Giám sát sự lưu hành của virus cúm AH5N1 trên gia cầm tại một số huyện của tỉnh hà tĩnh bằng phương pháp rRT PCR copy UP

“Giám sát sự lưu hành của virus cúm
A/H5N1 trên gia cầm tại một số huyện của tỉnh
Hà Tĩnh bằng phương pháp rRT - PCR”
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
Cùng với ngành trồng trọt, chăn nuôi là ngành không thể thiếu trong sản
xuất nông nghiệp của nước ta. Trong những năm qua, ngành chăn nuôi đã phát
triển rất đa dạng với nhiều đối tượng và phương thức chăn nuôi khác nhau góp
phần mang lại những bữa ăn ngon, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của con
người, góp phần tăng thu nhập cho người chăn nuôi. Trong đó, phải kể đến
ngành chăn nuôi gia cầm, là một ngành đóng vai trò quan trọng và thiết yếu.
Hàng năm, ngành chăn nuôi gia cầm cung cấp một khối lượng thực phẩm đứng
thứ hai sau chăn nuôi lợn, chiếm 17% tổng thịt hơi các loại. Theo số liệu từ
Tổng cục thống kê năm 2010 đàn gia cầm có 300,5 triệu con, tăng 7,3% so với
năm 2009. Số lượng thịt gia cầm 621,2 nghìn tấn, tăng 17,5% so với năm 2009.
Trứng gia cầm 6371,8 triệu quả, tăng 16,5% so với năm 2009. Cũng theo Bộ
Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, năm 2011 lượng thịt gia cầm tăng 16,8%,
sản lượng trứng tăng 18,97% so với năm 2010. Như vậy, chăn nuôi gia cầm
đang ngày càng phát triển với sự tăng lên về số lượng. Tuy nhiên, trong những
năm gần đây, ngành chăn nuôi gia cầm đã và đang gặp không ít khó khăn. Nhiều
dịch bệnh đã xảy ra buộc phải tiêu hủy toàn đàn gây thiệt hại lớn cho người chăn
nuôi và nền kinh tế đất nước. Đặc biệt, nhiều dịch bệnh không chỉ xảy ra trên vật
nuôi mà còn lây sang người gây tử vong. Một trong số đó là bệnh cúm gia cầm.
1
Cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm lây sang người. Nhiều
nước trên thế giới và ở Việt Nam, cúm gia cầm đã làm nhiều người bị thiệt
mạng. Kể từ thời gian đầu có dịch (tháng 12/2003) cho đến nay (12/4/2012) đã
có 258 người tử vong do cúm gia cầm trong số 423 ca nhiễm H5N1 tại 15 nước,
chủ yếu là ở Châu Á. Ở Việt Nam đã có 123 người nhiễm virus cúm A/H5N1 tại
40 tỉnh/thành phố, trong đó có 61 trường hợp tử vong (theo số liệu của Tổ chức
Y tế thế giới – WHO). Trong thời gian gần đây, mặc dù đã có nhiều biện pháp

phòng chống dịch nhưng bệnh vẫn đang xảy ra trên phạm vi rộng và ngày càng
nguy hiểm hơn. Theo thống kê sơ bộ của Cục Thú y, chỉ tính riêng 6 tháng đầu
năm 2011 (tính đến ngày 15/6/2011) cả nước có 17 tỉnh xảy ra cúm gia cầm với
tổng số là 50.347 con gia cầm bị nhiễm bệnh. Tổng số gia cầm bị tiêu hủy trên
cả nước là 80.762 con. Trong đó, Bắc Trung Bộ và duyên hải miền Trung là
vùng có số lượng gia cầm bị nhiễm bệnh lớn nhất 16.578 con, chiếm 33% số
lượng gia cầm bị nhiễm trên cả nước.
