Phân lập và nuôi cấy acetobacter xylinum tạo màng cellulose vi khuẩn

i
Lời cảm ơn

Lời cảm ơn đầu tiên con muốn gửi đến ba mẹ và gia đình với lòng biết ơn
sâu sắc. Ba mẹ đã cho con sự sống, gia đình cho con tinh thần và vật chất để con
vững bước trên con đường học vấn và sự nghiệp.
Tôi trân trọng gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Văn Duy và TS. Phạm Thu
Thủy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm giúp tôi hoàn
thành đề án tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tất cả các thầy cô trong Viện Công nghệ
sinh học và Môi trường đã tận tâm giảng dạy, truyền đạt kiến thức quý báu và hết
lòng giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi có được những nền tảng kiến thức
không chỉ trong trong suốt quá trình học tập bốn năm tại trường và còn trên những
bước đường đời sau nay.
Bên cạnh đó, tôi còn muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến các cán bộ phòng
thí nghiệm Viện công nghệ sinh học và Môi trường, các bạn Nguyễn Thị Hoàng
Nhạn và Lê Thị Lệ lớp 50 SH, Nguyễn Thị Lý lớp 49 SH cùng tất cả các bạn lớp 49
SH và 50 SH đã hết lòng giúp đỡ, tạo mọi điều kiện hỗ trợ để tôi hoàn thành đồ án này.
Và một lần nữa xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến tất cả mọi người đã giúp đỡ
và dành nhiều tình cảm cho tôi trong suốt thời gian qua.

Nha Trang, ngày tháng 7 năm 2011
Sinh viên thực hiện


Nguyễn Thành Duy




ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC BẢNG v
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vi
LỜI NÓI ĐẦU 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3
1.1.

Tổng quan về màng cellulose vi khuẩn
3
1.2.

Tổng quan về vi khuẩn Acetobacter xylinum
9
1.2.1.

Phân loại vi khuẩn Acetobacter xylinum
9
1.2.2. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Acetobacter xylinum
11
1.2.3. Khả năng tạo màng cellulose của Acetobacter xylinum
12
1.3.

Tình hình nghiên cứu và ứng dụng cellulose vi khuẩn
15

1.3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng cellulose vi khuẩn trên thế giới
15
1.3.2.

Tình hình nghiên cứu và ứng dụng cellulose vi khuẩn tại Việt Nam
16
1.4.

Tính cấp thiết và mục tiêu của đề tài
18
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1. Vật liệu nghiên cứu
21
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
21
2.1.2. Hóa chất
21
2.2. Nội dung nghiên cứu
25
2.3. Phương pháp nghiên cứu
26
2.3.1. Phân lập vi khuẩn Acetobacter xylinum
26
2.3.2. Xác định đặc điểm hình thái vi khuẩn Acetobacter xylinum
27
2.3.3. Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn Acetobacter xylinum
27
2.3.4. Xác định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Acetobacter xylinum
28
iii

2.3.5. Bảo quản chủng giống
30
2.3.6. Nuôi cấy tạo màng cellulose vi khuẩn
30
2.3.7. Thu nhận và xử lí màng cellulose vi khuẩn
31
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
3.1. Phân lập vi khuẩn Acetobacter xylinum
32
3.2 Đặc điểm hình thái vi khuẩn Acetobacter xylinum
33
3.3. Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn

Acetobacter xylinum
34
3.4. Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Acetobacter xylinum
36
3.5. Khảo sát khả năng tạo màng cellulose vi khuẩn
Error! Bookmark not defined.
CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO

iv
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BC : Bacterial cellulose
HS : Herstrin and Schram
Glu : Gluccose
GHK : Glucose hexokinase
G6P : Glucose 6 phosphate
G1P : Glucose 1 phosphate
PGM : Phosphoglucoemutase
UGP : UDPglucose pyro-gluco 6 phosphate
PGA : Phosphogluconic acid
PGI : Phosphoglucose isomerase
FHK : Fructose hexokinase
Frc : Fructose
F6P : Fructose 6 phosphate

1PFK : Fructose 1 phosphate kinase
F1P : Fructose 1 phosphate
PTS : Hệ thống vận chuyển phosphat
FDP :Fructose1,6 diphosphate
PE : Polyethylen
PVC : Polyvinylchlorua
PP : Polypropylene







v
DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Ảnh hưởng của các loại đường khác nhau đến sự hình thành màng BC 5
Bảng 2. Kết quả khảo sát nồng độ saccharose 5
Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ (NH
4
)
2
SO
4
đến sự hình thành BC 6
Bảng 4: Ảnh hưởng của nồng độ (NH
4
)
2

HPO
4
đến sự hình thành BC 7
Bảng 5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành màng BC 8
Bảng 6: Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành màng BC 8
Bảng 7: Một số ứng dụng của màng BC trên thế giới 15
Bảng 8: Mật độ và hình thái khuẩn lạc phân lập trên môi trường HS 32
Bảng 9: Sự thay đổi của pH trong suốt quá trình nuôi cấy 40
Bảng 10: Khảo sát tỉ lệ nước dừa trong nuôi cấy BC 40
Bảng 11: Các đặc điểm của màng BC 42
Bảng 12: Khảo sát khả năng chịu lực của màng BC 43
vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Màng BC tươi sau khi nuôi cấy thử nghiệm 4
Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn A. xylinum quan sát dưới kính hiển vi 12
Hình 1.3. Sơ đồ quá trình tổng hợp Cellulose của A. xylinum 14
Hình 2.1. Sơ đồ tiến trình thực hiện nội dung nghiên cứu của đề tài 25
Hình 2.2. Các bước tiến hành nuôi tạo màng BC 31
Hình 3.1. Các khuẩn lạc của chủng vi khuẩn A
3
sau 48 giờ nuôi cấy trên môi
trường HS 33
Hình 3.2. Tế bào vi khuẩn A
3
sau khi nhuộm Gram 34
Hình 3.3. Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn A
3
trên môi trường HS lỏng 34
Hình 3.4. Phản ứng catalase của vi khuẩn A

