Ứng dụng của liệu pháp gen trong điều trị bệnh

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
1. GIỚI THIỆU CHUNG
Vào ngày 14-9-1990, nhóm nghiên cứu tại học viện sức khỏe quốc gia Mỹ
(U.S.National Instituse of Helth) đã tiến hành chuỗi thử nghiệm liệu pháp gen đầu
tiên cho bé Ashanti Desilva 4 tuổi. Sinh ra với căn bệnh di truyền hiểm nghèo có tên
là severe combined immune deficiency SCDI, cô bé thiếu hệ thống miễn dịch và có
thể bị tổn thương khi mắc phải bất kỳ mầm bệnh nào. Trẻ em mắc bệnh này thường
không chống lại được sự lây nhiễm của bệnh tật và rất khó sống đến tuổi trưởng
thành, tuổi thơ của chúng luôn mắc bệnh tật. Ashanti được lập một hành lang bảo vệ
xung quanh, không tiếp xúc với những người ngoài gia đình, trong môi trường vô
trùng tại nhà và được điều trị thường xuyên với kháng sinh liều cao.
Trong thủ tục liệu pháp gen của Ashanti, bác sĩ đã tách các tế bào máu trắng ra
khỏi cơ thể cô ta, cho chúng phát triển trong phòng thí nghiệm, gắn gen thiếu vào các
tế bào này và sau đó chuyển các tế bào đã được biến đổi di truyền trở lại máu của
bệnh nhân. Những kiểm tra trong phòng thí nghiệm đã cho thấy liệu pháp này đã làm
tăng hệ thống miễn dịch của Ashanti, cô ta không bị cảm lạnh trở lại, có thể đến
trường và đã miễn dịch với chứng ho. Thủ tục này không phải là một phương thuốc,
những tế bào máu trắng được xử lý về mặt di truyền chỉ làm việc trong một vài tháng
và quá trình này phải lặp lại.
Mặc dù sự giải thích đơn giản về liệu pháp gen này dường như có kết quả khả
quan, nhưng nó mở đầu cho một cuộc tranh luận kéo dài; con đường để liệu pháp gen
được chấp nhận chứa đầy những cuộc tranh luận. Liệu pháp gen sinh học ở người là
rất phức tạp, một số công nghệ cần được phát triển và những căn bệnh cần được hiểu
biết cặn kẽ hơn trước khi liệu pháp gen có thể được sử đụng một cách thích đáng.
Tuy nhiên, không thể phủ nhận rằng, ngày nay liệu pháp gen là một lĩnh vực
khổng lồ với cơ hội sinh lời lớn cho các nhà đầu tư có hiểu biết. Bằng chứng là sự
phát triển của các nghiên cứu về liệu pháp gen trong hơn một thập kỷ qua. Lĩnh vực
này có tiềm năng vô cùng to lớn, một số người đã so sánh tiềm năng đầu tư trong
công nghệ sinh học đặc biệt là liệu pháp gen với kinh nghiệm về công nghệ những
năm 1980.
2. LIỆU PHÁP GEN LÀ GÌ?

