi di chuyển làm dịch chuyển các chất
trong mẫu thử. Các chất hấp phụ thường dùng là silicagel, alumin oxyt, sephadex ,v.v...được kết
hợp với thạch cao (gypse) để dán vào phiến kính
o Sắc ký khí.
Nguyên tắc của phương pháp này là lợi dụng tính chất khó bay hơi của các amino acid nên
có thể sử dụng chương trình nhiệt để chuyển chúng thành các dẫn xuất (thường là N-acetyl-amin).
Cho tác dụng amino acid với cồn amylic và HBr khan, sau đó cho tác dụng hỗn hợp này với
anhydrit acetic.
Cột thường dùng là loại Chromosorb W (60-80 mesh) có một lớp polyetylenglycol 1%
(carbowax 1564 hoặc 6000). Chương trình nhiệt giữa 125o C và 155oC, tốc độ chảy 60-240
ml/phút.
 Phân tích bằng máy tự động
o Xác định trình tự (sequence) amio acid trong chuỗi polypeptid
Máy phân tích amino acid trong chuỗi polypeptide tự động dựa trên nguyên tắc của phương
pháp Edman, nghĩa là tách tách lần lượt từng amino acid ở đầu N tận cùng và xác định lần lượt
theo thứ tự từng amino acid được tách ra đó, vì vậy có thể xác định chính xác trình tự sắp xếp của
các amino acid trong chuỗi.

o Xác định thành phần amio acid trong chuỗi polypeptide bằng máy sắc ký lỏng cao
áp-HPLC (High Liquid Pressor Chromatography )