Một số phương pháp cụ thể thường được dùng cho kỹ thuật giải trình tự ADN - Phương pháp 1 ppsx

Một số phương pháp cụ thể thường được dùng
cho kỹ thuật giải trình tự ADN – Phương pháp 1






Phương pháp 1: Tinh sạch Plasmid cho giải trình tự ADN.
Hiện nay có nhiều kỹ thuật tinh sạch plasmid khác nhau, phương pháp được
trình bày dưới đây là phương pháp thu được plasmid có độ tinh sạch cao, có thể
dùng cho cả giải trình tự ADN thủ công và tự động hóa. Quá trình này là cải tiến
phương pháp sử dụng dịch kiềm làm tan tế bào, sau đó sử dụng sắc ký qua cột trao
đổi ion. Cũng như các sản phẩm được lưu hành trên thị trường của các công ty,
hạn chế lớn nhất của phương pháp này là giá thành của nhựa trao đổi ion tương
đối đắt. Thực tế có rất nhiều công việc phải giải trình tự một cách thủ công và các
cán bộ nghiên cứu đã tìm ra nhiều phương pháp tinh sạch khác nhau để thu nhận
ADN đạt độ sạch cần thiết, thậm chí có thể dùng cho giải trình tự ADN tự động.
Tuy vậy, nhiều người vẫn thích sử dụng cột trao đổi ion, kết quả có thể đọc được
tới 600 bps hoặc nhiều hơn nữa.

Quá trình tinh sạch như sau:
+ Nuôi cấy vi khuẩn mang plasmid trên môi trường chọn lọc với kháng
sinh tương ứng (khoảng 3 ml).
1, Phân 3 ml môi trường LB chứa 100 mg/ml apicilin trong ống nghiệm
vô trùng (12X100 nm có nút).
2, Vô trùng đầu que cấy trên lửa và làm nguội trên mặt đĩa thạch.
3, Lấy sinh khối từ một khuẩn lạc và đưa vào ống nghiệm chứa môi
trường nuôi cấy trên.
4, Nuôi cấy vi khuẩn 37
o

C qua đêm có lắc vừa phải.
+ Chuẩn bị ADN dùng cột Qiagene:
Các cột Qiagene được chuẩn bị dễ dàng và nhanh để tinh sạch ADN không
cần dùng gradient CsCl. ADN được chuẩn bị theo phương pháp này đạt kết quả rất
tốt cho việc biến nạp và giải trình tự gene.
Có hai chú ý quan trọng khi dùng cột Quiagene là: (1) Không sử dụng quá
nhiều mẫu lên cột, điều này rất quan trọng vì nếu dùng thể tích quá nhiều kết quả
là sẽ có nhiều protein ảnh hưởng đến khả năng bám cột của ADN. Với cách này có
thể nhận được lượng ADN có chất lượng cao hơn từ thể tích ít hơn. Nếu như
lượng ADN thu được ít từ lần thử đầu tiên thì cần thực hiện đúng theo chỉ dẫn để
lần thử thứ 2 với thể tích lớn hơn. Khi có một loạt thể tích mẫu được Quiagene
khuyến cáo lên cột để đạt được hiệu suất tinh sạch cao nhất thì nên dùng lượng
dịch lên cột có thể tích nhỏ nhất. (2) Đảm bảo cột phải được rửa hai lần trước khi
giải phóng ADN ra khỏi cột, điều này cũng rất có ý nghĩa vì việc rửa như vậy sẽ
loại trừ được protein và các thành phần tạp nhiễm khác.
+ Các bước dùng cột trao đổi Qiagene (tài liệu hướng dẫn sử dụng
Quiagene):
1. Ly tâm khoảng 1,3 ml dịch vi khuẩn mang plasmid. Làm tan với
0.3 ml đệm P1 có RNase, chuyển sang tube mới.
2. Thêm vào 0.3 ml đệm P2 và trộn đều, giữ ở nhiệt độ phòng 5 phút
(không nên để lâu hơn).
3. Thêm vào 0.3 ml đệm P3 trộn đều ngay nhưng phải nhẹ nhàng, ly
tâm ở 4
o
C trong 30 phút với tốc độ 15000 v/phút. Thu lấy phần trên
tủa.
4. Ly tâm lại như bước 3 một lần nữa để loại các phần cặn nếu có.
5. Cân bằng đệm cho cột Qiagene-tip 20 với 1ml QBT và để cho đệm
chảy hết tự do.
6. Đưa phần dịch thu được ở bước 4 lên cột và để tự chảy qua cột.

7. Rửa cột 2 lần, mỗi lần 1 ml đệm QC.
8. Thu ADN với 0.8 ml đệm QF.
9. Kết tủa ADN với 0.7 thể tích isopropanol (trước đó đưa về nhiệt độ
phòng). Ly tâm 15000 v/phút tại 4
o
C.
10. Rửa ADN thu được với ethanol 70%, để khô 5 phút và hoà tan lại
trong thể tích đệm thích hợp (25ml). Chú ý trong trường hợp mẫu
dùng cho giải trình tự ADN tự động huỳnh quang thì hoà tan mẫu
trong nước.
Nói chung sử dụng cột Qiagene thu được trên 90% ADN và thường được
dùng cho tinh sạch Plasmid và cosmit (kích thước dưới 2 Kbs đến lớn hơn 50
Kbs). Số lượng plasmid thu nhận được từ tế bào E.coli phụ thuộc vào hệ tế bào
chủ, loại plasmid từ thấp trung bình đến số lượng plamid cao và điều kiện nuôi cấy
(có thể tham khảo tài liệu liên quan từ các chỉ dẫn của Qiagene để quyết định số
lượng tế bào dùng để xử lý cho mỗi loại kích thước cột).
Chú ý cách làm sạch và tái sử dụng cột:
1, Thêm ethanol đầy vào cột, ly tâm.
2, Bỏ ethanol và ly tâm lại một lần nữa.
3, Lặp lại bước 1 và 2 với nước cât.
4, Giữ cột ở trạng thái khô cho đến lần sử dụng về sau.
(Cột có thể được dùng cho nhiều lần tuy nhiên khi muốn tinh sạch ADN
dùng cho tách dòng thì nên dùng cột mới).

Các loại dịch đệm dùng cho cột Qiagene:
Đệm P1 50 mM Tris -HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0, Rnase A
pha ngay trước khi dùng trong đệm P1 nồng độ 100
µg/ml
B
ảo quản

4
o
C
Đệm P2 200 mM NaOH,1%SDS Nhiệt độ
phòng
Đệm P3 2,55M KAc, pH 4,8 Nhiệt độ
phòng
Đệm QBT 750mM NaCl,50mM MOPS,15% ethanol, pH 7,0,
0,15% Triton X-100
Nhiệt độ
phòng
Đệm QC 1M NaCl, 50mM MOPS, 15% ethanol, pH 7,0 Nhiệt độ
phòng
Đệm QF 1,25M NaCl, 50mM MOPS, 15% ethanol, pH 8,2 Nhiệt độ
phòng