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
2.1. Định nghĩa liệu pháp gen.
Trong các ứng dụng của sinh học phân tử vào y học, liệu pháp gen đối với các rối
loạn di truyền mở ra nhiều triển vọng nhất, đồng thời cũng là hướng ứng dụng khó
thực hiện nhất. Các định nghĩa về liệu pháp gen được thay đổi theo thời gian, ngày
nay không có định nghĩa chung nào được chấp nhận cho khái niệm này. Song định
nghĩa sau đây được sử dụng rộng rãi nhất trong các diễn đàn Quốc tế.
Định nghĩa: liệu pháp gen là kỹ thuật đưa gen lành vào cơ thể thay thế cho
gen bệnh hay đưa gen cần thiết nào đó thay vào vị trí gen bị sai hỏng để đạt được
mục tiêu của liệu pháp.
- Biện pháp thứ nhất là cách giải quyết triệt để, vì gen lành sẽ được đưa vào đúng
vị trí của nó trên bộ gen và chịu tác động bình thường của các trình tự biểu hiện gen
đó. Cho đến nay, chưa có thành tựu đáng kể nào trong lĩnh vực này vì người ta chưa
biết cách sửa chữa gen một cách đặc hiệu. Tuy vậy, kỹ thuật tái tổ hợp đồng dạng
cũng đem dến những hy vọng rất lớn và khả năng thành công là điều hoàn toàn có thể
hy vọng trong tương lai.
- Biện pháp thứ hai dễ thực hiện hơn nhưng khi đưa thêm một gen cần thiết vào
bộ gen, người ta không làm chủ được vị trí gắn xen của đoạn mới đưa vào. Điều này
dẫn đến một số kết quả không lường trước được:
 Gen mới đưa vào không nằm trong phức hợp điều hoà nên có thể được
biểu hịên một cách tuỳ tiện, không đúng nơi (đúng với loại tế bào, mô đặc
hiệu) và không đúng lúc (đúng với chu trình phát triển cá thể), hoặc thậm
chí không được biểu hiện.
 Gen mới đưa vào gây những hiệu quả không mong muốn.
 Gen gắn vào một vị trí có khả năng hoạt hoá một gen tiền ung thư dẫn
dến sự biểu hiện quá độ của gen này gây ra ung thư.
Hiện nay, mọi cố gắng đều nhằm giải quyết những vấn đề này. Đặc biệt, liệu pháp
gen trong trường hợp này được giới hạn chặt chẽ trên tế bào sinh dưỡng. Việc tác
động vào gen của tế bào sinh dục bị nghiêm cấm vì lý do đạo đức, con người từ chối
việc thay đổi gia sản di truyền có thể lưu lại cho con thế hệ sau.

Liệu pháp gen có thể được tiến hành thông qua một số cách sau:
 Chuyển trực tiếp gen vào mô người bệnh.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
 Tạo véctơ virus để chuyển gen một cách hiệu quả tới tế bào (in vivo).
Virus xâm nhiễm trực tiếp vào tế bào bằng cách gắn với chúng và “bơm” thông tin di
truyền của chúng vào tế bào. Vì các virus tự nhiên tự sinh sản bên trong tế bào chủ
nên gây hại với vật chủ mang chúng. Tuy nhiên, có thể xoá hay làm mất các phần có
hại của virus, ngăn không cho chúng tái bản trong tế bào chủ. Ngày nay các virus
không có khả năng tái bản này được sử dụng chung cho các nghiên cứu liệu pháp gen
trên người và động vật.
 Sử dụng các kỹ thuật khác nhau để chuyển gen vào tế bào bên ngoài
người bệnh, sau đó chuyển các tế bào đã được biến đổi này vào người
bệnh (ex vivo). Phương pháp này được sử dụng chung để phân phối các
nhân tố phát triển và các phân tử khác tới các vùng đặc hiệu của cơ thể.
Chúng cũng được sử dụng để tạo ra các dòng tế bào đã bị biến đổi hoàn
toàn cho cấy ghép. Giống như trong liệu pháp gen in vivo, các tế bào được
chuyển có thể gây biểu hiện các protein lạ gây sưng tấy hay đáp ứng miễn
dịch.
 Các nhóm chuyên gia đã chia liệu pháp gen thành các mức khác nhau:
 Chuyển gen với sự hoà nhập (gen được kết hợp chặt chẽ với DNA của
vật chủ)
 Chuyển gen không hoà nhập (gen không kết hợp chặt chẽ với DNA của
vật chủ)
 Sử dụng các oligonucleotide tổng hợp nhân tạo gọi là các phân tử
ribozyme/antisense không có các thành phần điều hoà (sự biểu hiện gen đã
bị biến đổi).
2.2. Các bước cơ bản trong liệu pháp gen
Trong thực nghiệm, người ta dùng các vector virus để chuyển các gen vào tế bào
động vật theo 2 bước:
Bước 1: Tạo vector tái tổ hợp mang gen cần chuyển. Trước đó, các virus đã được