Với đặc điểm của căn bệnh là có nhiều biến chủng khác nhau và khả năng
tổ hợp biến chủng đã làm cho căn bệnh ngày càng trở nên nguy hiểm hơn, việc
kiểm soát và khống chế bệnh gặp khó khăn hơn. Chưa kể, virus này còn tồn tại
cả trên các đàn thủy cầm nhưng lại không biểu hiện bệnh. Để góp phần hạn chế
thiệt hại do cúm gia cầm thì việc điều tra, khảo sát tình hình lưu hành virus cúm
là vấn đề cấp bách rất cần thiết hiện nay. Đồng thời vấn đề đặt ra là yêu cầu sự
chính xác cao trong quá trình chẩn đoán bệnh. Phương pháp realtime RT - PCR
(rRT - PCR) không chỉ đáp ứng được đòi hỏi này mà còn thể hiện được điểm ưu
việt hơn so với các phương pháp chẩn đoán trước đây.
Xuất phát từ tính thực tế đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Giám sát sự lưu hành của virus cúm A/H5N1
trên gia cầm tại một số huyện của tỉnh Hà Tĩnh
bằng phương pháp rRT - PCR”
Mục tiêu của đề tài
− Tìm hiểu sự lưu hành virus cúm A/H5N1 trên đàn thủy cầm tại một số
chợ của tỉnh Hà Tĩnh.
− Phát hiện sớm các ổ dịch nghi cúm trên đàn gia cầm tại tĩnh Hà Tĩnh để
kịp thời xử lý, tránh lây lan.
2
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1. KHÁI NIỆM VỀ BỆNH CÚM GIA CẦM
Bệnh cúm gia cầm (trước đây còn được gọi là bệnh dịch tả gà - Fowl

plague) là một bệnh truyền nhiễm gây ra bởi virus cúm type A thuộc họ
Orthomyxoviridae với nhiều type phụ khác nhau.
Các virus cúm type A gây nhiễm cho gia cầm được chia làm hai nhóm:
Nhóm virus gây bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian -
HPAI) có tỉ lệ chết cao (có thể lên đến 100%) chủ yếu ở các phân type H5 và
H7. Nhóm virus cúm gia cầm thể độc lực thấp (Lowly Pathogenic Avian -
LPAI) gây ra bệnh có triệu chứng nhẹ, chủ yếu ở đường hô hấp.
Bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao (HPAI) là một trong những bệnh đầu
tiên do virus gây ra được mô tả ở gia cầm. Đây là một bệnh truyền nhiễm cấp
tính lây lan rất mạnh ở gia cầm. Bệnh được tổ chức Thú y thế giới (OIE) xếp
vào bảng A - bảng danh mục các bệnh nguy hiểm nhất ở động vật. Bệnh xảy
ra ở nhiều nơi trên thế giới và gây thiệt hại rất lớn về kinh tế cũng như đời
sống xã hội.
3
2.2. TÌNH HÌNH BỆNH CÚM GIA CẦM TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM
2.2.1. Tình hình bệnh trên thế giới
Bệnh cúm gia cầm xảy ra nhanh và mạnh trên đàn gia cầm, làm chết và tiêu
hủy với số lượng lớn. Vụ dịch đầu tiên được ghi nhận vào năm 1878 tại Italia
với tỉ lệ chết cao ở đàn gia cầm và được gọi tên là “dịch tả gà”.
Năm 1959, bệnh xảy ra trên đàn gia cầm tại Scotland do H5N1 gây ra [7].
Năm 1983-1984, virus cúm gia cầm chủng H5N2 gây ra vụ dịch ở Pensylvania,
bang New Jersay, Virginia Mỹ làm chết hơn 10 triệu gà, thiệt hại 60 triệu đô la.
Chính phủ Mỹ còn phải chi 349 triệu đô la cho công tác chẩn đoán, tiêu độc môi
trường và hỗ trợ thiệt hại cho các cơ sở chăn nuôi phải tiêu hủy đàn gà [32].