3
36
Hình 3.5. Vòng sáng quanh khuẩn lạc A
3
sau thời gian nuôi cấy 37
Hình 3.6 Khả năng chuyển hóa glucose thành acetic acid của chủng A
3
38
Hình 3.7. Kết quả thử nghiệm khả năng tạo màng của chủng A
3
39
Hình 3.8. Khảo sát hàm lượng nước dừa trong nuôi tạo màng BC 41
Hình 3.5. Màng BC qua các giai đoạn 42












1
LỜI NÓI ĐẦU
Túi nilon là một sản phẩm của dầu mỏ, được sử dụng nhiều nhất và rất phổ
biến trên toàn thế giới. Với các tính năng tiện dụng như dẻo dai, dễ sử dụng, đủ mọi
kích cỡ, màu sắc và kèm theo đó là dễ loại bỏ khi không còn dùng, thì túi nilon trở

thành một thứ sản phẩm hữu ích cho nhu cầu của con người.
Rác thải túi nilon trong rác thải sinh hoạt thực chất là hỗn hợp các loại nhựa
phế thải mà trong đó bao bì bằng nhựa polyethylene (PE) hoặc polypropylene (PP)
chiếm đa số. Chúng thuộc loại polyethylene tỉ trọng thấp (LDPE) hoặc tỉ trọng cao
(HDPE).
Các loại vật liệu nhựa ra đời từ đầu thế kỉ XX và gia tăng rất nhanh về số
lượng, chủng loại. Chỉ tính riêng LDPE năm 1999 thế giới đã sản xuất 27,4 triệu
tấn, năm 2000 là 33,8 triệu tấn. Số liệu thống kê mức tiêu thụ ở một số nước trên
thế giới vào năm 1994 như Mỹ là 108 kg/ người/ năm; Nhật Bản là 85 kg/ người/
năm; Hàn Quốc là 74,9 kg/người/ năm….Riêng tại Việt Nam, số liệu năm 1998 là
5,3 kg/ người/ năm và tăng lên 15 kg/ người/ năm vào năm 2003. Hiện tại số liệu
này đang ngày càng gia tăng ( Viện Vật liệu xây dựng- Bộ xây dựng, 2003).
Chính vì sự gia tăng rất lớn của nhu cầu sử dụng và sản xuất các loại bao bì
nhựa mà lượng rác thải nilon cũng tăng theo. Kéo theo đó là các tình trạng ô nhiễm
môi trường ngày càng trầm trọng. Thời gian phân hủy của túi nilon có thể kéo dài từ
50 đến 100 năm hoặc hơn nên còn rất nhiều tác hại mà nó có thể gây ra khi bị thải
vào môi trường.
Trước tình trạng báo động về ô nhiễm túi nilon và các tác hại của nó, các nhà
khoa học đã nghiên cứu để tìm ra loại bao bì có nguồn gốc tự nhiên, thân thiện với
môi trường. Có nhiều loại nguyên liệu đã được chú ý và đưa vào nghiên cứu như
polylactic acid (PLA), polyglyconic acid (PGS)…Tất cả đều có nguồn gốc tự nhiên
từ tinh bột của sắn, ngô, khoai tây và một số loại khác.
Ngoài các loại nguyên liệu trên thì còn có một loại nguyên liệu khác rất có
tiềm năng trong việc tạo bao bì thân thiện môi trường. Đó là màng cellulose vi
khuẩn.
2
Đây là một polysaccharide được tế bào vi khuẩn tổng hợp từ quá trình trao
đổi chất trong môi trường nuôi cấy.
Có nhiều loại vi khuẩn có khả năng tổng hợp cellulose như Acetobacter,
Rhizobium, Agrobacterium…nhưng các chủng vi khuẩn Acetobacter là loại vi

khuẩn sản xuất cellulose là đáng chú ý nhất. Trong đó có chủng vi khuẩn
Acetobacter xylinum là loài có khả năng tạo ra màng cellulose tốt nhất.
Ngoài thực phẩm, màng cellulose vi khuẩn đã và đang được nghiên cứu
nhằm mở ra các hướng ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác như y học, mỹ phẩm và
mới đây là các triển vọng trong lĩnh vực môi trường.
Với các đặc tính cơ học bền, chắc, dai, màng bacterial cellulose có thể ứng
dụng tạo loại ra loại bao bì thân thiện môi trường. Vì vậy, chúng tôi quyết định thực
hiện đề tài “ Phân lập và nuôi cấy Acetobacter xylinum tạo màng cellulose vi
khuẩn” với mục đích:
Phân lập vi khuẩn Acetobacter xylinum từ nguồn cơ chất nước dừa.
Khảo sát khả năng tạo màng cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo
tiền đề ứng dụng làm bao bì sinh học.