biến đổi để không còn khả năng sao chép, đồng thời lại có khả năng biểu hiện mạnh
gen cần đưa vào cơ thể. Các biến đổi này bao gồm việc loại bỏ các trình tự cần cho
sự sao chép của virus và gắn vào trước gen các trình tự promotor mạnh. Sau đó,
vector tái tổ hợp được đưa vào tế bào nuôi cấy. Loại tế bào được sử dụng nhiều nhất
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
là tế bào tuỷ xương vì dễ nuôi cấy lại bao gồm nhiều tế bào nguồn đa thế (pluri
potential)
Bước 2: Vector virus mang gen lành được đưa vào cơ thể mà từ đó người ta đã
tách các tế bào tuỷ xương. Như vậy, có thể xem đây là kỹ thuật ghép tự thân dù gen
ghép vào là gen lạ đối với cơ thể. Trở ngại lớn là protein do gen lạ tạo ra có thể kích
thích sản sinh kháng thể chống lại chính nó, hơn nữa, nếu việc chuyển gen vào tế bào
nuôi cấy thường thành công thì việc đưa tế bào chuyển gen trở lại cơ thể lại ít khi có
hiệu quả do nhiều nguyên nhân.
Gần đây nhất, một quy trình liệu pháp gen vừa được thông qua nhằm làm chậm sự
phát triển của bệnh AIDS. Người ta chuyển các oligonucleotit đối (antisens) bổ sung
cho một số trình tự của virus HIV (trình tự TAR, REV) vào các tế bào của một người
lành là anh em sinh đôi của người bệnh. Sau đó các tế bào này được tiêm vào bệnh
nhân. Các Oligonicliotit đối TAR sẽ ức chế sự sao chép của virus khi bắt cặp và vô
hiệu hóa trình tự TAR đóng vai trò trong sự sao chép. Còn các Oligonucleotit đối
REV, khi bắt cặp với trình tự REV sẽ ngăn sự vận chuyển mRNA từ nhân ra tế bào
chất.
2.3. Ứng dụng của liệu pháp gen trong điều trị bệnh
Đến nay có 533 thử nghiệm liệu pháp gen diễn ra trên thế giới. Với 407 thử
nghiệm diễn ra ở Mỹ, đây là nước dẫn đầu trong các thử nghệm của liệu pháp gen.
Trong số 533 thử nghiệm, có 322 thử nghiệm trong điều trị bệnh ung thư, chiếm
62,28%, 37 thử nghiệm trong điều trị HIV chiếm 6,94%, ngoài ra là các thử nghiệm
với các bệnh tim mạch, u xơ, SCID (severe combined immune deficiency), chứng
máu khó đông...
3. CÁC YẾU TỐ KỸ THUẬT TRONG CHUYỂN GEN
“Không hệ thống véctơ nào là tối ưu cho tất cả các kỹ thuật của liệu pháp gen’

