Tiểu luận một số phương pháp dùng để định lượng protein

Protein đóng vai trò rất quan trọng, là thành phần không thể thiếu trong mọi
hoạt động của cơ thể. Protein được tổng hợp từ nhiều nhóm nhỏ các amino axit, các
axit này liên kết với nhau tạo thành dạng chuỗi. Cơ thể con người có thể tự tổng
hợp và tạo ra các chuỗi axit amino, đó là những axit aminio không thể thiếu trong
mọi chế độ ăn uống của chúng ta (kể cả trong chế độ ăn kiêng). Trong tất cả các tế
bào của động, thực vật đều có chứa hàm lượng protein nhất định, số lượng và chất
lượng protein đều rất đa dạng, tuỳ thuộc vào từng loài khác nhau. Các thực phẩm
có chứa hàm lượng protein cao, có chứa đủ lượng amino axit rất cần thiết cho mọi
đối tượng. Chúng được xem như là các protein có lợi, có nhiều trong thịt, cá, trứng.
Ngược lại các loại thực phẩm có hàm lượng protein thấp, chứa một lượng nhỏ
amino axit, chúng thường có nhiều trong các loại thực vật như đậu hà lan, lạc hay
các loại hạt. Có thể tóm tắt các chức năng chủ yếu của protein như sau:
• Protein là thành phần chủ yếu cấu tạo nên tế bào, đặc biệt là cấu trúc nên
màng tế bào.
• Protein - enzyme là chất xúc tác sinh học, xúc tác các phản ứng hoá sinh xảy
ra trong tế bào nên có vai trò quyết định quá trình trao đổi chất-năng lượng của cơ
thể.
• Protein của nguyên sinh chất có vai trò điều tiết các hoạt động sống xảy ra
trong cơ thể. Nó quyết định các tính chất của nguyên sinh chất.
• Nhiều loại protein có chức năng vận chuyển như hemoglobin vận chuyển
O
2
trong máu, các chất làm nhiệm vụ vận chuyển qua màng
• Protein trong cơ có vai trò vận động.
• Nhiều loại protein là các loại kháng thể được tạo ra trong cơ thể đề kháng lại
các kháng nguyên gây bệnh giúp cho cơ thể miễn dịch với bệnh tật.
• Một số protein là hoocmon như insulin có vai trò quan trọng trong điều tiết
hoạt động sinh lý của cơ thể (như insulin điều chỉnh lượng glucose trong máu ổn
định ở 1%)
1
Protein tồn tại ở nhiều dạng khác nhau như đạm hữu cơ, đạm vô cơ Để xác

định được chúng thì hiện nay có nhiều phương pháp nhưng tùy theo đối tượng khảo
sát và tùy theo chiều hướng muốn khảo sát người ta áp dụng từng phương pháp
thích hợp có thể trực tiếp hoặc gián tiếp.
Seminar này sẽ trình bày một số phương pháp dùng để định lượng protein,
cùng với một số lưu ý khi sử dụng từng phương pháp cụ thể.
2
I. Định luợng Nitơ tổng số bằng phuơng pháp KJELDAHL
1. Nguyên tắc:
- Protein được định lượng bằng cách xác định lượng nitơ tổng số và kết quả
nhân với hệ số.
- Trong phân tử protein, hàm lượng nitơ chiếm tỉ lệ 15- 18% khối lượng phân
tử. Do đó nếu xác định được hàm lượng % nitơ trong nguyên liệu, tùy theo mỗi loại
protein mà ta nhân với hệ số khác nhau.
• Hàm lượng protein động vật: % protein = % N protein x 6,25
• Hàm lượng protein thực vật: % protein = % N protein x 6,25
đối với hạt ngũ cốc; % protein = % N protein x 5,75 đối với hạt đậu đỏ.
- Trong thực tế bên cạnh protein thật còn có các chất hữu cơ khác có chứa nitơ
như: alcaloic, amin, amoniac, acid nitric Các chất này gọi là nitơ phi Protein. Vì
vậy trong trường hợp này cần phải xác định nitơ tổng số và nitơ phi protein sau đó
xác định nitơ Protein.
• Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein
• Nitơ protein = Nitơ tổng số - Nitơ phi protein
3
Hình 2
Johan Gustav Christoffer Thorasager Kjeldahl
(1849-1900), nhà hoá học người Đan Mạch
Hình1
Bộ chưng cất Kjeldahl
- Dưới tác dụng của H
2