3
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về màng cellulose vi khuẩn
Cellulose được tổng hợp bởi một số loại vi khuẩn như Acetobacter,
Rhizobium, Sarcina và Agrobacterium được gọi là cellulose vi khuẩn (bacterial
cellulose- BC). Trong các vi khuẩn nói trên thì Acetobacter là loại vi khuẩn sản xuất
cellulose đáng chú ý nhất (Brown và cs, 1976).
Về mặt cấu trúc, BC có cấu trúc dạng bó sợi đan xen lẫn nhau. Các sợi sắp
xếp không theo trật tự, không theo quy luật, chúng đan xen vào nhau từ mọi hướng.
Do trong quá trình lên men, các vi khuẩn A. xylinum chuyển động hỗn độn không

theo qui luật, kết quả là tạo ra tính bền, dai chắc về mọi phía của màng BC. Đặc tính
cấu trúc của BC phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy đặc trưng. Tuỳ thuộc
vào yêu cầu ứng dụng mà ta chọn điều kiện nuôi cấy tĩnh hay động ( Trần Thị Diễm
Chi, 2000).
Về tính chất, BC có độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với các loại cellulose
khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn. Ngoài ra, BC còn có
độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định về kích thước và
hướng.
BC còn là một mạng polymer sinh học có khả năng giữ nước rất lớn, có tính
xốp, ẩm độ cao, có thể chịu được một thể tích đáng kể trên bề mặt (lực bền cơ học
cao). Màng BC sau khi sấy ở 90
0
C thì sẽ mỏng như tờ giấy, bề mặt láng bóng, rất
dai chắc. Do chuỗi polymer của màng BC có chứa nhiều nhóm OH
-
nên dễ dàng tạo
liên kết hydro với nước, chính vì vậy mà bên trong toàn bộ màng BC sau nuôi cấy
nước chiếm tới 99% ( Nguyễn Thúy Hương, 2008).

4

Hình 1.1. Màng BC tươi sau khi nuôi cấy thử nghiệm
(99% thành phần màng là nước)
Dựa vào các nghiên cứu của Ramos (1977), Lapuz và cộng sự (1967), Trần
Phú Hòa (1996) đã tiến hành một số khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình
hình thành màng BC.
Thứ nhất, trạng thái màng BC tạo thành chịu ảnh hưởng của nguồn
đường. Kết quả sử dụng các nguồn đường của vi khuẩn A. xylinum và trạng thái
màng BC được hình thành thể hiện qua bảng 1. A. xylinum có thể sử dụng glucose,
saccharose, lactose, maltose, dextrin và galactose nhưng không thể sử dụng tinh bột.

Đối với mỗi loại đường khác nhau sẽ cho ra màng BC có trạng thái khác nhau.
5
Bảng 1: Ảnh hưởng của các loại đường khác nhau đến sự hình thành màng BC
trong nước dừa ở pH = 5,0
Loại đường Độ dày- trạng thái
Khối lượng màng sau 15 ngày
lên men (g)
Glucose Dày – chắc 198,50
Saccharose Dày – chắc 193,79
Lactose Mỏng – mềm 84,50
Maltose Mỏng – mềm 86,35
Dextrin Mỏng – mềm 81,20
Galactose Mỏng – mềm 50,45
Không đường Mỏng – mềm 50,00
(Trần Phú Hòa, 1996)
Dựa vào kết quả của bảng 1, nguồn đường glucose và saccharose được vi
khuẩn A. xylinum sử dụng một cách có hiệu quả nhất với khối lượng màng BC tạo
ra là 198,5g và 193,79g sau 15 ngày lên men. Trong thực tế sản xuất, người ta
thường sử dụng đường saccharose do giá thành rẻ và năng suất khá cao. Vì vậy
trong bảng 2, Trần Phú Hòa tiến hành khảo sát đường saccharose ở các nồng độ
khác nhau và với nồng độ 10% sẽ cho khối lượng màng cao nhất.
Bảng 2. Kết quả khảo sát nồng độ saccharose
Nồng độ saccharose (%) Độ dày- trạng thái Khối lượng màng BC sau
15 ngày lên men (g)
2 Trung bình - chắc 112.08
4 Trung bình - chắc 146.45
6 Trung bình - chắc 165.76
8 Trung bình - chắc 187.54
10 Dày – chắc 198.58
12 Trung bình - chắc 188.78

14 Trung bình - chắc 185.65
Không bổ sung đường Màng rất mỏng 95.88
(Trần Phú Hòa, 1996 )
6
Thứ hai, nguồn N sử dụng cho quá trình lên men có thể là (NH
4
)
2
HPO
4
hoặc
(NH
4
)
2
SO
4
. Do đó khối lượng BC tạo thành cũng phụ thuộc vào hàm lượng
(NH
4
)
2
HPO
4
và (NH
4
)
2
SO
4

sử dụng.
Dựa vào kết quả của bảng 3, ta nhận thấy với nồng độ của (NH
4
)
2
SO
4
là
0,5% thì khối lượng màng đạt giá trị cao nhất (210,35 g) sau 15 ngày nuôi cấy. Khi
nồng độ % của (NH
4
)
2
SO
4
nằm trong khoảng 0,5%- 0,8% thì khối lượng màng thay
đổi không đáng kể.
Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ (NH
4
)
2
SO
4
đến sự hình thành BC

Nồng độ (NH
4
)
2
SO

4
(%)
Khối lượng BC sau 15 ngày nuôi cấy
(g)
0,0 110,0
0,1 128,70
0,2 135,50
0,3 148,65
0,4 168,20
0,5 210,35
0,6 178,90
0,7 174,85
0,8 170,45
0,9 163,90
1 150,40
( Trần Phú Hòa, 1996)


7
Bảng 4: Ảnh hưởng của nồng độ (NH
4
)
2
HPO
4
đến sự hình thành BC

Nồng độ (NH
4
)

