Luận văn : ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp. BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ part 2 ppt

11
Môi trường thông thường dùng cho quá trình nhận biết Phytophthora: V-8
juice, cà rốt agar, lima bean agar.
Khi ủ ở nhiệt độ thích hợp, mẫu nấm nuôi cấy sẽ có những biểu hiện hình thái
đặc trưng cho loài. Đặc điểm sợi nấm, hình dạng tản nấm hoặc khả năng hình thành bộ
phận vô tính như túi bào tử, bào tử vách dày (chlamydospore) trên bề mặt môi trường
nuôi cấy là đặc điểm quan trọng để phát hiện Phytophthora.
Với kỹ thuật trên ta có thể phát hiện một số loài Phytophthora chẳng hạn: loài
P. capsici với dạng tản nấm đồng nhất, túi bào tử hình thành nhiều nhưng không có sự
hiện diện của bào tử vách dày (chlamydospore). Trong khi P. parasitica với dạng nấm
xòe ra, túi bào tử và bào tử vách dày (chlamydospore) hình thành phong phú trên môi
trường nuôi cấy.
Tuy nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi nhiều thời gian, công sức. Nó không phải là
giải pháp tốt cho những kiểm tra thường lệ trên một số lượng mẫu lớn (Drenth và
Irwin, 2001). Mục đích định danh muốn thực sự đạt hiệu quả cao, ta phải kết hợp đồng
thời kỹ thuật quan sát hình thái với các kỹ thuật hiện đại về sinh hoá hay sinh học
phân tử. Chúng tôi xin giới thiệu một số kỹ thuật phổ biến nhằm phát hiện và định
danh một số giống nấm gây bệnh thường gặp (James C. Correll. Genetic,
Biochemical, and Molecular Techniques for the Identification and Detection of
Soilborne Plant-Pathogenic Fungi)
2.3.2. So sánh sự tƣơng đồng về sinh sản và sinh dƣỡng
Kỹ thuật so sánh tính tương đồng về sinh sản thường được sử dụng để xác định
và mô tả mật độ lai của loài, đặc tính sinh học giữa các loài, bên trong loài. Kỹ thuật
so sánh tính tương đồng về sinh dưỡng thường được sử dụng để xác định các tiểu
quần thể clone hoặc các cá thể trong một loài. Hai kỹ thuật này khác nhau không
nhiều về di truyền và cơ chế.
Giới hạn của kiểm tra tính tương quan sinh sản bao gồm những điều sau: khó
khăn phải đối mặt trong việc tái sinh những điều kiện lai thích hợp trong môi trường
thuần khiết; tất cả những chủng kiểm tra thích hợp trong những quần thể lai khác nhau

của các loài định sẵn có thể không có giá trị; một số cá thể trong quần thể nấm có thể
không có bộ phận sinh sản, và do đó không thể tái sản xuất với bất kì những chủng
kiểm tra đã biết.


12
So sánh về sinh dưỡng, hay thể dị hạch (heterokaryon) giúp ta hiểu thêm về
mối liên hệ di truyền của những chủng nấm trong một loài. Kỹ thuật này đơn giản dựa
vào khả năng nối nhau của sợi nấm của hai chủng khác nhau, nó rất giống với sự đánh
giá những đặc điểm di truyền khác.
Kỹ thuật này được sử dụng như một kỹ thuật xác định sự đa dạng di truyền trong
các loài nấm, đột biến dinh dưỡng – sinh trưỡng, đột biến nitrate- nonutilizing (nit ).
2.3.3. Kỹ thuật protein profile
Điện di protein hòa tan trong ứng dụng ở cấp độ loài và dưới loài. Kỹ thuật này
bao gồm ly trích protein tổng số từ sợi nấm và bào tử đính., phân tách trên gel
polyacrylamide bằng điện di, nhuộm màu để kiểm tra sản phẩm protein phân tách. Kỹ
thuật này được áp dụng trên nhiều giống nấm bệnh có nguồn gốc từ đất (soilborne).
2.3.4. Isozymes
Trong phân tách Isozyme, nhiều enzyme có thể không kiểm tra được trong các
mẫu đã định. Các enzyme cắt này được xác định có thể ở dạng đơn hình trong khi có
rất ít sự khác nhau giữa các loài, dưới loài hoặc chúng có độ đa hình rất cao. Các
enzyme sau khi điện di trên tinh bột, gel polyacrylamide, hoặc màng cellulose acetate
cơ chất enzyme được cho vào cùng với thuốc nhuộm chlorogenic. Phản ứng giữa
enzyme với cơ chất và với thuốc nhuộm, phức tạp của phản ứng màu phản ánh sự hiện
diện của enzyme. Sự khác nhau nhỏ giữa trong cấu hình acid amino có thể thay đổi
trong cấu trúc hay vật mang của protein. Sự xác định và tính biến động của những
enzyme này phụ thuộc nhiều yếu tố khác nhaubao gồm những điều kiện trên sinh vật
như tốc độ tăng trưởng, độ pH, dòng điện, hệ thống đệm, tuổi, độ đậm của dung dịch
nhuộm,và chuẩn bị mẫu.
Gel cellulose acetate thường được sử dụng do nó hạn chế thấp nhất thời gian

chuẩn bị so với điện di bằng gel polyacrylamide và tinh bột
2.3.5. Huyết thanh học và kit chẩn đoán
Việc ứng dụng kháng thể trong việc kiểm tra và phát hiện nấm gây bệnh có
nguồn gốc từ đất đã ra đời 5 - 10 năm trước. Nhiều phương pháp thường được sử dụng
để sản xuất ra huyết thanh miễn dịch các loại bệnh cây do nấm gây ra mà không cần
phải hiểu biết về mặt di truyền của nguyên liệu nấm bệnh (vách tế bào, bào tử, các
protein hòa tan,…) đã tạo ra huyết thanh miễn dịch đa dòng đặc biệt. Vấn đề gặp phải