Kay, M., Glorioso, J., Naldini, L. Nature Medicine 7 (1) 2001
3.1. Các cơ sở của sinh học phân tử:
Thông tin di truyền dưới dạng DNA tồn tại trong mỗi tế bào của cơ thể (trừ các tế
bào máu). Mỗi tế bào chứa đựng các thông tin để xây dựng bất cứ dạng tế bào hay
mô đặc hiệu nào của sinh vật. Vì các tế bào và mô khác nhau quy định sự sản xuất
của các khối cấu trúc (building block) khác nhau nên DNA chứa đựng thông tin liên
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
quan đến khối các cấu trúc để sản xuất các mô đặc hiệu. Sự tiến hoá đã cung cấp một
giải pháp tuyệt vời cho vấn đề này. DNA được tạo nên từ một chuỗi bốn phân tử
khác nhau: adenine, guanine, cytosine và thymine. Sự kết hợp của các phân tử này tạo
nên “ngôn ngữ” của DNA. Gen, được tạo nên từ DNA mã hoá tất cả các protein, là
khối cấu trúc của tế bào. Các promoter cho phép hoạt hoá của các gen và qua đó các
protein đặc hiệu được biểu hiện. Các vùng khác của DNA không mang mã và là phần
quan trọng để bảo tồn cấu trúc nhiễm sắc thể. Thành phần này của của DNA vô cùng
quan trọng trong các dự án về bộ gen, tính tuần hoàn đoạn của DNA trong các vùng
không mang mã có thể được kết hợp với các gen đã biểu hiện, cho chúng ta phương
pháp tìm kiếm các gen chưa biết.
Tự nhiên đã phát triển một cách thức rất thông minh mà qua đó các protein
đặc hiệu chỉ được biểu hiện trong các mô dặc hiệu. DNA sắp thành các sợi dài gọi là
nhiễm sắc thể. Có hai bản sao của mỗi gen tồn tại trong tế bào. Tuy nhiên có một số
trường hợp ngoại lệ, các gen tồn tại trong các nhiễm sắc thể X và Y (nhân tố quyết
định giới tính) có thể chỉ có duy nhất một bản sao.
Thông tin được truyền từ DNA đến các cơ quan phức tạp hơn. Quá trình phiên
mã được bắt đầu bởi các phân tử nhận biết đặc hiệu có tên là các nhân tố phiên mã
(nhân tố gắn với các chuỗi điều hoà của gen và cho phép sự sao chép được tiến
hành). Bản sao được tạo thành từ phân tử ban đầu gọi là RNA trong nhân tế bào. Bản
sao sau đó ra khỏi nhân tế bào, chuyển đến lưới nội chất, nơi mà nó sẽ được dịch mã
tổng hợp thành protein.
3.2. Cơ sở của liệu pháp gen
Để chuyển gen, cần hội đủ một số điều kiện sau đây:

 Đầu tiên, phải có bản sao đầy đủ của gen thích hợp với những trình tự
điều hoà thích hợp (trình tự khởi động), trình tự khởi động có thể là duy
nhất đối với gen đặc hiệu, bằng cách này cho phép gen chỉ biều hiện trong
các mô mà thông thường chúng được biểu hiện.
Lần lượt, các gen có thể được kết nối với các trình tự khởi động, hoạt hoá trong
tất cả các mô (phương pháp chung nhất được sử dụng ngày nay) hoặc có thể kết nối
với các trình tự có thể hoạt hoá hay bất hoạt như một công tắc. Những thao tác như
vậy có thể đạt được bằng công nghệ DNA tái tổ hợp.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
 Thứ hai, phải lựa chọn kỹ thuật đích. DNA cần kỹ thuật này để có thể
tiếp cận với tế bào. Ba kỹ thuật cơ bản được sử dụng để làm điều này:
 DNA có thể được gắn trực tiếp với các tế bào hoặc cấy vào mô. Gọi là
chuyển DNA trần (nacked DNA transfer)
 DNA có thể được sử dụng dể tạo nên con thoi dịch chuyển virus (viral
transfer shuttle). Đây là phương pháp chuyển DNA hầu như chắc chắn
nhất. DNA xâm nhập không hiệu quả vào tế bào vì nó khó có thể xuyên
qua lớp màng lipit kép, nhưng vector virus dễ dàng làm việc này.
 DNA cũng có thể phối hợp với các phức hệ hoá học khác nhau để
khuếch đại khả năng chuyển dịch qua màng tế bào của nó.
 Thứ ba, có hai phương pháp ứng dụng liệu pháp gen: liệu pháp gen có
thể ứng dụng trực tiếp với bệnh nhân hoặc trên các tế bào đã tách ra khỏi
người bệnh (như tế bào tuỷ xương) sau đó cấy trở lại người bệnh. Trong
tương lai, các thao tác liệu pháp gen của tế bào gốc phát triển trên môi
trường mô tế bào và sau đó cấy lên người bệnh sẽ là tiến triển tột cùng.
Mỗi kỹ thuật trên đều có những thuận lợi và khó khăn riêng. Khi chọn phương
pháp phân phối gen, một số nhân tố cần được cân nhắc:
 Hiệu quả của liệu pháp phải được đặt lên hàng đầu.
 Sau đó, gen chuyển đổi phải được điều hoà đúng đắn. Nó phải được
hoạt hoá đúng lúc, với độ dài thời gian chính xác và đúng số lượng.
Những vấn đề này là rào cản to lớn cho sự phát triển và phổ biến của liệu pháp

