Nghiên cứu một vài đặc điểm sinh học của rickettsia like bacteria (RLB) ở tôm hùm bông (panulirus ornatus fabricius, 1798)

i
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của
nhiều tổ chức và cá nhân. Qua đây tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Trường Đại học Nha Trang, Khoa Nuôi trồng Thủy sản, phòng Bệnh và Môi
trường của Trung tâm Giống hải sản miền Trung thuộc Viện nghiên cứu Nuôi trồng
Thủy sản 3, phòng Công nghệ phôi của Viện công nghệ sinh học Hà Nội là những cơ
quan đã giúp đỡ về mặt vật chất và kỹ thuật để tôi hoàn thành đề tài này.
TS Nguyễn Chí Thuận - giáo viên hướng dẫn, người đã định hướng, giúp đỡ và
tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi thực hiện đề tài.
Cô Nguyễn Hoàng Uyên, các anh Phạm Ngọc Long, Nguyễn Quang Vinh,
Nguyễn Văn Giang, Đinh Quang Huy đã động viên và giúp đỡ tôi trong việc phân tích
mẫu cũng như hoàn thành khóa luận.
Và tất cả người thân, bạn bè đã luôn bên tôi, cổ vũ, động viên tinh thần để tôi có
nghị lực học, vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận.
Xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, ngày 15 tháng 03 năm 2011
Học viên: Nguyễn Thị Thu Thủy


ii

MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn i
Mục lục ii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt v
Danh mục các bảng vi
Danh mục các hình vii

MỞ ĐẦU 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tình hình nghiên cứu Rickettsia trên động vật thủy sản trên thế giới 3
1.1.1. Tình hình nghiên cứu Rickettsia–like organism (RLO) trên cá 3
1.1.2. Tình hình nghiên cứu RLO trên nhuyễn thể 8
1.1.3. Tình hình nghiên cứu RLO trên giáp xác 12
1.2. Tình hình nghiên cứu Rickettsia trên động vật thủy sản ở Việt Nam 16
1.3. Tổng quan về các phương pháp phát hiện RLB 18
1.3.1. Phương pháp chẩn đoán lâm sàng 18
1.3.2. Phương pháp mô bệnh học 18
1.3.3. Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) 19
1.3.4. Phương pháp phân lập RLB 20
1.3.5. Phương pháp PCR phát hiện RLB 21
1.3.6. Một số phương pháp phân loại vi sinh vật 23
1.3.6.1. Phân loại theo phương pháp cổ điển 23
1.3.6.2. Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử 23
1.3.6.3. Tách dòng và giải trình tự gen 16S rRNA 25
Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu 27
2.2. Phương pháp nghiên cứu 27
2.2.1. Phương pháp thu mẫu nghiên cứu 27
2.2.1.1 . Phương pháp thu mẫu tại hiện trường 27
2.2.1.2. Phương pháp thu mẫu trong phòng thí nghiệm 28
2.2.2. Phương pháp nuôi cấy RLB 28


iii

2.2.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của RLB 29
2.2.4. Phương pháp PCR xác định RLB 29

2.2.4.1. Phương pháp tách chiết DNA của RLB 29
2.2.4.2. Thực hiện phản ứng PCR 30
2.2.5. Phương pháp PCR nhân đoạn gen 16S rRNA 32
2.2.6. Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR 33
2.2.7. Phương pháp tách dòng và xác định trình tự gen 16S rRNA của RLB 34
2.2.7.1. Tách dòng gen 16S rRNA trong vector pCR TOPO 2.1 34
2.2.7.2. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α bằng phương pháp sốc
nhiệt 35
2.2.7.3. Tách plasmid DNA bằng Qiagen Miniprep Kit 35
2.2.7.4. Cắt kiểm tra DNA plasmid bằng EcoRI 36
2.2.7.5. Giải trình trình tự đoạn gen 16S rRNA 37
2.2.8. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 37
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39
3.1. Kết quả thu mẫu 39
3.1.1. Mẫu tôm hùm bông 39
3.1.2. Mẫu thức ăn 41
3.1.3. Mẫu sinh vật bám xung quanh lồng nuôi tôm hùm 45
3.2. Đặc điểm hình thái và trình tự gen 16S rRNA của chủng RLB trên tôm hùm
bông ở Việt Nam 46
3.2.1. Đặc điểm hình thái của chủng RLB trên tôm hùm bông ở Việt Nam 46
3.2.2. Trình tự gen 16S rRNA của chủng RLB trên tôm hùm bông ở Việt Nam 48
3.2.2.1. Tách chiết DNA tổng số 48
3.2.2.2. Kết quả nhân đoạn gen 16S rRNA của RLB bằng phương pháp PCR .48
3.2.2.3. Tinh sạch sản phẩm PCR chủng RLB1 và RLB2 49
3.2.2.4. Tách dòng gen 16S rRNA trong vector pCR TOPO 2.1 50
3.2.2.5. Xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng RLB1 52
3.3. Kết quả khảo sát sự phân bố của RLB trên tôm hùm bông và một số loại thức
ăn nuôi tôm bằng phương pháp PCR 53
3.3.1. Kết quả khảo sát sự phân bố của RLB trên tôm hùm bông 53

iv

3.3.2. Kết quả khảo sát sự phân bố của RLB trên một số loại thức ăn nuôi tôm
và các sinh vật bám xung quanh lồng nuôi tôm 57
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO 60



v
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
% : Phần trăm
µm : Micromet
bp : Base pair
DNA : Deoxyribonucleic acid

FBS : fetal bovine serum
g : Gam
H & E : Hematoxyline và Eosin
LB : Luria – Bertani
M : Marker
PCR : Polymerase Chain Reaction
RLB : Rickettsia-like Bacteria
RLO : Rickettsia-like organism
RNA : Ribonucleic acid
rRNA : Ribosomal ribonucleic acid
SEM : Scanning electron microscopy
sp : Loài chưa xác định
spp : Nhiều loài chưa xác định tên

SV : Sinh vật
TA : Thức ăn
TEM : Transmision electron microscopy
TH : Tôm hùm
X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indodyl- β galactosidase








vi

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Phân tích các thành phần hóa học của tế bào theo hệ thống hóa học 24
Bảng 1.2: Các thành phần chính trong vectơ pCR TOPO 2.1 25
Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR 31
Bảng 2.2: Chu trình phản ứng PCR 31
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rRNA của RLB 33
Bảng 2.4: Chu trình phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rRNA của RLB 33
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng tách dòng gen 16S rRNA bằng vector pCR TOPO 2.1 35
Bảng 3.6: Hỗn hợp phản ứng cắt EcoRI 36
Bảng 3.1: Danh sách mẫu tôm hùm bông thu theo thời gian và địa điểm nghiên cứu.39
Bảng 3.2: Số lượng mẫu thức ăn đã phân tích 43
Bảng 3.3: Số lượng mẫu sinh vật bám xung quanh lồng nuôi tôm hùm 45
Bảng 3.4: Mức độ tương đồng đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng RLB1 với
một số chủng vi khuẩn khác 53
Bảng 3.5: Kết quả PCR phát hiện RLB trên tôm hùm bông 55

