tiểu luận hóa sinh chuyển gen thực vật

Mở Đầu
Các kỹ thuật sinh học truyền thống nh kỹ thuật lai chọn giống đã đợc
con ngời sử dụng hàng ngàn năm qua để tạo ra các cây trồng có đặc tính riêng
biệt. Tuy nhiên, những kỹ thuật này đòi hỏi nhiều thời gian và có thể phải trải
qua nhiều thế hệ mới có đợc những tính trạng mong muốn và loại bỏ những đặc
tính không cần thiết. Công nghệ sinh học sử dụng các kỹ thuật di truyền để
biến đổi cây trồng bằng cách đa những gen có giá trị vào bộ gen của cây nhận
(thậm chí kể cả gen của các loài vốn không có quan hệ họ hàng) và nhanh chóng
tạo ra các cây trồng biến đổi di truyền (Genetically Modified). Một trong những
kỹ thuật đợc áp dụng là chuyển gen ở thực vật nhờ phơng pháp biến nạp
(transformation). Có rất nhiều phơng pháp chuyển gen đợc nghiên cứu và áp
dụng thành công nh phơng pháp bắn gen, phơng pháp vi tiêm, phơng pháp
chuyển gen nhờ xung điện, hoá chất Ngoài ra, việc phát hiện ra vi khuẩn
Agrobacterium có khả năng chuyển một phần gen vào tế bào cây chủ đã có ý
nghĩa rất to lớn trong công cuộc tạo ra những giống cây trồng mang đặc tính
mong muốn.
Kỹ thuật chuyển gen thông qua Agrobacterium và ứng dụng
Giới thiệu về vi khuẩn Agrobacterium
Vi khuẩn đất có tên khoa học là Agrobacterium (A. tumefaciens, A.
rhizogens) khi bị dẫn dụ tới và tiếp xúc các vết thơng thực vật, chuyển nạp
một đoạn ADN (T-ADN) từ Ti-plasmit của nó vào nhân của tế bào vật chủ
(Nguyễn Văn Uyển, 1995). Tiếp theo các tế bào thực vật này hình thành
khối u do các gen onc của T-ADN sau khi gắn vào genom thực vật đã mã
hoá sinh tổng hợp auxin và cytokinin là các chất gây nên sự phân chia tế
bào liên tục. Ngoài ra, T-ADN còn đợc chuyển nạp vào nhiễm sắc thể thực
vật có chứa gen mã hoá sinh tổng hợp chất opine. Các chất opine không đợc
tổng hợp trong Agrobacterium mà chỉ đợc tổng hợp trong tế bào vật chủ vì
đoạn gen điều khiển biểu hiện các gen sinh tổng hợp opine chỉ hoạt động
trong tế bào nhân chuẩn. Đây chính là yếu tố chỉ thị sự biến nạp của T-
ADN (Lê Trần Bình & CS, 1997).
Dựa trên tính chất sinh học trên của Agrobacterium, ngời ta đã sử

dụng nó nh là một hệ thống chuyển gen hữu hiệu. Hai công trình đầu tiên
thông báo về khả năng phát triển Agrobacterium để chuyển gen ở thực vật
là công trình về chuyển T-ADN vào tế bào trần của thuốc lá (Lê Trần Bình
& CS, 2003) và công trình về chuyển một đoạn ADN ngoại lai (Tn7) gắn
trong T-ADN vào thực vật thông qua Agrobacterium (Nguyễn Văn Uyển,
1995). Ngày nay Ti plasmit trở thành một vector chuyển gen lợi hại vì kích
thớc đã đợc thu nhỏ lại và cắt bỏ các thành phần bất lợi nh các gen onc,
opine và đợc bổ xung trong vùng giữa hai đầu biên của T-ADN một đoạn
1
ADN gắn kết đa điểm và các gen chọn lọc dành cho tế bào thực vật. Tại
đoạn gắn kết đa điểm ngời ta có thể lắp ráp các gen quan trọng cần đa vào
thực vật (Vijayachandra at al., 1995).
Các nhà nghiên cứu đã xây dựng nhiều qui trình chuyển gen thông
qua A. tumefeciens vào rất nhiều loại cây trồng nh đậu tơng, bông, ngô, lúa
mì, (Briew at al., 2000; James at al., 2003; lúa (Hiei at al., 1994; Komari at
al., 1996) So với kỹ thuật chuyển gen trực tiếp thì tần suất biến nạp gen
thông qua Agrobacterium cao hơn nhờ có cơ chế chuyển nạp T-ADN và tái
tổ hợp với ADN của tế bào vật chủ. Hơn thế nữa, lợng copy gen biến nạp ít,
tạo thuận lợi trong phân tích cây chuyển gen. Việc sử dụng Agrobacterium
để chuyển gen đơn giản và tiện lợi hơn so với bắn gen, dùng sung điện, dùng
PEG. Trong kỹ thuật dùng sung điện hay PEG thì việc tạo và nuôi tế bào
trần đòi hỏi nhiều công sức và thời gian. Còn trong chuyển gen bằng kỹ
thuật bắn gen thì cần phải có phơng tiện bắn gen, ngoài ra, thờng không
khống chế đợc lợng copy gen chuyển vào.Vì vậy trong việc phân tích và theo
dõi cây chuyển gen ở các thế hệ sau gặp nhiều khó khăn (Lê Trần Bình &
CS, 1997, 2003; Briew at al.,2000).
Cấu trúc của Ti - Plasmit
Sự phát hiện ra A. tumefaciens mang một cấu trúc di truyền ngoài
nhiễm sắc thể chứa gen liên quan đến sự hình thành khối u (Zaenen at al.,
1974). Song họ chỉ nghĩ rằng đó là bản sao của một loại virus xâm thực vi