Năm 1997, ở Hồng Kông dịch cúm gia cầm xảy ra do chủng virus H5N1
gây ra, làm tiêu hủy gần như toàn bộ đàn gia cầm. Điều quan trọng là người có
khả năng nhiễm chủng virus cúm Hồng Kông/1997 ở dạng cấp tính và tỉ lệ tử
vong cao [30].
Năm 2000, dịch cúm gia cầm lại tái phát ở vườn thú Hồng Kông [17].
Từ cuối năm 2003 bệnh cúm A/H5N1 đã xảy ra với quy mô lớn và tốc độ

bùng phát rất nhanh ở các nước châu Á. Đến cuối tháng 2/2004 đã có 11 nước
và vùng lãnh thổ công bố dịch cúm gia cầm do virus H5N1 gây ra, bao gồm:
Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Campuchia, Lào, Indonesia, Malaysia, Trung
Quốc, Hồng Kông, Mông Cổ và Việt Nam [7], [13], [16], [25].
Ngoài ra, còn có các ổ dịch cúm gia cầm do các chủng khác như H5N2 ở
Nhật Bản, Zimbabue (H5N2), Mỹ (H3N2), Canada (H7N3), Pakistan (H7N3 và
H9N2), Italia (H5N2), Mêhico (H5N2), Triều Tiên (H7N7) [23].
Người bị phơi nhiễm chủng virus cúm gia cầm H7N7 (A/H7) từ gà, vịt tại
các nông trang nhiễm. Từ tháng 2 đến tháng 6/2003 Navani đã đánh giá trên
3410 trường hợp có nguy cơ lây nhiễm bệnh cúm gia cầm, 453 nguyên nhân
chết khác nhau, 349 trường hợp viêm kết màng mắt, 90 trường hợp ốm giống
bệnh cúm và 67 trường hợp khác. Tại phòng thí nghiệm dịch swab được khẳng
định bằng RT - PCR tỉ lệ dương tính lần lượt là 23%, 7,8% và 6,0% [29].
Tính từ năm 2003 - 2005 đã có 55 nước và vùng lãnh thổ bị dịch cúm gia
cầm bùng phát làm 250 triệu con gia cầm chết hoặc tiêu hủy bắt buộc, có 258
người nhiễm cúm gia cầm, trong đó 154 người chết [15]. Cho đến nay dịch cúm
gia cầm đã bùng phát và diễn ra ở hầu khắp quốc gia trên các châu lục [31].
4
2.2.2. Tình hình bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam
Theo báo cáo của Cục Thú y, dịch cúm gia cầm được ghi nhận tại nước ta
vào cuối năm 2003, diễn biến tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam được chia
nhiều giai đoạn [12].
Đợt dịch thứ nhất (từ cuối tháng 12/2003 đến hết tháng 01/2004):
Dịch xuất hiện đầu tiên tại trại gà giống của công ty C.P ở xã Thuỷ Xuân
Tiên, huyện Chương Mỹ, tỉnh Hà Tây, gây ốm chết 8.000 con gà trong 4 ngày.
Ngày 02/01/2004, Công ty tiến hành tiêu huỷ 100.000 gà. Trong thời gian
này dịch xảy ra ở hai tỉnh Tiền Giang và Long An, đồng thời lan nhanh sang các
tỉnh An Giang, Vĩnh Long, Bến Tre, Đồng Tháp, Cần Thơ, Hậu Giang [2].
Giữa tháng 01/2004, dịch lan rộng khắp cả nước: Thành phố Hồ Chí Minh,
các tỉnh miền Đông Nam Bộ (Bình Dương, Tây Ninh, Đồng Nai), các tỉnh miền

Bắc (Hà Nội, Bắc Ninh, Nam Định, Sơn La, Hòa Bình, Thanh Hóa, Hà Nam,
Phú Thọ), tiếp đó là các tỉnh miền Trung, Tây Nguyên.