13
với kháng thể sử dụng là sự thiếu tính chuyên biệt và đặc hiệu trong hầu hết chất nền
là mô cây hay đất.
Kháng thể đơn dòng được chấp nhận như một dụng cụ chẩn đoán và phát hiện
ở mức độ loài và dưới loài. Kháng thể đơn dòng có thể ở cấp độ giống, loài, hay các
chủng đặc biệt.
Các kit chẩn đoán thường kiểm tra và phát hiện các mầm bệnh từ đất dựa vào
kỹ thuật kháng thể đơn dòng hay đa dòng. Những kit này có thể chứng minh rằng sự
cần thiết của các chẩn đoán nhanh và chính xác. Những phát hiện nhanh thường cần
thiết khi điều đó cần được cung cấp lời giải thích cho việc sử dụng các loại thuốc diệt
nấm. Các kit chuẩn đoán thông thường nhằm cung cấp hai mục đích: chẩn đoán và
nghiên cứu. Câu hỏi được đặt ra là các kit này có hiệu quả như thế nào khi quản lí
bệnh.
2.3.6. Phân tích đa dạng độ dài các đoạn đoạn đƣợc phân cắt (RFLP)
Phân tích RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) được dùng để
xác định mối quan hệ phân loài của nấm. Phản ứng RFLP bao gồm nhiều bước sau: ly
trích và tinh sạch DNA từ cơ quan hay genome; sử dụng enzyme cắt để phân cắt các
đoạn DNA; điện di phân tích các đoạn DNA trên gel agarose; thu hình các đoạn DNA
bằng cách nhuộm với ethidium bromide hoặc chuyển các đoạn DNA sang màng
nitrocellulose hay màng nylon (kỹ thuật Southern blot) và đánh dấu với các probe có
đánh dấu hay không đánh dấu phóng xạ lai với các các đoạn DNA. Blot sau khi lai

được chuyển qua phim rửa hay giấy nhạy cảm với hóa chất. Sự khác nhau về kích cở
các đoạn đa dạng là sự đa dạng di truyền (sự mất đoạn cắt, lặp lại đoạn, hay thêm đoạn
DNA).
Giá cả để thực hiện phản ứng RFLP cao nhưng giá cả sẽ giảm, và ứng dụng
của phản ứng này tăng khi thay thế các probe đánh dấu phóng xạ thành các probe
không đánh dấu. Phân tách RFLP thường dùng để nghiên cứu đa dạng di truyền trên
DNA ribosome (rDNA) và DNA ti thể ở mức độ loài hay dưới loài .
2.3.7. Kỹ thuật dùng probe acid nucleic, DNA fingerprinting và Molecular
karyotyping
Sử dụng DNA như probe phân tử để xác định các loài nấm bệnh. Một đoạn
DNA giới hạn được clone dòng và được dùng để xác định ở cấp độ loài nấm
P.parasitica ( Goodwin và cộng sự, 1989). Hiệu quả của các probe acid nucleic khi


14
xác định các loài nấm phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau bao gồm cả mức độ đa
dạng di truyền hiện diện trong các loài đã biết.
Một ứng dụng khác của các probe acid nuceic gần đây là việc sử dụng các
probe DNA minisatellite trong kỹ thuật DNA fingerprinting (Jeffreys và cộng sự,
1985). Các probe rất nhỏ được sử dụng trên nhiều sinh vật để xác định cá thể và theo
dỏi phả hệ, chúng chỉ hiện diện để xác định độ đa dạng di truyền trên nấm.
Minisatellite probe, probe oligonucleotide có thể được ứng dụng cho cấp độ loài, dưới
loài và cả những dòng clone.( Rodriguez, 1989).
2.3.8. Sự lai DNA-DNA
Sự lai DNA-DNA (DNA-DNA hydridization) được ứng dụng ở một mức độ
giới hạn trong quá trình phân loại nấm bệnh trên. Qui trình thực hiện gồm: tách DNA
của dòng phân lập; trộn với DNA từ chủng khác hay loài khác nhằm mục đích cho
chúng sáp nhập lại; mức độ sáp nhập của chúng phụ thuộc vào sự tương đồng hay
giống nhau giữa các phân tử DNA khác nhau. Kỹ thuật này không được sử dụng rộng
rãi bởi vì giá cả của bộ dụng cụ thực hiện thí nghiệm cao, tuy nhiên tỉ lệ tương đồng