khuẩn. Thực tế nhân tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể này chính là một
plasmid khổng lồ (Ti-plasmid) có khả năng hình thành khối u ở cây chủ mà
vi khuẩn xâm nhập.
Ti-plasmid là một đoạn phân tử ADN mạch vòng, sợi kép có trọng l-
ợng phân tử bằng 3-5% so với trọng lợng phân tử của nhiễm sắc thể vi
khuẩn. Với kích thớc khoảng 200kb, trong tế bào chúng tồn tại nh một đơn
vị sao chép độc lập.
Mặc dù đợc tách ở các chủng Agrobacterium khác nhau, song tất cả
Ti-plasmd qua phân tích di truyền cho thấy, chúng đều chứa đựng ba vùng
quan trọng. Vùng T-ADN và vùng vir (virulence) có liên quan trực tiếp đến
sự hình thành khối u. Vùng còn lại là vùng dị hoá opine (opine catabolism
region) (Vijayachandra at al., 1995; Cannon at al., 1997).
2
Hình: cấu trúc Ti-plasmid
Cấu trúc và chức năng của vùng T-ADN
Nghiên cứu trình tự gen trên vùng T-ADN ở các Ti-plasmit khác
nhau ngời ta thấy rằng T-ADN đợc giới hạn bởi các đoạn trình tự lặp lại
gần nh hoàn toàn khoảng 25 bp đợc gọi là đoạn đầu biên (T-ADN border
sequence). Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyển T-ADN vào
tế bào thực vật. ở đoạn đầu biên bên phải có chứa yếu tố cis, cần thiết cho
quá trình chuyển T-ADN vào tế bào cây chủ. Đoạn đầu biên bên trái giữ vai
trò để quá trình chuyển T-ADN kết thúc bình thờng. T-ADN mang rất
nhiều gen và biểu hiện trong quá trình chuyển hoá của tế bào thực vật. Các
phân tích trình tự gen trên T-ADN cho thấy T-ADN cũng mang các dấu
hiệu khởi đầu phiên mã (hộp TATA) và kết thúc phiên mã (hộp AATAAA).
Gen tồn tại trên T-ADN đợc chia làm hai hệ chính (Hooykaas at al., 1992)
+ Hệ thứ nhất là gen gây ung th onc, gen này mã hoá sinh tổng hợp
auxin và cytokinin, kết quả làm cho các tế bào phân chia liên tục và biến
đổi hình dạng tạo ra các nốt sần trên cây.
+ Hệ gen thứ hai mã hoá cho các enzim cần thiết trong quá trình