Đợt dịch thứ hai (đợt cao điểm từ ngày 01/02 đến ngày 10/02/2004):
Trong những ngày đầu tháng 2 dịch bùng phát rất nhanh, xảy ra trên quy
mô lớn và diễn biến phức tạp. Bình quân mỗi ngày có khoảng 150 – 230 xã, 15
– 20 huyện phát sinh ổ dịch mới trên phạm vi cả nước.
Ngày cao điểm nhất có 27 xã, 20 huyện thị mới phát sinh dịch. Số gia cầm
phải tiêu hủy hàng ngày từ 2 – 3 triệu con, ngày cao điểm nhất phải tiêu hủy 4
triệu con (ngày 06/02).
Đợt dịch thứ ba (từ ngày 11/02 đến ngày 27/02/2004):
- Từ ngày 11-20/02 dịch có chiều hướng giảm dần, không có huyện, tỉnh
mới phát sinh ổ dịch. Bình quân mỗi ngày có từ 20 – 30 xã phát sinh ổ dịch mới.
Số gia cầm phải tiêu hủy hàng ngày giảm chỉ còn từ 0,2 – 0,7 triệu con (cao nhất
ngày 11/02 là 0,84 triệu con, thấp nhất ngày 15/02 là 17.864 con).
- Từ ngày 21/02 dịch cơ bản đã được khống chế, chỉ phát sinh thêm một vài
thôn ấp của một số xã đã phát dịch trước đây, số gia cầm phải tiêu hủy giảm rõ
rệt (ngày 25/02 là 1.438 con, ngày 26/02 chỉ còn 45 con).
5
- Tính đến ngày 27/02, dịch bệnh đã xảy ra ở 2.574 xã, phường (24,6% số
xã phường), 381 huyện, thị (60% số huyện, thị) thuộc 57 tỉnh, thành phố ở đồng
bằng sông Cửu Long, Đông Nam Bộ, đồng bằng sông Hồng. Dịch xảy ra nặng ở
các tỉnh: Long An (185 xã), Tiền Giang (135 xã), An Giang (145 xã), Đồng
Tháp (116 xã), Hà Tây (134 xã), Hải Dương (144 xã). Một số tỉnh xuất hiện ở
diện hẹp như: Cao Bằng, Lai Châu (2 xã), Hà Tĩnh (5 xã), Hòa Bình, Bình
Phước (6 xã), Lạng Sơn (8 xã), Kiên Giang (9 xã).
Tình hình dịch cúm gia cầm H5N1 trong các năm 2005 – 2012 được tóm
tắt như sau:
− Năm 2005 tổng số gà, vịt, ngan mắc bệnh, chết, tiêu huỷ hơn 4,78 triệu
con (trong đó có 2,38 triệu con tiêu huỷ trong ổ dịch, 2,42 triệu con tiêu huỷ tự
nguyện do không tiêu thụ được hoặc thuỷ cầm phải tiêu huỷ bắt buộc do ấp nở

trái phép ở đợt dịch thứ 3) chiếm 2,17% tổng đàn, trong đó gà chiếm 1,816 triệu
con, thuỷ cầm chiếm 2,968 triệu con. Ngoài ra còn có hơn 1 triệu con chim các
loại khác chết và tiêu huỷ [12].
− Năm 2006 ở cả 3 miền không xảy ra dịch, do sự chỉ đạo quyết liệt của
Chính phủ, Ban chỉ đạo quốc gia và hiệu quả chiến dịch tiêm phòng đợt 2 năm
2005 và đợt 1 năm 2006 [12].
