Nghiên cứu đứt đoạn nhỏ nhiễm sắc thể Y ở người bệnh vô sinh không có tinh trùng

Nghiên cứu đứt đoạn nhỏ nhiễm sắc thể Y ở
người bệnh vô sinh do không có tinh trùng
hoặc ít tinh trùng

Nguyễn Thị Việt Hà

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Khoa Sinh học
Luận văn Thạc sĩ ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70
Người hướng dẫn: PGS.TS. Trần Văn Khoa
Năm bảo vệ: 2012


Abstract. Tổng quan về bệnh vô sinh và vô sinh ở nam giới. Nghiên cứu và đánh
giá tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể ở bệnh nhân vô sinh nam không có tinh trùng
hoặc ít tinh trùng. Hoàn thiện quy trình phát hiện mất đoạn vùng AZF trên nhiễm sắc
thể Y bằng kỹ thuật Multiplex PCR và phân bố mất đoạn vùng AZF trên nhiễm sắc
thể Y ở người bệnh vô sinh do không costinh trùng hoặc ít tinh trùng.

Keywords. Di truyền học; Bệnh vô sinh; Nhiễm sắc thể y; Bệnh tật; Tinh trùng

Content

Trong những năm gần đây, vô sinh đã trở thành một trong những vấn đề sức khỏe
sinh sản gây ảnh hưởng tới cuộc sống hạnh phúc của rất nhiều cặp vợ chồng và là một vấn đề
lớn của toàn xã hội. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy khoảng 10%- 15% các cặp vợ
chồng trong độ tuổi sinh đẻ bị vô sinh. Theo một nghiên cứu đa trung tâm của Tổ chức y tế
thế giới, gần 50% các trường hợp vô sinh có nguyên nhân do nam giới. Trong các nguyên
nhân vô sinh do nam thấy có khoảng 10%- 15% trường hợp không có tinh trùng (KCTT)
và 5 % ít tinh trùng (ITT) là do bất thường về mặt di truyền.
Việc chẩn đoán nguyên nhân gây vô sinh ở nam giới là một trong những yêu cầu bắt

buộc trước khi tiến hành điều trị và hết sức cần thiết để thực hiện tư vấn di truyền. Bằng
phương pháp nuôi cấy tế bào và kỹ thuật nhuộm tiêu bản nhiễm sắc thể (NST), đặc biệt là kỹ
thuật nhuộm băng ngày càng phát triển và cải biến không ngừng đã giúp cho các nhà di
truyền học phát hiện được các biểu hiện rối loạn số lượng và cấu trúc NST. Với việc áp dụng
phương pháp nhuộm NST đã giúp phát hiện hội chứng Klinefelter là nguyên nhân hàng đầu
gây ra vô sinh ở nam giới [53]. Bên cạnh đó, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử vào
chẩn đoán nguyên nhân vô sinh ở nam giới do mất đoạn nhỏ (microdeletion) trên nhánh dài
của NST Y đang trở nên phổ biến trên thế giới. Mất đoạn nhỏ trên NST Y chủ yếu xảy ra ở
vùng AZF (azoospermia factor) trên nhánh dài của NST Y (Yq), là nơi có chứa nhiều gen
liên quan tới quá trình sinh tinh, được coi là nguyên nhân bất thường di truyền thứ hai sau hội
chứng Klinefelter gây vô sinh ở nam giới [53]. Phát hiện được những mất đoạn trên NST Y
sẽ cung cấp thêm bằng chứng và sự hiểu biết đầy đủ về bất thường di truyền liên quan đến vô
sinh nam giới
Với mong muốn góp phần nhỏ vào công tác chăm sóc sức khỏe sinh sản, đặc biệt
trong tìm hiểu nguyên nhân vô sinh nam giới do rối loạn di truyền, chúng tôi đã tiến hành đề
tài: “Nghiên cứu đứt đoạn nhỏ NST Y ở người bệnh vô sinh do không có tinh trùng hoặc ít
tinh trùng”
Mục tiêu:
- Đánh giá tỷ lệ bất thường NST ở bệnh nhân vô sinh nam không có tinh trùng hoặc ít tinh
trùng.
- Hoàn thiện quy trình phát hiện mất đoạn vùng AZF trên NST Y bằng kỹ thuật Multiplex
PCR và phân bố mất đoạn vùng AZF trên NST Y ở người bệnh vô sinh do không có tinh
trùng hoặc ít tinh trùng.
Đối tượng nghiên cứu của luận văn là: 264 bệnh nhân vô sinh nam giới điều trị tại
Trung tâm công nghệ phôi- Học viện Quân y, Bệnh viện Nam học và hiếm muộn Hà Nội
trong thời gian từ 09/2010 đến 12/2011.
Tiêu chuẩn chọn mẫu nghiên cứu: chọn những bệnh nhân vô sinh nam giới đã được
xét nghiệm tinh dịch đồ và xác định là KCTT hoặc ITT, không thuộc nhóm tắc nghẽn, dị
dạng ống dẫn tinh. Các bệnh nhân này được xét nghiệm NST, lập nhiễm sắc thể đồ. Bệnh
nhân nào có kết luận nhiễm sắc thể đồ bình thường 46,XY sẽ được xét nghiệm ADN để phát