2
HPO
4
(%) Khối lượng BC sau 15 ngày nuôi cấy
(g)
0,0 78,3
0,1 117,1
0,2 146,9
0,3 162,5
0,4 150,2
0,5 139,3
0,6 130,4
0,7 126,8
0,8 119,7
0,9 108,5
1 107,6
( Trần Phú Hòa, 1996)

Kết quả bảng 4 cho thấy nồng độ (NH
4
)
2
HPO
4
trong khoảng 0,2%- 0,4% cho
khối lượng màng BC cao nhất. Như vậy, khi bổ sung nguồn N vào môi trường nuôi
cấy cần lựa chọn nồng độ % (NH
4
)
2

HPO
4
và (NH
4
)
2
SO
4
sao cho phù hợp ( đối với
(NH
4
)
2
HPO
4
thì trong khoảng 0,5%- 0,8%, (NH
4
)
2
SO
4
trong khoảng từ 0,2%-
0,4%) để cho khối lượng màng cao nhất.
Về nhiệt độ, vi khuẩn A. xylinum hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ từ
28
o
C-32
o
C. Trong khoảng nhiệt độ này thì khả năng tổng hợp màng là tốt nhất. Trần
Phú Hòa đã khảo sát dựa trên các nghiên cứu của Ramos (1977), Lapuz và cộng sự.

(1967) và đưa ra kết quả trong bảng 4.
8
Bảng 5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành màng BC trong nước dừa
ở pH = 5,0
Nhiệt độ (
o
C) Trạng thái màng
Khối lượng
trung bình (g)
15 Không phát triển 0,00
20 Màng mỏng- mềm 87,50
25 Trung bình- chắc 128,82
28-31 Dày- chắc 195,02
35 Không tạo màng 0,00
40 Không tạo màng 0,00
( Trần Phú Hòa, 1996)
Một trong những điều kiện quan trọng ảnh hưởng tới sự hoạt động sống của
vi sinh vật là độ acid của môi trường. A. xylinum là một loài chịu acid nên môi
trường thường được điều chỉnh về pH 3,5-4 bằng acetic cacid 40%. Trong 4 ngày
đầu pH tăng dần từ 3,78 đến 3,91. Sau đó giảm dần đến ngày thứ 10 thì đạt giá trị
pH= 3,35. Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành màng BC được thể hiện qua bảng 6.
Bảng 6: Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành màng BC
Độ pH Độ dày- trạng thái Khối lượng màng (g)
2,5 Không tạo màng 0,00
3,0 Không tạo màng 0,00
3,5 Màng mỏng- mềm 92,60
4,0 Màng mỏng- mềm 148,52
4,5 Màng dày- chắc 188,32
5,0 Màng dày- chắc 193,89
5,5 Màng dày- chắc 184,20

6,0 Màng dày- chắc 173,70
6,5 Màng mỏng- chắc 163,85
7,0 Màng mỏng- mềm 86,90
7,5 Không tạo màng 0,00
8,0 Không tạo màng 0,00
( Trần Phú Hòa, 1996)
9
1.2. Tổng quan về vi khuẩn Acetobacter xylinum
1.2.1. Phân loại vi khuẩn Acetobacter xylinum
Phân loại khoa học của Acetobacter xylinum:
Giới: Vi khuẩn
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Alpha Proteobacteria
Bộ: Rhodospirillales
Họ: Acetobacteraceae
Chi: Acetobacter
Loài: Acetobacter xylinum
Vi khuẩn Acetobacter phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể phân lập
được các từ không khí, đất, nước, lương thực, thực phẩm, dấm, rượu, bia, hoa quả…
Có nhiều loài thuộc giống Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó có
nhiều loài có ý nghĩa kinh tế.
Acetobacter xylinum (A. xylinum) thuộc nhóm vi khuẩn acetic và có nguồn
gốc từ Philippines. Theo hệ thống phân loại của Bergey (1989) thì A. xylinum là vi
khuẩn Gram âm, thuộc lớp Schizommycetes, bộ Pseudomonadales, họ
Pseudomonadieae (Krieg và Holt, 1984).
Đến nay đã có nhiều tác giả đề cập đến vấn đề phân loại các loài vi khuẩn
trông giống Acetobacter, nhưng đáng chú ý nhất là bảng phân loại Acetobacter của
J-Frateur (1950). Frateur đã đưa ra một khóa phân loại vi khuẩn Acetobacter dựa
trên các tính chất sinh hoá. Trên cơ sở này, Frateur đã chia thành 4 nhóm:
Suboxydans, mesoxydans, oxydans và peroxydans.

• Nhóm Suboxydans gồm các loài Acetobacter suboxydaz và Acetobacter
melanogennum.
• Nhóm Mesoxydans gồm Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti và
Acetobacter mesoxydans.
• Nhóm Oxydans gồm các loài không có khả năng tạo các hợp chất keto như
Acetobacter ascendans, Acetobacter ransens và Acetobacter lovaniens.
10
• Nhóm Peroxydans gồm Acetobacter pezoxydans và Acetobacter paradoxum
không chứa catalase và không oxy hoá được glucose
.