Dịch xảy ra ở mức độ và địa bàn ít hơn nhiều các năm trước. Các ổ dịch
xảy ra chủ yếu trên đàn vịt chăn nuôi nhỏ lẻ, dưới 3 tháng tuổi, ấp nở trái phép
và chưa được tiêm phòng vacxin. Trừ Cà Mau, Bạc Liêu, ở các địa phương khác
dịch lây lan chậm, quy mô dịch nhỏ, được bao vây và dập tắt ngay (kể cả Hải
Dương, Hà Tây) do có sự chủ động phát hiện dịch và tiêm phòng tốt. Tuy nhiên,
việc để dịch tái phát do công tác tiêm phòng đợt 2 năm 2006 chưa được triệt để,
việc tiêm phòng bổ sung không được thực thi nghiêm túc nên dịch xảy ra trên
các đàn chưa tiêm phòng [12].
+ Đợt 1: Từ 06/12/2006 đến 07/03/2007 dịch xảy ra trên 83 xã, phường của
33 huyện, quận thuộc 11 tỉnh. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ
103.094 con, trong đó gà 13.622 con, vịt, ngan là 89.472 con. Nặng nhất ở Cà
Mau, Bạc Liêu, các tỉnh khác dịch xảy ra lẻ tẻ và dập tắt nhanh chóng.
+ Đợt 2: Từ 01/05 đến 23/08/2007 dịch xảy ra ở 167 xã, phường của 70
huyện, thị thuộc 23 tỉnh, thành phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu
hủy là 294.849 con (215 gà chiếm 7,31%, 264.549 vịt chiếm 89,71% và 8.775
ngan chiếm 2,98%). Dịch bùng phát nặng ở các tỉnh Nghệ An, Nam Định và
Điện Biên.
6
Sau hơn một tháng khống chế thành công dịch cúm gia cầm trong phạm vi
cả nước, từ ngày 01/10/2007 dịch đã tái phát ở 15 xã, phường của 9 huyện, thị
thuộc 6 tỉnh là Trà Vinh, Quảng Trị, Nam Định, Cao Bằng, Hà Nam và Bến Tre.
Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 8.850 con (1.024 gà chiếm 12%,
7.826 vịt chiếm 88%). Dịch dây dưa, kéo dài ở các tỉnh Quảng Trị, Trà Vinh và
Cao Bằng, còn các tỉnh khác dịch chỉ xảy ra ở hộ nhỏ lẻ và được dập tắt ngay.

− Đầu năm 2008, dịch cúm gia cầm mới chỉ xảy ra trên tỉnh Trà Vinh sau
đó dịch đã xảy ra trên các tỉnh khác như Thái nguyên, Tuyên Quang, Quảng
Bình, Hải Dương, Nam Định, Nghệ An, Hà Tĩnh và nhiều tỉnh khác. Trong năm
2008 dịch đã xảy ra trên 80 phường/xã thuộc 54 huyện/thị trấn của 27 tỉnh/thành
phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh là 13.007 con và tổng số gia cầm tiêu hủy là
106.058 con [10].
− Năm 2009, tính từ đầu năm đến ngày 22/12/2009 cả nước đã có 129 ổ
dịch tại 17 xã/phường của 35 huyện/thị xã thuộc 17 tỉnh/thành phố phát dịch
cúm gia cầm là: Bạc Liêu, Bắc Ninh, Cà Mau, Điện Biên, Đồng Tháp, Hậu
Giang, Khánh Hòa, Nghệ An và một số tỉnh khác. Tổng số gia cầm mắc bệnh,
chết và tiêu hủy là 105.605 con, trong đó gà 23.733 con (chiếm 22,51%), vịt
79.138 con (chiếm 74,94%) và ngan 2.690 con (chiếm 2,55%). Trong năm 2009,
dịch bệnh đã diễn ra trên 72 xã/phường thuộc 36 huyện/thị trấn của 18 tỉnh.
Tổng số gia cầm mắc bệnh 68.463 con, tổng số gia cầm chết và tiêu hủy là
105.601 con [10].
Qua những số liệu trên ta thấy năm 2009 dịch bệnh đã giảm về phạm vi (số
phường/xã) tuy nhiên số lượng gia cầm chết và tiêu hủy năm 2009 tương đương
năm 2008 và bằng 1/3 so với năm 2007.
