nuôi cấy lát mỏng potx

Trường CĐSP Đà Lạt
khoa: Tự Nhiên
lớp: CNSH K34
Bài báo cáo: Nuôi cấy lớp lát mỏng, hiện tượng
hóa nâu, hiện tượng thủy tinh thể, nuôi cấy chồi
bất định, tạo củ giống lily bằng phương pháp nuôi
cấy invitro, phương pháp thủy canh
Nhóm thực hiện:
Nguyễn Tiến Chiến
Phạm Thanh Huyền
Võ Tiến Diễn
I. Sự phát sinh cơ quan từ lớp mỏng của
giống điều
1. M Đ UỞ Ầ

Cây điều là cây công nghiệp đem lại hiệu quả kinh tế cao ở một số nước
thuộc vùng nhiệt đới Châu Á và Châu Phi do nhân hạt điều có giá trị cao
trong xuất khẩu.

Thông thường cây được nhân giống từ hạt, nhưng phương pháp này đem lại
tính không đồng nhất về di truyền .

Các phương pháp nhân giống vô tính truyền thống như giâm cành, ghép cành
thường được sử dụng để nhân các dòng điều có năng suất cao, tuy nhiên hệ
số nhân giống không đáp ứng được nhu cầu.

Nuôi cấy lớp mỏng tế bào là một phương pháp cho nhiều ưu thế hơn so với
những phương pháp nhân giống in vitro truyền thống khác và được ứng dụng
thành công trên nhiều loài cây khác nhau

Tuy nhiên, việc ứng dụng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào ở cây thân

gỗ chưa được công bố nhiều.
2. Vật liệu và phương pháp
a. Vật liệu:
- Mẫu nuôi cấy là hạt trưởng thành của giống điều cao sản BO1
b. Phương pháp:
- Hạt được khử trùng bằng dung dịch NaOCl với nồng độ 1%
trong 24 giờ, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần
- Cây mầm phát triển từ hạt nuôi cấy trên môi trường khoáng MS
không có đường và vitamin sau 2 tuần được dùng làm nguyên
liệu cho thí nghiệm.
- Lớp mỏng cắt ngang từ 2 loại vật liệu là đốt tử diệp và đốt
thân của cây mầm (có bề dày khoảng 0,3-0,5mm) được cấy trên
các đĩa petri (Ф = 10cm) chứa 20ml môi trường.
- Môi trường nuôi cấy là môi trường MS có bổ sung nước dừa
10%, adenine sulphate 40mg/L, saccharose 20g/L, maltose 10
g/L, agar 9g/L, than hoạt tính 3g/L.
- Môi trường được bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng thực vật
là benzyladenine (BA), kinetin (KN) và naphthalene -1-acetic
acid (NAA) ở các nồng độ khác nhau. pH của môi trường trước
khi khử trùng là 5,9.
- Môi trường được khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 20 phút.
Phòng nuôi cây có nhiệt độ 25 ± 2oC, độ ẩm 60 ± 5%. Đĩa petri
đựng mẫu được che tối trong 3 ngay đầu, với thời gian chiếu sáng
12 giờ/ngày.
-Mỗi đĩa petri có 24 mẫu cấy của mỗi loại vật liệu (đốt thân mầm
hoặc đốt tử diệp).
-Thí nghiệm có 3 yếu tố là 3 chất điều hòa tăng trưởng thực vật,
mỗi yếu tố có hai mức độ.
-Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và mỗi nghiệm
thức gồm 4 đĩa petri lập lại 3 lần. Số liệu được phân tích thống kê

bằng phần mềm MSTATC .
-Thí nghiệm được theo dõi trong 28 ngày.

3. K T QUẾ Ả
- Kết quả thí nghiệm sau 28 ngày nuôi cấy cho thấy các lát mỏng
ở vùng đốt thân chỉ cho một chồi còn ở vùng đốt tử diệp thì cho
nhiều chồi hơn.
- Điều này cho thấy là do vùng sinh mô chờ hiện diện chung
quanh đốt tử diệp dễ bị kích hoạt dưới tác động của chất điều hòa
sinh trưởng thực vật.