SO
4
đặc, nhiệt độ cao nitơ có trong thành phần các hợp
chất hữu cơ tạo thành (NH
4
)
2
SO
4
. Dùng kiềm đặc, đầy nitơ ra khỏi muối của nó
dưới dạng NH
3
kết hợp với hơi nước tạo thành NH
4
OH. Lượng nitơ có trong thành
phần NH
4
OH được xác định bằng hệ chuẩn H
2
SO
4
- NaOH hoặc H
3
BO
3
- H
2
SO
4
0,01N.

- Dưới tác dụng của H
2
SO
4
đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất có chứa nito bị
phân huỷ và oxy hoá đến CO
2
và H
2
O còn nito chuyển thành amoniac (NH
3
) và tiếp
tục kết hợp với H
2
SO
4
tạo thành muối amoni sulfat
 Quá trình được thực hiện theo các bước sau :
Bước 1: Vô cơ hoá nguyên liệu
R-CH-COOH + H
2
SO
4
CO
2
+H
2
O + (NH
4
)

2
SO
4
NH
2
Bước 2: Cất đạm
Phản ứng xảy ra trong thiết bị cất đạm
(NH
4
)
2
SO
4
+ 2NaOH Na
2
SO
4
+ 2NH
3
+ 2H
2
O
Phản ứng xảy ra trong bình phản ứng
NH
3
+ H
2
SO
4
(NH

4
)
2
SO
4
+ H
2
SO
4
dư
Bước 3: Chuẩn độ lượng H
2
SO
4
còn thừa trong bình hứng bằng NaOH
4
t
0
Xúc tác
Hình 3
Máy Microkjendahl
Các bộ phận của máy:
1. Bình đun
2. Bình cất
3. Hệ thống sinh hàn
4. Bình hứng
5. Bình đựng dung dịch
thải
2. Hóa chất và nguyên liệu:
- Thuốc thử hỗn hợp: xanh metylen 0,1% và đỏ metylen 0,1% trong ethanol

960 với tỉ lệ 1/2; H
2
SO
4
đặc; hỗn hợp xúc tác K
2
SO
4
/CuSO
4
với tỉ lệ 3/1; H
2
SO
4
0,01N; NaOH 0,01N; H
3
BO
3
2%; ethanol 960; axit trichloacetic (TCA) 20%. Các
nguyên liệu có nguồn gốc động vật như thịt, cá, nguồn gốc thực vật như gạo, ngô,
đậu đỗ, sấy khô tuyệt đối ở 105
0
C
3. Dụng cụ:
- Ống đong 100ml, 50ml, 10ml; bình định mức 100ml; cốc 250ml, 100ml,
50ml, đũa thủy tinh; lọ đựng hóa chất; máy Microkjeldahl bán tự động hoặc tự
động; bếp đun; ống sinh hàn
4. Tiến hành:
- Cân 200mg nguyên liệu dạng bột sấy khô tuyệt đối cho vào bình kjeldahl,
dùng ống đong 10ml H