gen. Hiện nay đích ứng dụng quan trọng nhất của liệu pháp gen là các bệnh hiểm
nghèo, ở đó mô bệnh dễ dàng bị ảnh hưởng và những bệnh mà sự điều hoà chính xác
của gen được chuyển là không cần thiết. Đúng như mong muốn, hiệu quả của liệu
pháp trong các trường hợp này dễ dàng quản lý.
Sự tinh vi của chúng ta trong thiết kế vector và promotor ngày càng tăng, mở ra
nhiều triển vọng mới cho những ứng dụng điều trị các bệnh hiểm nghèo (như bệnh
đái đường) thông qua sự tập hợp thông tin của các dự án về bộ gen người mà ở đó sự
điều hoà gen là phức tạp hơn.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Để chuyển gen, trong các nghiên cứu sử dụng các vector có hoặc không có bản
chất virus nhằm đưa gen mục tiêu đến các tế bào. Hiện nay, các nghiên cứu phân phối
gen nhờ retrovirus diễn ra nhiều nhất sau đó đến adenovirus.
3.3. Vector chuyển gen có bản chất virus
3.3.1. Các bước quan trọng để hoạt hóa thành công virus và chức năng
của nó
Sự sử dụng virus trong liệu pháp gen dựa trên các chức năng cơ bản của nó:
 Chuyển đặc hiệu vật chất di truyền đến tế bào. Virus chứa vật chất
di truyền được bao quanh bởi lớp màng protein. Đầu tiên, virus gắn tới các
tế bào riêng biệt bằng sự tương tác với thụ thể (hay một chuỗi các điểm thụ
thể) trên bề mặt tế bào. Tiếp đó, virus vào tế bào bởi sự tương tác với các
phân tử bề mặt đặc hiệu trên tế bào, bằng cách này nó dễ dàng đi xuyên
qua lớp rào chắn màng tế bào.
 Sự phụ thuộc vào dạng của vector virus được sử dụng, những gen được
mang bởi virus hoặc được nhân bản sử dụng nguyên liệu của chính các tế
bào hoặc được tiếp hợp tới nhân của tế bào, nơi mà các nhiễm sắc thể và
DNA nhân tồn tại. Các gen đặc hiệu được mang và được tiếp hợp bởi virus
sẽ phiên mã thổng hợp RNA và dịch mã tạo thành protein để tạo nên chức
năng mong muốn hay sản phẩm của liệu pháp.
 Các virus khác nhau có mức độ khác nhau trên phương diện chuyển gen
của chúng tới các tế bào và tạo ra các sản phẩm gen. Hơn nữa, hiệu quả

cuối cùng của chúng đối với các gen chức năng trong tế bào không giống
nhau và có thể khác nhau từ tế bào này đến tế bào khác hoặc mô của cơ
quan này đên mô cơ quan khác.
Những vấn đề này hưởng lớn tới thuận lợi y học và thành công của chiến lược
liệu pháp gen dựa trên vector virus.
Tất cả các vector được sản xuất từ các virus tái tổ hợp kiểu hoang dại đã được
xác định. Nói chung, các gen có vai trò trong tái bản virus được loại bỏ để ngăn cản
sự truyền đi không mong muốn của vector virus và để ngăn cản các vector virus gây
bệnh.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Hiện tại, có 4 dạng chính của vector virus đang được sử dụng trong nghiên
cứu và ứng dụng: adenovirus, adeno-associate virus (AAV), retrovirus và herpes
Simplex.
Bảng 2: So sánh đặc điểm của các hệ thống chuyển gen virus
3.3.2. Vector Adenovirus:
Một trong những vector liệu pháp gen chung nhất hiện đang sử dụng là vector có
cơ sở adenovirus. Adenovirus gây bệnh khó thở ở người (cảm lạnh, nhiễm trùng dạ
dày) và có 47 dạng khác nhau (gọi là kiểu huyết thanh) được tìm thấy ở người. Kiểu
2 và 5 được sử dụng chung nhất cho các ứng dụng liệu pháp gen.
Hình 1: Adenovirus có cấu trúc chung chứa capsid hai mươi mặt bao quanh bộ
gen dsDNA dài xấp xỉ 36kbp. Vỏ capsid của virus chứa ba protein: hexon, fiber và
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
base penton. Hexon là thành phần cấu trúc quan trọng, tạo thành bề mặt hai mươi
mặt, trong khi các penton tạo thành phức hệ với fiber cho kết quả là 12 “chóp” ngoài
vỏ virus đóng vai trò quan trọng trong việc gắn với các phối tử.
Điểm đầu tiên trong sản xuất vector liệu pháp gen là lấy đi gen điều khiển tái bản
(sự phát triển) của virus trong mô. Sự sinh sản và phát triển của một lượng nhỏ virus
mới là nguyên nhân chung cho những hiệu ứng độc do nhiễm virus.
Bộ gen của adenovirus đã được nghiên cứu khá kỹ, chứa DNA xoắn kép gồm 50
gen, dài 36 kilobase (KB). Gen E1 điều hoà phiên mã trong khi gen E2 và E3 điều