Bảng 3.6: Tỷ lệ cảm nhiễm của RLB trên tôm hùm bông 55
Bảng 3.7: Mức độ tương đồng đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng RLB4 với
một số chủng RLB trên các đối tượng khác nhau 57



vii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Hình kính hiển vi điện tử của RLO ký sinh trên loài hàu Crassostrea
rizophorae 11
Hình 1.2: Hình kính hiển vi điện tử của RLO trên ống thực quản và tuyến tiêu hóa của loài
bào ngư đỏ (H. rufescens). 12
Hình 1.3: Các khuẩn lạc của RLO bên trong tế bào mô liên kết của loài cua biển C.
mediterraneus. 13
Hình 1.4: Hình cua C. maenas bị bệnh sữa và hình kính hiển vi điện tử của RLO
trên gan tụy của cua bị bệnh sữa 14
Hình 1.5: Hình TEM của RLB trong cơ quan lympho của tôm 16
Hình 1.6: Hình kính hiển vi điện tử của RLB ký sinh trong nguyên sinh chất của tế
bào mô liên kết gan tụy của tôm hùm bị bệnh sữa. 17
Hình 1.7: Sơ đồ cấu trúc vectơ pCR TOPO 2.1 26
Hình 2.1: Sơ đồ qui trình nuôi cấy RLB 29
Hình 2.2: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 38
Hình 3.1: Hình tôm hùm bông và máu tôm hùm bông khỏe mạnh (A); Hình tôm
hùm bông và máu tôm hùm bông bị bệnh sữa (B). 41
Hình 3.2: Thức ăn tôm hùm được bán tại chợ Ba Ngòi – Cam Ranh – Khánh Hòa 42
Hình 3.3: Mẫu thức ăn thu tại chợ Xuân Thịnh – Sông Cầu – Phú Yên 42
Hình 3.4: Hình bình nuôi cấy tế bào 25cm
2
trước (A) và sau khi nuôi cấy 7 ngày (B) 46

Hình 3.5: Kết quả nuôi cấy của dịch L-15 trên môi trường MA, BHI và TCBS sau 48 giờ 46
Hình 3.6: Ảnh RLB nhuộm Gram và quan sát KHV vật kính dầu 1000x 47
Hình 3.7: Hình kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) của RLB (A) và hình chụp
RLB trên kính hiển vi điện tử quét (SEM) (B) 47
Hình 3.8: Ảnh quá trình sinh sản của RLB chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) 47
Hình 3.9: Điện di đồ DNA mẫu RLB1 và RLB2. M: thang chuẩn; giếng 1, 2: DNA
của RLB1, RLB2 48
Hình 3.10: Điện di đồ sản phẩm PCR đoạn gen 16s rRNA của RLB1 và RLB2 49
Hình 3.11: Điện di đồ sản phẩm tinh sạch của phản ứng PCR chủng RLB1 và
RLB2. 49
Hình 3.12: Màu sắc khuẩn lạc sau khi biến nạp 50


viii

Hình 3.13: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm cắt Enzyme giới hạn EcoRI của các DNA
plasmid 51
Hình 3.14: Điện di đồ DNA tổng số hemolymph của một số mẫu tôm hùm 53
Hình 3.15: Hình điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA của
RLB trên hemolymph của 30 mẫu tôm hùm bông. 54
Hình 3.16: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên agarose 1,5% 56
Hình 3.17: Phổ điện di DNA tổng số của các mẫu thức ăn tôm hùm. 57
Hình 3.18: Kết quả điện di sản phẩm PCR của thức ăn nuôi tôm hùm bông 58


1
MỞ ĐẦU
Tôm hùm bông (Panulirus ornatus Fabricius, 1798) là một trong những loài hải
đặc sản có giá trị kinh tế của Việt Nam, đặc biệt là các tỉnh miền Trung. Từ năm 1992,
nghề nuôi tôm hùm lồng thương phẩm đã góp phần làm thay da đổi thịt cho các vùng

ven biển thuộc các tỉnh từ Phú Yên đến Bình Thuận. Tuy vậy, một dịch bệnh mà người
dân thường gọi là bệnh sữa (hay bệnh đục thân) xuất hiện vào cuối năm 2006 và bùng
phát thành dịch vào tháng 8, 9 năm 2007 đã gây thiệt hại hàng trăm tỷ đồng cho người
nuôi tôm.
Bệnh có các dấu hiệu đặc trưng như máu và dịch tiết cơ thể có màu trắng đục
như sữa, cơ của các đốt bụng chuyển từ trắng trong sang trắng đục. Ngoài ra, có một
số con có thêm dấu hiệu các phần phụ và thân tôm chuyển sang màu hồng. Bệnh có
thể gây chết đến 90% lượng tôm nuôi sau 3 – 7 ngày xuất hiện dấu hiệu bệnh lý. Bệnh
thường xuất hiện ở tôm hùm bông 3 tháng tuổi đến 0,8 kg và cả tôm sắp thu hoạch.
Hiện nay, bệnh sữa ở tôm hùm bông vẫn là một thách thức lớn đối với các nhà khoa
học cũng như người nuôi tôm.
Bệnh có các biểu hiện tương tự với bệnh sữa ở tôm hùm bông của Việt Nam là
bệnh sữa ở tôm hùm gai Florida Keys (Panulirus argus), tuy nhiên bệnh chỉ xuất hiện
ở giai đoạn juvenile. Tác nhân được xác định là một loại virus không có vỏ bọc, có
dạng hình khối 20 mặt, được đặt tên là virus PaV1 [34]. Bệnh sữa cũng đã được phát
hiện trên loài tôm sú (Penaeus monodon) nuôi ở Madagasca và vùng Đông Phi. Tác
nhân gây bệnh được xác định là loại vi khuẩn ký sinh nội bào tựa như Rickettsia
(Rickettsia-like bacteria - RLB). Kỹ thuật sinh học phân tử đã được ứng dụng để phát
hiện loại vi khuẩn này [39].
Ngoài ra, bệnh sữa cũng xuất hiện trên loài cua châu Âu (Carcinus maenas) với
dấu hiệu máu đục như sữa. Bệnh thường xuất hiện vào mùa hè khi nhiệt độ nước tăng
cao. Tác nhân gây bệnh là một loại vi khuẩn gram (-), hình que, không nuôi cấy được
trên các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường. Kết quả phân tích 16S rRNA
của vi khuẩn gây bệnh cho thấy đây là một loại vi khuẩn thuộc nhóm α-proteobacteria,
bộ Ricketsiales [28].


2
Ở Việt Nam, bệnh tôm hùm sữa là một bệnh mới và chưa có nhiều nghiên cứu
về bệnh này. Theo kết quả nghiên cứu của Đỗ Thị Hòa và cộng sự (2009), tác nhân

gây bệnh sữa ở tôm hùm nuôi tại các tỉnh miền Trung là một loại vi khuẩn gram (-),
cong nhiều, kích thước 1,5 – 2,5 µm, ký sinh nội bào bắt buộc giống với Rickettsia
(Rickettsia-like Bacteria - RLB) [2]. RLB là vi sinh vật ký sinh nội bào bắt buộc, ký
sinh và nhân lên bên trong nguyên sinh chất của tế bào ký chủ. Hiện vẫn chưa nuôi cấy
được RLB trên các loại môi trường nuôi cấy vi khuẩn nhân tạo thông thường nên việc
phát hiện chúng gặp nhiều khó khăn. Các loại thức ăn tươi sống nuôi tôm như cá,
nhuyễn thể và giáp xác bị nghi ngờ là các vật chủ mang mầm bệnh.
Xuất phát từ thực tế trên, bằng việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử,
chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu một vài đặc điểm sinh học của Rickettsia-like
Bacteria (RLB) ở tôm hùm bông (Panulirus ornatus Fabricius, 1798)”. Mục tiêu của
đề tài là nhằm xác định đặc điểm hình thái, kích thước của chủng RLB ở tôm hùm
bông và biết được sự phân bố của chúng trong thức ăn nuôi tôm. Nghiên cứu góp phần
làm rõ hơn về tác nhân gây bệnh sữa, vật mang bệnh và đường truyền lan của bệnh sữa
ở tôm hùm. Đây là việc làm mới có ý nghĩa khoa học và thực tế cần được triển khai
nghiên cứu.
Đề tài được thực hiện với các nội dung chính sau:
 Nghiên cứu đặc điểm hình thái và trình tự gen 16S rRNA của chủng RLB trên
tôm hùm bông nuôi ở Việt Nam.
 Điều tra sự phân bố của RLB trên tôm hùm bông nuôi ở Việt Nam và một số
loại thức ăn nuôi tôm.









