BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN KHÁNG PSEUDOMONAS SOLANACEARUM GÂY HÉO CÂY TRỒNG" pdf

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ
KHUẨN KHÁNG PSEUDOMONAS
SOLANACEARUM GÂY HÉO CÂY TRỒNG

Đào Thị Lương, Phạm Văn Ty, Trịnh Thành Trung,
Nguyễn Thị Anh Đào
Trung tâm Công nghệ Sinh học- ĐHQGHN
I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh héo cây gây ra bởi vi khuẩn Pseudomonas
solanacearum là một bệnh phổ biến và nghiêm trọng ở
nhiều loại cây hoa màu như cà chua, khoai tây, lạc, ớt,
gừng vv Đây là bệnh chủ yếu gây giảm năng suất và mất
mùa lạc ở nhiều nước như Trung Quốc, Thái Lan, Việt
nam, Indonesia Hàng năm nạn dịch xảy ra gây thiệt hại từ
50-90% năng suất cây trồng. Mặc dù đã có một số nghiên
cứu tập trung nghiên cứu về Pseudomonas solanacearum
nhưng việc kiểm soát loại vi khuẩn gây héo này vẫn còn
quá xa so với kết quả mong muốn. Với mục tiêu sử dụng
đấu tranh sinh học nhằm góp phần giảm thiểu những tổn
thất cho mùa màng do vi khuẩn Pseudomonas
solanacearum gây ra, vì vậy chúng tôi tiến hành phân lập,
tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh kháng
sinh ức chế và tiêu diệt loài vi khuẩn gây héo này. Các vi
sinh vật đối kháng có khả năng tiêu diệt Pseudomonas
solanacearum sẽ được sử dụng trong sản xuất phân bón
chức năng phục vụ chăm sóc cây trồng.

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chủng giống

- Chủng xạ khuẩn, các vi sinh vật kiểm định từ Bảo tàng
Giống chuẩn Vi sinh vật
- Các chủng Pseudomonas solanacearum từ Viện khoa
học kỹ thuật Nông nghiệp
Môi trường
Môi trường Gauze I và II; ISP-4; A-4H; A-4 ; A-9; A-12;
ISP-6 (pepton-cao nấm men-sắt);
ISP-9; 79; Glyxerin- nitrat thạch; Gluco-asparagin thạch;
ISP-3 (Thạch - đại mạch).

Phương pháp
Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh.
- Phương pháp thỏi thạch (Dùng để sơ tuyển xạ khuẩn)
- Phương pháp đục lỗ. (Xác định kháng sinh trong môi
trường dịch thể ).
Phương pháp xác định trọng lượng sinh khối khô
Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại [1, 4].
Lựa chọn các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả năng
sinh tổng hợp chất kháng sinh: Môi trường lên men, nhiệt
độ, pH ban đầu, thời gian lên men, nguồn carbon, nguồn
nitơ.
ảnh hưởng của xạ khuẩn đến cây trồng
- ảnh hưởng của dịch nuôi xạ khuẩn đến khả năng nảy mầm
của lạc
- ảnh hưởng của xạ khuẩn đến sự phát triển của cây lạc non.

III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chủng xạ khuẩn L30 được phân lập từ đất, được nuôi trên
môi trường ISP-4 sau 5 ngày, xác định hoạt tính kháng

sinh. Kết quả trên bảng 1 cho thấy chủng xạ khuẩn có khả
năng sinh chất kháng sinh phổ rộng, kháng vi khuẩn và
nấm, nhưng mạnh nhất là chống các chủng Pseudomonas
solanacearum gây bệnh héo lá ở cây trồng
(P.solanacearum 12 gây bệnh héo lá trên khoai tây,
P.solanacearum 20 gây bệnh trên cà chua và
P.solanacearum 222 gây bệnh trên cây lạc)
Bảng 1. Hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn L30.



Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của chủng xạ
khuẩn L30.

Chủng xạ khuẩn được nuôi trên 6 môi trường để xác định
đặc điểm nuôi cấy (bảng 2) và các đặc điểm sinh lý, sinh
hoá (bảng 3)
Bảng 2: Đặc điểm nuôi cấy của chủng xạ khuẩn L30.


Bảng 3: Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chủng xạ khuẩn
L30.



Từ kết quả bảng 2 và 3 dựa theo các bản mô tả của Shirling
và Gottlieb đồng thời dựa vào khoá phân loại của Gauze và
cộng sự [1,4]: chủng L30 có các đặc điểm không giống với
các loài đã được mô tả, nên tạm gọi là Streptomyces sp
L30. Cần được tiếp tục phân loại bằng phương pháp hoá

phân loại và sinh học phân tử.