tổng hợp opine. Vi khuẩn sử dụng opine làm nguồn năng lợng cung cấp
cacbon và nitơ. Dạng opine đợc tổng hợp trong khối u có thể là nopaline,
octopine, agropine, manopine và agrocinopine phụ thuộc vào các chủ
Agrobacterium sinh ra khối u ban đầu. Đây cũng là cơ sở để phân loại các
chủng Agrobacterium.
3
Vùng các gen độc tố của Ti-plasmit
Vùng các gen độc tố (vir) phụ trách quá trình gây cảm ứng tạo đoạn
T-ADN và vận chuyển T-ADN tới nhân tế bào vật chủ. Có tới 24 gen vir
nằm trong vùng này của Ti-plasmit dạng octopine. Các gen này đợc bố trí
trong 8 operon ký hiệu virA đến virH, tạo thành cấu trúc regulon (Hooykaas at
al., 1992).
Sự biểu hiện của các gen vir đợc điều khiển bởi hệ thồng gồm hai
thành phần là protein VirA và protein VirG. Protein VirA là định vị trên
màng tế bào, nó có khả năng tự phosphoryl hoá ở gốc histidine 474 và gốc
photphat này đợc chuyển tới protein VirG. Sau đó protein VirG hoạt hoá sự
phiên mã của các gen vir khác.
Tuy nhiên các hoạt động cần thiết cho quá trình tạo T-ADN và hình
thành phức hợp T (T- complex) là do các gen virC, virD và virE điều khiển.
Operon của virD mã hoá sinh tổng hợp 4 protein VirD1, VirD2, VirD3 và
VirD4. VirD2 là một endonuclease có chức năng nhận biết và làm đứt gẫy
T-ADN tại vùng đầu biên cùng với sự có mặt của VirD1. Đoạn ADN "định
vị nhân" trong gen virD2 giúp cho sự định hớng của phức hợp T tới nhân tế
bào thực vật. Hai protein VirC1 và VirC2 đợc mã hoá bởi locus virC,
protein VirC1 giữ vai trò thúc đẩy sự tạo thành T-ADN nhờ sự liên kết với
trình tự đoạn gia tốc (overdrive), operon virE mã hoá sinh tổng hợp protein
VirE1 và VirE2. VirE2 liên kết với T-ADN ở một đoạn không đặc hiệu, có
chức năng giữ cho T-ADN không bị đứt gẫy. Hơn thế nữa VirE2 giữ cho T-
ADN có cấu trúc thẳng không bị gấp quấn và đoạn "định vị nhân" VirE2
đã giúp cho sự vận chuyển của phức hợp T tới nhân tế bào thực vật.

Có thể nói locus lớn nhất trong vùng vir là virB , mã hoá cho 11
protein từ VirB1-VirB11. Một số trong những protein này nằm trên màng
và dờng nh chúng tạo ra các lỗ màng cần thiết cho quá trình vận chuyển
phức hợp T vào trong tế bào thực vật .
Hệ vector nhị thể
Kích thớc lớn của Ti-plasmit gây không ít khó khăn trong chuyển nạp
gen thông qua Agrobacterium. Mặt khác các enzim giới hạn có thể cắt ADN
của Ti-plasmit ở nhiều chỗ khác nhau, trong khi đó công nghệ gen lại cần
những có vị trí cắt duy nhất cho hoạt động của một số enzim giới hạn (Lê
Trần Bình & CS, 1997, 2003; Bùi Bảo Hoàn,1993; Briew at al., 2000). Ngoài
ra mặc dù các gen onc đợc dùng làm chỉ thị chọn lọc có tính trội, nhng
chúng lại cản trở quá trình tái sinh bình thờng ở thực vật (Cannon at al.,
1997).
Với các lí do trên đây, các nhà khoa học đã cải tiến Ti-plasmid thành
một hệ vector nhị thể gồm có vector chuyển gen (Ti-plasmid tái tổ hợp) và
vector bổ trợ (helper Ti-plasmid) (Lê Trần Bình & CS, 1997, 2003).
4
- Vector chuyển gen: Có cấu trúc từ Ti-plasmid với đoạn T-DNA đợc
cắt bỏ hết các gen không cần thiết nh gen onc và gen tổng hợp opine ở giữa
hai trình tự biên trái (T-border left) và biên phải (T-border right), gắn thêm
một số thành phần tạo ra cấu trúc mới gồm: i) các replicon để ADN plasmid
có thể vừa tự nhân trong cả E. coli và Agrobacterium; ii) các gen chọn lọc,
gen đánh dấu và iii) vùng có chứa nhiều điểm cắt của các enzim giới hạn
nằm ở giữa hai trình tự biên trái (T-border left) và biên phải để chèn gen
mong muốn.
- Vector bổ trợ: cấu trúc gồm các gen vir đợc tách và đa vào chung một
plasmit đảm nhiệm chức năng vận chuyển vào tế bào thực vật. Plasmit này
đợc cải tiến loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối u,
những vẫn duy khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật.
Hai cấu trúc này cùng đợc đa vào Agrobacterium, Khi các gen trên