3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu Rickettsia trên động vật thủy sản trên thế giới
Rickettsia là một nhóm vi sinh vật có kích thước nhỏ, sống ký sinh nội bào bắt
buộc, tăng trưởng và nhân lên trong tế bào chất của các tế bào chủ nhân chuẩn (thường
là các tế bào nội mô). Do đó Rickettsia chưa sống được trong môi trường dinh dưỡng
nhân tạo. Rickettsia gây bệnh trên cả người, động vật có xương sống và động vật
không xương sống [16].
Vi sinh vật thuộc bộ Rickettsiales thường đa hình thái, chúng có thể có dạng
hình coccoit, elip, hình que hoặc dạng sợi. Kích thước: 0,3–0,5 x 0,3-2 µm. Chúng
không có khả năng di động, gram (-) và có cấu trúc vách tế bào đặc thù của vi khuẩn,
không roi và chỉ nhân lên bên trong tế bào ký chủ [16].
Rickettsia thường được báo cáo về khả năng gây bệnh trên các loài động vật
thủy sản biến nhiệt như cá biển, đặc biệt là các loài cá di cư để đẻ như cá hồi. Ngoài ra,
chúng cũng đã được tìm thấy trên các đối tượng thủy sản ngọt như cá rô phi. Các báo
cáo gần đây cho thấy, có ít nhất 25 loài thân mềm hai mảnh vỏ nước mặn và 12 loài
giáp xác bị nhiễm sinh vật ký sinh nội bào giống Rickettsia (Rickettsia–like organism
– RLO) ở Pháp, Canada, Nhật Bản, Tây Ban Nha, Scotland, Thụy Điển, Singapore,
Malaysia và Mỹ [29].
1.1.1. Tình hình nghiên cứu Rickettsia–like organism (RLO) trên cá
Nghiên cứu đầu tiên về RLO trên cá được thông báo vào năm 1939. Trong
nghiên cứu này, RLO được phát hiện trong tế bào của cá Tetrodon fahaka bị bệnh ở
sông Nile, Ai Cập. Các tế bào RLO có dạng hình cầu, đường kính xấp xỉ 0,25 µm
được tìm thấy trong máu và các cơ quan khác của cá khi nhuộm bằng phương pháp
nhuộm Giemsa mà vẫn chưa nuôi cấy được. Đến năm 1975, Ozel và Schwanz-Pfitzner
đã tình cờ nuôi cấy và phát hiện RLO ký sinh nội bào trên cá hồi vân (Oncorhynchus
mykiss) khi nuôi cấy virus bằng phương pháp nuôi cấy tế bào RTG-2 [46]. Tuy vậy,
các nghiên cứu về nhóm vi sinh vật này vẫn còn nhiều hạn chế, vị trí phân loại cũng
như những vấn đề liên quan tới bệnh vẫn chưa được làm sáng tỏ. Do đó, chúng vẫn
không được quan tâm nghiên cứu trong thời gian dài. Không có nghiên cứu nào đề cập
tới đối tượng này cho đến khi Davies phát hiện RLO tồn tại trên cá đàn lia

4
(Callionymus lyra) ở vịnh Cardigan, Wales vào năm 1986. RLO được tìm thấy trong
mô của cá đàn lia trong nghiên cứu mô về bệnh do ký sinh trùng máu gây ra trên loài
cá này [26].
RLO được nghiên cứu nhiều từ năm 1989. Trong năm này, khoảng 1,5 triệu con
cá hồi bạc (Oncorhynchus kisutch) có khối lượng từ 200 g đến 2 kg ở Chile chết không
rõ nguyên nhân. Dịch bệnh này đã làm thất thoát hơn 10 triệu USD của người nuôi cá
hồi công nghiệp ở Chile [23]. Tỷ lệ hao hụt do bệnh này gây ra từ 60% cho đến 90%.
Bệnh thường xuất hiện ở cá hồi bạc (O. kisutch), cá hồi vân (O. mykiss) và cá hồi
Atlantic (Salmo salar) [31]. Do vậy, ban đầu bệnh do RLO gây ra được đặt tên là SRS
(Salmonid Rickettsial Septicaemia) [24].
Sau khi dịch bệnh bùng nổ, các nghiên cứu sâu hơn được tập trung nghiên cứu
như phân lập và xác định tác nhân gây bệnh, phát triển kỹ thuật chẩn đoán, kiểm tra
đáp ứng miễn dịch của cá và thử nghiệm với các loại kháng sinh trị bệnh [23].
Trong nghiên cứu về bệnh trên cá hồi bạc nuôi ở vùng biển Chile, RLO được
phân lập bằng cách sử dụng dòng tế bào cá để nuôi cấy. Cũng trong nghiên cứu này,
RLO đã được cảm nhiễm vào cá hồng bạc và được tái phân lập và định danh. Từ đó,
loài Piscirickettsia salmonis thuộc bộ Rickettsiales, họ Rickettsiaceae được xem là tác
nhân gây bệnh trên cá hồi ở Chile [31].
Sau khi phân lập RLO trên cá hồi bạc nuôi ở Chile, bệnh truyền nhiễm do
Rickettsia cũng được phát hiện trên cá hồi Atlantic nuôi ở vùng biển Colombia Anh
vào năm 1991. Dấu hiệu bệnh tích của bệnh trên cá hồi Atlantic rất giống với dấu hiệu
của bệnh trên cá hồi bạc ở Chile gây ra bởi RLO [15]. Bệnh cũng đã được báo cáo trên
cá hồi pink (Oncorhynchus gorbuscha) nuôi ở vùng biển Colombia Anh vào những
năm 1970, cá hồi Atlantic nuôi ở Phần Lan, Ireland và Scotland.
Đến năm 1994, RLO đã được tìm thấy trên tất cả các loài cá hồi nước mặn. Tuy
nhiên, tác nhân này đã được phát hiện trên cả các loài cá nước ngọt. Chern và Chao
(1994) đã báo cáo về bệnh do Rickettsia gây ra trên cá rô phi nuôi ở ao nuôi nước mặn

và ngọt ở Đài Loan. Tỷ lệ chết do bệnh này gây ra có thể lên đến 95% [19]. Khoo và
cộng sự (1995) cũng đã phát hiện RLO trên loài cá nước ngọt Panaque suttoni nuôi ở
vùng nhiệt đới của Mỹ [37]. Ở Pháp, Comps và cộng sự (1996) đã thông báo về sự tồn