giữa các loài thường rất đáng kể.
2.3.9. Kỹ thuật PCR và RAPD
Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật nhân đoạn DNA dựa
vào các base trình tự. Kỹ thuật này thường dùng để xác đinh mối quan hệ phát sinh
loài giữa các loài và là kỹ thuật ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học (Amheim
và cộng sự, 1990; White và cộng sự, 1990). PCR bao gồm enzyme khuếch đại một
trình tự DNA đặc hiệu. Vùng thường được sử dụng để khuếch đại là vùng lập lại
không mã hóa ITS ( Internal Transcribed Spacer) trong RNA ribosome, vùng này có
giá trị thay đổi giữa các loài nấm và do đó có thể xác định mối quan hệ giữa các loài
(Bruns và cộng sự, 1992). Kỹ thuật này rất có giá trị bởi tính tiến hóa ở mức độ cao
của các loài và các chủng có thể được so sánh. PCR rất có giá trị trong việc xác định ở
mức độ loài và chủng. Nó phù hợp để xác đinh các nhóm, các chủng đặc biệt.
Gần đây, kỹ thuật khuếch đại các đoạn đa hình RAPD (Randomly Amplified
Polymorphic DNA) được phát triển (William và cộng sự, 1990). RAPD nhằm sử dụng
những cặp mồi khoảng 10 base để nhận ra nhiều đoạn DNA khác nhau trên toàn DNA
sinh vật (đoạn lớn nhất có kích thước khoảng 1kb). Sự xuất hiện, vắng mặt và sự khác
nhau về các band DNA cho phép xác định sự đa dạng giữa chúng.


15
2.4. Một số công trình nghiên cứu định danh nấm Phytophthora
2.4.1. Một số công trình nghiên cứu ngoài nƣớc:
Sử dụng cặp mồi ITS để khuếch đại vùng ITS trên nấm Phytopthora. Sản phẩm
PCR đem đi phân tích mối quan hệ di truyền với hơn 35 loài bằng ba enzyme cắt AluI,
TaqI, MspI hoặc được giải trình tự để so sánh với 17 loài nấm Phytophthora khác
bằng cách dùng phần mềm so sánh trình tự PHYLIP [7].
P. palmivora được phân lập từ cây cacao và cây dừa. P. capsici được phân lập
từ ca cao, tiêu đen và tiêu chuông đã được chọn lọc từ nhiều địa phương khác nhau
của Ấn Độ. Tác giả sử dụng cập mồi ITS1, ITS2 để khuếch đại vùng ITS của gen
rDNA bằng kỹ thuật PCR và phân tích AFLP. Dòng phân lập của P. capsici (P575) từ

cacao ở Mehico cũng bao gồm trong sự so sánh đa dạng di truyền ở trên. Phân tích
AFLP của P. palmivora phân lập từ cây ca cao và cây dừa cũng giống như các mẫu
khác. Nhưng các phân tích AFLP của loài P. capsici cho thấy sự khác nhau một cách
hiển nhiên với loài P. palmivora. Do đó, vùng ITS được dùng như marker phân loại để
xác định giống Phytophthora và AFLP được dùng cho việc ước định những thay đổi
đặc biệt bên trong [14].
Sử dụng kết hợp 2 phương pháp: quan sát hình thái và sinh học phân tử.
Phương pháp sinh học phân tử dùng cho những nghiên cứu chi tiết, sử dụng PCR-
RFLP phân tích đoạn gen ITS1-5,8S-ITS2 trên vùng ITS thuộc DNA ribosome của
180 dòng phân lập. Phân tích trình tự trên ITS2 cho 50 dòng phân lập được dùng cho
điều tra mối quan hệ giữa sự thay đổi di truyền và sự phát sinh loài giữa các loài phân
lập. Dòng phân lập được chia làm 12 nhóm dựa theo kiểu phát triển của chúng trên
môi trường CMA (Corn Meal Agar). Phân cắt bằng 3 enzyme cắt nhằm tìm ra sự phát
sinh loài trong vùng ITS2 [11].
Nghiên cứu trình tự lặp lại ITS (internal transcribed spacer) của gen rDNA và
đa dạng độ dài các đoạn khuếch đại (AFLP) DNA tổng của loài mới (mầm bệnh
Phytophthora trên cây dương đỏ ở Châu Âu). Kỹ thuật lai (heteroploid-interspecific
hydrid) trên P.cambivora, một số loài khác và một loài chưa rõ giống như P.
fragariae. Phương pháp này đánh dấu tính biến đổi di truyền đang tăng, sự thay đổi
hình thái một cách khác thường, sự tái tổ hợp trên vùng ITS [15].
Kỹ thuật PCR dùng để xác định Phytophthora capsici trên cây tiêu. Ba mồi
PCR ( CAPFW, CAPRV1 và CAPRV2) được thiết kế đặc biệt dựa trên trình tự của


16
Hình 2.3. Vùng trình tự ITS trong DNA ribosome
(A.Drenth và J.A.G Irwin,2001)

Hình 2.3. Vùng trình tự ITS trong DNA ribosome
(A.Drenth và J.A.G Irwin,2001)

vùng ITS của chúng. Cặp mồi CAPFW/CAPRV1 khuếch đại sản phẩm 452bp trong
khi cặp mồi CAPFW/CAPRV2 khuếch đại đoạn 595bp. Cặp mồi CAPFW/CAPRV2
trong PCR dùng để phát hiện đoạn gel của P.capsici trong cây được chủng bệnh. Kết
quả xuất hiện sau 8 giờ chủng bệnh trên mẫu gốc bị ảnh hưởng trong khi cây vẫn chưa
thấy sự biểu hiện bệnh của cây [8].
2.4.2. Nghiên cứu trong nƣớc
Sử dụng hai kỹ thuật mô tả hình thái và PCR định danh được một số loài nấm
như Phytophthora capsici gây bệnh trên hồ tiêu ở Bà Rịa Vũng Tàu, Phytophthora
parasitica gây bệnh trên sầu riêng Đồng Nai, Phytophthora palmivora gây bệnh trên
sầu riêng và lan Dendrobium ở Đắc Lắc và Tp. HCM [1].
2.5. Sơ lƣợc về trình tự ITS và danh mục các loài Phytophthora ở Việt Nam
2.6.1. Sơ lƣợc về trình tự ITS (Internal Transcribed Spacer)