vector bổ trợ hoạt động thì các sản phẩm của nó sẽ tác động tới đoạn T-
DNA trên vector chuyển gen dẫn đến sự chuyển đoạn T-DNA sang tế bào
thực vật.
Cơ chế chuyển gen của Agrobacterium
Quá trình chuyển nạp đoạn T-DNA từ Agrobacterium vào tế bào thực
vật bao gồm các giai đoạn: Hớng hoá của Agrobacterium tới tế bào thực vật
bị thơng; tiếp gắn với tế bào thực vật; cảm ứng các gen vir để tạo ra T-
DNA ; tạo phức hợp T, chuyển vận phức hợp T vào tế bào thực vật và gắn T-
DNA vào genom thực vật (Vijayachandra at al., 1995).
Quá trình hớng hoá
Các chủng A. tumefaciens rất hớng động và bị dẫn dụ về phía acid
amin và các loại đờng nh: saccarose, glucose, fructose có trong tế bào thực
vật bị thơng (Vijayachandra at al., 1995).
Quá trình gắn Agrobacterium với tế bào thực vật
Quá trình này xảy ra nhờ các thụ quan bề mặt tế bào thực vật dành
riêng đối với các phân tử bề mặt của Agrobacterium. Trong quá trình tiếp
xúc, Agrobacterium tạo ra các sợi cellulose và các sợi này kết tụ thành bó
gắn lên bề mặt tế bào thực vật.
Sự cảm ứng của các gen vir
Sau khi nhận đợc các phân tử tín hiệu từ thực vật, quá trình cảm ứng
của các gen vir xảy ra nhờ hệ thống truyền cảm ứng bao gồm 2 yếu tố là
protein VirA và protein VirG. Ngoài các phân tủ gây tín hiệu từ vết thơng
thực vật nh các chất phenol vàng đơn, flavonoid và đờng đơn còn có các tín
hiệu khác nh pH acid, đói phosphat và opine cũng có tín hiệu gây cảm ứng
các gen vir (Valuthambi at al., 1989).
5
Protein VirA định vị trên màng tế bào chất của vi khuẩn, có khả năng
cảm nhận những phân tử tín hiệu và tự phosphoryl hoá. Sụ phosphoryl hoá
VirA đã chuyển nhóm phosphat của nó tới VirG. VirG đợc phosphoryl hoá
đóng vai trò nh là một chất hoạt hoá sự phiên mã của tất cả các gen vir dới

hình thức gắn nó vào một đoạn gồm 12 bp gọi là hộp vir (vir boxes). Hầu hết
những hộp vir đều đợc tìm thấy ở tất cả các đoạn khởi động của các gen vir.
Sự hình thành T phức hợp vận chuyển T-DNA
Chính các sản phẩm protein của gen vir đã làm nhiệm vụ chế biến T-
DNA. Sản phẩm của gen virD2 là một endonuclease, nó nhận biết trình tự
đầu biên bên phải tại base thứ 3 hoăch thứ 4 tính tử trái sang và tách T-
DNA thành hai mạch đơn. Một mạch đơn sẽ đợc chuyển sang tế bào thực
vật với đầu 5
,
đi trớc. Đoạn mạch đơn còn lại trên Ti-plasmid sẽ đợc làm
khuôn để tổng hợp lên mạch DNA bổ trợ mới. Trong quá trình di chuyển sợi
đơn DNA phải chui qua rất nhiều màng trớc khi vào đợc đến nhân tế bào
thực vật. Vì vậy, để tránh đứt gãy T-DNA sợi đơn gắn với protein virE. Sản
phẩm gen virD2 liên kết hoá trị với đầu 5
,
của sợi T-DNA đơn và liên kết
cộng hoá trị với gen VirE trên T-DNA tạo ra phức hợp T (Vijayachandra at
al., 1994).
Chuyển vận phức hợp T tới tế bào thực vật
T-DNA đợc chuyển vận tới tế bào thực vật dới dạng phức hợp T và
hoạt tính của nucleotid đợc bảo vệ trong cả Agrobacterium và tế bào thực
vật. Dây truyền vận chuyển phức hợp T là các protein đợc mã hoá từ các
gen virB. Các sản phẩm của virB1, virB2, virB3, virB5, virB7, virB9,virB1
và virB10 có cấu trúc cần thiết cho việc liên kết màng. Sản phẩm của
virB11 nằm bên trong màng có khả năng liên kết với ATP, có hoạt tính
ATPase và tự động phosphoryl hoá. nên có thể cung cấp năng lợng cho quá
trình vận chuyển T-DNA qua màng tế bào. Hoạt tính không gấp lại
(unfoldase) của sản phẩm gen virE giữ cho T-DNA có cấu trúc thẳng không
bị gấp quấn tạo điều kiện dễ dàng cho quá trình vận chuyển của nó qua
phức hợp của lỗ màng (Vijayachandra at al., 1995)