hiện những mất đoạn nhỏ trên vùng AZF của NST Y.
Phương pháp chọn mẫu của đề tài là chọn mẫu không xác suất.
Cỡ mẫu nghiên cứu gồm 264 bệnh nhân vô sinh nam giới do KCTT hoặc ITT được
xét nghiệm NST, lập nhiễm sắc thể đồ tại Bộ môn Y sinh học- Di truyền, trường Đại học Y
Hà Nội, Bộ môn Sinh học- Di truyền y học, Học viện Quân y. Trong số 264 bệnh nhân được
xét nghiệm chọn ra 248 bệnh nhân có kết luận nhiễm sắc thể đồ bình thường 46,XY và không
có bất thường về cơ quan sinh dục ngoài để tiến hành xét nghiệm ADN nhằm kiểm tra và
phát hiện các mất đoạn nhỏ trên vùng AZF của NST giới tính Y.
Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp lâm sàng: Lập hồ sơ bệnh án
Các bệnh nhân nam giới được lập hồ sơ bệnh án và chẩn đoán vô sinh được thăm
khám lâm sàng, khai thác tiền sử gia đình, tiền sử bản thân, tuổi, nghề nghiệp, môi
trường làm việc, tiền sử mắc bệnh, nhiễm độc, quai bị, chấn thương bộ phận sinh dục,...
kết quả xét nghiệm tinh dịch đồ, nội tiết, siêu âm và các xét nghiệm khác.
- Phương pháp cận lâm sàng:
+Phương pháp phân tích NST và lập nhiễm sắc thể đồ
Nuôi cấy tế bào bạch cầu lympho máu ngoại vi theo phương pháp của Hungerford D.A
(1965) có cải biên.
Nuôi cấy tế bào sau 72 giờ tiến hành thu hoạch.
Tiến hành nhỏ tiêu bản
Tiến hành nhuộm băng NST
Phân tích tiêu bản NST trên kính hiển vi và lập nhiễm sắc thể đồ bằng phần mềm Ikaros.
+Phương pháp phát hiện những mất đoạn vùng AZF của NSTY
Quy trình tách chiết ADN
Tiến hành đo nồng độ ADN mỗi mẫu bằng máy Nanodrop USA.
Sử dụng mẫu ADN thu được của từng bệnh nhân để chạy Multiplex PCR nhằm phát hiện
mất đoạn trên vùng AZF của NST Y.
Sản phẩn sau khi chạy Multiplex PCR xong được tiến hành điện di trên agarose, có sử dụng
Marker 100bp của hãng Invitrogen.
Đánh giá kết quả thu được bằng cách nhuộm bản và đọc kết quả thu được và kết luận.

Xử lý số liệu: Sử dụng phương pháp thống kê và tính tỷ lệ %
Thời gian từ tháng 09/2010 tới tháng 12/2011, tổng số 264 bệnh nhân vô sinh nam
giới tuổi từ 18 tới 51 tuổi đã được thăm khám lâm sàng, xét nghiệm tinh dịch đồ và kết luận
là KCTT và ITT. Những bệnh nhân này được xét nghiệm NST và xét nghiệm ADN, kết quả
nghiên cứu được trình bày ở dạng các bảng và biểu đồ dưới các đề mục sau:
1. Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu
Trong tổng số 264 bệnh nhân vô sinh nam giới thu thập được có độ tuổi thấp nhất là
18 tuổi, cao nhất là 51 tuổi, tuổi trung bình của các bệnh nhân này là: 31,77 ± 5,96.
Bảng 1. Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nhóm tuổi
Tuổi Số bệnh nhân Tỷ lệ
≤ 24
19 7.20%
25- 29
93 35.23%
30- 34
85 32.20%
35- 39
33 12.50%
≥ 40
34 12.88%
Tổng 264 100%
2. Phân tích NST, lập nhiễm sắc thể đồ ở bệnh nhân vô sinh nam giới
2.1. Phân bố tỷ lệ nhiễm sắc thể đồ ở bệnh nhân vô sinh nam giới
Tất cả 264 bệnh nhân vô sinh nam giới đều được chỉ định xét nghiệm NST, phân tích
và lập nhiễm sắc thể đồ. Kết quả được biểu diễn qua biểu đồ sau:

Hình 1 Phân bố tỷ lệ nhiễm sắc thể đồ ở bệnh nhân vô sinh nam giới
2.2. Phân bố bất thường NST thường và NST giới tính về số lượng và cấu trúc
Bảng 2: Phân bố về bất thường NST thường và NST giới tính về số lượng và cấu trúc
của bệnh nhân vô sinh nam giới.