hoà quá trình dịch mã của bộ gen. Các vector đã tách gen này cho phép mang gen dài
8kb. Trước đây, sự phát triển của các vector này dựa trên việc sử dụng virus giúp đỡ
(helper virus) để cung cấp các chức năng của gen bị huỷ. Tuy nhiên, ngày nay một
dòng tế bào có giá trị thương mại đã được tạo ra để mang các gen bị xoá dạng vector.
Sự phát triển của các dòng tế bào này có thể làm adenovirus có giá trị thương mại và
an toàn hơn. Khi đó rủi ro của việc sử dụng virus kiểu hoang dại được giảm bớt.
Trên hết, sản phẩm vector này có hiệu quả, với nồng độ 1x10
12
đoạn virus/ml
đang được sản xuất. Phép đo hoạt tính vector thực tế rất quan trọng trong liệu pháp
gen. Việc đo các phần tử vector đơn độc không bao hàm rằng tất cả các đoạn là
nhiễm và do đó, có hoạt tính. Hiện nay, có những cố gắng tiêu chuẩn hóa liều lượng
và hoạt tính của các vector virus.
Thật không may, hệ thống vector adenovirus đã xuất hiện một vài bất cập. Sự sản
xuất của liệu pháp gen là giới hạn cho một chu kỳ thời gian ngắn và DNA đã được
chuyển không trở thành một phần của DNA trên tế bào chủ. Các tác động trở lại của
vector adenovirus cũng có thể gây ra đáp ứng miễn dịch mạnh trên vật chủ, có nguy
cơ dẫn tới các biến chứng nghiêm trọng. Trọng tâm nghiên cứu hiện nay nhằm cải
tiến vector adenovirus đích và giảm các phản ứng miễn dịch do virus gây ra, mang tới
thành công đầy hứa hẹn trong việc sự sử dụng các vector phá huỷ bên trong (gutted
vector) chỉ sử dụng vỏ ngoài của adenovirus.
Sự phát triển thú vị khác là khả năng điều khiển vector adenovirus đích tới các
nhóm tế bào đặc hiệu. Công nghệ “retargeting” bao gồm việc sản xuất kháng thể cho
protein thụ thể có vỏ adenovirus, nhân tố được sử dụng để gắn kết và gia nhập tế bào.
Kháng thể này được hợp nhất với kháng thể đơn dòng (monoclonal) chống lại protein
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
đặc hiệu tồn tại trên bề mặt của tế bào. Vector sau đó hoà trộn với kháng thể dung
hợp. Khi được sử dụng, chỉ những tế bào biểu hiện protein đặc hiệu được chữa trị
bằng vector này. Một số công ty (ví dụ: GenVec) sản xuất vector adenovirus đã biến
đổi bề mặt điểm thụ cảm, điểm sẽ kết hợp với các tế bào khác nhau. Việc phân loại

của các vector khác nhau này cho phép adenovirus đích tới những mô khác nhau khi
sử dụng các kháng thể.

