Thực nghiệm về cây Hedyotis Dichotoma keon

Chương 4


THỰC NGHIỆM















Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Thực nghiệm
63
4.1. TRÍCH LY CÔ LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ
4.1.1. Hóa chất
• Dung môi dùng trong sắc kí cột, sắc kí điều chế và bản mỏng gồm: eter dầu
hỏa (60 – 90
o
C), cloroform, etyl acetat, aceton, metanol, etanol là hóa chất Trung
Quốc (Xilong), Việt Nam (Chemsol) và được làm khan bằng Na
2

SO
4
nếu sử dụng
lại.
• Thuốc thử để hiện hình các chất trên sắc kí bản mỏng: dung dịch H
2
SO
4
50%,
dung dịch FeCl
3
/EtOH, đèn UV.
• Silica gel 60G F254 loại dùng cho sắc kí lớp mỏng, Merck.
Silica gel 60 (0,040 – 0,063 mm), Merck.
Sắc kí lớp mỏng, sắc kí điều chế 25DC - Alufolien 20 x 20 cm Kieselgel F254
Merck.
4.1.2. Thiết bị
• Lọ thủy tinh, becher, cột sắc kí, phễu xốp thủy tinh, fiol, hệ thống máy hút
chân không...
• Máy cô quay chân không Buchi-111, RE 111 Rotavapor và bếp cách thủy
Buchi 461 Water Bath.
• Thiết bị đo nhiệt độ nóng chảy: khối Maquenne và máy Polytherma-Wagner
and munz (Phòng Thí nghiệm Hợp chất Tự nhiên và Hóa dược).
• Thiết bị đo năng lực triền quang: triền quang kế KRUSS-Germany, Phòng Thí
nghiệm Hợp chất Tự nhiên và Hóa dược, Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên.
• Các thiết bị ghi phổ:
Phổ MS: ghi trên máy 5989B Serie II và máy AGILENT 1100 LC-MSD trap
spectrometer.
Phổ

1
H-NMR (500 MHz),
13
C-NMR (125 MHz), DEPT- NMR 90 và 135,
HSQC
, HMBC, COSY: ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500.
Tất cả phổ được ghi tại Phòng Phân Tích Cấu Trúc, Viện Hóa Học và Khoa
Học Công Nghệ, Số 18 Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội.

Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Thực nghiệm
64
4.1.3. Điều chế các loại cao
Cây An điền lưỡng phân được thu hái ở tỉnh Bình Phước, rửa sạch, phơi khô,
cắt nhuyễn, thu được bột cây khô 1,64 kg. Bột cây được cho vào bình thủy tinh,
ngâm với etanol 95
o
. Sau một ngày dung môi trích được rót ra, lọc qua giấy lọc, cô
quay thu hồi dung môi, bột cây còn lại được rót dung môi mới vào. Tiếp tục quá
trình trích thu được cao etanol.
Cao etanol được trích pha rắn trên silica gel, giải ly lần lượt bằng các đơn
dung môi từ không phân cực đến phân cực: eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat,
metanol. Sau khi cô quay thu hồi dung môi, thu được các loại cao eter dầu hỏa,
cloroform A, cloroform B, etyl acetat A, etyl acetat B, etyl acetat C, metanol.
4.1.4. Cô lập một số hợp chất hữu cơ
Tiến hành sắc kí cột cổ điển, sắc kí điều chế các loại cao trên thu được các hợp
chất Dichoto-Clo1 (từ cao cloroform A), Dichoto-Clo2, Dichoto-Clo3 (từ cloroform
B), Dichoto-Ace1 (từ cao etyl acetat A), Dichoto-Ace2 (từ cao etyl acetat B),
Dichoto-Ace3, Dichoto-Ace4 (từ cao etyl acetat C), Dichoto-Me1 (từ cao metanol).
Toàn bộ quá trình trên được theo dõi bằng sắc kí lớp mỏng, thuốc thử hiện hình
dung dịch H

2
SO
4
50%, dung dịch FeCl
3
/EtOH, đèn UV.
4.2. THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC
4.2.1. Thử nghiệm độc tính Brine Shrimp
Thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa Hữu cơ, Khoa Hóa, Đại học
Khoa học Tự nhiên.
• Dụng cụ và hóa chất
- Trứng Brine Shrimp.
- DMSO, nước biển.
- Becher 500 ml dùng để ấp trứng, becher 250 ml dùng để chứa ấu trùng.
- Pipet pasteur để bắt ấu trùng.
- Pipetteman sử dụng cone 10 – 100 μl, 100 – 1000 μl.
- Đèn pin.
- Giá đỡ và ống nghiệm có dung tích lớn hơn 5 ml.

Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Thực nghiệm
65
• Cách thử
Thử nghiệm trên các loại cao điều chế được, mỗi loại được thử nghiệm với
nhiều nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ thử ba lần. Mỗi ống nghiệm thử chứa 10 ấu
thể Artemia salina.
Từ dung dịch mẫu cái 20 (mg/ml) hút lấy 500, 250, 125, 75, 50, 25 μl cho vào
các ống thử (sau này mỗi ống có thể tích dung dịch tổng cộng là 5 ml tương ứng với
nồng độ 1000, 500, 250, 150, 100, 50 μg/ml.
Dùng pipet pasteur hút 10 ấu trùng cho vào mỗi ống thử.
Thêm dung dịch nước biển cho đủ 5ml/ống.

Khay được che sơ lại và ủ ở nhiệt độ phòng.
Sau 24 giờ, đếm số lượng ấu trùng chết, suy ra tỷ lệ ấu trùng chết do dung dịch
thử nghiệm ở mỗi nồng độ.
• Kết quả
Kết quả được trình bày ở liều LC
50
là liều mà cao trích pha ở nồng độ xác định
có thể giết chết ấu trùng Brine Shrimp trong vòng 24 giờ.
4.2.2. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn
Thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Chuyển hóa Sinh học, Khoa Sinh, Đại
học Khoa học Tự nhiên.
• Chuẩn bị
Mẫu thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn: cao eter dầu hỏa, cloroform, etil
acetat, metanol. Tẩm mẫu lên đĩa giấy vô khuẩn, để thu được các đĩa giấy có nồng
độ nhất định, để khô ở nhiệt độ phòng.
Chủng vi khuẩn: Staphylococus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus spp
(gram dương) và
Escherichia coli (gram âm). Các chủng vi khuẩn được giữ trong
môi trường BHI +5% glycerol, giữ trong những ống eppendort, ở nhiệt độ -26
o
C;
được cấy chuyền 2 tháng một lần.
Môi trường kháng sinh đồ: sử dụng môi trường Mueller Hinton Agar ( MHA)
của hãng Biolife, và môi trường canh thang cao thịt – peptone.

Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Thực nghiệm
66
Các đĩa giấy có đường kính 6mm được tiệt trùng trong 30 phút trong nồi hấp
autoclave ở 121
o

C và sấy khô an toàn. Các hộp petri vô trùng, bằng thủy tinh, có
đường kính 90 mm. Que thuỷ tinh vô trùng để trải vi khuẩn.
• Cách tiến hành
Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm: từ các ống eppendorf giữ chủng vi khuẩn được
cấy chuyền ra trên mặt thạch dinh dưỡng (nutrient agar) . Các hộp thạch đã có vi
khuẩn được ủ qua đêm ở 37
o
C. Sau khi thấy trên mặt thạch xuất hiện các khuẩn lạc
(vi khuẩn sinh sản mọc thành từng cụm) chọn 3 - 5 khuẩn lạc riêng lẻ , giống nhau,
cho vào ống nghiệm có 5 ml nước muối sinh lý, để làm thành một dung dịch huyền
phù vi khuẩn, sao cho đạt độ đục 0.5McF (tương đương với 10
8
CFU/ml). Mỗi
chủng vi khuẩn chuẩn bị trong những ống nghiệm riêng.
Chuẩn bị hộp thạch thử nghiệm: cân 38g môi trường MHA cho vào 1 lít nước
cất, đun cách thuỷ đến tan hoàn toàn. Khử trùng bằng nồi hấp autoclave ở 121
o
C
trong 30 phút. Sau khi để nguội đến 50
o
C , bắt đầu phân phối ra các đĩa petri vô
trùng. Mỗi đĩa petri có 22 ml thạch với độ dày lớp thạch là 4 mm. Các hộp thạch
này được ủ qua đêm ở 37
o
C để kiểm tra sự vô trùng. Loại bỏ các hộp thạch bị
nhiễm.
Dùng que thuỷ tinh vô trùng nhúng vào dung dịch huyền phù vi khuẩn đã
chuẩn bị ở trên, rồi trải đều chủng vi khuẩn thử nghiệm lên mặt thạch của môi
trường MHA.
Làm kháng sinh đồ: sử dụng phương pháp khuyếch tán trên thạch. Mỗi khoanh

giấy tẩm loại dung dịch thử nghiệm khác nhau (mỗi khoanh giấy được tẩm 20
μl
dung dịch chất thử nghiệm); để bay hơi hết dung môi. Dùng kẹp vô khuẩn để kẹp
khoanh giấy có tẩm dung dịch thử nghiệm, đặt lên mặt thạch thử nghiệm. Một đĩa
thạch có thể đặt 5 khoanh giấy.
Thực hiện với mẫu trắng là đĩa giấy chứa dung môi (loại đã dùng để trích cao).
Lật ngược lớp vỏ thạch và ủ ở 37
o
C để vi khuẩn phát triển. Chất thử nghiệm ở
khoanh giấy sẽ khuyếch tán ra môi trường thạch. Sau 18 - 24 giờ, đọc kết quả