5
tại của RLO trong não cá vược giống (Dicentrarchu labrax) đang hấp hối và có biểu
hiện bơi lội bất thường [20].
Cvitanich và cộng sự (1995) đã phát hiện và phân lập được một loài RLO mới
từ cá hồi Atlantic từ tháng 12/1994 đến tháng 1/1995 ở Chile. Bệnh bùng phát trong
các lưới vây ở hồ Llanquihue (có nhiệt độ nước xấp xỉ 16
0
C) và đăng chắn ở biển (nơi
có nhiệt độ nước khoảng 14
0
C). Cvitanich và cộng sự (1995) đã đặt tên cho loài này là
UA-2 (unidentified agent 2) hoặc U2 (unidentified 2) vì tác nhân này không giống với
các tác nhân đã được thông báo trước đó [25].
Gaggero và cộng sự (1995) đã phân lập được P. salmonis từ cá hồi bạc và cá
hồi vân nước ngọt. Kích thước của loài P. salmonis (đường kính: 0,2 – 0,8 µm) nhỏ
hơn loài P. salmonids (0,5 – 1,5 µm) nhưng cả hai đều có dạng coccoit (dạng dâu
khuẩn) [32].
Bệnh do RLO cũng đã bùng phát ở 4 vùng nuôi cá hồi Atlantic công nghiệp ở
Ireland vào năm 1995 và 1996. P. salmonis cũng đã được phân lập và nuôi cấy bằng
dòng tế bào cá [47].
Ở Đông Bắc nước Mỹ, dịch bệnh cũng đã bùng phát ở cá hồi Atlantic vào mùa
xuân năm 1996. Các phương pháp chẩn đoán đã kết luận RLO là tác nhân gây ra bệnh
này. Đây là dịch bệnh thứ hai xảy ra ở Bắc Mỹ do RLO gây ra [22].
Ở Địa Trung Hải, dịch bệnh do RLO gây ra đã được thông báo trên loài cá vược
châu Âu (Dicentrarchus labrax). Bệnh thường xảy ra ở cá sau 20 ngày chuyển vào

lồng nuôi. Khi bị bệnh cá có dấu hiệu bơi lội bất thường, tỷ lệ chết có thể lên đến 80%
trong những tháng mùa lạnh. Các thể vùi của RLO trong nguyên sinh chất của tế bào
ký chủ ở những vết thương tổn giống với loài P. salmonis [9].
Năm 2000, dịch bệnh bùng phát và gây chết cho cá vược giống (Atractoscion
nobilis) ở miền Nam California nước Mỹ với tác nhân là những vi sinh vật có nhiều
điểm tương đồng với loài P. salmonis. Mặc dù vi khuẩn phân lập được gây chết trên
80% cá hồi bạc trong vòng 10 ngày thí nghiệm nhưng lại phản ứng yếu với huyết
thanh kháng P. salmonis đa dòng [18].
Mauel và Miller (2002) đã báo cáo về sự hiện diện của vi sinh vật giống với P.
salmonis trong mẫu mô của cá rô phi bị bệnh tương tự bệnh Piscirickettsiosis. Chen và


6
cộng sự (2000) đã phát hiện thấy vi sinh vật giống với P. salmonis trên loài cá mú
Epinephelus melanostigma nuôi ở Đài Loan. Dấu hiệu bệnh tích và đặc điểm mô học
của bệnh giống với bệnh Piscirickettsiosis ở cá hồi và cá rô phi. Các loài này có hình
dạng, kích thước giống với P. salmonis và phản ứng với kháng thể đa dòng kháng P.
salmonis [18].
Mauel và cộng sự (2003) đã thông báo về dịch bệnh gây tỷ lệ chết cao trên hai
loài cá rô phi (Oreochromis mossambicus và Sarotherodon melanotheron) ở Oahu,
Hawaii, USA vào năm 1994. Tác giả không cho rằng P. salmonis là tác nhân gây bệnh
này mà ông khẳng định tác nhân gây bệnh chỉ là những vi sinh vật giống với P.
salmonis (Piscirickettsia-like organism - PLO). PLO không phản ứng với các kháng
thể P. salmonis đặc hiệu với phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT (Indirect
fluorescent antibody test) và không tạo ra sản phẩm khuếch đại với phản ứng PCR P.
salmonis đặc hiệu. Tuy vậy, PLO có nhiều điểm giống với P. salmonis như ký sinh nội
bào bắt buộc, dạng coccoit, sống tự do bên trong nguyên sinh chất và trong thể thực
bào sinh tan (phagolysosome). Cả PLO và P. salmonis đều có vách tế bào đôi nhưng
PLO có kích thước nhỏ hơn P. salmonis. Triệu chứng bệnh gây ra bởi hai loài này
giống nhau mặc dù PLO không gây ra các lỗ thương tổn trên gan cá bệnh như P.

salmonis và phát triển ở nhiệt độ trên 20
0
C [43].
Corbeil và cộng sự (2005) đã phát hiện RLO trên cá hồi Atlantic nuôi ở Đông
Nam Tasmania, Australia. Sự bắt màu yếu với thuốc nhuộm của RLO ở Tasmania cho
thấy sự tồn tại của một số quyết định kháng nguyên giữa dòng RLO ở Tasmania và
loài P. salmonis. RLO ở Tasmania cũng có nhiều điểm tương đồng về hình thái với P.
salmonis. Tuy nhiên, khác với P. salmonis, RLO ở Tasmania đã phát triển trong điều
kiện nuôi cấy tế bào. Bằng nghiên cứu giải trình tự, Corbeil và cộng sự (2005) kết luận
RLO ở Tasmania khác với P. salmonis [21].
Dấu hiệu của cá bệnh do RLO gây ra gồm: Cá thường bơi lội thẳng đứng hoặc
bơi vòng tròn trên mặt nước và thành của lưới [51, 12, 24, 15, 49, 13, 19, 47, 22, 45]
cá có dấu hiệu hôn mê, bụng trương to [51, 12, 18]; dạ dày nhợt nhạt, hoại tử, dạ dày
chứa dịch trong suốt còn ruột chứa dịch màu vàng [51, 12]; xuất huyết điểm trong dạ
dày, ruột, bóng bơi, mỡ trong nội tạng, xoang bụng và có các đốm trắng trên dạ dày,
ruột [23, 15, 19, 47, 45]; gan, thận và lách cá bệnh thường sưng, màu sắc nhợt nhạt


7
hoặc xuất huyết; có những điểm trắng trên tim, thận và lách [51, 23, 12, 15, 49, 19,
45]. Dấu hiệu bệnh lý bên ngoài gồm: xuất huyết trên đầu, màu sắc da tối và có những
vết thương tổn trên da như những điểm trắng, các vết loét ở mặt bụng [51, 12, 24, 13,
45]. Các dấu hiệu khác bao gồm các vết thương tổn trên đuôi, xuất huyết ở vây bụng
và vây lưng, vết loét ở giữa đỉnh đầu, mang nhợt nhạt, mắt lồi, xuất hiện các điểm
trắng trên mang của một số loài cá [51, 12, 15, 20, 52, 13, 18, 19, 22, 45].
Ban đầu, bệnh được cho là liên quan tới tình trạng stress của cá với các yếu tố
môi trường như sự biến động nhiệt độ nước, sự nở hoa của tảo. Tuy vậy, cá vẫn chết
ngay cả khi không có sự nở hoa của tảo và nhiệt độ nước ổn định. Do đó, không có sự
liên quan chặt chẽ giữa bệnh với các yếu tố môi trường.
Sự lan truyền của RLO qua các ký chủ trung gian cũng đã được xem xét. Rận