Sự lựa chọn trình tự DNA dùng cho việc phát hiện đặc biệt giống Phytophthora
và các loài thuộc giống này giữ vai trò quan trọng trong quá trình tìm ra những trình
tự có tính ổn định cao. Các trình tự đó phải thể hiện sự khác biệt đặc biệt sao cho ta có
thể phân biệt được dòng phân lập ở cấp độ loài hay giống của chúng. Gen mã hóa
vùng ribosomal RNA trên sinh vật Eukaryote đảm bảo được chất lượng này. Chúng là
một phần thiết yếu của sự sống tế bào và các vùng biểu hiện mà vùng này có sự khác
biệt về sự thay đổi trình tự giữa các loài. Mặt khác, độ nhạy của các kiểm tra chẩn

đoán tăng khi gen mục tiêu tồn tại ở một số lượng lớn trong genome. Trong hầu hết
các sinh vật Eukaryote gen ribosomal RNA (rDNA) gồm một họ đa gen, trong đó các
bản sao được sắp xếp lặp lại liên tiếp nhau. Mỗi đoạn lặp lại gồm một đơn vị phiên mã


17
đơn bao gồm một cấu trúc tiểu đơn vị nhỏ 5,8S và một cấu trúc tiểu đơn vị lớn (chia
làm hai phần ) là ITS1, ITS2 (A. Drenth và J.A.G. Irwin, 2001)
Primer ITS4 và ITS5 là các Universal primer được White và cộng sự (1990)
thiết kế để khuếch đại đoạn gen nằm trong vùng ITS. Đoạn gen của giống
Phytophthora có kích thước 900bp.
Vùng ITS cũng có một số ứng dụng như: tính toán các đột biến điểm trong quá
trình hình thành loài, đo lường sự giống nhau bên trong trình tự DNA, dùng các phần
mềm chuyên dụng tạo ra cây tiến hóa loài không chỉ bao gồm các loài giống nhau mà
còn phân biệt sự khác nhau giữa các loài; mô tả vùng ITS bằng các enzyme cắt chuyên
dụng như: TaqI, AluI, MspI.
2.6.2. Danh mục các loài Phytophthora đƣợc tìm thấy ở Việt Nam
Bảng 2.2. Danh mục các loài nấm Phytophthora đƣợc tìm thấy ở Việt Nam
(A. Drenth và I. Guest, 2004)
Tên loài Kí chủ Bệnh Năm Tài liệu tham khảo
P.botryosa Cao su Rụng lá 1961 Đặng Vũ Thị Thanh
Vệt đen và Hà Minh Trung (1999)
P.cactorum Mận Thối trái 1996 Đặng Vũ Thị Thanh
và Hà Minh Trung (1999)
P.capsici Tiêu đen Thối rễ 1998 NguyễnViết Trọng (2002)
P.cinnamomi Dứa Thối nõn 2001 Đặng Vũ Thị Thanh
và cộng sự (2004)
P.citrophthora Họ cam chanh Thối trái Roger (1951)
Loét thân
P.colocasiae Khoai mỡ Tàn lụi lá 1951 Roger (1951)

P. infestans Khoai tây Tàn lụi lá 1951 Roger (1951)
Cà chua Tàn lụi lá
Cà trứng Tàn lụi lá
P.nicotianae Dứa Thối nõn 2001 Đặng Vũ Thị Thanh
và cộng sự (2004)
Thuốc lá Thân đen 1967 NIPP (1975)
Họ cam chanh Loét thân 2002 Đặng Vũ Thị Thanh
và cộng sự (2004)
P.palmivora Sầu riêng Tàn lụi lá 2000 Đặng Vũ Thị Thanh


18
và cộng sự (2004)
Dừa Loét thân 2002 Đặng Vũ Thị Thanh
và cộng sự (2004)
Cacao Thối trái 2002 Đặng Vũ Thị Thanh
và cộng sự (2004)
Caosu Tàn lụi lá 1965 Đặng Vũ Thị Thanh
Vệt đen và Hà Minh Trung (1999)
Rụng lá
P.durian Sầu riêng Loét 2002 Đặng Vũ Thị Thanh
và cộng sự (2004)
Phytophthora sp Cao su Loét thân 1965 Đặng Vũ Thị Thanh
và Hà Minh Trung (1999)
Phytophthora sp Ziziphus Thối trái 1997 Đặng Vũ Thị Thanh
và Hà Minh Trung (1999)
Phytophthora sp Nhãn Thối trái 1995 Đặng Vũ Thị Thanh
Tàn lụi lá và Hà Minh Trung (1999)

19
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
3.1.1 Thời gian
Đề tài được thực hiện từ ngày 06/02/2006 cho đến ngày 15/08/2006
3.1.2 Địa điểm thực hiện:

- Quá trình tăng sinh, nhân sinh khối được thực hiện tại Phòng thí nghiệm
Bệnh Cây – Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật – Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí
Minh.
- Quá trình chiết tách DNA và phản ứng PCR được thực hiện tại Phòng thí
nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật – Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh
– Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
3.2 Vật liệu và hóa chất:
Chúng tôi tiến hành tăng sinh nhân sinh khối 2 mẫu nấm Phytophthora phân lập
trên sầu riêng Đồng Nai, tiêu Bà Rịa và 2 mẫu nấm Phytophthora trên địa lan Đà Lạt
của kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy. Các mẫu nấm này đã được định danh bằng kỹ thuật
quan sát hình thái.
3.2.1 Phục hồi và nhân sinh khối
a. Vật liệu và hóa chất
Đường Glucose
Agar
Khoai tây
Cồn 70% và Cồn 96%
Cà rốt
CaCO
3

3.2.2 Ly trích DNA
a. Vật liệu và dụng cụ:
 Máy vortex
 Máy ủ nhiệt độ 60
0
C
 Máy li tâm Siqma
 Ống nghiệm(eppendorf) 1,5 ml

20
 Pipetman và đầu tip các loại ( hãng Nichikyo Le)
b. Hóa chất: ( Merk)
 Lysis buffer( 50 mM Tris HCl; 50mM EDTA; 3% SDS; 1% -mercaptoethanol)
pH 8,0.
 Nitơ lỏng
 Hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (25: 24: 1).
 Isopropanol.
 Ethanol 70%.
 Dung dịch TE ( 10mM Tris HCl; 1mM EDTA; pH 8,0).
3.2.3 Kỹ thuật điện di
a. Vật liệu và hóa chất
 Dung dịch TAE( Tris HCl; Na
2
EDTA 0,5 M; Glacial acetic acid).
 Agarose.
 Thuốc nhuộm gel Ethidium bromide 1%.
3.2.4 Kỹ thuật PCR
a. Vật liệu
 Mẫu nấm ly trích.
b. Hóa chất ( Biorad)
 dNTPs(dATP; dTTP; dGTP; dCTP), MgCl
2
, 10X PCR buffer.
 Taq DNA polymerase( BioRad).
 Ethidium bromide; dung dịch đệm TAE 0,5%.
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1 Tăng sinh và nhân sinh khối
Mẫu nấm đã thu thập trên nhiều mẫu khác nhau được tăng sinh trên môi trường

PGA.
Thành phần trong 1lít môi trường tăng sinh PGA ( Potato – Glucose Agar)
- Khoai tây 200gram
- Glucose 20gram
- Agar 15gram
- Nước cất vừa đủ 1000ml
Môi trường PGA được hấp tiệt trùng ở 121
0
C/ 1 atm / 20 phút, được đổ ra đĩa
petri.


21
Tiến hành cấy các dòng nấm Phytophthora từ các mẫu khác nhau vào các đĩa môi
trường PGA. Sau đó, các đĩa môi trường này được ủ ở nhiệt độ 25
0
C – 28
0
C.
Sau khoảng 3 – 4 ngày, khi tản nấm đã hình thành và có đường kính khá lớn ( 4
– 5 mm) ta tiến hành cấy mẫu nấm vào môi trường nhân sinh khối lỏng ( môi trường
cà rốt ).
Thành phần có trong 1l môi trường cà rốt
- Cà rốt 600gram
- CaCO
3
15gram
- Nước cất vừa đủ 1000ml
Cách thực hiện: Cà rốt gọt vỏ, rửa sạch, bào mỏng xay nhuyễn cùng với 700 ml
nước cất; hấp tiệt trùng 100

0
C / 20 phút. Để nguội lọc qua rây và 4 lớp vải lọc, lấy dịch
trong. Thêm 15gram CaCO
3
vào dung dịch khuấy đều, sau đó lắng 20 phút. Gạn lấy
dịch lỏng, bỏ CaCO
3
. Chia đều dung dịch vào bình tam giác hay chai nước biển với thể
tích khoảng 100 ml/chai. Hấp tiệt trùng 121
0
C/ 1atm / 20 phút.
Cách cấy nấm sang môi trường nhân sinh khối
- Sử dụng đĩa petri mang các khuẩn lạc nấm có đường kính 4 – 5 mm.
- Cắt nhỏ ( băm nhuyễn ) rìa mép tản nấm.
- Cấy mẫu nấm đã được băm nhuyễn sang bình chứa môi trường cà rốt.
Sau khi cấy, những bình nhân sinh khối phải được ủ tối từ 7 đến 10 ngày trong
điều kiện nhiệt độ phòng, tĩnh lặng.
Quá trình thu sinh khối: mẫu nấm sau khi nhân sinh khối sẽ được lọc qua vải lọc và
làm cho khô kiệt bằng giấy thấm. Bảo quản mẫu ở -70
0
C.
3.3.2 Ly trích DNA
Mẫu nấm trước khi chiết tách DNA phải qua quá trình nghiền mẫu trong Nitơ lỏng
và được cho vào các eppendorf.
Qui trình ly trích DNA tổng số: dựa trên qui trình ly trích được của Lee và
Taylor (1990) có cải tiến thêm một số bước.
Các hóa chất cần pha để thực hiện qui trình ly trích
- Lysis buffer(50mM Tris-HCl; 50mM EDTA; 3% SDS; 1% -mercaptoethanol).
- Hỗn hợp Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1).
- TE(10mM Tris-HCl; 1mM EDTA; pH 8,0).

