Luận văn : XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIRUS PMWaV-1 GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (Mealybug wilt) TRÊN CÂY DỨA CAYENNE BẰNG PHƯƠNG PHÁP RT-PCR part 1 pdf

1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
****0O0****






KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP



XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIRUS PMWaV-1 GÂY
BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (Mealybug wilt) TRÊN CÂY DỨA
CAYENNE BẰNG PHƯƠNG PHÁP RT-PCR



Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2001 – 2005
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN PHÚ DŨNG




Thành phố Hồ Chí Minh
09/2005

2
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***




KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP




XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIRUS PMWaV-1 GÂY
BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (Mealybug wilt) TRÊN CÂY DỨA
CAYENNE BẰNG PHƯƠNG PHÁP RT-PCR




Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện
Ts. TRẦN THỊ DUNG NGUYỄN PHÚ DŨNG
Cn. LƯU PHÚC LỢI

Thành Phố Hồ Chí Minh
- 09 / 2005 -


3

LỜI CẢM TẠ
ZY

Để hoàn thành cuốn luận văn này tôi đã nhận được sự hướng dẫn tận
tình, sự góp ý, giúp đỡ của các thầy cô, gia đình và bạn bè. Nay tôi xin được
bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

 Cha và Mẹ đã sinh thành, dạy dỗ con đạt được ngày hôm nay.

 Ts. Trần Thị Dung đã hết lòng hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi hoàn tất đề tài.

 Thầy Lưu Phúc Lợi đã tận tình giúp đỡ, góp ý và động viên trong suốt thời
gian tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp.

 Các Thầy – Cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông Lâm
TP. Hồ Chí Minh.

 Các anh chị thuộc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại Học Nông
Lâm Tp.Hồ Chí Minh.

 Các bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã cùng tôi chia sẻ vui
buồn, thành công và thất bại trong suốt thời gian thực hiện đề tài.


Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2005
Nguyễn Phú Dũng


4
TÓM TẮT

Đề tài "Xây dựng qui trình phát hiện virus PMWaV-1 gây bệnh đỏ đầu lá trên
chồi dứa Cayenne bằng phương pháp RT-PCR" được thực hiện tại phòng thí nghiệm
CNSH – Trung tâm phân tích thí nghiệm – trường Đại học Nông Lâm TPHCM từ
ngày 15/3/2005 đến ngày 15/8/2005.
Đề tài được thực hiện bởi sinh viên Nguyễn Phú Dũng thuộc lớp CNSH khóa
27 dưới sự hướng dẫn của Ts. Trần Thị Dung - trưởng Bộ môn CNSH.
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là virus PMWaV-1 gây bệnh héo đỏ đầu lá
trên cây dứa Cayenne. Bệnh đang hiện diện ở hầu hết các vùng trồng dứa trên thế giới,
gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho người trồng vì chưa có thuốc phòng trị đặc hiệu.
Mục đích của đề tài là xây dựng quy trình phát hiện PMWaV-1 trên chồi giống
dứa Cayenne bằng cách khuếch đại đoạn gen HSP 70 của virus với phương pháp
RT-PCR.

Nội dung nghiên cứu bao gồm:
¾ Thu thập chồi giống dứa Cayenne.
¾ Thiết lập quy trình RT-PCR khuếch đại đoạn gene HSP 70 của PMWaV-1.
¾ Áp dụng quy trình vừa xây dựng, giám định PMWaV-1 trên 90 chồi dứa
Cayenne thuộc 3 giống: Thái Lan, Trung Quốc và Lâm Đồng.

Các kết quả thu được:
¾

Ly trích được RNA tổng số từ mẫu dứa.
¾

Xây dựng được quy trình RT-PCR phát hiện PMWaV-1 qua việc xác định
được các yếu tố chu trình nhiệt, nồng độ primer và số chu kỳ tối ưu cho
phản ứng.
¾
Sản phẩm RT-PCR được giải trình tự cho thấy nằm đúng vùng gene
HSP 70 cần nhân bản và hoàn toàn đặc hiệu cho PMWaV-1. Như vậy, quy
trình RT-PCR được xây dựng hoàn toàn đáng tin cậy trong việc phát hiện
PMWaV-1

¾
Tỷ lệ nhiễm PMWaV-1 trên cả 3 giống dứa Cayenne được giám định đều
rất cao, giống Thái Lan: 53,3%, giống Trung Quốc: 46,7% và giống Lâm
Đồng: 46,7%. Kết quả này cho thấy một nguy cơ lớn của bệnh héo đỏ đầu
lá đang đe dọa người trồng dứa và đòi hỏi cấp thiết một phương pháp
phòng trừ bệnh hiệu quả.