nước Calligus spp., động vật chân đều và thân mềm là những đối tượng bị nghi là vật
chủ trung gian dẫn truyền bệnh. Trong môi trường nước mặn, P. salmonis có thể sống
sót trong vòng 14 ngày ở nhiệt độ 14
0
C, điều này cho phép P. salmonis lan truyền
trong nước mà không cần vật chủ trung gian. Tuy vậy, P. salmonis bị bất hoạt nhanh
trong môi trường nước ngọt nên con đường truyền lan của chúng bị giới hạn và điều
này cũng giải thích vì sao bệnh ít xảy ra ở nước ngọt [29].
Cvitanich và cộng sự (1991) đã thông báo về sự lan truyền bệnh theo trục ngang
giữa cá hồi bạc bị nhiễm và không nhiễm RLO nuôi trong bể nước ngọt và nước mặn ở
nhiệt độ nước 15
0
C [24]. Trong khi đó, Garcés và cộng sự (1991) không phát hiện thấy
bất kỳ sự truyền lan bệnh nào giữa những con cá hồi bạc có và không bị nhiễm bệnh
nuôi trong cùng một bể ở nhiệt độ nước 8
0
C [33]. Chern và Chao (1994) lại chứng
minh có sự lan truyền bệnh trực tiếp giữa những con cá rô phi bị nhiễm RLO và cá
khỏe mạnh bằng thí nghiệm nuôi chung chúng với nhau trong cùng một bể [19]. Mặc
dù sự lan truyền bệnh theo trục ngang chưa được chứng thực trong điều kiện nuôi
nhưng những dấu hiệu bệnh lý thể hiện trong ruột và các vết thương tổn trên mang của
những con cá bệnh cho thấy có đường dẫn truyền RLO vào cơ thể hoặc RLO phát tán
từ cá bệnh thông qua phân [52, 19].
Almendras và cộng sự (1997) đã thử nghiệm các con đường truyền bệnh bằng
cách tiêm P. salmonis vào xoang bụng, miệng và mang cá hồi Atlantic. Kết quả nghiên
cứu cho thấy P. salmonis có thể xâm nhập vào cá qua mang, da và đường miệng [6].


8
Cvitanich và cộng sự (1991) đã phát hiện sự tồn tại của RLO trong dịch buồng trứng

cá hồi ở Chile. RLO cũng đã được tìm thấy trong phôi của trứng. Như vậy, rất có thể
RLO được lan truyền từ cá cái sang cá con [24].
Để chẩn đoán bệnh do RLO gây ra trên cá, người ta thường dựa vào dấu hiệu
bệnh tích, đặc điểm mô thông qua nhuộm H & E, gram, Giemsa, Acridine orange,
xanh Methylene, Gimenez, Macchiavello và PAS…Các kỹ thuật này tương đối nhanh
và được sử dụng rộng rãi nhưng không thật sự chính xác [31, 6]. Phương pháp hiệu
quả nhất để phân lập RLO là phương pháp nuôi cấy tế bào nhưng kỹ thuật này tốn
nhiều thời gian và khó do việc sử dụng kháng sinh trong trị bệnh.
Các phương pháp chẩn đoán dựa vào kháng thể cũng có nhiều hiệu quả trong
việc xác định P. salmonis [30]. Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFAT),
miễn dịch mô hóa học (immunohistochemistry - IHC), việc sử dụng kháng thể Pab
kháng P. salmonis của thỏ đã được phát triển để phát hiện P. salmonis [5]. Phương
pháp ELISA cũng đã được sử dụng trong chẩn đoán P. salmonis ở cá hồi [17]. Kỹ
thuật Nested PCR là phương pháp chẩn đoán nhanh và hiệu quả cao để phát hiện DNA
của P. salmonis ở giai đoạn mới cảm nhiễm, xác định hệ thống phân loại và những đặc
điểm sinh thái của vi khuẩn, con đường lan truyền bệnh và sự phát tán của tác nhân
trong môi trường [42]. Kỹ thuật lai DNA cũng đã được sử dụng trong nghiên cứu P.
salmonis trên cá bệnh [53].
1.1.2. Tình hình nghiên cứu RLO trên nhuyễn thể
Các loài vi sinh vật ký sinh nội bào bắt buộc thuộc bộ Rickettsiales và
Chlamydiales thường được tìm thấy trong tế bào biểu mô của mang và ống tiêu hóa
của rất nhiều loài thân mềm hai mảnh vỏ, trong đó có điệp. Leibovitz (1989) cho rằng
bệnh Chlamydiosis là một bệnh nghiêm trọng đối với ấu trùng và hậu ấu trùng của loài
điệp bay Argopecten irradians [50].
Morrison và Shum (1982) cho rằng vi sinh vật giống với Chlamydia
(Chlamydia-like organism - CLO) có mặt trong ống tiêu hóa của loài điệp Placopecten
magellanicus ở giai đoạn điệp giống và giai đoạn điệp trưởng thành. 40% số mẫu điệp
kiểm tra bị nhiễm CLO. Bằng phương pháp nhuộm H & E, nhóm nghiên cứu đã phát
hiện các thể vùi với các kích cỡ khác nhau tồn tại bên trong các không bào của các tế

9
bào biểu mô của ống tiêu hóa. Ở những cá thể bị bệnh nặng thường xuất hiện các thể
vùi trong các tế bào biểu mô của thận. Năm 1983, trong một nghiên cứu khác
Morrison và Shum cho rằng CLO là RLO vì nhóm vi sinh vật này không phát triển qua
các giai đoạn đặc trưng như Chlamydia [50].
Gulka và cộng sự (1983) đã thông báo về hiện tượng chết hàng loạt của loài
điệp biển Placopecten magellanicus ở vịnh Narragansett, đảo Rhode. Dấu hiệu của
bệnh là màng áo thụt vào và sẫm màu, cơ khép vỏ mềm nhũn, vỏ thường không bị
thương tổn. Bệnh xảy ra ở các giai đoạn khác nhau của điệp. Kết quả kiểm tra mô bệnh
học cho thấy có sự thoái hóa cơ khép vỏ và tồn tại các thể vùi ưa kiềm bên trong tế bào
biểu bì của mang và mặt ngoài của những cơ quan khác. Khi bị bệnh nặng, mô thường
mất cấu trúc bình thường, đặc biệt là mang. Nghiên cứu về cấu trúc cho thấy các tế bào
vi sinh vật không nhân ký sinh trên điệp có vách tế bào mỏng, kích thước 0,5 µm x 1,9
– 2,9 µm, được đặt tên là RLO. Có sự tương quan giữa mức độ nhiễm bệnh với sự
thoái hóa của cơ khép vỏ nên bệnh còn được gọi với một tên gọi khác là “bệnh xám cơ
khép vỏ” (“gray muscle disease”) [50].
Gulka và Chang (1984) đã bố thí nghiệm cảm nhiễm bằng cách chuyển điệp
Placopecten magellanicus khỏe mạnh vào nuôi tại các lồng ở vịnh Narragansett, đảo
Rhode. Trong vòng 2,5 – 3,5 tháng, có tới 53% số điệp chuyển đến bị nhiễm bệnh và
tỷ lệ nhiễm bệnh lên đến 100% sau 5 tháng nuôi. Tỷ lệ chết của điệp nuôi ở các lồng
cao hơn điệp nuôi trong phòng thí nghiệm. Thí nghiệm tiêm dịch mang điệp bệnh vào
điệp khỏe cho thấy điệp khỏe bị nhiễm bệnh trong vòng 20 – 25 ngày. Các thí nghiệm
cảm nhiễm tương tự lên vẹm xanh Mytilus edulis và loài ngao Mya arenaria đã không
thành công. Các kỹ thuật nuôi cấy cũng không đem lại kết quả [50].
Sự nhiễm RLO trên mang cũng được tìm thấy trên loài điệp P. magellanicus và
điệp Argopecten irradians bởi Leibovitz và cộng sự (1984). Nghiên cứu kết luận điệp
ở giai đoạn ấu trùng và điệp giống không bị ảnh hưởng bởi bệnh này. Tác nhân gây
bệnh được cho là nhóm vi sinh vật có hình thái giống với các vi sinh vật được tìm thấy
trên điệp P. magellanicus ở đảo Rhode và các vi sinh vật được tìm thấy bởi Comps