Hình 2: Sơ đồ cấu trúc của vector adenovirus hiệu năng cao (high-capacity
adenoviral) HC-Ad. Tất cả các gen của virus HC-Ad bị xoá, chỉ còn đầu bên trái và
phải của Ad5 và DNA thêm vào (stuffer DNA) thu được từ gen C346 và HPRT.
AdSTK109 chứa bộ gen hAAT bao gồm liver và promoter macrophage đặc hiệu,
trong AdGS85, hAAT cDNA được biểu hiện từ promoter cytomegalovirus của người
((hCMV promoter). AdSTK129 chỉ chứa DNA thêm vào và không biểu hiện bất cứ
gen chuyển nào.
3.3.3. Vector Adeno-associated Virus (AAV):
AAV là một parvovirus không xuất hiện trong các bệnh do vi sinh vật ở người.
Virus này có thể chuyển DNA tới các tế bào không phân chia và hoà nhập với DNA
của tế bào chủ. Điều này mở ra khả năng ứng dụng của một vector chống lại các bệnh
kinh niên. Trong dài hạn, sự biểu hiện của liệu pháp gen đã được chứng minh. Virus
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
này nhỏ do đó chỉ có thể mang những gen có kích thước giới hạn. Nó cũng khó sản
xuất hơn các vector khác nên tính thương mại hiện nay bị hạn chế.
Có 6 kiểu huyết thanh (serotype) của AAV, kiểu 2 thường được sử dụng trong các
ứng dụng của liệu pháp gen. Do kích thước nhỏ, vector này chỉ mang được gen có
kích thước lớn nhất là 5 kB. Như vậy, không thể chuyển được các gen phức tạp với
kích thước lớn. Một số phương thức được đề ra để giải quyết vấn đề này.
Một trong số đó là kỹ thuật liên kết bộ gen vector để phân cắt một số gen hợp
nhất (cooperating gene) và phân phối chúng tới đích, sử dụng hai vector phân cắt.
Một cách trung gian là sự nhân bản của các vector dung hợp sử dụng lớp vỏ của
adenovirus kết hợp với bộ gen của vector AAV. Điều không thuận lợi của phương
pháp là vector này đòi hỏi sự giứp đỡ của adenovirus để được tổng hợp. Điều này có
thể dẫn đến sự hợp tác mạo hiểm với vector adenovirus (phản ứng miễn dịch). Gần
đây, 3 plasmid, hệ thống virus giúp đỡ đa năng (helper virus free system) đã phát
triển cho phép sản xuất các thể giúp đỡ đa năng của vector này.

Hình 3: cấu trúc bộ gen của kiểu hoang dại (wild-type) và của vectorAAV.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
 (A) bản đồ bộ gen của AAV hoang dại chứa các khung đọc (reading
frames) Rep và Cap, các promoter (p5, p19, và p40), polyadenylation site
(pA), và inverted terminal repeats (ITR). Quá trình phiên mã của virus mã
hoá các protein Rep và Cap (VP1-3) khác nhau được vẽ dưới bộ gen. Các
protein Rep nhỏ hơn được dịch mã từ các điểm khởi đầu nội tại (internal
initiation sites).
 (B) bản đồ của vector AAV, cho thấy sự thay thế các gen Rep và Cap
của virus với băng chuyển gen (promoter, transgene cDNA và
polyadenylation site).
 (C) Cấu trúc bậc hai của AAV ITR, với các vùng gắn Rep (RBS) và
vùng tiêu tan cuối cùng (TRS) (terminal resolution site)
Thuận lợi chính của hệ thống vector AAV là nó hoà nhập với nhiễm sắc thể của tế
bào chủ. Điều này cho phép các vector được chuyển biểu hiện một cách ổn định và
lâu hơn. Nhưng thật không may, nếu AAV kiểu hoang dại hoà nhập tại điểm đặc hiệu
trong nhiễm sắc thể 19 thì các vector tái tổ hợp lại mất tính đặc hiệu này và hoà nhập
tuỳ tiện. Cho dù vậy, một vài thành công trong nghiên cứu trên động vật và người đã
cho thấy rằng, sụ biểu hiện ổn định có thể đạt được với vector này.