Có hai qui trình ly trích DNA được sử dụng


22
3.3.2.1 Qui trình 1
- Mỗi eppendorf ly trích chứa khoảng một phần ba eppendorf nấm.
- Cho vào mỗi eppendorf 750 l Lysis buffer.
- Ủ ở nhiệt độ 65
0
C trong 1 giờ.
- Cho thêm 500 l hỗn hợp Phenol /Chloroform/ Isoamyl alcohol (25:24:1), lắc
nhẹ dung dịch có màu trắng đục.
- Ly tâm 13000 rpm/ 15 phút/ 28
0
C, hút pha trên cho vào một eppendorf mới.
- Cho isopropanol vào theo tỉ lệ 2:1, dung dịch xuất hiện kết tủa.
- Ly tâm 13000 rpm/ 5 phút/28
0
C, thu nhận DNA cô đặc có màu trắng đục ở đáy
eppendorf.
- Rửa mẫu nhiều lần bằng Ethanol 70%.
- Hong khô mẫu.
- Hòa tan mẫu với lượng TE 0,5X hay nước cất hai lần vô trùng.
3.3.2.2 Qui trình 2
- Sử dụng mỗi eppendorf chứa khoãng một phần ba eppendorf mẫu.
- Cho vào mỗi eppendorf 750 l Lysis Buffer.
- Ủ ở 65
0
C trong một giờ.
- Cho thêm 500 l hỗn hợp Phenol /Chloroform/ Isoamyl alcohol (25:24:1), lắc

nhẹ dung dịch có màu trắng đục.
- Ly tâm 13000 rpm/5 phút/ 28
0
C, hút pha trên cho vào một eppendorf mới.
- Cho 2 l RNase vào eppendorf trên, ủ ở 37
0
C trong một giờ.
- Hút khoảng 400 l Chloroform/ Isoamyl alcohol cho vào, lắc nhẹ đều.
- Ly tâm 13000 rpm/ 5 phút/ 28
0
C, hút pha trên vào một eppendorf mới.
- Thêm Isopropanol theo tỉ lệ 2:1, dung dịch xuất hiện kết tủa.
- Ly tâm 13000 rpm/ 5 phút/ 28
0
C, thu nhận DNA cô đặc có màu trắng đục ở đáy
eppendorf.
- Rửa mẫu bằng Ethanol 70%.
- Hong khô mẫu.
- Pha loãng mẫu với TE 0,5X hay nước cất hai lần vô trùng.
Mẫu ly trích được bảo quản ở 4
0
C.
Kiểm tra kết quả ly trích bằng kỹ thuật chạy điện di trên gel agarose 0,8%.


23
Thành phần trong bản gel agarose 0,8%
- Dung dịch TAE 0,5X 12,5ml
- Agarose 0,1gram
Sản phẩm ly trích DNA được chạy điện di trong dung dịch TAE và chạy 100V/

20 phút/ 250mA. Sau đó, miếng gel được nhuộm Ethidium Bromide trước khi đọc kết
quả trên máy Geldoc.
DNA tổng số thu được phải được pha loãng ở nồng độ thích hợp để tiến
hành phản ứng PCR. Nồng độ DNA chạy phản ứng PCR nằm trong một khoảng khá
rộng từ 3ng đến 100ng tùy thuộc mẫu DNA.
3.3.3 Kỹ thuật PCR
Hóa chất cần pha cho phản ứng PCR.Chủ yếu có 3 loại
- Pha dNTPs có nồng độ là 2,5mM.
- Pha loãng hai primer ITS4, ITS5 ra nồng độ 100pmol/ l.
- Pha loãng mẫu DNA sau cho lượng DNA < 100ngram/ l.
- Nhiệt độ bắt cặp Tm = 2*(A+T) + 4*(G+C).
- Trình tự cặp primer chạy PCR lần lượt là:
ITS4 ( 5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’)
ITS5 ( 5’ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3’)

Bảng 3.1.Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 25 l
Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích
PCR buffer 10X 1X 2,5 l
MgCl
2
50mM 1,5mM 0,75 l
dNTPs 2,5mM 0,2mM 2 l
Primer ITS4 100pmol/ l 10pmol/ l 0,1 l
Primer ITS5 100pmol/ l 10pmol/ l 0,1 l
Taq DNA polymerase 5UI 0,5UI 0,1 l
DNA khuôn mẫu <100ngram 1 l


24
Nước cất vừa đủ

25 l
Bảng 3.2.Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 50 l
Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích
PCR buffer 10X 1X 5 l
MgCl
2
50mM 1,5mM 2 l
dNTPs 2,5mM 0,2mM 2 l
Primer ITS4 100pmol/ l 10pmol/ l 2 l
Primer ITS5 100pmol/ l 10pmol/ l 2 l
Taq DNA polymerase 5UI 0,5UI 0,2 l
DNA khuôn mẫu <100ngram 1 l
Nước cất vừa đủ

50 l
Bảng 3.3.Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR
Các bƣớc của phản ứng
Nhiệt độ
Thời gian
Giai đoạn khởi động
Giai đoạn chạy phản ứng
(30 chu kỳ)
Tách DNA khuôn
Bắt cặp
Kéo dài
Giai đoạn kết thúc
94
o
C

94
o
C
56
o
C
72
o
C
72
o
C
3 phút


1 phút
45 giây
1 phút
5 phút

Kiểm tra sản phẩm PCR :
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose nồng độ
1% - 1,5%.
Thành phần gel 1% chạy điện di:
Dung dịch TAE 0,5X 12,5ml
Agarose 1,25g

25
Điều kiện chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR 50V/40 phút/250mA. Sau đó, ta
nhuộm gel và chụp hình nhuộm bằng máy Geldoc.