2
SO
4
đặc đổ vào bình kjeldahl sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen
do nguyên liệu đã bị oxy hóa. Cho thêm 200mg hỗn hợp xúc tác, lắc nhẹ, đậy kín
bình, để một thời gian cho H
2
SO
4
tác dụng với nguyên liệu sẽ giảm bớt được thời
gian đun. Sau đó đặt bình kjeldahl lên bếp đun (đặt hơi nghiêng), đậy miệng bình
bằng phễu thủy tinh, đặt bếp vào trong phòng hút khí. Khi đã sôi, giữ nhiệt độ bếp
đun không quá cao để tránh hóa chất trào ra, vừa tránh mất amoniac.
- Trong khi đun theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi
thấy dung dịch có màu trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở
trên thành bình chưa bị oxy hóa vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho đến khi
dung dịch trong hoàn toàn. Để nguội bình, chuyển dung dịch sang bình định mức
100ml, dùng nước cất tráng lại bình kjeldahl và dẫn tới vạch.
- Giai đoạn cất đạm theo phương pháp dùng hệ chuẩn H
2
SO
4
- NaOH:
• Cho nước cất 1 lần tới 2/3 thể tích của bình, cắm điện đun sôi nước trong
bình. Hơi nước và nhiệt độ của bình 1 giúp cho nitơ trong (NH
4
)
2
SO
4

của dịch
nghiên cứu bị NaOH 30% đẩy ra dưới dạng NH
3
. NH
3
được ngưng tụ nhờ hệ
thống làm lạnh và hơi nước tạo thành NH
4
OH. Sau khi nước trong bình đã sôi,
5
cho vào bình hứng 10ml H
2
SO
4
0,01N và 3 giọt thuốc thử hỗn hợp, dung dịch
trong bình nón sẽ có màu tím hồng chứng tỏ môi trường axit. Đặt bình hứng vào
giá đỡ sao cho đầu mút của ống sinh hàn ngập trong dung dịch của bình hứng.
• Nếu lương axit trong bình hứng không đủ ngập, có thể cho thêm vào một ít
nước cất vô đạm.
• Cho vào bình cất 10ml dung dịch nghiên cứu và 3 giọt thuốc thử hỗn hợp,
sau đó tráng phễu bằng nước cất vô đạm. Cho tiếp vào bình cất 15ml NaOH
30% rồi đóng chặt van lại. Dung dịch trong bình cất chuyển từ màu tím hống
sang màu xanh lá mạ thể hiện môi trường kiềm. Sau 8-10 phút cất đạm, để kiểm
tra xem NH
4
OH còn được tạo ra không, dùng giấy quỳ thử dung dịch ở đầu ống
sinh hàn. Nếu giấy quỳ còn màu xanh thì phải cất đạm tiếp, nếu giấy quỳ không
đổi màu thì quá trình cất đạm đã xong, lấy bình hứng đem chuẩn độ.
- Chuẩn độ: Dùng NaOH 0,01N chuẩn độ cho tới khi dung dịch trong bình
hứng chuyển từ màu tím hồng sang màu xanh lá mạ. Lượng NaOH 0,01N dùng để

chuẩn độ bằng H
2
SO
4
0,01N còn dư trong bình hứng.
- Tính kết quả: Hàm lượng % nitơ tổng số hay nitơ toàn phần được tính theo
công thức :
N% = 1,42 x (V
1
– V
2
) x 100 / a
Trong đó
• V
1
: Số ml H
2
SO
4
0,01N cho vào bình hứng.
• V
2
: Số ml NaOH 0,01N đã chuẩn độ.
• ( V
1
– V
2
): Số ml H
2
SO

4
0,01N trong bình hứng đã bị trung hòa bởi NH
4
OH
được tạo ra do quá trình chưng cất đạm
• 1,42 là hệ số: cứ 1ml H
2
SO
4
0,01N dùng để trung hòa NH
4
OH thì tương
đương với 1,42 mg nitơ.
• a : là số nguyên liệu tính bằng gam của mẫu cất đạm
• Sau khi tính được nitơ tổng số, đem kết quả đó nhân với hệ số tương ứng sẽ
cho ra hàm lượng protein trong nguyên liệu.
6
II. Định lượng protein bằng phương pháp so màu
1. Định lượng protein bằng phương pháp Biure
a. Nguyên tắc
- Dựa vào phản ứng tạo màu giữa protein và Cu
2+
trong môi trường kiềm tạo
phản ứng màu xanh tím có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 540nm
Hình 4: Phản ứng Biure
- Cường độ màu của phản ứng tỉ lệ thuận với lượng Cu và số lượng liên kết
peptid trong chuỗi polypeptid
b. Cách tiến hành
- Chuẩn bị nguyên liệu và hóa chất: dung dịch Albumin tiêu chuẩn 1%
- Chuẩn bị thuốc thử Biure: cân chính xác