Hớng nhân của phức hợp T và gắn T-DNA vào genom thực vật
Có một số bằng chứng chứng tỏ T-DNA đợc vận chuyển tới nhân tế
bào thực vật và gắn hoá trị vào genom thực vật. Việc định hớng tới nhân
của T-DNA cũng nh gắn nó với genom thực vật xảy ra dễ dàng là nhờ có
đoạn định vị nhân của các sản phẩm virD2 và virE2 trong phức hợp T.
Sau khi đợc gắn vào genom thực vật T-DNA đợc phiên mã nhờ RNA
polymeraseII (Wilmitzer at al., 1995).
6
Hình 1: Cơ chế chuyển gen của Agrobacterium vào tế bào thực vật: A-mật độ
VirA tăng lên nhanh chóng dới sự kích thích của hợp chất dạng phenol.
VirA kích hoạt VirG thông qua cơ chế phosphoryl hoá và VirG lại hoạt hoá
các protein khác; B-VirD là một loại endonuclease; C-VirE là một protein
bám vào DNA sợi đơn ; D-VirB hoạt động nh một cầu nối tiếp hợp giữa
Agrobacterium và tế bào thực vật [2].
Các yếu tố ảnh tố ảnh hởng lên quá trình chuyển gen thông qua
Agrobacteirum
7
Phổ vật chủ của Agrobacteirum đợc xác định là rất rộng, song hiệu
quả biến nạp gen lại không giống nhau ở các cây chủ khác nhau. ở cây hia
lá mầm có tần suất chuyển nạp gen cao hơn nhiều so với cây một lá mầm.
Ngay cả trong cùng một loài thực vật nh ở lúa tần suất biến nạp gen khác
nhau phụ thuộc vào thứ, giống (Briew at al., 2000).
Hiệu quả biến nạp gen thông qua Agrobacterium ở thực vật phụ thuộc
vào một số yếu tố nh tiền xử lý mô thực vật, nguồn vật liệu gây nhiễm, nồng
độ vi khuẩn và thời gian nuôi nhiễm và đặc biệt là khả năng tái sinh của
thực vật sau biến nạp. Vì vậy, trong thí nghiệm chuyển gen, việc đầu tiên là
tìm vật liệu thích hợp và nghiên cứu xây dựng hệ thống nuôi cấy tối u để
nâng cao hệ số tái sinh cây lên cao nhất.
Thời gian nuôi nhiễm cũng ảnh hởng đến tần suất biến nạp, ở lúa thời
gian nuôi nhiễm từ 2-3 ngày là lý tởng nhất (Hiei at al., 1994). An & CS

thấy rằng nồng độ vi khuẩn cao 10
10
/ml tăng hiệu quả biến nạp gen hơn
nồng độ thấp 10
6
/ml đợc thấy ở thuốc lá và Arabidopsis. Tuy nhiên, nồng độ
vi khuẩn không ảnh hởng đến hiệu quả biến nạp gen ở Petunia .
Biết rằng nếu tăng hiệu quả biểu hiện của gen vir sẽ cải thiện hiệu
quả biến nạp gen của Agrobacteirum. Tăng khả năng biểu hiện của gen vir
đạt đợc bằng cách gây tiền cảm ứng vi khuẩn với acetosyringone (AS) hoặc
AS + opine. Tiền xử lý mô lá trên môi trờng chứa AS đã làm tăng tần suất
biến nạp gen ở cây thuốc lá. Bổ xung AS vào môi trờng nuôi nhiễm và môi
trờng cộng sinh cũng ảnh ảnh hởng tới hiệu quả chuyển gen của
Agrobacteirum. Ngoài ra các nhân tố pH, nồng độ phosphat trong môi trờng
và nhiệt độ nuôi cấy cũng ảnh hởng trực tiếp tới sự chuyển nạp T-DNA vào
tế bào thực vật thông qua cảm ứng gen vir. pH tối thích cho cảm ứng gen
vir dao động khoảng từ 5,25 5,80 phụ thuộc vào chủng Agrobacteirum.
Khả năng cảm ứng gen vir tăng khi nồng độ phosphat trong môi trờng thấp.
Nhiệt độ thích hợp cho sự cảm ứng gen vir là từ 25-28
0
C, ở nhiệt độ thấp
dẫn đến làm mất Ti-plasmid ở các chủng Agrobacteirum, ở nhiệt độ cao
cũng làm giảm chức năng của các gen vir (Vijayachandra at al., 1995).
Một số kết quả đã đạt đợc trong nghiên cứu và thực tế sản xuất vấn
đề này
Việt Nam
ở Việt Nam, lĩnh vực chuyển gen tạo sinh vật biến đổi di truyền còn
rất chậm so với thế giới. Do diều kiện còn hạn chế nên nghiên cứu về cây
trồng chuyển gen còn ít. Gần đây với sự đầu t của Nhà nớc trong việc xây
dựng tiềm lực cán bộ và phòng thí nghiệm chúng ta đã làm chủ đợc các kỹ

