THỰC HÀNH PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM - BÀI 4 doc

Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 20
Homepage:

tuyệt đối, dung dịch B là 40% NaOH hay KOH. Trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau
đó nhỏ 2 giọt dung dịch B. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4 giờ. Salmonella
cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP có hiện tượng không đổi màu trên bề mặt môi
trường. Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường.

Bài 4. Định lượng Bacillus cereus
4.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản
B. cereus là những trực khuẩn, gram dương, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, di động, tạo
nội bào tử, lên men glucose sinh hơi, phản ứng VP (+), có khả năng sử dụng nitrate. Loài
này tăng trưởng được trong khoảng nhiệt độ từ 5
0
C – 50
0
C, tối ưu ở 35
0
C – 40
0
C; pH dao
động từ 4.5-9.3, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng. Trên môi trường chọn lọc
loài này tạo khuẩn lạc rất lớn, mọc lan, rìa nhăn.
4.2 Quy trình định lượng Bacillus cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Cân 25g mẫu, đồng nhất trong 225ml BPW, đồng
nh
ấ
t
b
ằ
ng Stomacher, đ
ộ

pha loãng 10
-1

Pha loãng đến các độ pha loãng 10

-
2
, 10
-
3

Trãi 0.1ml mỗi độ pha loãng lên môi trường thạch
MYP,
ủ

ở

30
0
C, 24 gi
ờ

Chọn 5 khuẩn lạc có màu hồng eosin, lecithinase
dương tính (tủa lecithinase bao quanh khuẩn lạc)
cấy sang thạch nghiêng MYP, ủ ở 30
0
C, 24 giờ
Nhuộm Gram và thử nghiệm sinh hóa như: lên
men glucose, th
ử

nghi
ệ
m VP.

Kết luận B. cereus
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 21
Homepage:



4.3 Cách tiến hành và tính kết quả
Mẫu phân tích: tôm khô, khối lượng 50g cho 1 lớp
Bước 1: pha môi trường
Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích

Ghi chú
BPW
(Buffered Pepton
Water)
Pepton: 10g
NaCl : 5g
Na
2
HPO
4
: 3.5g
KH
2
PO
4
: 1.5g
1000 ml nước

cất
pH 7.2 ± 0.2
Phân phối cho mỗi tổ 50ml
BPW trước khi khử trùng.
(buổi 4)
MYP
(Mannitol-Egg
Yolk-Polymycin)

Môi trường cơ bản
Cao thịt: 1g
Pepton: 10g
Mannitol: 10g
NaCl: 10g
Phenol red (1% trong
ethanol 90%): 2.5ml
Agar: 15g
Nước cất: 900 ml
Dung dịch Polymixin
0.1%
Hòa tan 500 000 đơn vị
polymixin B sulfate
trong 50ml nước cất.
Lọc vô trùng và cất
trong tối 4
0
C cho đến
khi dùng.
Egg yolk emulsion 50%
(sản phẩm thương mại)

Môi trường cuối cùng
Môi trường cơ bản:
225ml (ở 50
0
C)
Dung dịch Polymixin B:
Môi trường
cơ bản đem
khử trùng, để
nguội 50
0
C.
Sau đó trộn
các thành
phần còn lại
Phân phối 100ml MYP cho
mỗi tổ (12.5ml/petri). (buổi
4)
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 22
Homepage:

2.5ml
Egg yolk emulsion (lòng
đỏ trứng): 12.5ml
PRG
(Phenol Red
Glucose Broth)
Proteose peptone No. 3:

10 g
NaCl: 5 g
Beef extract (optional):
1 g
Dextrose: 5 g
Phenol red (7.2 ml of
0.25% solution): 0.018 g
1000 ml nước
cất
pH 7.4 ± 0.2