• CuSO
4
1,5 (g)
• Tartrat Kilium vào Natrium 6 (g)
• Nước cất 500 (ml)
 Cho vào bình lắc cho tan hoàn toàn và định mức đến 1000ml
7
 Lập đồ thị chuẩn
Lấy 6 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6 và cho vào đó các chất theo bảng sau:
STT Protein1%(ml) H
2
O(ml)
Nồng độ
Protein
(mg/ml)
Thuốc thử
Biure (ml)
OD
1 0,0 1,0 0 5
2 0,2 0,8 2 5
3 0,4 0,6 4 5
4 0,6 0,4 6 5
5 0,8 0,2 8 5
6 1,0 0,0 10 5
Bảng 1: Lập đồ thị chuẩn nồng độ Protein
- Lắc đều các ống nghiệm và để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Đem đo
độ hấp thu của các ống ở bước sóng 540nm và ghi nhận mật độ quang
- Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch nghiên cứu và 4ml thuốc thử Biure lắc
đều và để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó đem đo mật độ quang ở bước
sóng 540nm. Ghi mật độ quang.

c. Tính toán
- Lập đồ thị chuẩn các ống nghiệm từ 2 đến 6. Trị số mật độ quang của các
ống nghiệm từ 2 đến 6 bằng mật độ quang của các ống nghiệm từ 2 đến 6 đã được
đo ở trên trừ cho mật độ quang của ống 1. Sau đó lập đồ thị biểu diễn sự biến thiên
của mật độ quang theo nồng độ protein chuẩn.
- Tương tự độ hấp thu thất sự của protein có trong ống nghiệm là trị số mật độ
quang của ống nghiệm trừ ống đối chứng. Sau đó đối chiếu vào đường cong mẫu
suy ra lượng protein có trong mẫu thí nghiệm.
d. Độ nhạy và khả năng ứng dụng
- Phương pháp này nhạy hơn phương pháp Lowry nhưng không bằng phương
pháp Bradford vì nó được sử dụng đối với mẫu nghiên cứu có khối lượng protein
tương đối lớn 20-2000 µg/ml.
2. Định lượng protein hoà tan theo Lowry (Biure cải tiến)
8
a. Nguyên tắc
- Phương pháp này dựa trên cơ sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp
photphomolipden – photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất
mầu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 660nm.
- Cường độ mầu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong
một phạm vi nhất định. Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta
có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.
Hình 5: Phản ứng Lowry
b. Hoá chất cần dùng
- Dung dịch A: 4g NaOH (0,1M) và 20g Na
2
CO
3
(2%) pha trong 1000ml nước
cất.
- Dung dịch B: 0,5g CuSO

4
.5H
2
O (0,5%) pha trong dung dịch Natri Xitrat
(1%) hoặc trong dung dịch Natri, Kali Tactơrat 1%.
- Dung dịch C: Hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (pha trước
khi dùng).
- Thuốc thử folin, trước khi dùng pha loãng hai lần sao cho độ axit bằng 1N.
- Albumin huyết thanh bò 1mg/ml.
c. Cách tiến hành
9
- Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0,5ml dịch chứa protein với hàm lượng thích
hợp cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C, lắc đều để yên trong 10
phút. Sau đó thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25ml folin đã pha loãng 2 lần,
lắc đều và để yên trong 30 phút, mầu vàng của hỗn hợp chuyển sang mầu xanh da
trời và đạt đến cường độ mầu cực đại. Đem so mầu của hỗn hợp trên máy so mầu
quang điện ở bước sóng 660nm. Xác định được trị số mật độ quang học của dung
dịch nghiên cứu. Đo trên máy 3 lần lặp lại và lấy trị số trung bình.
- Mẫu đối chứng: 0,5ml đệm cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch
C và bước tiếp theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm.
d. Xây dựng đường đồ thị chuẩn
- Hàm lượng protein tan trong dung dịch được xác định theo phương pháp
Lowry, dùng albumin huyết thanh bò (BSA) làm chất chuẩn.
- Cân 0,01g (10mg – albumin huyết thanh bò) hoà tan trong 10ml nước, ta
được dung dịch gốc có nồng độ là 1mg/ml. Sau đó pha loãng dung dịch gốc bằng
nước cất với các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100, 120
µ
g/ml để tiến hành xây dựng đồ
thị chuẩn.
- Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0,5ml dung dịch BSA ở nồng độ pha loãng