26
3.3.4 Kỹ thuật tinh sạch
Kỹ thuật tinh sạch đọc trình tự : có hai kỹ thuật tinh sạch chính
3.3.4.1 Kỹ thuật tinh sạch bằng thao tác tay:
- Lấy eppendorf chứa khoảng 20 l mẫu PCR.
- Thêm 180 l TE, trộn đều với mẫu.
- Cho vào 200 l Chloroform/ Isoamyl alcohol, trộn với lương mẫu trên.
- Ly tâm 13500 rpm/ 5 phút/ 28
0
C, hút dịch nổi cho vào một eppendorf mới.
- Thêm 100 l Ethanol 70%, ủ ở -70
0
C trong 30 phút.
- Ly tâm 13500 rpm/ 5 phút, bỏ phần dịch nổi ở trên.
- Rửa lại bằng Ethanol 70% .
- Ly tâm 13500 rpm/ 2 phút.
- Làm khô mẫu.
- Hòa tan mẫu với TE 0,5X.
3.3.4.2 Kỹ thuật tinh sạch bằng cột GMX
- Sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel agarose đặc biêt 0,8% ( có thể tan ở
nhiệt độ thấp) với thể tích từ 15 l cho đến 20 l. Miếng gel chạy điện di được
nhuộm Ethidium bromide trong thời gian ngắn (1-2 phút) và được cắt band trên
máy chiếu UV. Sản phẩm cắt cho vào một eppendorf mới.
- Cân lượng gel chứa band PCR.
- Cho vào eppendorf dung dịch capture buffer tỉ lệ 1:2 (10 mg gel ≈ 20 l capture

buffer), ủ hỗn hợp trên ở 60
0
C trong 15 phút.
- Ly tâm 3000 rpm/ 30 giây.
- Hút mẫu cho vào cột GFX, để mẫu ổn định trong 1 phút.
- Ly tâm 9000 rpm/ 30 giây.
- Thêm dung dịch wash buffer với lượng tương đương capture buffer cho vào.
- Ly tâm 9000 rpm/ 30 giây.
- Đặt cột vào eppendorf mới.
- Hút 15 l elution buffer nhỏ vào cột GFX, ủ khoảng 3 phút ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm 9500 rpm/ 2 phút, lấy cột GFX ra.
- Giữ mẫu tinh sạch ở 4
0
C.
Mẫu PCR tinh sạch được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.


27
Trình tự được giải trực tiếp bằng máy giải trình tự ABI TRISM 3100.
3.3.5. Xử lý kết quả giải trình tự:
Ta sử dụng một số phần mềm như sau:
- Sử dụng phần mềm Chromas145-95 để xử lý trình tự
- Phần mềm BLAST để so sánh trình tự với các loài Phytophthora đã được giải
trình tự trên ngân hàng gen.(
- Phần mềm ClustalX để so sánh độ tương đồng của trình tự và vẽ cây sinh loài
bằng phần mềm Treeview.

28
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Quá trình tăng sinh, nhân sinh khối
Chúng tôi áp dụng qui trình tăng sinh nhân sinh khối nấm Phytophthora của kỹ
sư Trịnh Thị Phương Vy (2005) để nhân sinh khối 4 mẫu nấm trên và rút ra một số
nhận xét:
- Tất cả 4 mẫu nấm đều phát triển tốt trong điều kiện ánh sáng tối.
- Nhiệt độ thích hợp cho sự tăng sinh mẫu nấm trên sầu riêng Đồng Nai và trên
tiêu Bà Rịa là nhiệt độ phòng trong khi nhiệt độ thích hợp trên 2 mẫu địa lan là 20
0
C –
22
0
C.
Chúng tôi kí hiệu cho 4 mẫu nấm như sau:
Kí hiệu Cây kí chủ Địa điểm
SRDN Sầu riêng Đồng Nai
TBR Tiêu Bà Rịa-Vũng Tàu
DL1 Địa lan Lâm Đồng
DL2 Địa lan Lâm Đồng.
4.2 Quá trình ly trích
Kỹ thuật chiết tách DNA tổng số được xem là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực
hiện. Nhưng qui trình tách chiết DNA là một trong những qui trình khởi đầu cho các

kỹ thuật sinh học phân tử quan trọng. Do đó nó đóng vai trò thu nhận sản phẩm DNA
cho những phản ứng tiếp theo sau bao gồm kỹ thuật PCR và kỹ thuật giải trình tự.
Chúng tôi đã tham khảo qui trình ly trích của Lee và Taylor (1990) sau đó cải tiến
thêm một số bước cho phù hợp với mẫu nấm Phytophthora. Trong bước ly trích này
chúng tôi áp dụng 2 qui trình ly trích khác nhau đã được đề cập ở trên.
Kết quả điện di 100 V/ 15 phút/ 400 mA sản phẩm trên gel agarose 0,8% chúng
tôi thu nhận được ở hai qui trình ly trích có sự khác nhau khá rõ:








29
DNA tổng số
Hình 4.2. Sản phẩm của qui trình ly trích 2









Qui trình ly trích 1 cho kết quả ly trích chưa đạt được hiệu quả. Chúng tôi
không thu được DNA. Phần tạp còn quá nhiều Qui trình ly trích 2 đạt được nhiều hiệu
quả hơn. Sản phẩm DNA thu được ở dạng tinh sạch khá cao, loại bỏ được tạp nhiễm.