(1983) nhưng lại khác với RLO được mô tả bởi Morrison và Shum (1983) [50].
Việc thiếu những dẫn chứng rõ ràng về bệnh và sự thiệt hại nghiêm trọng do
bệnh gây ra trên điệp là một câu hỏi hóc búa đối với các nhà khoa học vào thời điểm


10

đó. Do vậy, có nhiều nghiên cứu về RLO trên các đối tượng thân mềm khác như
nghiên cứu trên loài điệp Aequipecten opercularis (LeGall và cộng sự, 1992),
Argopecten purpuratus (Lohrmann và cộng sự, 2000, 2002), Mizuhopecten yessoensis
(Elston 1986; Friedman 1994) và Pecten maximus (Comps 1983; LeGall và cộng sự
1988, 1991, 1992; LeGall và Mialhe 1992; Kellner-Cousin và cộng sự 1993) [50].
Không giống với Rickettsia gây bệnh trên động vật máu nóng và cá, RLO gây
bệnh trên động vật thân mềm không nuôi cấy được bằng phương pháp nuôi cấy tế bào
do thiếu các dòng tế bào của động vật thân mềm cho nuôi cấy in vitro. Le Gall và
Mialhe (1992) đã sử dụng kỹ thuật ly tâm để thu nhận sinh khối RLO trên loài điệp
Pecten maximus nuôi ở Phần Lan. Ngoài ra, nghiên cứu còn sử dụng các phương pháp
khác như kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử để kiểm tra hình thái; phương
pháp kháng thể đa dòng đặc hiệu, phương pháp huỳnh quang miễn dịch gián tiếp (IIF),
sử dụng API ZYM để xác định thành phần enzyme của RLO. Kết quả nghiên cứu kính
hiển vi cho thấy có các thể vùi của RLO trong tế bào. Quá trình tách chiết đã thu được
sinh khối RLO với mật độ khoảng 10
8
RLO/điệp. Sinh khối RLO thu được được sử
dụng để xác định các chỉ tiêu sinh hóa của RLO. 15 loại protein của RLO (P1 – P15)
cũng đã được xác định trong nghiên cứu này, khối lượng phân tử của các protein này
dao động trong khoảng 16 đến 148 kD. Trong số đó, P9 là một protein đặc hiệu ở
màng ngoài tế bào vi khuẩn gram (-) [38].
Kellner-Cousin và cộng sự (1993) phát hiện sự có mặt của RLO trên loài điệp
Pecten maximus bằng kỹ thuật PCR. Trong nghiên cứu của mình, ông và cộng sự đã

ứng dụng kỹ thuật thu sinh khối RLO của Le Gall và Mialhe (1992) và qui trình tách
chiết DNA của loài Rickettsia Coxiella burnnetti trên động vật có xương sống (Samuel
và cộng sự, 1983, Vodkin và cộng sự, 1986), sau đó thực hiện phản ứng PCR để phát
hiện RLO.
RLO liên quan tới dịch bệnh vào tháng 4/1995 của loài trai ngọc Pinctada
maxima ở giai đoạn Umbo và hậu Umbo nuôi ở thành phố Sanya, tỉnh Hainan, Trung
Quốc. Tỷ lệ nhiễm RLO tỷ lệ thuận với tỷ lệ chết của ấu trùng loài trai này. Kết quả
quan sát dưới kính hiển vi điện tử (TEM) cho thấy RLO không xuất hiện trong noãn
bào, tế bào trứng đã thụ tinh và pha đầu (6h). Thể vùi của RLO bắt đầu xuất hiện ở ấu
trùng hình chữ D (ấu trùng Veliger) (24h) mặc dù ấu trùng giai đoạn này vẫn chưa sử


11

dụng thức ăn ngoài. RLO chưa gây chết ấu trùng ở giai đoạn ấu trùng chữ D mà ấu
trùng bắt đầu chết sau khi trứng được thụ tinh được 7 ngày với tỷ lệ chết là 21,8%.
Điều này cho thấy rằng RLO có thời kỳ ủ bệnh (từ giai đoạn ấu trùng chữ D) rồi mới
bắt đầu tấn công vật chủ và gây bệnh [54].
Bệnh do RLO gây ra cũng xuất hiện trên loài hàu Crassostrea ariakensis 2 - 3
năm tuổi nuôi ở vịnh Hailing, Yangxi County, tỉnh Guangdong, Trung Quốc từ tháng 2
đến tháng 5 và tháng 11,12 vào năm 2001, 2002, 2003. Kết quả phân tích cho thấy,
hàu ở giai đoạn này nhiễm nặng một loại vi sinh vật ký sinh nội bào bắt buộc được đặt
tên là RLO. Bằng phương pháp nhuộm mô và quan sát dưới kính hiển vi quang học đã
phát hiện thấy RLO nhiễm khoảng 87% (26/30) số lượng hàu thu thập. RLO được tìm
thấy ở lớp tế bào biểu bì và mô liên kết của mang, màng áo và ống tiêu hóa của hàu bị
nhiễm bệnh. Hình dạng, kích thước, màu sắc của RLO ở các mô khác nhau thì khác
nhau. RLO thường có dạng hình tròn, hình quả tạ (khi đang tiến hành phân cắt) hoặc
hình que. Kích thước khoảng 0,58 – 1,2 µm. RLO có cấu tạo tế bào gần với tế bào vi
khuẩn, màng tế bào gồm 3 lớp. RLO ký sinh bên trong các không bào nằm trong
nguyên sinh chất của tế bào ký chủ [36].

Carlos Azevedo và cộng sự (2005) mô tả siêu cấu trúc của RLO ký sinh trên
loài hàu Crassostrea rizophorae ở vùng biển Đông Bắc Atlantic của Braxin. Bằng kỹ
thuật TEM, nhóm nghiên cứu đã phát hiện ra sự tồn tại của RLO trong các không bào
(đường kính khoảng 85 µm) trong nguyên sinh chất của tế bào biểu bì mang của hàu
(Hình 1.1). RLO có chiều dài trung bình 2,0 µm (dao động trong khoảng: 1,8 µm – 2,3
µm) và rộng 0,6 µm (dao động trong khoảng: 0,4 µm – 0,7 µm), vách tế bào mỏng [17].

Hình 1.1: Hình kính hiển vi điện tử của RLO ký sinh trên loài hàu Crassostrea
rizophorae. Hình (1): Không bào bên trong tế bào chất (CV-Intracytoplasmic vacuole);
tế bào mang (GC-gill cells); lông rung nhỏ (Mv-microvilli). Phần trong khung được
3



12

phóng đại ở hình (2). Hình (2): Hình phóng đại phần trong khung của hình (1) cho
thấy RLO sinh sản theo kiểu phân đôi (*), không bào trong nguyên sinh chất (CV) và
các tế bào biểu bì mang (GC) bị dung giải (**). Hình (3): Không bào bên trong tế bào
chất (CV) với nhiều RLO đang phân chia và sự thoái hóa của nguyên sinh chất của tế
bào vật chủ (hình mũi tên). Vùng ngoại vi chứa các lông rung nhỏ (Mv) [17].
Theo Bondad-Reantaso và cộng sự (2007), kết quả kiểm tra mô học của loài trai
ngọc P. maxima nuôi ở Philipin cho thấy RLO ký sinh trong thận, ống tiêu hóa và
mang [11].
RLO cũng đã được tìm thấy trên ống thực quản và tuyến tiêu hóa của loài bào
ngư đỏ (H. rufescens) nuôi ở Chile [41]. Kích thước và hình dạng của RLO cũng được
xác định bằng kính hiển vi điện tử (Hình 1.2).