Chồi hình thành từ lớp mỏng đốt thân mầm và đốt tử diệp sau
28 ngày.
- Số chồi cao nhất (5, 7 chồi) từ lớp mỏng ở đốt tử diệp thuộc
nghiệm thức 6 có bổ sung 10mg/l BA, 1mg/l KN và 0,5mg/l
NAA. Lớp mỏng tạo chồi thấp nhất (3 chồi) khi được nuôi trên
môi trường có bổ sung 5mg/l BA v à 0,5mg/l NAA.
- Ảnh hưởng của BA và KN lên sự tạo chồi của lớp mỏng vung
đốt tử diệp thấy rõ nhất khi nồng độ BA 10mg/L và KN 1mg/L,
trong khi ảnh hưởng của NAA không thấy rõ lắm trong thí
nghiệm này.
- Đối với đốt thân mầm, nồng độ của các chất điều hoà sinh
trưởng thực vật được sử dụng trong thí nghiệm này không đem
lại sự khác biệt về số chồi hình thành ở cả 8 nghiệm thức.
S ch i t o thành t l p lát m ng đ t ố ồ ạ ừ ớ ỏ ố
thân m m và đ t t di p sau 28 ngàyầ ố ử ệ

Các chồi hình thành từ lớp mỏng được tiếp tục cấy chuyền
sang môi trường MS có bổ sung 1mg/l BA và 1mg/l KN để
phát triển thành cây với số lần cấy chuyền là 2 tuần/lần. Chiều

cao cây trung bình đạt 3-4cm sau 2 tháng cấy chuyền.
C m ch i cây đi u phát tri n sau 2 tháng c y chuy nụ ồ ề ể ấ ề
4. K T LU NẾ Ậ
- Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào có thể được sử
dụng để tạo chồi trực tiếp từ trục thượng diệp của hạt điều
nảy mầm. Số chồi được tạo trực tiếp từ lớp mỏng đốt tử
diệp là cao nhất khi môi trường có bổ sung 10mg/l BA,
1mg/l KN v à 0,5mg/l NAA.
- Đối với nuôi cấy lớp mỏng của đốt thân mầm thì chồi
có thể phát triển trên môi trường có BA 5mg/L và có hoặc
không có kinetin và NAA.

II. Hi n t ng hóa nâuệ ượ
- Hi n t ng hóa m u hóa nâu hay b đen là ch t ệ ượ ẫ ị ế
m u hay làm gi m s tăng tr ng. ẫ ả ự ưở
- Nguyên nhân c a hi n t ng này là do m u ủ ệ ượ ẫ
nuôi c y có ch a nhi u tannin hay hydroxyphenol ấ ứ ề
có nhi u trong mô già h n mô s oề ơ ẹ
- M t s ph ng pháp làm gi m s hóa nâu m u:ộ ố ươ ả ự ẫ
+ tách các ph n t phenol ra kh i môi tr ngầ ử ỏ ườ
+ b sung các ch t kh redox (oxidation-redution) ổ ấ ử
phenol vào môi tr ngườ
+ ngăn ch n s ho t đ ng c a enzim phenolaseặ ự ạ ộ ủ
+ gi m l ng phenol có s n trong m u b ng môi tr ng ả ượ ẵ ẫ ằ ườ
l ng gi ng môi tr ng r nỏ ố ườ ắ
+ m u chu n b có v t c t nh , đ ngoài vài gi tr c ẫ ẩ ị ế ắ ỏ ể ờ ướ
khi c y, hay n i c y trong môi tr ng không có ánh ấ ơ ấ ườ
sáng.

Than hoạt tính được đưa vào môi trường để hấp thụ chất kìm

hãm phenol, ngăn chặn quá trình hóa nâu hay đen, đặc biệt có
hiệu quả trên các loại phong lan, nồng độ thường 0,1-0,3%.

Tuy nhiên than hoạt tính sẽ làm chậm quá trình phát triển của
mô do hấp thụ chất kích thích sinh trưởng và các chất khác.
Polyvinylpyrolidone (pvp), một chất thuộc loại polyamide, hấp
thụ phenol qua vòng hydrogen, ngăn chặn sự hóa nâu, hiệu quả
phụ thuộc vào các loài cây trồng khác nhau.