5
MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG

Trang tựa
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Mục lục v
Danh sách các chữ viết tắt vii
Danh sách các bảng viii
Danh sách các hình ix

Phần 1: MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích 2
1.3 Yêu cầu 2

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Đặc điểm chung của cây dứa. 3
2.2 Phân loại 4
2.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ dứa trên thế giới và ở Việt Nam 7
2.4 Bệnh héo đỏ đầu lá trên cây dứa 9
2.5 Một số nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá trên thế giới và ở Việt Nam. 13
2.6 Các phương pháp chẩn đoán PMWaV 15
2.7 Gene HSP 70 của PMWaV-1 16
2.8 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 17
2.8.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR 17
2.8.2 Các yếu tố quan trọng trong phản ứng PCR 19
2.8.2.1 Dung dịch đệm (Buffer) 19
2.8.2.2 Mg
2+
19
2.8.2.3 Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs) 19
2.8.2.4 Primer (đoạn mồi) 20

2.8.2.5 Taq – polymerase 20
2.8.2.6 Số chu kỳ của phản ứng PCR 21
2.9 Phương pháp RT-PCR (Reverse transcription PCR) 21
2.10 Kỹ thuật giải trình tự DNA. (Sequencing) 24





6
Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Vật liệu nghiên cứu. 25
3.1.1 Mẫu 25
3.1.2 Dụng cụ và thiết bị 25
3.1.3 Hóa chất 26
3.1.3.1 Hoá chất dùng cho tách chiết RNA 26
3.1.3.2 Hoá chất dùng cho phản ứng RT-PCR 26
3.1.3.3 Hóa chất dùng cho điện di DNA 27
3.1.3.4 Hóa chất dùng cho điện di RNA 28
3.2 Phương pháp nghiên cứu 28
3.2.1 Tách chiết RNA 28
3.2.2 Điện di sản phẩm ly trích RNA 29
3.2.3 Xây dựng quy trình RT-PCR 30
3.2.3.1 Khảo sát độ đặc hiệu của primer 30
3.2.3.2 Xác định chu kỳ nhiệt tối ưu 30
3.2.3.3 Xác định nồng độ primer thích hợp 31
3.2.3.4 Xác định số chu kỳ tối ưu cho phản ứng RT-PCR 31
3.2.4 Điện di sản phẩm RT-PCR 31
3.2.5 Giải trình tự sản phẩm RT-PCR 32
3.2.6 Giám định chồi giống dứa 32

Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả ly trích RNA 33
4.2 Kết quả xây dựng quy trình RT-PCR 34
4.2.1 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của primer 34
4.2.2 Kết quả xác định chu kỳ nhiệt tối ưu 36
4.2.2 Kết quả xác định nồng độ primer thích hợp 38
4.2.3 Kết quả xác định số chu kỳ tối ưu cho phản ứng RT-PCR. 39
4.3 Kết quả kiểm tra sản phẩm RT-PCR bằng phương pháp giải trình tự 42
4.4 Kết quả giám định chồi giống dứa 46

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết luận. 49
5.2 Đề nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 53


7


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT



bp : base pair
cDNA : Complementary deoxyribonucleic acid
dNTP : Deoxyribonucleotide triphophate

ddNTP : Dideoxyribonucleotide triphophate
DNA : Deoxyribo nucleic acid
ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
HSP 70 : Heat shock protein 70
mRNA : messenger Ribonucleic acid
NCBI : National Center for Biotechnology Information
Nu : Nucleotide
PCR : Polymerase Chain Reaction
PCV : Pineapple Closterovirus
PMWaV-1 : Pineapple mealybug wilt associated virus – 1
RNA : Ribonucleic acid
RT-PCR : Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
TBIA : Tissue Blotting Immuno Assay
Taq-polymerase : Thermos aquaticus - polymerase
Tm : Melting temperature

8




DANH SÁCH CÁC BẢNG


BẢNG TRANG

Bảng 3.1: Các chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR được khảo sát 30
Bảng 4.1: Các đặc tính cơ bản của cặp primer 225, 226 34
Bảng 4.2: Các cấu trúc thứ cấp mang năng lượng tự do thấp nhất 35
Bảng 4.3: Kết quả phân tích BLAST của 2 primer 225, 226 36
Bảng 4.4: Trình tự của sản phẩm RT-PCR 42
Bảng 4.5: Kết quả so sánh trình tự của sản phẩm RT-PCR 44
Bảng 4.6: Kết quả phân tích BLAST của 2 trình tự D1, D2 46
Bảng 4.7: Tổng kết giám định PMWaV-1 trên chồi dứa 47