Hình 1.2: Hình kính hiển vi điện tử của RLO trên ống thực quản và tuyến tiêu hóa của loài
bào ngư đỏ (H. rufescens). Hình (a): Các thể vùi của RLO (mũi tên) trong biểu mô (E) thực

quản (PE) của loài bào ngư đỏ. Hình (b): Ảnh với độ phóng đại cao của một thể vùi của RLO
X. californiensis. Hình (c): Sự biến dạng của tuyến tiêu hóa của bào ngư đỏ; một ống tiêu hóa
nhỏ vẫn còn tồn tại (DGT); mũi tên chỉ các thể vùi của RLO; H: hồng cầu; nhuộm: H & E.
1.1.3. Tình hình nghiên cứu RLO trên giáp xác
Bệnh do các sinh vật giống Rickettsia (RLO) đã gây ra một số thiệt hại cho các
loài giáp xác có giá trị kinh tế như cua và tôm.
 RLO trên cua
Nghiên cứu đầu tiên về RLO trên cua biển là nghiên cứu của Bonami và
Rapparado (1980). Theo kết quả nghiên cứu, RLO nằm trong nguyên sinh chất của các
tế bào mô liên kết của gan tụy, ruột, mang và tuyến sinh dục của loài cua biển
Carcinus mediterraneus. Chúng là vi sinh vật gram (-), hình que, kích thước tế bào


13

0,7 µm x 2 µm, không có khả năng di động và không nuôi cấy được trên môi trường
nuôi cấy vi khuẩn thông thường. Hình chụp kính hiển vi điện tử cho thấy RLO có thể
nhân lên trong các không bào trong nguyên sinh chất của tế bào ký chủ (Hình 1.3) [10].

Hình 1.3: Các khuẩn lạc của RLO bên trong tế bào mô liên kết của loài cua biển
C. mediterraneus (v: màng của không bào, n: nhân, r: giai đoạn sinh dưỡng của RLO).
Fiona Eddy và cộng sự (2007), lần đầu tiên thông báo về một bệnh lạ, mới bùng
phát ở loài cua châu Âu (Carcinus maenas) có tên gọi là bệnh sữa (milky disease).
Dấu hiệu bên ngoài của cua bệnh là máu chảy ra có màu trắng đục như sữa và không
đông; cua bị bệnh nặng thường bỏ ăn, lỏng khớp, các phần phụ và thân chuyển hồng.
Dấu hiệu bên trong gồm cơ nhão và trắng đục do hoại tử, khi nấu chín có dịch trắng
đục như sữa, vị đắng; mang có thể chuyển màu trắng [28].
Bệnh khá phổ biến vào các tháng mùa hè khi nhiệt độ nước nuôi cua dao động
từ 19 - 26
0

C. Nghiên cứu đã xác định được tác nhân gây bệnh là một loại vi khuẩn
gram (-), ký sinh nội bào, không thể nuôi cấy trên các loại môi trường tổng hợp thông
thường. Kết hợp các nghiên cứu về mô bệnh học, kỹ thuật lai DNA (in situ
hybridization), kính hiển vi điện tử và giải trình tự 16S rRNA của vi khuẩn, nhóm tác
giả đã xác định được tác nhân gây bệnh là loài vi khuẩn thuộc nhóm α-proteobacteria,
bộ Ricketsiales. Đây là loại vi khuẩn ký sinh nội bào, thường được phát hiện trong
nguyên sinh chất của các đại thực bào cố định (fixed phagocytes) trên thành mạch máu
trong mô gan tụy của cua. Vi khuẩn này thường tập trung thành các đám lớn bắt màu
tím của hematoxylin trong mô liên kết của gan tụy. Bệnh nặng vi khuẩn sẽ được giải
phóng vào máu gây ra hiện tượng “máu sữa”, đồng thời tổng số tế bào máu tự do trong
hệ tuần hoàn và protein huyết thanh giảm trong khi hàm lượng glucose và amonia tăng [28].


14








Hình 1.4: Hình cua C. maenas bị bệnh sữa và hình kính hiển vi điện tử của
RLO trên gan tụy của cua bị bệnh sữa. Gan tụy cua khỏe (A) và cua bệnh (B-F). Hình
(A): Thực bào cố định của cua khỏe chỉ số lượng lớn các hạt đặc thù (G), không bào
lớn chứa các chất mang điện (V) và vây quanh bởi lớp màng có các khe hở (mũi tên);
thước 2 mm, thước đưa vào (khung) 1 mm. Hình (B, C): Thực bào cố định của cua bị
bệnh sữa chỉ vi khuẩn kết hợp với các thể xoắn myelin (M) trong không bào lớn và vi
khuẩn trong nguyên sinh chất; màng (mũi tên); thước 51 nm (B) và 200 nm (C). Hình
(D): Ảnh với độ phóng đại cao chỉ sự phát tán của vi khuẩn ra khỏi thực bào cố định

(mũi tên), thước 200 nm. Hình (E): Ảnh với độ phóng đại thấp chỉ vùng được vây
quanh bởi màng (mũi tên) gần các vi khuẩn và các vết tích của thực bào cố định với vi
khuẩn (R), thước 2 mm. Hình (F): Ảnh có độ phóng đại cao chỉ sự vận động của vi
khuẩn xuyên qua khe hở của màng tế bào (BM) xung quanh các thực bào cố định bị
nhiễm bệnh, thước 200 nm [28].
 RLO trên tôm
RLO đã được thông báo trên loài tôm nước ngọt Cherax quadricarinatus và
được mô tả bởi Ketterer và cộng sự (1992), Owens và cộng sự (1992). Bệnh do RLO
gây ra cũng xuất hiện trên tôm C. quadricarinatus nuôi ở Queensland, Australia. Theo
Edgerton và Prior (1999), RLO trên loài tôm này là vi sinh vật ưa kiềm, gram (-), hình
que, có chiều dài 0,2 – 0,4 µm; các khuẩn lạc của RLO tồn tại trong không bào của các
tế bào ở lớp biểu mô của ống gan tụy [27].
Ở tôm biển, RLO được tìm thấy trên tôm he hoang dã ở Hawaii, tôm nuôi ở
Mexico và ở các nước Đông Nam Á. Các loài thuộc họ tôm he thường dễ bị nhiễm