như trên cho vào ống nghiệm, thêm vào mỗi ống 2ml dung dịch C để ở nhiệt độ
phòng 10 phút, sau đó cho 0,25ml thuốc thử folin (1N) đem so mầu với bước sóng
660nm.
- Mẫu đối chứng: lấy 0,5 ml nước cất cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml
dung dịch C và các bước tiếp theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm.
 Qua 3 lần lặp lại thí nghiệm có thể xây dựng đường hồi quy. Kết quả được xử lý
theo phương pháp thống kê thông thường.
Ta có phương pháp hồi quy.
10
y = 0,55066844x + 0,01791961

Hình 6: Hàm lượng protein
Hình 6 : Đường đồ thị xác định nồng độ Protein theo phương pháp Lowry
 Dựa vào đồ thị chuẩn, có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu
nghiên cứu.
e. Độ nhạy và khả năng ứng dụng
- Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao cho phép xác định dung dịch
mẫu chứa vài chục µg protein thường nhạy cảm trong khoảng từ 5-2000 µg protein.
Tuy nhiên phương pháp này không dùng để định lượng các protein không chứa
acid amin vòng thơm như gelatin, đối với những hợp chất có chứa ion kali thì tạo
kết tủa ảnh hưởng đến kết quả.
3. Định lượng protein theo Bradford
- Hàm lượng protein huyết thanh có thể được định lượng theo phương pháp
Bradford (1976).
a. Nguyên tắc
- Dựa vào phản ứng của protein với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant
Blue G-250) và cả khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm. Trong môi
trường acid Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết chặt chẽ với protein, tương tác
11
660

nm
OD
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,2 0,4 0,6
0,8 1
1,2
0
mg
với cả nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein làm
dung dịch có màu xanh. Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein trong dung dịch.
Dựa vào đường chuẩn của protein suy ra hàm lượng protein trong mẫu.
Hình 7: Phản ứng cho màu Coomassine
b. Vật liệu và dụng cụ
- Các mẫu protein.
- Dung dịch mầu:
• Coomassie blue G 40mg
• Ethanol (EtOH) (absolute) 20ml
• H
3
PO
4
85% 40ml
• H
2
O 40ml

- Dung dịch BSA (Bovine Serum Albumin) 100mg/ml.
- Cóng đo bằng nhựa.
- Pipet man (Hãng Gilson – Pháp).
- Máy đo quang phổ Shimadzu UV – 200s (Japan).
c. Cách tiến hành
12
 Xây dựng đường cong chuẩn biểu diễn nồng độ protein chuẩn (BSA): 1,8ml
dung dịch protein chuẩn có chứa từ 5 – 40mg BSA trong nước cất được đưa vào
cóng đo nhựa.
- Thêm 0,6 ml dung dịch màu, lắc đều để 5 phút cho phản ứng xẩy ra ở nhiệt
độ phòng.
- Đo độ hấp phụ ở bước sóng 595 nm sau 2 phút.
- Dung dịch mẫu trắng (Blank) được chuẩn bị từ 1,8ml nước cất và 0,6 ml chất
thử màu.
- Dựng đồ thị biểu diễn hàm lượng BSA tương ứng với giá trị OD 595nm.
Đường cong tiêu chuẩn này được sử dụng để xác định hàm lượng protein trong các
mẫu chưa biết, cũng được xây dựng tương tự theo phương pháp Lowry.
 Định lượng protein của mẫu.
- Các mẫu có chứa từ 1 – 10 mg protein trong 1,8 ml H
2
O được đưa vào cóng
nhựa.
- Thêm vào 0,6ml dung dịch mầu lắc đều.
- Đo độ hấp phụ quang học (OD) ở bước sóng 595nm.
- Dựa vào đồ thị chuẩn xác định hàm lượng protein trong mẫu theo công thức
X(mg) =
1000
aVC
Trong đó:
• X: số mg protein có trong mẫu