Bất thường NST
Bất thường về
số lượng NST
Bất thường về
cấu trúc NST
Tổng số (%)
NST thường
1 4 5 (31,25%)
NST giới tính
10 1 11 (68,75%)
Tổng số 11 5 16 (100%)
Bảng 3: Phân bố các kiểu nhiễm sắc thể đồ bất thường ở bệnh nhân vô sinh nam giới:
Kiểu bất
thường
Nhiễm sắc thể đồ Số lượng
Bất thường số
lượng NST
NST giới tính
47,XXY 9

46,XX 1

NST thường
45,XY, der(13:14)(q10:q10) 1
Bất thường
cấu trúc NST
NST giới tính
46,XY, t(14;X) 1

NST thường

46,XY, t(2q;13q) 1

46,XY, inv(9)(p11q13) 1


46,XY,t(2;8)(q14.2; q24.1)
t(3;14) (p23;q13)
1


46,XY,t(5;7;14)
(p10;q36;q10)
1
Tổng

16
3 Kết quả phát hiện mất đoạn vùng AZF của NST Y
1 Hoàn thiện quy trình Multiplex PCR nhằm phát hiện mất đoạn vùng AZF ở bệnh nhân vô
sinh.
- Lựa chọn các trình tự mồi:
Các STS đặc hiệu được sử dụng trong phản ứng PCR và số lượng STS cũng là một
yếu tố ảnh hưởng tới tỷ lệ mất đoạn nhỏ trên AZF được phát hiện. Có khoảng 300 STS đặc
hiệu cho vùng AZF và có thể sử dụng để chẩn đoán các mất đoạn nhỏ. Tuy nhiên, không thể
dùng tất cả các STS để xét nghiệm mất đoạn nhỏ vùng AZF vì giá thành xét nghiệm sẽ rất
cao và thời gian xét nghiệm sẽ rất dài. Để giải quyết vấn đề này, Học viện nam học Châu Âu
(EAA: European Academy of Andrology), khuyến cáo chỉ cần sử dụng 2 STS cho mỗi phân
vùng AZF cũng có thể phát hiện trên 90% các mất đoạn nhỏ [56]. Các STS được khuyến cáo
để chẩn đoán mất đoạn nhỏ trên vùng AZF là: sY84 và sY86 cho AZFa, sY127 và sY134 cho
AZFb, sY254 và sY255 cho AZFc [55]. Tuy nhiên, tính đặc hiệu của các STS này đối với các
mất đoạn nhỏ còn là điều gây tranh cãi.

Trong nghiên cứu này, các STS được khuyến cáo bởi Học viện nam học Châu Âu
được sử dụng với một sự thay đổi nhỏ. Các STS cho AZFa và AZFb được giữ nguyên. Để
chẩn đoán mất đoạn nhỏ vùng AZFc, sY255 được thay thế bằng sY153. Một lý do cho sự
thay thế này là sY255 nằm rất gần sY254 trên vùng DAZ và chúng hay bị tổn thương cùng
nhau. Việc chọn sY153 có thể giúp phát hiện những mất đoạn nhỏ trên AZFc ở ngoài vùng
DAZ.
Như vậy, đề tài sử dụng 6 cặp mồi: sY86, sY127, sY254, sY84, sY134, sY153 nhằm
phát hiện mất đoạn trên các vùng AZFa, AZFb, AZFc. Cùng với đó, tiến hành chạy thêm với
cặp mồi SRY với vai trò là đối chứng dương nội tại.
Bảng 4: Trình tự 7 cặp mồi chạy Multiplex PCR [16]
STT
Kích
thước
STS Vị trí

Trình tự mồi
a1 472 bp SRY SRY F 5′-GAATATTCCCGCTCTCCGGA-3′

R
5′-GCTGGTGCTCCATTCTTGAG-3′
a2 320 bp sY86 AZFa
F
5-GTGACACACAGACTATGCTTC-3′

R
5′-ACACACAGAGGGACAACCCT-3
a3 274 bp sY127 AZFb
F
5′-GGCTCACAAACGAAAAGAAA-3′

R
5′-CTGCAGGCAGTAATAAGGGA-3′
A4 350 bp sY254 AZFc
F
5′-GGGTGTTACCAGAAGGCAAA-3′

R
5′-GAACCGTATCTACCAAAGCAGC-3′
Â5 326 bp sY84 AZFa
F
5′-AGAAGGGTCTGAAAGCAGGT-3′

R
5′-GCCTACTACCTGGAGGCTTC-3′
A6 301 bp sY134 AZFb
F
5′-GTCTGCCTCACCATAAAACG-3′

R
5′-ACCACTGCCAAAACTTTCAA-3′