Khi so sánh kết quả của hai qui trình ly trích này ta thấy qui trình ly trích 2 có
thêm một số các hóa chất khác như: RNase và Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1). Vai
trò của Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1) là hòa tan các protein thừa, chất cặn còn lại
sau khi đã loại bỏ chúng bằng hỗn hợp Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1).
RNase có vai trò loại bỏ RNA nằm trong lượng DNA thu được. Qui trình ly trích 2
(qui trình ly trích tinh sạch) loại bỏ hầu hết những phần tạp nhiễm nhưng vẫn không
ảnh hưởng đến chất lượng DNA. Như vậy, chúng tôi đã chiết tách DNA thành công
bằng qui trình ly trích 2.
4.3 Quá trình PCR
Phản ứng PCR bao gồm nhiều thành phần khác nhau trong một chu trình nhiệt,
và các thành phần này đều có ảnh hưởng đến kết quả PCR trong đó nồng độ và độ tinh
sạch của DNA khuôn đóng vai trò quan trọng. Sản phẩm tách chiết được chúng tôi
hoàn thiện ở quy trình ly trích 2 đã đủ độ tinh sạch cho phản ứng PCR. Nhưng nồng độ
của nó cao hơn gấp nhiều lần so với nồng độ cần cho phản ứng PCR ( khoảng 3 – 100
ng/ l). DNA mẫu được pha loãng bằng TE 0,5X hoặc nước cất vô trùng. Thang nồng
độ DNA chuẩn được sử dụng để định lượng DNA cho phản ứng PCR.




DNA tổng số
phần tạp


Hình 4.1. Sản phẩm của qui trình ly trích 1


30

Sau khi hoàn thiện được quy trình phản ứng PCR đáng tin cậy cho mục đích
khuếch đại vùng ITS chúng tôi tiến hành những phân tích đồng thời thực hiện phản
ứng khuếch đại vùng ITS của dòng nấm Trichoderma làm đối chứng định danh nấm
Phytopthora. Chạy điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% trong 75 V/45 phút/
250 mA.
Sản phẩm DNA khuếch đại vùng lặp lại ITS có kích thước khoảng 900bp.
Trong bốn mẫu nấm phân tích chỉ có ba mẫu cho kết quả band 900bp. Trong cùng điều
kiện đó, phản ứng khuếch đại vùng ITS của nấm Trichoderma cho band có kích thước
khoảng 650 – 700bp. Kết quả này khá phù hợp với những nghiên cứu định danh nấm
Phytopthora trên vùng ITS (Cooke và Duncan, 1997; Trịnh Thị Phương Vy, 2005).
Tuy nhiên, kết quả PCR mẫu DL2 trái với kết quả định danh bằng kỹ thuật quan sát
hình thái. Kết quả định danh hình thái của kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy khẳng định mẫu
DL2 thuộc giống Phytophthora nhưng kết quả PCR trên vùng ITS cho band có kích
thước khoảng 800bp.

Hình 4.3. Thang nồng độ DNA chuẩn
( Nguyễn Văn Lẫm và Lê Minh Kha, 2005)


31















Một số lý do giải thích cho kết quả trên bao gồm:
Sự sai khác về vùng bắt cặp của primer trên gen do ITS là vùng có trình tự lặp
lại cho nên primer có thể bắt cặp sai vị trí.
Quá trình tăng sinh, nhân sinh khối đã bị tạp nhiễm một giống nấm khác và sản
phẩm thu sinh khối dùng cho phản ứng PCR thuộc giống Phytophthora.
Phản ứng PCR chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nồng độ DNA chạy phản
ứng, nhiệt độ bắt cặp, nồng độ đoạn mồi bắt cặp. Do giới hạn của thời gian thực hiện
đề tài nên chúng tôi chỉ tiến hành kiểm tra kết quả PCR ở yếu tố nồng độ DNA mẫu
trên hai mẫu nấm DL1 và DL2.
Để hạn chế khả năng tạp nhiễm chúng tôi đã tiến hành tăng sinh nhân sinh khối

và ly trích lại hai mẫu này. DNA mẫu được pha loãng ở hai nồng độ 30ng và 10ng.
phản ứng PCR lặp lại với cùng điều kiện phản ứng trên hai mẫu ở hai nồng độ này.
Kết quả điện di trên gel agarose 1% cho ta thấy rằng, sự phụ thuộc của sản phẩm PCR
vào nồng độ DNA mẫu.



900bp

Hình 4.4. Kết qủa phản ứng PCR
(1) TBR; (2) SRDN; (3) ladder; (4) DL1 ;
(5) DL2; (6) mẫu Trichoderma làm đối chứng