• C: nồng độ protein theo đồ thị 1000 (mg/ml).
• V: thể tích dung dịch mẫu.
• a: độ pha loãng dung dịch.
d. Độ nhạy và khả năng ứng dụng
- Phương pháp này dùng cho protein hòa tan trong nước, phản ứng xảy ra ở
nhiệt độ phòng. Phương pháp này nhạy hơn 2-3 lần so với phương pháp Lowry,
nhanh và đơn giản hơn nhiều vì nó cho phép xác định tới vài µg protein/ml, đồng
13
thời giảm ảnh hưởng của muối, đệm, các chất khử. Tuy nhiên phương pháp này
không dùng với những chất có chứa surfactants vì gây kết tủa của các phản ứng.
Những chất có tính kiềm mạnh làm tăng mật độ quang gây sai lệch kết quả. Màu
coomassie làm bẩn cuvet thạch anh nên chỉ dùng cuvet thủy tinh để đo mật độ
quang.
III. Định lượng protein bằng phương pháp dùng Bicinchoninic Acid (BCA)
1. Nguyên tắc
- Dựa vào phản ứng giữa protein và thuốc thử BCA trong môi trường kiềm tạo
màu đỏ tía (tím) có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 562nm.
Hình 8: Phản ứng cho acid bincinchoninic (BCA)
- Đầu tiên protein sẽ khử Cu
2+
thành Cu
+
và tạo thành phức có màu xanh trong
môi trường kiềm. Sau đó hai phân tử BCA sẽ kết hợp với Cu
+
được tạo ra ở trên
cho màu đỏ tía (tím) và có độ hấp thu ở bước sóng 562nm.
2. Cách tiến hành
- Cách tiến hành cũng tương tự phương pháp Biure nhưng chỉ thay thuốc thử
Biure thành thuốc thử BCA.

3. Tính kết quả
- Tương tự phương pháp Biure
4. Độ nhạy và khả năng ứng dụng
14
- Phương pháp này nhạy gấp 100 lần so với phương pháp Biure. Nó phát hiện
protein tương đối lớn 20-2000 µg, nhưng đối với những tạp chất có hàm lượng CU
dù ít cũng bắt màu với BCA làm ảnh hưởng đến kết quả và những hợp chất hữu cơ
trong phân tử có aminoacid, cystine, cystein, tyrosine, trytophan cũng bắt màu với
BCA làm ảnh hưởng đến kết quả
IV. Định lượng protein bằng phương pháp quang phổ
- Nguyên tắc của phương pháp này là các axit amin acid thơm như trytophan,
tyrosine và phenylalanine trong chuỗi pholypeptit có phổ hấp thụ cực đại ở bước
sóng 280nm.
1. Cách tiến hành
- Nguyên liệu: dung dịch protein để đo, đệm hòa tan protein
- Thiết bị: máy đo quang phổ UV có cuvet thạch anh đường truyền sóng là
1cm.
Quá trình gồm các bước sau:
• Bước 1: Ly tâm mẫu để loại bỏ các phân tử hoặc phức hợp khác có trong
thể huyền phù. Lấy dịch nổi để xác định mật độ quang học.
• Bước 2: Chỉnh máy quang phổ ở bước sóng 280nm và điều chỉnh độ hấp
thụ về 0 với cuvet chứa đệm.
• Bước 3: Đo mẫu và đọc độ hấp thụ của mẫu. Nếu giá trị được > 2,0 thì pha
loãng mẫu (1/5 hoặc 1/10) hoặc đường truyền ánh sáng ngắn hơn (2mm) cho
đến khi số đọc được nằm trong khoảng 0,5 đến 1,5.
• Bước 4: Lặp lại bước 2 và 3 ở bước sóng 260nm
• Bước 5: Tính tỉ số hấp thụ 260nm/280nm. Tỉ số này nên nhỏ hơn 0,6. Nếu
lớn hơn 0,6 thì protein không sạch có lẫn các tạp chất khác đặc biệt với acid
nucleic.
2. Tính kết quả