Một số đặc điểm chung của Acetobacter:
 Dạng hình que, tuỳ điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, thành phần môi trường nuôi
cấy) mà các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra các tế bào có hình thái khác biệt
dạng kéo dài hoặc phình to ra.
 Tế bào đứng riêng lẽ hoặc kết thành từng chuỗi.
 Kích thước thay đổi tuỳ loài (0,3-0,6 x 1,0-8,0 µm), có thể di động (có tiên
mao đơn hoặc chu mao), hoặc không di động (không có tiên mao).
 Hiếu khí bắt buộc và chịu được độ acid cao.
 Có khả năng đồng hoá nhiều nguồn thức ăn cacbon khác nhau nhưng không
sử dụng được tinh bột.
 Có khả năng tạo thành váng trên môi trường lỏng, khả năng tạo thành váng
thay đổi tuỳ loại.
 Có khả năng đồng hoá muối amôn (NH
4
)
+
và phân giải pepton. Một số loài
đòi hỏi một số acid amin nhất định như pantothenic acid và các chất khoáng (K,
Mg, Ca, Fe, P, S …)ở dạng muối vô cơ, hữu cơ hoặc hợp chất hữu cơ. Do đó bia,

dịch nấm men, nước mạch nha, nước trái cây… là nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sự
phát triển của vi khuẩn Actobacter. Ngoài khả năng oxy hoá ethanol thành acetic
acid, một số loài Acetobacter còn tổng hợp được vitamin B
1
, vitamin B
2
, oxy hoá
sorbit thành đường sorbose (dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C)…
Sau đây là một số loài quan trọng trong chi Acetobacter:
 Acetobacter xylinum: trực khuẩn không di động, tạo thành váng nhăn và khá
dày.Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H
2
SO
4
và thuốc nhuộm Iod sẽ bắt màu
xanh, ccó thể tích luỹ 4,5% acetic acid trong môi trường.
 Acetobacter schutzenbachi: trực khuẩn khá dài, tạo thành váng dày, và không
bền vững, có khả năng tích luỹ trong môi trường đến 11,5% acetic acid do đó
thường được sử dụng để làm giấm theo phương pháp của Đức.
 Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng, dễ vỡ ra, có khả năng chuyển
hoá glucose thành gluconic acid hay sorbic thành sorbose. Loại vi khuẩn này muốn
11
phát triển bình thường cần được cung cấp một số chất sinh trưởng như para
aminopenzoic acid, panthoteric acid, nicotinic acid.
 Acetobacter orleansen: trực khuẩn dài trung bình không di động. Gặp điều
kiện nhiệt độ cao có thể sinh ra các tế bào dị hình kéo dài hoặc phình to ra. Có thể
phát triển được có nồng độ rượu cao (10% -12%) và làm tích luỹ đến 9,5% acetic
acid. Do vậy thường được dùng trong công nghiệp chuyển rượu vang thành giấm
(phương pháp của Pháp), phát triển thích hợp ở nhiệt độ 25
o

C -30
o
C.
 Acetobacter aceti: Trực khuẩn ngắn, không di động, thường xếp thành từng
chuỗi dài. Váng của vi khuẩn bắt đầu màu vàng khi nhuộm bằng thuốc nhuộm Iod,
chúng có thể phát triển trong môi trường có nồng độ rượu khá cao 11% và có thể
tích luỹ đến 6% acetic acid trong môi trường, phát triển thích hợp nhất ở nhiệt độ
34
o
C.
 Acetobacter pasteurianum: hình dạng tương tự như Acetobacter aceti nhưng
váng vi khuẩn có dạng khô và nhăn nheo, váng bắt màu xanh khi nhuộm với thuốc
Iod.
1.2.2. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn A. xylinum
A. xylinum là loại vi khuẩn hình que dài khoảng 2 µm, đứng riêng lẻ hoặc
xếp thành chuỗi, có khả năng tạo váng hemicellulose khá dày, bắt màu xanh với
thuốc nhuộm Iod và H
2
SO
4
(do phản ứng của hemicellulose), sinh trưởng ở pH < 5,
nhiệt độ 28-32
o
C và có thể tích luỹ 4,5% acetic acid.
Acetic acid là sản phẩm sinh ra trong quá trình hoạt động của vi khuẩn,
nhưng khi chúng vượt quá mức cho phép sẽ quay ngược trở lại làm ức chế hoạt
động của vi khuẩn.


12

Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn A. xylinum quan sát dưới kính hiển vi
(
Tế bào hình que, đứng riêng lẻ hoặc từng chuỗi, không di động)
Theo Hestrin (1947), pH tối ưu để A. xylinum phát triển là 4,5 và nó không
phát triển ở 37
0
C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu. Theo Bergey, nhiệt
độ tối ưu để A. xylinum phát triển là 25
0
C- 30
0
C. Còn theo Marcormide (1996) thì
A. xylinum có thể phát triển được ở pH từ 3 – 8, nhiệt độ là 12
0
C- 32
0
C và nồng độ
ethanol lên đến 10% (Trần Thị Ánh Tuyết, 2004).
Nguồn carbohydrate mà A. xylinum sử dụng cho khả năng tạo sinh khối cao
là glucose, fructose, mannitol, sorbitol; hiệu suất sẽ thấp hơn khi sử dụng glycerol,
lactose, sucrose, maltose; và hiệu suất bằng 0 nếu sử dụng sorbose, mannose,
cellobiose, erythritol, ethanol và acetate (Phùng Lê Nhật Đông, Trần Kim Thủy,
2003).
Các phản ứng sinh hóa đặc trưng cho A. xylinum bao gồm phản ứng catalase
(+), oxi hóa ethanol thành acetic acid (+), chuyển hóa glucose thành acid (+) và khả
năng tạo màng cellulose là phản ứng phân biệt giữa các chủng có khả năng sinh tổng
hợp cellulose.
1.2.3. Khả năng tạo màng BC của A. xylinum
Trong chi Acetobacter thì A. xylinum là loài có khả năng tạo ra BC tốt nhất