Lựa chọn các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng
hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn L30
Môi trường thích hợp
Trong lên men công nghiệp, sau khi tìm được chủng có
hoạt tính cao cần phải lựa chọn môi trường thích hợp nhất.
Một môi trường thích hợp là vừa đảm bảo chủng có khả
năng sinh trưởng tốt vừa sinh ra các sản phẩm mong muốn
với hiệu suất tối ưu.
Chủng L30 được nuôi cấy trên 6 loại môi trường, sau 5
ngày ở 30
o
C.

Hình 1. Môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng
sinh của chủng L30


Kết quả hình 1 cho thấy: Chủng xạ khuẩn đều sinh trưởng
và cho hoạt tính ở các môi nuôi cấy, nhưng sinh tổng hợp
chất kháng sinh tốt nhất trên môi trường ISP-4 và A-9.

pH thích hợp
Chủng xạ khuẩn L30 được nuôi trên môi trường ISP-4, pH
được chỉnh ở 5, 6, 7, 8, 9. Sau 5 ngày nuôi cấy ở 300C cho
kết quả ở hình 2.

Hình 2. pH thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh
của chủng xạ khuẩn L30

Chủng xạ khuẩn có khả năng sinh trưởng trong dải pH từ 5
đến 9 song khả năng tổng hợp chất kháng sinh nhiều nhất là
trong khoảng pH7.

Nhiệt độ thích hợp

Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP-4 ở các nhiệt độ
25, 30, 35, 40, 45
0
C trên máy lắc ổn nhiệt. Hoạt tính kháng
sinh được xác định ở hình 3.

Hình 3. Nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng
sinh của xạ khuẩn L30


Kết quả cho thấy: Chủng xạ khuẩn sinh trưởng được trong
khoảng 25-40
0
C, hoạt tính kháng sinh và sinh khối cao nhất
ở 30-35
0
C. ở nhiệt độ nuôi cấy trên 400C thì sinh trưởng và
tổng hợp chất kháng sinh giảm đáng kể.

Thời gian nuôi cấy
Sự sinh trưởng và phát triển trong môi trường lên men
mang đặc tính của chủng và liên quan tới khả năng sinh

tổng hợp chất kháng sinh.

Chủng xạ khuẩn đựơc nuôi trong các điều kiện thích hợp,
cứ sau 24 giờ được lấy mẫu xác định hoạt tính kháng sinh
và sinh khối (hình 4)

Hình 4. Thời gian thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng
sinh của xạ khuẩn L30


Kết quả cho thấy: Trong 3 ngày lên men đầu tiên sinh khối
tăng dần đạt cực đại ở 96 giờ và giảm dần sau đó, còn quá
trình sinh tổng hợp chất kháng sinh bắt đầu sau 2 ngày và
mạnh nhất ở 120 giờ.

Nguồn carbon thích hợp
Chủng xạ khuẩn đựơc nuôi trong các điều kiện thích hợp
với các nguồn carbon khác nhau (hình 5).

Hình 5. Nguồn carbon thích hợp cho sinh tổng hợp chất
kháng sinh của xạ khuẩn L30


Kết quả trình bày ở hình 5 cho thấy sinh khối phát triển
mạnh nhất trên nguồn glucoz, nhưng hoạt tính kháng sinh
mạnh nhất trên nguồn tinh bột

Nguồn nitơ thích hợp
Chủng xạ khuẩn được nuôi trong các điều kiện thích hợp
với các nguồn nitơ khác nhau (hình 6 ). Kết quả cho thấy

sinh khối phát triển mạnh nhất trên nguồn cao men và
pepton, hoạt tính kháng sinh mạnh nhất trên nguồn amôn,
cao men và pep ton.

Hình 6. Nguồn nitơ thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng
sinh của xạ khuẩn L30


Ảnh hưởng của xạ khuẩn đến cây trồng
ảnh hưởng của dịch nuôi xạ khuẩn đến khả năng nảy mầm
của hạt lạc [3].

Hạt lạc giống được ngâm trong dung dịch xạ khuẩn đã
được pha loãng, sau đó đặt vào các đĩa Petri đã lót sẵn giấy
lọc ướt. Sau 6 ngày kiểm tra tỷ lệ nảy mầm của hạt.

Dịch nuôi được pha loãng 10 lần ức chế khả năng nảy
mầm, còn ở tỷ lệ pha loãng 100-10.000 lần thì lại kích thích
nảy mầm.
Bảng 4. ảnh hưởng của chất kháng sinh của chủng xạ
khuẩn đến khả năng nảy mầm của lạc



Điều này khẳng định rằng: chất kháng sinh do chủng xạ
khuẩn L30 tạo ra không ảnh hưởng xấu đến khả năng nảy
mầm của hạt lạc mà còn có tác dụng kích thích nảy mầm

ảnh hưởng của chủng xạ khuẩn L30 đến khả năng sinh
trưởng của lạc [2].