Giảm sự hóa nâu bằng cách cho các chất khử quá trình oxi hóa
vào môi trường ngăn chặn sự oxi hóa phenol. Chất khử thường
dùng: vitamin C, axit citric, L-cystein hydroclorit, gluta thione,
và mecaptoethanol. Phương pháp quan trọng là phối hợp
vitaminC và axit citric

Phương pháp đề nghị:
+ sử dụng mẫu cấy nhỏ từ mô sẹo
+ gây vết thương trên mẫu nhỏ nhất khi khử trùng
+ ngâm mẫu vào dung dịch vitamin C và axit citric vài giờ
trước khi cấy
+ Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, O2 thấp không có đèn
1-2 tuần chuyển mẫu từ môi trường có nồng độ chất kích thích
sinh trưởng thấp sang môi trường có nồng độ cao.
III. Hi n t ng th y tinh thệ ượ ủ ể
-
Nhân giống vô tính in vitro chỉ có hiệu quả khi cây con
được nhân giống chuyển ra đồng ruộng có tỉ lệ sống cao.
Có hiện tượng trong nuôi cấy mô là xuất hiện cây in vitro
thủy tinh thể.
-

Khi chuyển ra khỏi bình nuôi cấy, cây con đễ dàng bị
mất nước và tỉ lệ sống thấp. Đây là một dạng bệnh sinh
lý. Dạng này thường thấy khi nuôi cấy trên môi trường
lỏng hay môi trường thạch có hàm lượng thạch thấp, đặc
biệt khi sự trao đổi khí thấp, quá trình thoát hơi nước tập
trung trong cây.
- Đặc điểm cây thủy tinh thể
+ Nhận thấy là có sự khác nhau về hình thành lớp sáp ở cây nuôi
cấy mô và cây ngoài tự nhiên. Lượng sáp chứa trong cây ngoài
vườn ươm cao hơn hẳn cây in vitro. Tế bào có chứa nhiều phân
tử có cực dễ dàng nhận phân tử nước gắn trên nó, gia tăng độ mất
nước và tốc độ hô hấp của tế bào trong nhân vô tính và đưa đến
sự chết của mô trong nuôi cấy.
- Ngăn chặn quá trình thủy tinh thể
+ giảm sự hút nước bằng cách tăng nồng độ đường
+ giảm sự tăng hấp thụ nước bằng cách tăng nồng độ đường trong nuôi cấy và
dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao, nhưng phương pháp này làm thay đổi
sự tổng hợp cấu trúc không gian của diệp lục và ức chế hình thành chồi.
+ giảm gây vết thương trên mẫu qua chất khử trùng và tiếp xúc với môi
trường cấy ít nhất. ABA ngăn chặn được sự hóa thủy tinh thể ở một số loài
cây trồng.
+ giảm nồng độ đạm trong môi trường nuôi cấy
+chuyển cây in vitro thuần hóa ngoài vườn ươm không ảnh hưởng đến cây bị
thủy tinh thể.
+ giảm etylen trong bình nuôi cấy bằng cách thông khí tốt
+ tăng nồng độ ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy
IV. Quy trình tạo củ lily bằng phương pháp
nuôi cấy in vitro
- Lily là cái tên được đặt cho loài hoa đẹp, bền và đa số có
toả hương thơm dịu dàng.

Quy trình nhân giống cây hoa Lily bằng phương pháp nuôi
cấy in-vitro được tiến hành qua các công đoạn sau:
Khử trùng mẫu
Nhân giống invitro
- Tạo mô sẹo
- Tạo phôi
- Tạo củ con từ phôi
- Tạo củ bi
- Tạo củ lớn
- Tạo củ thương phẩm
V. Phương pháp nuôi cấy chồi bất định

Đỉnh chồi bất định mới có thể phát triển hoặc trực tiếp trên
mẫu vật hoặc gián tiếp từ mô callus, mà mô callus này
hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu vật. Một số loại
mẫu vật được dùng như sau:
- Đoạn thân: thuốc lá, cam, chanh, cà chua, bắp cải…
- Mảnh lá: thuốc lá, cà chua, bắp cải, cà phê, ca cao…
- Cuống lá: thủy tiên…
- Các bộ phận của hoa: súp lơ, lúa mỳ, thuốc lá…
- Nhánh củ: họ hành, họ lay ơn, họ thủy tiên…
- Đoạn mầm: măng tây.