15
- Sử dụng BSA làm chất chuẩn, biết rằng ở bước sóng 280nm 1ml BSA có
nồng độ 1mg/ml sẽ có mật độ quang học là OD = 0,67. Dựa vào đó có thể xác định
hàm lượng protein trong các mẫu thí nghiệm theo công thức sau:
Y(mg) =
67,0
.].[ VaOD
Trong đó:
• [OD]: mật độ quang học của 1ml dung dịch mầu.
• V: thể tích dung dịch mầu.
• a: độ pha loãng dung dịch.
Chú ý
1. Con số 0,67 là hệ số tắt của BSA. Để xác định nồng độ các loại protein
khác thì cần phải sử dụng hệ số tắt tương ứng đối với mỗi loại protein. Ví dụ: hệ số
tắt của protein con A là 1, 2.
2. Lựa chọn các protein tiêu chuẩn cần có cấu trúc tương tự như cấu trúc của
các protein cần đo xét nghiệm ở mẫu nghiên cứu vì các protein thường có hệ số tắt
khác nhau ở bước sóng 280nm (Hệ số tắt biểu thị bằng sự hấp thụ của dung dịch
1% protein đối với một tia sáng có bề dày 1cm). Thêm vào đó, các protein có cấu
trúc khác nhau cũng cho khả năng tạo phản ứng mầu khác nhau với các thuốc thử
tạo mầu như thuốc thử folin – ciocalteu, coomassie brilliant blue G 250.
Sau đây là bảng cho các giá trị hệ số tắt (
E
%1
280
, nghĩa là sự hấp thụ của dung
dịch 10mg protein/ml ở bước sóng 280nm) đối với một số loại protein khác nhau:
Bảng 2: Hệ số tắt của một số protein ở bước sóng 280nm (theo Fashman, 1976)
Các protein
%1

280
E
IgG 13,6
IgM 11,8
IgA 13,2
IgA tiết 13,1
IgD 17,0
IgE 15,3
Chuỗi
γ
13,7
16
Chuỗi
µ
13,9
Chuỗi
α
15,5
Chuỗi nhẹ 12,3
Fab 15,0
Fc 12,0
V
H
27,0
Con A (lectin
Canavalia ensiformis)
12,0
Lectin Lens culinaris
(LCA)
12,5

BSA 6,7
3. Nếu chưa biết hệ số tắt của protein, hoặc dung dịch gồm hỗn hợp của một
số dạng protein thì nồng độ protein tổng số có thể được tính theo phương trình sau:
 Nồng độ protein, tính theo
mg/ml = 1,55 x A280 – 0,77 x A260
Trong đó:
• A280 là giá trị hấp thụ ở bước sóng 280 nm.
• A260 là giá trị hấp thụ ở bước sóng 260 nm.
4. Nếu tỉ lệ A280/A260 thấp hơn 0,6 nghĩa là dung dịch protein đã lẫn
(nhiễm) axit nucleic, các peptit, chất tẩy rửa hoặc chất kháng khuẩn azit natri
(NaN
3
). Trường hợp này cần sử dụng phép đo nồng độ protein theo kỹ thuật Lowry
hoặc Bradford.
5. Dung dịch protein có nồng độ thấp hơn 0,1mg/ml thường cho kết quả
không chính xác.
3. Độ nhạy và khả năng ứng dụng
- Đây là phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ protein trong dung dịch.
Phương pháp này không dùng được cho các dung dịch có nồng độ protein thấp
(dưới 0,05-0,1 mg/ml) hoặc khi có mặt nhiều chất khác mà hấp thụ cùng một vùng
17
cực tím (ví dụ: đệm, acid nucleic và một số chất béo) hoặc khi protein ở trong dung
dịch huyền phù.
V. Phương pháp định lượng amoniac (NH
3
)
1. Nguyên tắc
- Trong nguyên liệu chứa nitơ thường chứa một loại nitơ nằm dưới dạng vô cơ
(muối amonium hay những amin dễ bay hơi). Đây là dạng nitơ tạo thành do sự
phân hủy protein. Những loại nitơ này thường có tính kiềm yếu, vì vậy khi cho tác