thuật cơ bản và triển khai đợc các nghiên cứu làm cơ sở để tạo các sinh vật
biến đổi di truyền . Nhiều gen quý có giá trị ứng dụng nh năng suất, chất l-
ợng, chống chịu đã đợc phân lập và nghiên cứu nhằm chuyển vào cây trồng
8
(nh gen Bt, gen ức chế trypsin để trừ sâu, gen Xa21, gen chịu lạnh, gen
protein giàu tryptoan )(Lê Trần Bình &CS, 1997).
Bằng phơng pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn
A.tumefaciens đã có một số kết quả công bố: gen kháng sâu cry1Ab và
cry1Ac đã đợc chuyển vào cây trồng (Nguyễn Thị Hồng Châu & CS, 2003;
Trần Thị Cúc Hoà & CS, 2004); gen nptII và anti-ACO kéo dài tuổi thọ của
hoa cắt (Nguyễn Thị Lan Hoa & CS); gen Xa21 kháng bệnh bạc lá lúa và
cry đã đợc chuyển vào giống lúa C71 (Lê Thị Muội & CS, 2000) , và gen
chọn lọc nh gen kháng kanamycin, hygromycine, gen mã hoá -
glucuronidase (gus) đợc chuyển vào cây trồng nhằm mục đích hoàn thiện
quy trình, làm cơ sở chuyển gen có giá trị cho các đối tợng cây trồng.
Kết quả của những nghiên cứu trên là những cây chuyển gen đã đợc
tạo ra và lu giữ trong điều kiện phòng thí nghiệm và trong điều kiện nhà
kính. Những cây trồng này đang đợc thử nghiệm từ khi có quy chế quản lý
về an toàn sinh học đối với các sinh vật biến đổi gen; sản phẩm, hàng hoá có
nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen (văn bản số 212/2005/QĐ-TTg ngày 26
tháng 8 năm 2005 của thủ tớng chính phủ).
Trên thế giới
Trên đối tợng thực vật, việc áp dụng công nghệ GM phải mất một thời
gian dài mới thu đợc thành công. Những thí nghiệm chuyển gen đầu tiên
đã sử dụng vi khuẩn A.tumefaciens để đa gen ADH của nấm men và gen
kháng kanamycine vào cây thuốc lá (Horsch et al., 1984). Đến nay, rất
nhiều loài cây trồng đã đợc chuyển gen thành công, nh cà chua, khoai tây,
cải, hớng dơng, da hấu, khoai lang (James, 1997; Wu, 1998) sử dụng những
phơng pháp phổ biến nh thông qua A.tumefaciens, xung điện, PEG, bắn
gen. Các nghiên cứu không chỉ dừng ở việc hoàn thiện các phơng pháp và

thực hiện chuyển gen thành công cho nhiều đối tợng cây trồng mà còn đi
sâu tìm hiểu các biện pháp làm tăng cờng hiệu quả chuyển gen cũng nh
hiệu quả biểu hiện của gen có giá trị trong cây trồng GM nh sử dụng những
đoạn khởi động mạnh để điều khiển gen, cắt bớt gen và biến đổi mã di
truyền của chúng cho phù hợp với thực vật Nhiều nhóm nghiên cứu đã
tiến hành tổng hợp nhân tạo một phần hoặc toàn phần gen có giá trị và sử
dụng các mã di truyền phù hợp với từng loại cây trồng nhất định (Perlak at
al., 1991; Adang at al., 1993; Altosaar, at al., 1997). Với những cải biến đa
dạng, hiệu quả chuyển gen và mức độ biểu hiện của hàng loạt gen có giá trị
trong cây trồng GM đã tăng lên rất nhiều.
Nhờ công nghệ GM, các gen có giá trị nông học có thể dễ dàng đợc
chuyển vào bộ gen thực vật và đợc điều khiển biểu hiện ở những mô, cơ
quan đặc biệt trong những giai đoạn phát triển nhất định. Số lợng gen đợc
tách dòng, đa vào vector thích hợp để chuyển vào cây trồng ngày một nhiều
và sản phẩm của quá trình chuyển gen là hàng loạt cây trồng mang những
9
đặc tính mong muốn nh: nhóm gen kháng côn trùng, nhóm gen cry tự nhiên
đợc phát hiện sớm, cải biến và biểu hiện trong hàng loạt cây trồng nh: cây
thuốc lá, cà chua (1987), ngô (1989), lúa (1990), khoai tây (1992), cải dầu và
đậu tơng (1994) (Lê Thu Hiền, 2003). Ngô, bông mang gen cry là những
cây chuyển gen đầu tiên đợc trồng đại trà và thơng mại hoá tại Mỹ. Gần
đây nhiều nhóm nghiên cứu thuộc công ty Syngenta đã chuyển gen kháng
sâu vip vào cây bông và hiện đang đợc tiến hành trồng thử nghiệm ở Mỹ.
Ngoài các gen Bt, một số gen kháng sâu khác nh gen tạo protein
inhibitor, gen tạo -amylase inhibitor, lectin và chitinase cũng đợc chuyển
thành công vào lúa, thuốc lá giúp cây trồng kháng lại côn trùng Bộ cánh
vảy (Lê Trần Bình & CS, 2003).
Năm 1994 là măm đánh dấu cây trồng GM đầu tiên (cà chua Flavr
Savr) có mặt trên thị trờng thực phẩm Hoa Kỳ (Chrispeels, Sadava, 2002).
Từ đó đến nay số lợng và chủng loại đã tăng lên nhanh chóng. Theo thông