Sự phát sinh chồi bất định trực tiếp bắt đầu bằng các tế bào nhu
mô nằm ở trong biểu bì hoặc ngay phía dưới bề mặt của thân;
một số tế bào này trở thành mô phân sinh và các túi nhỏ gọi là
thể phân sinh phát triển. Các thể phân sinh này rõ ràng có
nguồn gốc từ các tế bào đơn. Tuy nhiên, chiều hướng phản ứng
của thực vật cũng tùy thuộc vào nồng độ phytohormone.


Sự phát triển các chồi bất định gián tiếp đầu tiên qua giai
đoạn hình thành callus cơ sở từ các chồi được tách trong nuôi
cấy. Các chồi sau đó phát triển từ ngoại vi mô callus và không
có quan hệ ban đầu với các mô có mạch dẫn của mẫu vật
VI. Nuôi tr ng th y canhồ ủ

Th y canh là k thu t tr ng cây không dùng đ t ủ ỹ ậ ồ ấ
mà tr ng tr c ti p vào môi tr ng dinh d ng ồ ự ế ườ ưỡ
ho c giá th mà không ph i là đ t. các giá th có ặ ể ả ấ ể
th là cát , tr u, v x d a, than bùn, ể ấ ỏ ơ ừ

K thu t th y canh là m t trong nh ng ngh ỹ ậ ủ ộ ữ ề
làm v n hi n đ i. ch n l a môi tr ng t nhiên ườ ệ ạ ọ ự ườ ự
c n thi t cho cây phát tri n là ch n s d ng ầ ế ể ọ ử ụ
ngh ng ch t thích h p cho s sinh tr ng và ữ ấ ợ ự ưở
phát tri n c a cây, tránh đ c s phát tri n c a ể ủ ượ ự ể ủ
côn trùng, c d i và các b nh t t t đ t.ỏ ạ ệ ậ ừ ấ
u đi mƯ ể

Ngày nay, th y canh đ c xem nh là gi i pháp c a n n nông nghi p t ng lai. Nó ủ ượ ư ả ủ ề ệ ươ
là ph ng th c canh tác có ý nghĩa l n v môi tr ng, kinh t và xã h i. Nh ng u ươ ứ ớ ề ườ ế ộ ữ ư
đi m c a k thu t th y canh có th k đ n nh sau: ể ủ ỹ ậ ủ ể ể ế ư
• Không c n đ t, ch c n không gian đ đ t h p d ng c cây tr ng, do vây có th ầ ấ ỉ ầ ể ấ ộ ụ ụ ồ ể
tri n khai nh ng vùng đ t nh h i đ o, vùng núi xa xôi, cũng nh t i gia đình ể ở ữ ấ ư ả ả ư ạ
trên sân th ng, balcon…ượ
• Không ph i làm đ t, không có c d i , không c n t i.ả ấ ỏ ạ ầ ướ
• Tr ng đ c nhi u v , có th tr ng trái v . ồ ượ ề ụ ể ồ ụ
• Không ph i s d ng thu c tr sâu b nh và các hóa ch t đ c h i khác.ả ử ụ ố ừ ệ ấ ộ ạ
• Năng su t cao, vì có th ch đ ng mùa v và tr ng liên t cấ ể ủ ộ ụ ồ ụ

• S n ph m hoà n toàn s ch và đ ng nh t, giàu dinh d ng và t i ngon.ả ẩ ạ ồ ấ ưỡ ươ
• Không tích lũy ch t đ c, không gây ô nhi m môi tr ng.ấ ộ ễ ườ
• Không đòi h i lao đ ng n ng nh c, ng i già , tr em đ u có th tham gia hi u ỏ ộ ặ ọ ườ ẻ ề ể ệ
quả