dụng với MgO thì những loại nitơ nói trên sẽ bị đuổi ra khỏi dung dịch, nên chúng
sẽ được lôi cuốn theo hơi nước qua một bình đựng lượng thừa acid. Sau đó đem
định phân lượng acid dư, cho phép ta xác định loại nitơ này.
2(NH
4
)
+
+ Mg(OH)
2
2NH
3
+ 2H
2
0 + Mg
2+
2NH
3
+ H
2
SO
4
(NH
4
)
2
SO
4
2. Hóa chất
- Dung dịch H
2

SO
4
0,1N
- Dung dịch NaOH 0,1N
- Dung dịch alizarin natri sunfonat 1% trong nước
- Dầu parafin hay cồn octylic
- Thiết bị: máy cấy amoniac
3. Tiến hành
Bước 1: Rửa máy
- Cho nước cất vào bình A khoảng 2/3 thể tích bình, 5 giọt chỉ thị alizarin natri
sunfonat và cho H
2
SO
4
0,1N từng giọt một đến khi dung dịch chuyển sang vàng.
18
- Cho nước trong bình khoảng ½ thể tích bình, lắp nguồn nước lạnh vào ống
sinh hàn, đun sôi cả 2 bình A và B, cất kéo hơi nước cho đến khi hơi nước chảy ra
trung tính.
Bước 2: Cất đạm
- Cân hoặc lấy một lượng chính xác m(g) hay V(ml) thực phẩm cho vào bình
B với nước trung tính đã cất kéo hơi nước để rửa máy ở trên. Sau đó cho thêm
0,5ml chỉ thị màu.
- Cho MgO bột vào tới khi có phản ứng kiềm rõ rệt (màu tím). Để tránh bọt
sủi phồng lên, cho thêm vào giọt dầu parafin hay cồn octylic. Đun sôi, hơi nước từ
bình A qua bình B kéo NH
3
theo khi ống sinh hàn sẽ đọng lại, rơi xuống, bình
chuẩn độ D đã đựng sẵn nước trung tính, chỉ thị màu và V(ml) H
2

SO
4
thành
(NH
4
)
2
SO
4
.H
2
SO
4
thừa sẽ được chuẩn độ bằng NaOH 0,1N.
4. Tính kết quả
- Hàm lượng NH
3
trong 100g thực phẩm
1,7*( )*100
1000*
x
v v
m
−
Hoặc trong 1000ml thực phẩm
1,7*( )
x
m
v v
v

−
Trong đó
• V: thể tích H
2
SO
4
0,1N cho vào bình chuẩn độ
• V
x
: thể tích NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ H
2
SO
4
thừa
• M: khối lượng mẫu dùng để định lượng
• V
m
: thể tích mẫu lấy định lượng.
5. Khả năng ứng dụng
- Khi xác định lượng amoniac trong thực phẩm, một mặt sẽ xác định độ hư
hỏng của thực phẩm, một mặt đánh giá giá trị protein, acid amin trong thực phẩm.
Một số thiết bị liên quan đến định lượng protein
19
1. Các thiết bị tự động chưng cất Kjeldahl
20
2. Cuvet đựng mẫu
3. Máy đo độ hấp thụ
21
22