Phân phối 30ml PRG cho
mỗi tổ (3ml/ống nghiệm)
(buổi 4)
MR-VP Both
(Glucose
Phosphate)
Môi trường 1:
Buffered peptone-water
powder: 7g
Glucose: 5g
K
2
HPO
4
: 5g
Môi trường 2:
Casein Pancreatic
Digest: 3.5g
Peptic digest of animal

tissue:3.5g
Dextrose: 5g
Potassium phosphate: 5g
pH 6.9 ± 0.2
Môi trường 3:
Peptone: 5g
Glucose: 5g
Phosphate buffer: 5g
pH 7.5 ± 0.2
1000ml nước
cất.
pH 6.9 ± 0.2
Mỗi tổ chỉ dùng 50ml, phân
phối 10ml/ống nghiệm.
Kiểm tra lại môi trường cung
cấp nào để pha môi trường.
(buổi 4)



Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 23
Homepage:

Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha.
Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp
tiệt trùng ở 121
0
C trong 15 phút.

Bước 3: Pha loãng mẫu
Cho 25g mẫu vào túi PE, bổ sung 225ml môi trường BPW đồng nhất để có độ pha
loãng 10
-1
, đồng nhất bằng Stomacher trong 1 phút. Mẫu tiếp tục pha loãng thành 10
-2
,
10
-3
.
Bước 4: Phát hiện bằng môi trường chọn lọc
Trãi 0.1ml mỗi độ pha loãng trên môi trường thạch MYP, ủ ở
30
0
C, 24 giờ. Do B. cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase
và kháng polymycin nên trên môi trường này khuẩn lạc B. cereus có
màu hồng eosin, được bao quanh bởi vùng có tủa chứng tỏ
lecithinase được tạo thành. Chọn 5 khuẩn lạc (+) cấy sang thạch
nghiêng để chuẩn bị cho các phản ứng khẳng định.
Bước 5: Các thử nghiệm khẳng định
- Nhuộm Gram: nhỏ 1 giọt nước cất lên phiến kính sạch;
dùng que cấy vòng lấy 1 ít sinh khối vi khuẩn chuyển vào giọt
nước trên phiến kính, khuấy nhẹ. Cố định vệt bôi trên phiến kính
bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn. Nhỏ vài giọt methyl violet
lên vệt bôi, giữ yên 20 giây. Rửa sạch phẩm nhuộm bằng nước.
Nhỏ vài giọt dung dịch KI/I
2
lên vệt bôi, để yên 1 phút. Rửa
bằng cồn 95% đến vừa mất màu. Rửa lại bằng nước. Nhuộm bằng dung dịch
safranin 30 giây. Rửa sạch bằng nước. Thấm nước dư bằng giấy lọc. Quan sát vi

khuẩn bằng vật kính 100X nhúng trong dầu, Gram dương có màu xanh tía, Gram
âm có màu đỏ hồng.
- Thử nghiệm lên men glucose: cấy vi khuẩn vào 3ml canh PRG, ủ ở 35
0
C, 24 giờ
trong điều kiện kỵ khí. Lắc ống nghiệm thật mạnh và quan sát sự phát triển thông
qua độ đục và sự chuyển màu từ đỏ sang vàng, chứng tỏ sự sinh acid từ glucose
trong điều kiện kỵ khí.
Hình 18: khuẩn lạc B. cereus trên MYP
Hình 19: nhuộm gram B. cereus
Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM

Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 24
Homepage:


- Thử nghiệm VP (xem bài 3)

Bài 5. Định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí và tổng nấm men-nấm mốc
5.1 Tóm tắt kiến thức cơ bản
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong
điều kiện có oxi phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ
vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc
trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem 1 khuẩn lạc
là sinh khối phát triển từ 1 tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số
đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng
thực phẩm.
Nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty. Nấm men là
những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng
khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thành chuỗi. Đơn vị hình thành khuẩn lạc của

nấm mốc và nấm men là mầm để tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường.
Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn của khuẩn ty. Trong thực phẩm, nấm
mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát
sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm.












Hình 20: thử nghiệm lên men glucose. Ống
a: đối chứng. Ống b: không lên men
glucose. Ống c: lên men yếu. Ống d: lên
men m
ạ
nh.