báo tóm tắt của tổ chức ISAAA (International Service for the Acquisition of
the AgriBiotech Applications) trong giai đoạn 1986-1997, trên toàn cầu có
tới 25000 thử nghiệm trên đồng ruộng đối với các cây trồng biến đổi di
truyền. Trong đó, 72% các cuộc thử nghiệm đợc tiến hành tại Mỹ, tiếp đến
là Canada, châu âu, châu Mỹ la tinh và châu á. Các thử nghiệm này tập
trung vào 10 loại tính trạng trên đối tợng là 60 loại cây trồng (Lê Trần Bình
& CS, 2003).
Năm 2003, diện tích trồng cây chuyển gen tiếp tục tăng với tỉ lệ hơn
15% so với năm 2002. Theo đánh giá diện tích trồng cây chuyển gen toàn
cầu năm 2003 là 67,7 triệu ha tăng 40 lần so với năm 1996 là 1,7 triệu ha.
Thu hút khoảng 7 triệu nông dân ở 18 nớc tham gia. Có 5 quốc gia chính
trồng cây chuyển gen là Mỹ (48,2 triệu ha), Argentina (13,9 triệu ha),
Canada (4,4 triệu ha) và Braxin (3 triệu ha) Trung Quốc 2,8 triệu ha. Trong
đó Braxin là nớc lần đầu tiên tham gia trồng thử nghiệm và thơng mại hoá
cây chuyển gen trên diện tích 3 triệu hecta đứng hàng thứ 4 trên thế giới .
Nhìn chung, những cây trồng chuyển gen chính đợc trồng và thơng
mại hoá là đậu tơng (36,5 triệu hecta), ngô (12,4), bông (6,8), và cải dầu (3).
Trong đó, hai tính trạng đợc tập trung chuyển gen nhiều nhất là kháng
thuốc diệt cỏ và kháng côn trùng. Vào năm 2003, diện tích trồng cây chuyển
gen kháng thuốc diệt cỏ là 44,2 triệu hecta (73%) chủ yếu là cây ngô, đậu t-
ơng, bông và 12,2 triệu hecta (18%) trồng cây chuyển gen kháng sâu, tăng
2,1 triệu hecta so với năm 2002 tập trung chủ yếu và hai loại cây trồng là
bông và ngô Bt. Ngoài ra một số thử nghiệm nhỏ trồng cây du đủ, bí chuyển
gen kháng virus và một số tính trạng khác (Jame, 2003).
Định lợng DNA bằng phơng pháp diphenylamin
10
Nguyên tắc
Khi đun nóng dung dịc ADN với thuốc thử diphenylamin tạo thành
phức chất màu xanh da trời có độ hấp phụ ánh sáng cực đại ở = 595 nm.
Nguyên liệu và hóa chất

Dung dịch ADN cần xác định hàm lợng, dung dịc ADN tinh khiết có
hàm lợng 500àg/ml, HClO
4
0,5 N, TCA 5%, H
2
SO
4
5%, thuốc thử
diphenylamin (C
12
H
11
N).
Thiết bị
Nồi cách thuỷ (100
o
C), máy so màu quang điện.
Tiến hành
Cho vào ống nghiệm 2ml dung dịch ADN, 10 ml HClO
4
0,5 N (hoặc
TCA 5%), lắc đều, đậy kín ống nghiệp và đặt vào nồi cách thuỷ đang sôi
trong 30 phút để thuỷ phân ADN, sau đó làm nguội dung dịch.
Hút 2 ml ADN đã đợc thuỷ phân cho vào ống nghiệm, bổ xung 4 ml
thuốc thử diphenylamin, đặt vào nồi cách thuỷ đang sôi 20 phút sẽ thu đợc
dung dịch màu xanh da trời, để nguội và đo độ hấp phụ ánh sáng trên máy
soa màu với kính lọc ánh sáng đỏ ( = 595 nm). Từ số đọc về mật độ quang
học thu đợc, dựa vào đồ thị chuẩn ADN tính ra lợng ADN trong mẫu.
Xây đựng đồ thị chuẩn ADN: từ dung dịch gốc ADN tinh khiết có
nồng độ xác định tiến hành pha loãng để có nồng độ 50, 100, 200, 300, 400