và nhiều nhất trong tự nhiên. Một tế bào A. xylinum có thể chuyển hoá 108 phân tử
glucose thành cellulose trong 1 giờ (Brown và cs, 1976).
Các tế bào A. xylinum khi sống trong môi trường lỏng sẽ thực hiện quá trình
trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ đường glucose, kết hợp đường với acid
13
béo để tạo thành tiền chất nằm ở màng tế bào. Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ
hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng với một enzyme có thể polymer hóa
glucose thành cellulose ( Bazon và cs, 1984).
Sự tổng hợp lớp màng cellulose ngoại bào của vi khuẩn A. xylinum được
Brown báo cáo lần đầu tiên vào năm 1886 nhưng đến giữa thế kỉ XX thì A. xylinum
và BC mới được nghiên cứu sâu bởi Hestrin và cộng sự.
Năm 1943 – 1954, Hestrin và các cộng sự trong một nghiên cứu về khả năng
tổng hợp BC của vi khuẩn A. xylinum đã chứng minh rằng A. xylinum có thể sử
dụng đường trong điều kiện hiếu khí để tạo nên cellulose.
Năm 1957, Next và Colvin chứng minh rằng cellulose được A. xylinum tổng
hợp trong môi trường có đường và ATP.
Năm 1989, nhóm Saxena Trường Đại học Texa đã thu nhận được enzyme
cellulose synthase tinh sạch của A. xylinum. Enzyme này gồm 2 chuỗi polypeptide
có trọng lượng phân tử là 83 và 93 kD. Trong đó, tiểu phần 83 kD liên quan đến quá
trình sinh tổng hợp cellulose tinh khiết. Năm 1990, nhóm đã xác định được gen tổng
hợp cellulose ở A. xylinum (dòng hoá và giải trình tự đoạn gen tổng hợp cellulose).
Dưới đây là cơ chế tổng hợp cellulose của A. xylinum từ nguồn đường glucose:
Glucose
(glucokinase)
Glucose-6-Phosphate
(phosphoglucomutase)
Glucose-1-Phosphat
(UDP-glucose pyrophosphorylase)
UDP-Glucose
(cellulose synthase)

Cellulose

BC được tổng hợp bởi vi khuẩn A. xylinum có bản chất là hemicellulose (là
những polysaccharide không tan trong nước nhưng tan trong dung dịch kiềm tính)
có đặc tính cấu trúc và cơ học khá giống với cellulose thực vật nhưng có một số đặc
14
điểm khác biệt như độ bền đứt cao, mật độ polymer hóa cao và có độ thuần khiết
cao hơn cellulose thực vật (Trần Thị Ánh Tuyết, 2004).
Các chuỗi đơn phân tử glucan liên kết với nhau bằng liên kết Van der Waals.
Qua nối hydro, các lớp đơn phân tử sẽ kết hợp với nhau tạo nên cấu trúc tiền sợi với
chiều rộng 1,5 nm. Các tiền sợi này sẽ kết hợp với nhau tạo thành dải có kích thước
từ 3 – 4 nm và chiều rộng 70 – 80 nm. Theo Zaaz (1977) kích thước của dải là 3,2 x
133 nm, còn theo Brown và cộng sự (1976) thì kích thước của dải là 4,1 x 177 nm.
So với cellulose thực vật thì BC có độ polymer hóa cao hơn, từ 2000 – 6000 gốc, có
trường hợp lên đến 16000 hay 20000 gốc. Trong khi đó, khả năng polymer hóa của
cellulose thực vật chỉ từ 13000 – 14000 ( Trần Thị Ánh Tuyết, 2004).
Con đường tổng hợp cellulose từ A. xylinum như sau:

Hình 1.3. Sơ đồ quá trình tổng hợp Cellulose của A. xylinum
15
1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng ccellulose vi khuẩn
1.3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng cellulose vi khuẩn trên thế giới
Do các đặc tính ưu việt như bền, dai , chắc mà BC có thể ứng dụng vào nhiều lĩnh
vực khác nhau (bảng 7).
Bảng 7. Một số ứng dụng của màng BC trên thế giới
Lĩnh vực Ví dụ

Thực phẩm
- Thức ăn tráng miệng (thạch dừa, cocktail, Kombucha, tr
à

Manchurian…)
- Các loại bánh snack, kẹo có năng lượng thấp
- Chất làm đặc để bổ sung trong kem, dầu trộn salad -
Màng
bao thực phẩm, màng bảo quản trái cây
- Chất ổn định thực phẩm

Y học
- Chất thay thế da tạm thời (da nhân tạo)
- Bột cellulose ứng dụng làm tá dược trong bào chế viên nén
- Băng gạc, băng trị phỏng

Mỹ phẩm

Ổn định kem dưỡng da
- Chất làm se (astringent)
- Chất làm đặc và làm chắc trong thuốc sơn móng tay
Môi trường - Làm miếng bọt để xử lí sạch các vết dầu tràn
- Hấp thu và loại bỏ những nguyên vật liệu độc

(
www. botany. utexas. edu/ facstaff / facpages / mbrown / position 1. htm )
Trong y học, màng BC được ứng dụng trong các điều trị bệnh về phỏng và
mang lại nhiều kết quả tốt. Tỉ lệ bao phủ vết thương từ 9%- 18%, cách ngăn vết
thương với môi trường bên ngoài, làm sạch và thông thoáng, giúp vết thương mau
lành. Các vết thương sau phẫu thuật, chứng lở loét cũng được điều trị có hiệu quả
bằng màng BC (Jonas R và Farah F, 1998).
16
Một ứng dụng khá thú vị vừa được các nhà khoa học của Đại học Thực
nghiệm London, Anh hợp tác với các nhà thiết kế của Đại học Hội họa và Thiết kế

Saint Martins đó là tạo ra loại vải siêu bền từ màng BC.
(
1.3.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng cellulose vi khuẩn tại Việt Nam
Hiện nay, A. xylinum cũng như BC là đối tượng của nhiều nghiên cứu ứng
dụng của các nhà khoa học trong nước. Sự phát triển các ứng dụng mới đòi hỏi sản
xuất BC phải đạt quy mô công nghiệp với nhiều yêu cầu: Thứ nhất, đa dạng hoá
nguồn nguyên liệu ban đầu (không chỉ là nước dừa già, mà số lượng rất hạn chế).
Thứ hai, các chủng giống mới phù hợp hơn với yêu cầu kỹ thuật như tế bào dài để
BC có độ bền chắc hơn, đặc biệt là phát triển nhanh trong các loại môi trường khác
nhau. Thứ ba, cần sàng lọc các chủng giống thích hợp với điều kiện lên men.