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn
Hình 4: Quá trình phiên mã của vector AAV. Các bước khác nhau cần cho quá
trình phiên mã của vector AAV bao gồm: đầu tiên AAV tương tác với các receptor
đa dạng và các phân tử coreceptor trên bền mặt tế bào, sự tiếp thu virion, nhân vào
trong tế bào và giải phóng bộ gen mạch đơn vủa vector, sự lai của bộ gen đưa vào bổ
sung (complementary input genomes) và sự hoà nhập nhiễm sắc thể trước biểu hiện
gen có thể xảy ra từ khuôn xoắn kép DNA. Cấu trúc bậc hai tiềm tàng của bộ gen
vector bổ sung (episomal) xuất hịên như các phân tử vector RNA đã được mã hoá.

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Hình 5: Chiến lược sản xuất rAAV. Plasmid tái tổ hợp chứa gen cần thiết, được
tách dòng cùng lúc, ITRs của AAV được chuyển với plasmid giúp đỡ tái tổ hợp có
chứa wtAAV và các gen adenovirus cần thiết cho sự giải phóng, tái bản, và đóng gói
rAAV trong 293 tế bào. Khoảng 48 đến 60 giờ sau, các tế bào bị dung giải và phần
chiết thô chứa rAAV và các protein của tế bào bị tách ra lệ thuộc vào sự tinh chế sau
này (qua ly tâm gradient mật độ và sắc kí cột). Các mẩu nhỏ rAAV sau tinh chế được
xác định chính xác và các virus đã tinh chế sau đó được sử dụng cho các nghiên cứu
in vitro và in vivo.
3.3.4. Vector Retrovirus
Retrovirus nằm trong số các vector virus được phát triển đầu tiên. Vector này
đã được sử dụng trong gần 60% dự án liệu pháp gen y học. Virus này có chứa vật
chất di truyền là RNA và có kích thước 7 đến 11 kB. Khi vào tế bào, RNA virus cần
trở thành DNA trước khi nó có chức năng trên tế bào chủ. Điều này được thực hiện
bởi enzim phiên mã ngược, RT (reversse transcriptase). Retrovirus có chứa enzim
phiên mã ngược (enzim xúc tác tạo thành bản sao DNA của vật liệu di truyền RNA
qua phiên mã ngược) và enzim hoà nhập (integrase) cần cho sự hoà nhập của
retrovirus virus vào tế bào chủ.
Bộ gen của tất cả các virus này nhỏ và đã được nghiên cứu đầy đủ. Retrovirus
dễ dàng biến đổi về mặt di truyền do đó được sử dụng rộng rãi như một vector của
liệu pháp gen. Virus murina leukaemia đã biến đổi di truyền (MuLV) được sử dụng
phổ biến nhất. Các retrovirus cổ điển chỉ nhiễm vào tế bào đang phân chia (dividing
cell) và vật chất di truyền của chúng sau khi chuyển thành DNA, hoà nhập với vật
chất di truyền của tế bào chủ như một “provirus”. Điều này giúp nó thích ứng với
bệnh ung thư, bệnh mà ở đó các tế bào phân chia rất nhanh, cũng như các bệnh cần
thời gian dài để gen được ổn định vững chắc. Điều bất lợi của vector này là nó hoà
nhập tuỳ tiện với DNA của tế bào chủ. Do đó, các rủi ro khi vector xâm nhập sẽ phá
vỡ chức năng sinh lí bình thường của tế bào chủ. Các retrovirus cơ bản cũng cần sự
phân chia của tế bào chủ để làm việc. Hiện nay tồn tại những lo ngại lớn hơn, đó là
khả năng các vector retrovirus sẽ nhiễm vào tế bào mầm của người bệnh và sản xuất
tinh trùng hoặc trứng. Do vậy, tiềm tàng sự ảnh hưởng đến sinh sản sau này. Tới nay,

điều này đã được quan sát trên các động vật mẫu.