và 500 àg/ml. Sau đó lấy từ mỗi nồng độ ra 2ml và tiến hành thí nghiệm
nh với dung dịch ADN mẫu ở trên. Dựng đồ thị tơng quan giữa mật độ
quang học và nồng độ ADN tơng ứng.
Từ số đọc mật độ quang học thu đợc của dung dịch mẫu đối chiếu với
đồ thị chuẩn ADN tính ra lợng ADN trong mẫu.
Tài liệu tham khảo
Bùi Bảo Hoàn (1993) ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong bảo
quản nhân giống và chọn dòng chịu lạnh ở khoai lang (Ipomea batatas L.).
Luận văn Thạc sĩ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà nội.
Briew LO, Henrry RJ (2000) Transgenic Cereal. American Association of
Cereal Chemist St. Paul, Minnesota, USA, pp. 649-656.
Cannon RJC (1997) Bacillus thuringiensis use in agriculture: A
molecular perspective, Biol. Rev., 7I, pp. 561-636.
11
Chrispeels MJ, Sadava DE (2002) Plants, genes, and crop biotechnology.
Jones and Bartlett publishers, Sudbury, Massachusetts, USA.
Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T (1994) Efficient
transformation of rice (Oryza saltiva. L) mediated by Agrobacterium and
sequence analysis of the boudaries of the T-AND. Plant Jounal 6(2), pp.
271-282
Hooykaas PJ, Schiperoort RA (1992) Agrobacterium and plant gentic
engineering. Plant Mol Bio 19: 15-38
James Clive (2003) Preview: Global Status of Commercialized Transgenic
Crops. ISAAA Briefs No. 30. ISAAA, pp 3-4.
Komari T, Hiei, Y, Saito Y, Murai N, Kumarishiro (1996) Vectors
carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants
Lê Thị Muội, Lê Trần Bình và CS (2000) BC tổng kết đề tài
KHCN0201B: chọn lọc và đánh giá ở mức độ phân tử các dòng cây trồng tạo
đợc bằng công nghệ tế bào và công nghệ gen. Hà Nội.
Lê Thị Thu Hiền (2003) Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

mang gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng. Luận văn Tiến sĩ Sinh
học, tr. 33-3
Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997) Công nghệ sinh học
thực vật trong cải tiến giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, tr. 72-
74.
Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trơng Nam Hải, Lê
Quang Huấn (2003) áp dụng các kĩ thuật phân tử trong nghiên cứu tài
nguyên sinh vật Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Nguyễn Hồng châu, Nguyễn Phơng Thảo, Lê Trần Bình, Lê Thị
Muội, (2003) Chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens vào giống
lúa C71. Tạp chí công nghệ sinh học 1(2): 219-226.
Nguyễn Thị Cúc Hoà, Lê Trầ Bình, Bùi Bá Bổng (2004) Chuyể nạp gen
kháng sâu cry1Ab và cry1Ac vào các giống lúa bằng phơng pháp
Agrobacterium và chọn lọc mannose. Nông nghiệp và phát triển nông thôn-
số 6.
Nguyễn Thị Lan Hoa, Doãn Thị Hoà, Đặng Trọng Lơng, Vũ Đức
Quang, Phí Công Nguyên, Đăng Thị Minh Trang, Đỗ Minh Huy
(2003) Những kết quả bớc đầu chuyển gen ANTI-ACO vào cây hoa cúc.
Thông tin công nghệ sinh học ứng dụng.
Nguyễn Văn Uyển (1995), Những phơng pháp công nghệ sinh học thực
vật. Nhà xuất bản nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh. Tập 1
12
Valuthambi K, Krishnan M, Gould JH, Smith RH, Gelvin SB, (1989)
Opines stimulate the induction of the vir genes of the Agrobacterium
tumefaciens Ti-plasmid. J. Bacteriol. 171: 3696-3703.
Vijayachandra K, (1995) Development of Agrobacterium transformation
system for rice. Ph.D thesis Madurai Kamaraj Uni, India, pp. 1-13; 27-30.
Vijayachandra K, (1995) Development of Agrobacterium transformation
system for rice. Ph.D thesis Madurai Kamaraj Uni, India, pp. 1-13; 27-30.
Vijayachandra K, Palanichelvam K, Veluthambi K, (1994) Rice

scutellum induces Agrobacterium tumefaciens vir gen T strand genration.
Plant Mol Biol 29: 125-133.
Wilmitzer L, Schamalenbach W, Schell J, (1981) Nucl. Acids Res. 9:
4801-4812. cited from Vijayachandra K, (1995) Development of
Agrobacterium transformation system for rice. Ph. D thesis Madurai
Kamaraj Uni, India.
13