Lạc được trồng trên các chậu đất được bố trí theo các
phương án sau: có nhiễm xạ khuẩn L30, hoặc nhiễm xạ
khuẩn L30 trộn với P. solanacearum 222, hoặc không
nhiễm gì làm đối chứng. Đo chiều cao cây lạc theo thời
gian.
Bảng 5. ảnh hưởng của chủng xạ khuẩn đến khả năng sinh
trưởng của cây lạc.



Kết quả cho thấy: khi nhiễm chủng xạ khuẩn nghiên cứu
vào đất trồng lạc đã không ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng
của cây lạc, ngay cả khi trong đất có chủng vi khuẩn gây
bệnh.

Khả năng kháng bệnh gây héo xanh của chủng xạ
khuẩn L30 trên đất trồng lạc
Tiến hành nhiễm chủng xạ khuẩn nghiên cứu vào đất,
cho chúng phát triển 2 tuần sau nhiễm tiếp chủng gây bệnh
héo xanh Pseudomonas solanacearum 222 vào trước khi
trồng lạc. Sau 1 tháng trồng lạc, tiến hành quan sát các chậu
đất. Khi lạc được 2-3 lá, tiến hành tiêm vi khuẩn gây bệnh
héo xanh (ở nồng độ 10-5) vào các lách lá cây lạc. Sau một
tháng đọc kết qủa.
Bảng 6. Khả năng kháng bệnh gây héo xanh của chủng xạ
khuẩn L30 trên đất trồng lạc .



Kết quả ghi ở bảng 6 cho thấy khi nhiễm P. solanacearum

vào đất trồng lạc, hay tiêm trực tiếp vào thân cây, trong
điều kiện trước đó đã nhiễm chủng xạ khuẩn thì không có
cây nào bị nhiễm bệnh (tỷ lệ sống sót 100%), trong khi đó
ở đất không nhiễm xạ khuẩn thì có 80-100% cây bị bệnh.

IV. KẾT LUẬN

1. Chủng xạ khuẩn L30 có phổ kháng sinh rộng với các
nhiều loại vi sinh vật kiểm định đặc biệt là hoạt tính mạnh
kháng Pseudomonas solanacearum.

2. Dựa vào các đặc điểm nuôi cấy, hình thái và sinh lý
sinh hoá, chủng L30 có đặc điểm khác với các loài đã mô tả
do đó gọi là Streptomyces sp

3. Điều kiện thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh
của chủng xạ khuẩn L30 trên môi trường ISP-4 với pH 7,
nhiệt độ 28-350C, thời gian lên men là 120- 144 giờ, nguồn
carbon trên tinh bột và nguồn nitơ là (NH4)2SO4.

4. Chất kháng sinh do chủng xạ khuẩn L30 sinh ra không
ảnh hưởng đến khả năng nảy mầm của hạt lạc

5. Khi nhiễm xạ khuẩn sinh chất kháng sinh vào đất
không gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng của cây lạc mà
còn có tác dụng ức chế bệnh héo xanh

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology.Vol 4,

1998.
2. Naomichi Watanabe (1994), “Biological control effect
of Gliocladium spp. against soil born plant pathogens”,
Proceeding of the Kanto-Tosan plant protection Society,
99, pp. 59-66.
3. .Rasamee Dhitikiattipong, Chiradej Chamswarng and
Twng Wah Mew. (1999), “Antagonistic Bacteria against
Rhizoctonia solani with Potential for Promoting Rice
growth”, International conference on Asian Network on
Microbial Research, November 29- December1, Chiang
Mai, Thailan , pp. 140-141.
4. Shirling, E. B. and D. Gottlieb. Methods for
characterization of Streptomyces species. Intern. J. Syst.
Bact., 22,1966, p. 313-340.


SUMMARY

BIOLOGYCAL PROPERTIES AND ANTIBIOTIC
ACTIVITY AGAINST PSEUDOMONAS
SOLANACEARUM OF THE STRAIN
STREPTOMYCES L30

Dao Thi Luong, Pham Van Ty, Nguyen Lan Dung,
Nguyen Thi Anh Dao

The strain L30 was isolated from soil sampl in Hatay
province and identified as belong to genus Streptomyces.
This strain has antibiotic activity against a large range of
pathogenic microorganisms causing diseases in human,

animals and plants. This strain was selected for
investigation of biologycal properties for the hightest
antibiotic activity in liquid culture. Antibiotic produced by
the strain L30 could stimulate the germination of groundnut
seeds. When the L30 was spayed to the soil, it could inhibit
the bacterial wilt of groundnut (Pseudomonas
solanacearum), but did have negative effect on the growth
of the groundnut .