9





DANH SÁCH CÁC HÌNH


HÌNH TRANG

Hình 2.1: Cây dứa 3
Hình 2.2: Dứa Cayenne 7
Hình 2.3: Cây dứa Cayenne bị héo đỏ đầu lá 10

Hình 2.4: Quả của cây dứa bị héo đỏ đầu lá 10
Hình 2.5: Rệp xám (Dysmicoccus neobrevipes), rệp hồng (Dysmicoccus
brevipes) và vị trí thường gặp của chúng trên cây dứa 11
Hình 2.6: Sự cộng sinh của kiến đầu to (Pheidole megacephala) với rệp sáp 12
Hình 2.7: Phản ứng PCR 18
Hình 2.8: Phản ứng RT-PCR 22
Hình 3.1: Mẫu chồi giống dứa Cayenne thương phẩm 25
Hình 3.2: Sơ đồ phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gene HSP 70
của PMWaV-1 bằng cặp primer 225, 226 27
Hình 3.3: Thang DNA 28
Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm ly trích RNA 33
Hình 4.2: Sản phẩm RT-PCR của 5 chu trình nhiệt 37
Hình 4.3: Kết quả khảo sát nồng độ primer thích hợp 39
Hình 4.4: Kết quả khảo sát số chu kỳ RT-PCR thích hợp 40
Hình 4.5: Sơ đồ phản ứng RT-PCR phát hiện PMWaV-1 41
Hình 4.6: Kết quả giám định PMWaV-1 trên 10 mẫu chồi dứa Thái Lan 47







10
Phần 1: MỞ ĐẦU

1.1

Đặt vấn đề
Cây dứa (

Ananas comosus
) là loại cây ăn quả nhiệt đới rất được ưa chuộng
trên thế giới. Ngoài giá trị dinh dưỡng và hàm lượng vitamin cao, cây dứa còn được
xem là hoàng hậu của các loại quả vì có hương vị thơm ngon và rất hợp khẩu vị của
người phương Tây. Bên cạnh đó, dứa còn được dùng làm nguyên liệu cho rất nhiều
sản phẩm chế biến: dứa hộp, dứa khoanh, nước dứa cô đặc, điều chế bromelin nên
hiện nay, dứa đang được xem là một loại cây ăn quả có giá trị kinh tế cao. Về mặt
trồng trọt, cây dứa vốn không kén đất, các vùng gò, đồi, đất xấu, nghèo dinh
dưỡng đều có thể trồng dứa. Vì vậy ở nước ta, từ những vùng đồi khô hạn đến các
vùng chịu nhiều thiên tai, gió bão, nắng nóng, từ vùng trung du bán sơn địa ở miền
Bắc đến những vùng đất nhiễm phèn, chua, mặn ở miền Nam đâu đâu cũng trồng
được dứa.
Chính vì vừa là một loại cây công nghiệp có giá trị cao, vừa thích hợp phát
triển qui mô ở những vùng đất xấu, kén cây trồng nên có thể nói, đối với nước ta cây
dứa chứa đựng một tiềm năng kinh tế - xã hội rất lớn. Trong các giống dứa chính,
cây dứa Cayenne mang nhiều đặc điểm phù hợp với công nghệ chế biến đồ hộp (quả
lớn, mắt cạn, cùi nhỏ) nên đang được trồng rất phổ biến trên thế giới. Hiện nay, dứa
Cayenne chiếm 80% diện tích trồng dứa trên toàn thế cầu. Ở nước ta, do trước đây
dứa Cayenne ít được trồng phổ biến nên từ năm 1998 đến nay, Chính phủ và các địa
phương đã đầu tư nhiều tỷ đồng để nhập chồi dứa Cayenne từ Trung Quốc, Thái
Lan nhằm tăng diện tích trồng dứa, mở rộng các vùng dứa nguyên liệu cho chế
biến trong nước. Ở miền Nam, cây dứa nói chung và dứa Cayenne nói riêng đang
nằm trong chương trình cung cấp giống cây, con chất lượng cao của Sở Nông
Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn thành phố Hồ Chí Minh. Tuy nhiên, cây dứa
Cayenne có nhược điểm chính là có nhiều sâu bệnh phá hoại, đặc biệt là khả năng
nhiễm bệnh wilt - bệnh héo đỏ đầu lá rất cao.