Nguyễn Thúy Hương và Phạm Thành Hổ (2003) đã nghiên cứu chọn lọc dòng
A. xylinum thích hợp cho các loại môi trường trong sản xuất cellulose vi khuẩn với
qui mô lớn nhằm sàng lọc một số dòng A. xylinum phát triển tốt trên 2 loại môi
trường mật rỉ đường và nước mía. Các kết quả đạt được trên 2 loại môi trường này
hứa hẹn sử dụng tốt trong sản xuất BC với quy mô công nghiệp.
Cũng nhằm mục đích nâng cao khả năng sản xuất BC ở quy mô công nghiệp,
tác giả Nguyễn Thúy Hương (2008) đã thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cơ
chất và kiểu lên men đến năng suất, chất lượng của BC. Nghiên cứu này nhằm khảo
sát khả năng lên men tạo BC trên nhiều loại nguyên liệu khác nhau. Kết quả của
nghiên cứu này cho thấy có thể lên men sản xuất BC từ dịch rỉ đường, nước mía, dịch
thải trái cây. Khảo sát tính ổn định của giống cho thấy: mật độ Cel
-
(tế bào mất khả
năng tạo BC) tăng dần sau mỗi đợt cấy chuyền và cao hơn trong môi trường không
bổ sung ethanol. Ngoài hình dạng bên ngoài hoàn toàn khác nhau, độ chịu lực của BC
nuôi cấy bề mặt cao hơn nhiều so với nuôi cấy chìm. Tuy nhiên khả năng giữ nước,
độ ẩm của BC nuôi cấy chìm cao hơn so với nuôi cấy bề mặt.
Trong lĩnh vực thực phẩm, tác giả Nguyễn Thúy Hương (2008) tiếp tục thực
hiện nghiên cứu thử nghiệm khả năng cố định tế bào vi khuẩn A. xylinum trên giá

17
thể cellulose do chính vi khuẩn sản sinh ra để tạo chế phẩm phục vụ nhân giống
nhanh và hiệu quả. Để tạo màng thực phẩm, vi khuẩn được lên men bề mặt, thu
hoạch màng sau 1 ngày nuôi cấy. Qua thực nghiệm cho thấy, nồng độ chế phẩm
giống là 2%, có thể tái sử dụng lên men thu nhận cellulose vi khuẩn 7 lần mà vẫn
đảm bảo về mặt thời gian, sản lượng, chất lượng BC và hoàn toàn không có sự khác
biệt so với chế phẩm dịch giống truyền thống.
Bên cạnh đó, Nguyễn Thúy Hương và Trần Thị Tưởng An (2007) còn thực
hiện nghiên cứu việc cố định tế bào vi khuẩn Lactococcus lactic trên chất mang BC
để ứng dụng lên men thu nhận bacteriocin và bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu. Kết
quả nghiên cứu cho thấy hiệu quả sử dụng chế phẩm tế bào vi khuẩn cố định trên
BC để lên men thu nhận bacteriocin khá cao, có thể tái sử dụng 9-10 lần mà vẫn
đảm bảo về mặt thời gian lên men, số lượng và chất lượng bacteriocin so với đối
chứng. Thịt tươi có thể ccđược bảo quản đến 3 ngày bằng màng BC hấp phụ dịch
bacteriocin 200 AU/m vẫn đảm bảo chất lượng thịt, theo TCVN 7046:2002. Kết quả
thu được cũng góp phần thăm dò 2 ứng dụng mới của BC đó là sử dụng BC làm
chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật và sử dụng màng mỏng BC làm
màng bao thực phẩm.

Trong lĩnh vực y học, Huỳnh Thị Ngọc Lan và cộng sự (2001) đã nghiên cứu
tạo màng sinh học trị bỏng từ sinh khối A. xylinum của nhằm ứng dụng trong điều
trị thỏ gây bỏng thực nghiệm. Vết bỏng của thỏ gây bỏng nông thực nghiệm lành
sau 22 ngày điều trị bằng màng sinh học tẩm dầu mù u so với lô thỏ dùng gạc tẩm
dầu mù u và so với lô chứng dương đều là sau 29 ngày. Màng BC tẩm dầu mù u
điều trị phỏng có nguồn gốc vi khuẩn ngăn không cho vết thương nhiễm trùng và
giúp vết thương mau lành. Kết quả của nghiên cứu này cho phép tiến hành những
nghiên cứu sâu hơn về màng BC tẩm dầu mù u thu được nhờ quá trình nuôi cấy vi
khuẩn A. xylinum để hoàn thành hồ sơ nghiên cứu và đưa ra thị trường sản phẩm
màng sinh học tẩm dầu mù u.

