THỰC HÀNH PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM - BÀI 2 ppsx

Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 10
Homepage:

Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường
lỏng SCA. Dùng que vòng cấy ria một lượng nhỏ khuẩn lạc lên
môi trường SCA rắn trong ống nghiệm thạch nghiêng, ủ ở 35
0
C
trong khoảng 24-48 giờ.
Đọc kết quả: (+) khi xuất hiện khuẩn lạc và môi trường
chuyển sang màu xanh dương. (-) khi không có khuẩn lạc và môi
trường giữ nguyên màu xanh lục.
1.4 Cách tính kết quả
Từ số lượng các ống nghiệm có E. coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng bảng
MPN loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp để tính ra mật độ vi sinh vật
trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng.

Bài 2. Định lượng Staphylococcus aureus
2.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản
Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý,
hình cầu, gram dương, có thử nghiệm coagulase, phản ứng
DNAse, phosphatease (+) có khả năng lên men và sinh acid từ
mannitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S. aureus đều mẫn
cảm với novobiocine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường
chứa đến 15% NaCl. Một số dòng có khả năng tăng trưởng làm
tan máu trên môi trường thạch máu. S. aureus có thể nhiễm vào
thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến thực phẩm.
Sự hiện diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và
kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến.

2.2 Quy trình định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN
Phương pháp này được dùng để định lượng S. aureus trong mẫu có mật độ S. aureus thấp
nhưng mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao.




Hình 8: thử nghiệm Citrate
Hình 9: S. aureus trên BPA
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 11
Homepage:

2.3 Cách tiến hành và tính kết quả
Mẫu phân tích: thịt heo sống, khối lượng 50g cho 1 lớp

Đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu thành các dãy nồng độ
th
ậ
p phân 10
-1
, 10
-2
, 10

-3
…

Chuyển 1ml dung dịch 10
-
1
, 10
-
2
, 10
-
3
vào ống 10ml canh
MSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 37
0
C, 48 giờ
Chọn ống (+) đục ở mỗi độ pha loãng
Ria lên đĩa thạch BPA, ủ ở 37
0
C, 48 giờ
Chọn khuẩn lạc đặc trưng (tròn lồi, đen
bóng, có quầng trong và quầng sáng
xung quanh (đôi khi chỉ xuất hiện 1
trong 2 quầng))
Cấy vào TSA, ủ ở 37
0
C ± 1
0
C , 24 giờ
Thử nghiệm ngưng kết coagulase

Ghi nhận số coagulase (+) ở mỗi độ pha
loãng
Tra bảng MPN
Mật độ S.aureus
(MPN/g hoặc MPN/ml)
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 12
Homepage:

Bước 1: pha môi trường
Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích

Ghi chú
SPW
(Saline Pepton
Water)
NaCl : 42.5g
Pepton: 5g
500 ml nước
cất
Phân phối cho mỗi tổ 27ml
SPW (9ml/ống nghiệm)
trước khi khử trùng. (buổi 2)

MSB
(Mannitol Salt
Broth)

Cao thịt: 1g

Polypeptone: 10g
NaCl: 75g
Mannitol: 10g
Phenol red: 0.025g
1000 ml nước
cất
pH 7.4 ± 0.2
Phân phối 90ml MSB cho
mỗi tổ (10ml/ống nghiệm)
trước khi khử trùng. (buổi 2)

BPA
(Baird Parker
Agar)
Môi trường cơ bản
Tryptone:10g
Cao thịt: 5g
Cao nấm men: 1g
Sodium pyruvate: 10g
Glycine: 12g
Lithium chloride.6H
2
O:
5g
Agar: 20g
Môi trường hoàn chỉnh
5ml Bacto EY tellurite
enrichment (45-50
0
C)

vào 95ml môi trường cơ
bản được làm nóng
chảy. Môi trường hoàn
chỉnh phải đục.
1000 ml nước
cất cho môi
trường cơ bản
pH 7.0 ± 0.2

Phân phối 100ml BPA cho
mỗi tổ (20ml/petri) (buổi 2)
TSA
(Tryptone Soya
Agar)
Trypticase peptone: 15g
Phytone peptone: 5g
NaCl: 5g
Agar: 15g
1000 ml nước
cất
pH 7.3± 0.2
Phân phối 50ml BGBL cho
mỗi tổ (25ml/petri) (buổi 3)


Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 13
Homepage:

Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha.
Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp
tiệt trùng ở 121
0
C trong 15 phút.
Bước 3: đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu
Cân 10g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dich SPW, đồng nhất mẫu
bằng máy dập mẫu khoảng 30 giây. Pha loãng mẫu (xem bài 1, mục 1.3.2)
Bước 4: Cấy mẫu vào canh MSB
Chuyển 1ml dung dịch 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
vào ống 10ml canh MSB, mỗi nồng độ có 3
ống lặp lại, ủ ở 37
0
C, 48 giờ. (xem bài 1, mục 1.3.2). Chọn các ống (+) có vi sinh vật phát
triển làm đục môi trường để tiến hành phân lập khuẩn lạc đơn trên BPA
Bước 5: phân lập khuẩn lạc đơn trên BPA
Dùng kỹ thuật cấy ria lên đĩa thạch BPA, ủ ở 37
0
C, 48 giờ.
Chọn khuẩn lạc đặc trưng :tròn lồi, đen bóng, có quầng trong và
quầng sáng xung quanh; đôi khi chỉ xuất hiện 1 trong 2 quầng (xem
hình 10).
Chọn khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus trên BPA để thử nghiệm sinh hóa
coagulase
Bước 6: thử nghiệm sinh hóa coagulase

Nguyên tắc: các loài thuộc giống Staphylococcus có khả năng tiết ra môi trường
enzyme coagulase có tác dụng làm kết tụ các thành phần của huyết tương, tạo thành các
khối đông làm đông huyết tương.
Phương pháp tiến hành: Huyết tương người hay thỏ đông khô thương phẩm được
dùng cho thử nghiệm này. Cho vào ống nghiệm 0.5ml huyết tương người hay thỏ không
pha loãng, bổ sung 0.5ml dịch nuôi cấy chủng thuần hoặc một lượng lớn sinh khối khuẩn
lạc. Xoay nhẹ ống để trộn đều VSV. Ủ ống thử nghiệm ở 37
0
C trong
4 giờ. Quan sát, ghi nhận sự ngưng kết mỗi 30 phút. Tiếp tục ủ đến
24 giờ nếu không thấy xuất hiện khối kết tụ.
Đọc kết quả: (+) có sự kết tụ; (-) không có sự kết tụ, hỗn hợp
vẫn đồng nhất



Hình 10: hình dạng S. aureus trên BPA
Hình 11: thử nghiệm coagulase. Ống trên (+); ống dưới (-)