15

RLO là: các loài tôm hoang dã như Penaeus marginatus, P. stylirostris, P. merguiensis
và tôm nuôi gồm tôm thẻ chân trắng (P. vannamei), tôm sú (P. monodon). Các triệu
chứng của tôm nhiễm RLO trên cơ quan gan tụy: nhẹ không có dấu hiệu bệnh lý rõ
ràng; nặng tôm sẽ hôn mê, bỏ ăn kèm theo dấu hiệu teo và mất sắc tố của gan tụy, gan
tụy mềm, trung tâm gan chứa đầy nước.
RLO nhiễm trên các loài tôm he với kích cỡ 0,2 - 0,7 µm x 0,8 - 1,6 µm. Các
loài này chưa phân lập và nuôi cấy được trên môi trường nhân tạo cũng như chưa được
mô tả và định danh một cách chính thức. Chúng được xếp vào bộ Rickettsiales, họ
Rickettsiaceae. Chẩn đoán RLO bằng cách nhuộm H & E hoặc nhuộm gram rồi quan
sát dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 400x) có thể phát hiện thấy sự tồn tại
của RLO như những hạt lớn nằm trong các không bào trong nguyên sinh chất của tế

bào vật chủ. Sử dụng phương pháp nhuộm Giemsa và quan sát dưới kính hiển vi quang
học (vật kính 400x) cho thấy RLO là những vi sinh vật màu xanh sẫm rất nhỏ trong
các không bào trong nguyên sinh chất. RLO cũng được chẩn đoán bằng phương pháp
kính hiển vi điện tử.
RLO được tìm thấy trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) bị hoại tử gan
tụy. Dấu hiệu đại thể của bệnh là gan tụy của tôm hấp hối có màu trắng nhợt nhạt.
Quan sát dưới kính hiển vi quang học cho thấy ống gan tụy bị teo lại và xuất hiện các
u hạt. Hình kính hiển vi điện tử (TEM) cho thấy sự tồn tại của 3 nhóm vi sinh vật
chính là: RLO, vi khuẩn có dạng hình xoắn ốc và vi khuẩn dạng sợi. RLO gây bệnh
trên đối tượng này có dạng hình que, kích thước 0,3 x 0,9 µm, tồn tại trong nguyên
sinh chất, có một màng nguyên sinh chất và một vách tế bào [48].
Một dịch bệnh gây chết hàng loạt các loài tôm sú (P. monodon) nuôi ở
Madagasca vào năm 1999 là do một loại vi khuẩn giống với Rickettsia (Rickettsia-like
bacteria – RLB). Dấu hiệu chính của bệnh là sự hoại tử lớp vỏ giáp đầu ngực, gan tụy
có màu trắng nhợt nhạt, máu tôm khó đông. Nunan và cộng sự (2003) đã sử dụng
phương pháp PCR, kỹ thuật lai DNA để phát hiện RLB trên mẫu tôm sú bệnh. RLB
trên tôm sú có dạng hình que, kích thước 0,5 – 1 µm, bắt màu gram (-) với thuốc
nhuộm Gram-Twort. Cơ quan đích của loài vi khuẩn này là cơ quan lympho, mô liên
kết, tế bào hồng cầu, thực bào cố định và các tế bào biểu bì cuticun (mang ngoài)
(Hình 1.5).


16


Hình 1.5: Hình TEM của RLB trong cơ quan lympho của tôm. Hình (A): Các tế
bào lympho chứa RLB trong nguyên sinh chất ở độ phóng đại thấp; N: nhân; thước 2,6
µm. Hình (C): hai tế bào con vẫn còn dính với nhau ở đỉnh của lớp màng ngoài (mũi
tên màu trắng; một lỗ hổng hình cầu (mũi tên màu đen) chỉ thị mối liên hệ với RLB
(thước 0,20 µm) [39].

Như vậy, một số loài của cả ba nhóm động vật thủy sản gồm cá, nhuyễn thể và
giáp xác đều có khả năng bị nhiễm RLB và đây cũng là một trong các bệnh nghiêm
trọng, gây tỷ lệ chết cao cho các đối tượng này. Điều này cho thấy, các loại thức ăn
tươi sống sử dụng trong nuôi tôm hùm như tôm, cá tạp và động vật thân mềm có thể là
một trong những mối nguy mang mầm bệnh.
Bên cạnh đó, theo các nghiên cứu trên, RLB thường khu trú nhiều ở các cơ
quan như gan, tụy của cá; mang, màng áo và tuyến tiêu hóa của nhuyễn thể; mang, cơ
quan gan tụy của giáp xác. Do vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành lấy mẫu
của các cơ quan này nhằm phát hiện RLB ở xác xuất cao hơn.
1.2. Tình hình nghiên cứu Rickettsia trên động vật thủy sản ở Việt Nam
Nghiên cứu đầu tiên về bệnh do vi khuẩn giống Rickettsia (RLB) gây ra trên
động vật thủy sản ở Việt Nam là trên tôm hùm (Panulirus spp.). Một dịch bệnh lần đầu
tiên xuất hiện trên tôm hùm nuôi ở Việt Nam vào cuối năm 2006, đầu năm 2007 đã
gây thiệt hại gần 200 tỷ đồng cho người nuôi tôm hùm ở hai tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên.
Dấu hiệu chính của bệnh là các đốt bụng chuyển sang màu trắng đục, dịch tiết
của cơ thể bao gồm cả máu có màu trắng như sữa hoặc hơi hồng, mô cơ đục và nhão,
gan tụy có màu nhợt nhạt, có thể bị hoại tử. Bệnh lan rộng, đến tháng 8 – 9/2008 bệnh
đã trở thành dịch, lan ra khắp các lồng nuôi thuộc 5 tỉnh miền Trung Việt Nam gồm:
Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận.


17

Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Hữu Dũng và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu để truy
tìm tác nhân gây bệnh. Kết quả nghiên cứu cho thấy tác nhân gây bệnh sữa trên tôm
hùm là một loại vi khuẩn hình cong, kích thước 1,5 – 2,5 µm, bắt màu gram (-), lớp vỏ
ngoài màu trắng bạc, không có tiên mao, không có lông (Hình 1.6) [2].

Hình 1.6: Hình kính hiển vi điện tử của RLB ký sinh trong nguyên sinh chất của
tế bào mô liên kết gan tụy của tôm hùm bị bệnh sữa.
Kết quả nghiên cứu mô cho thấy, RLB là loại vi sinh vật cảm nhiễm hệ thống,
chúng xâm nhập vào các tổ chức cơ quan khác nhau như mang, tim, gan tụy, ruột, dạ
dày, mắt, biểu mô dưới vỏ…và gây bệnh [2].
Như vậy, có thể nói nghiên cứu về Rickettsia gây bệnh trên động vật thủy sản ở
Việt Nam chưa nhiều và còn khá mới mẻ. Nghiên cứu về bệnh tôm hùm sữa của Đỗ
Thị Hòa và cộng sự (2009) là một nghiên cứu bước đầu về đối tượng này. Nghiên cứu
này cho thấy cho thấy tác nhân gây bệnh trên tôm hùm ở Việt Nam là vi khuẩn ký sinh
nội bào tương tự Rickettsia được đặt tên là RLB (Rickettsia-like Bacteria). Tuy nhiên,
khác với RLB đã thông báo trước đó trên tôm sú nuôi ở Madagasca và trên loài cua
châu Âu bị bệnh sữa, RLB ký sinh trên tôm hùm nuôi ở các tỉnh miền Trung Việt Nam
có hình cong như vành trăng khuyết.
RLB là nhóm vi sinh vật ký sinh nội bào bắt buộc, chỉ có thể nuôi cấy bằng
phương pháp nuôi cấy trên các dòng tế bào đặc trưng theo loài mà chúng cảm nhiễm.
Vì vậy, RLB trên động vật thủy sản không phát triển khi nuôi cấy bằng phôi gà như
Rickettsia trên động vật máu nóng. Đây là một trong những khó khăn trong nghiên cứu
RLB gây bệnh trên tôm hùm vì tại thời điểm hiện tại, kỹ thuật nuôi cấy RLB trên dòng