18
1.4. Tính cấp thiết và mục tiêu của đề tài
1.4.1. Tính cấp thiết của đề tài
Tình trạng rác thải nilon hiện nay ngày càng gia tăng đã và đang ảnh hưởng
nghiêm trọng đến môi trường và sức khỏe con người. Do nhu cầu sử dụng túi nilon
diễn ra hàng ngày hàng giờ nên lượng rác thải nilon tồn đọng ngày càng nhiều. Mặc
khác, các hiểu biết về tác hại của túi nilon trong cộng đồng còn rất hạn chế. Các giải
pháp tiêu hủy, xử lí chưa triệt để như nếu mang đốt, chúng sẽ gây ô nhiễm không
khí, trong khi đó chôn lấp sẽ rất tốn đất và ảnh hưởng tới nguồn nước ngầm. Hoạt
động tái chế cần đầu tư thiết bị máy móc đắt tiền, hiệu quả kinh tế thấp, gây nhiều
tác hại xấu cho hiện tại và sau này.
Mỗi năm có từ 500 tỉ đến 1000 tỉ túi nilon được sử dụng và vứt bỏ trên khắp
thế giới, có nghĩa là trong vòng 1 giây thì có hơn 1 triệu túi nilon được thải vào môi
trường. Nhưng chỉ từ 0,6 - 1% túi nilon được tái sử dụng.
Túi nilon rất khó "tái sử dụng", khi không được thu gom sẽ gây tắc nghẽn
cống rãnh, làm ứ đọng nước thải, phát sinh ruồi muỗi, dịch bệnh, phá hủy mỹ quan
và hệ sinh thái đô thị. Nằm lẫn trong đất, chúng sẽ cản trở sự sinh trưởng của thực
vật bởi nilon rất khó phân hủy, nếu không có sự tác động bởi nhiệt độ cao của ánh
sáng mặt trời thì phải mất từ 50 năm đến 100 năm hoặc có thể lâu hơn mới phân
hủy được.
Trong quá trình đó, túi nilon sẽ bị quang hủy ra thành những phần tử nhỏ
hơn, là những chất độc có thể sẽ tham gia vào mạng lưới thức ăn giữa các sinh vật,
khi chúng vô tình bị các con vật ăn phải. Mỗi năm có khoảng 100000 rùa biển, cá
heo, và các sinh vật khác bị chết do tưởng nhầm túi nilon là đồ ăn.
(
Theo các nhà khoa học, trong một số loại túi nilon có lẫn lưu huỳnh khi bị
đốt cháy, gặp hơi nước sẽ tạo thành sunfuric acid dưới dạng các cơn mưa acid, rất
có hại cho phổi người và động vật. Đối với túi nilon làm bằng nhựa PVC có chứa
clo, khi cháy tạo ra chlohydric acid và chất dioxin - độc chất mà nhân loại đang tiến

hành loại trừ theo Công ước Stockholm về bảo vệ môi trường. Các loại túi nylon
19
chứa các phụ gia độc hại còn là nguyên nhân gây ra nhiều căn bệnh nguy hiểm như
ung thư, biến đổi gen, các bệnh về da, đường ruột,…
(
Túi nilon chỉ dùng qua một hoặc hai lần sau đó bị thải ra ngoài môi trường
còn gây ra một sự lãng phí khá lớn. Ông Nguyễn Thành Lưu, Chủ tịch Trung tâm
Hỗ trợ ứng phó biến đổi khí hậu cho biết: một khảo sát vào tháng 9/2008 của Trung
tâm với hơn 200 người tiêu dùng tại Hà Nội cho thấy, bình quân mỗi gia đình sử
dụng (được siêu thị, cửa hàng, người bán hàng cấp miễn phí) 11,3 túi nilon một
ngày. Theo ông Lưu, nếu mỗi túi nilon trị giá trung bình 200 đồng thì với khoảng
800000 gia đình Hà Nội (số liệu cũ) sẽ thải 9 triệu túi nilon một ngày, tương đương
3 tỷ túi nilon một năm. Như vậy, số tiền bị lãng phí lên tới 648 tỷ đồng mỗi năm.
Chính vì những lý do trên mà nhiều nước trên thế giới đã bắt đầu nghiên cứu
sả xuất polymer tự phân huỷ kể từ những năm 1980 để sử dụng trong nông, lâm
nghiệp, chế biến thực phẩm (bao túi đựng thực phẩm) và y tế (màng mỏng phủ vết
bỏng và polymer để gắn xương).
Ở Việt Nam, các nhà khoa học và các nhà sản xuất cũng đang tìm ra nhiều
giải pháp thay thế túi nilon như sử dụng 100% tinh bột bắp, khoai tây hoặc khoai
mì để tạo ra bao bì tự hủy. Ngoài ra còn có phương pháp phối trộn tinh bột với
nguyên liệu sản xuất nilon truyền thống, nhằm đẩy nhanh quá trình phân hủy và
giảm được lượng chất thải ra môi trường. Và còn rất nhiều giải pháp được đưa ra
nhưng chưa đem lại kết quả khả quan.
Đối với việc sử dụng 100% tinh bột từ bắp hay khoai mì để tạo bao bì sẽ ảnh
hưởng đến vấn đề lương thực. Giá thành bao bì tạo ra cũng rất cao (gấp 4-5 lần so
với túi nilon), nguồn nguyên liệu không thể đáp ứng được và công nghệ sản xuất
chưa được hoàn thiện.
Phương pháp phối trộn nguyên liệu cũng không đạt hiệu quả do loại bao bì
tạo ra chỉ có khả năng phân hủy phân nguyên liệu tự nhiên ( tinh bột, khoai tây,
bắp…) còn phần nguyên liệu từ dầu mỏ chỉ phân rã chứ không phân hủy hoàn toàn.