− Trong năm 2010, dịch cúm gia cầm xảy ra trên 68 xã/phường của 41
huyện/quận thuộc 23 tỉnh/thành phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh 59.809 con,
tổng số gia cầm chết và tiêu hủy là 87.590 con.
− Năm 2011, trên cả nước dịch bệnh đã xảy ra ở 82 xã/phường của 43
huyện/quận thuộc 22 tỉnh/thành phố. Tổng số gia cầm mắc bệnh là 110.311 con,
số gia cầm chết và tiêu hủy là 151.356 con.
− Trong năm 2012 (tính từ ngày 01/01/2012 đến ngày 22/2/2012), dịch
cúm gia cầm xảy ra ở 36 xã, phường của 29 huyện, quận thuộc 12 tỉnh, thành
phố là: Hải Phòng, Hải Dương, Thái Nguyên, Hà Nam, Bắc Giang, Bắc Ninh,
Quảng Trị, Thanh Hóa, Sóc Trăng, Kiên Giang, Hà Tĩnh và Quảng Nam. Tổng
7
số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 51.983 con, trong đó gà là 5.058 con

(chiếm 9,7%), vịt là 46.399 con (chiếm 89,3%), ngan là 526 con (chiếm 1%).
Có thể nói rằng dịch cúm gia cầm ngày càng diễn ra phức tạp trên phạm vi
toàn quốc. Do vậy, công tác phòng chống dịch ngày càng phải chặt chẽ hơn, ý
thức người dân cũng phải nâng cao hơn.
8
2.3. VIRUS HỌC BỆNH CÚM GIA CẦM TYPE A
2.3.1. Cấu trúc chung của virus cúm
Virus cúm có màng lipid bọc bên ngoài, chủ yếu là lipid có gốc phosphor,
số còn lại là cholesterol, glucolipid và một ít hydrate carbon gồm các loại
galactose, ribose, fructose, glucosamin [18]. Trên màng này có 2 loại protein là
Hemagglutinine (HA) và Neuraminidase (NA).
Bên trong virus có 2 thành phần gồm ARN và protein (chủ yếu là
glycoprotein). ARN của virus cúm là loại sợi đơn có cấu trúc đa hình dễ thay
đổi, có vỏ bọc, có kích thước từ 80 – 120 nm. ARN của virus chiếm 0,8 – 1,1%;
protein chiếm 70 – 75%; lipid chiếm 20 – 24%; hydrate carbon chiếm 5 – 8%
khối lượng hạt virus [18]. Bộ gen ARN của virus cúm type A có 8 phân đoạn mã
hoá cho 10 loại protein khác nhau. Các phân đoạn gen ARN của virus cúm được
xác định đặc tính bởi các cầu nối phân đoạn ở đầu 5' và đầu 3' [6]. ARN được
bao bọc bởi các protein, chủ yếu là NP (nucleoprotein) và protein M (Matrix)
tạo ra nucleocapsid.
Các protein của virus bao gồm và có chức năng sau:
- HA: Là một trimer có bản chất glycoprotein type I có chức năng bám dính
vào thụ thể tế bào.
- NA: Là một tetramer, có nhiệm vụ cắt acid sialic, giúp HA gắn vào thụ
thể và giúp giải phóng ARN từ endosome (thể nội bào) và tạo hạt virus mới.
- M2: Là tetramer có chức năng tạo khe H+ nhằm giúp cởi vỏ virus.
- M1: Tập hợp (assembly) các thành phần của virus và gây ra hiện tượng
nảy chồi (budding) để giải phóng virus mới hình thành.
- PB1, PB2, NP và PA: Có nhiệm vụ bảo vệ, sao chép và biên dịch ARN.
- NS2: Kết hợp với M1 có nhiệm vụ chuyển ARN từ trong nhân tế bào ra

ngoài nguyên sinh chất.
- NS1: Là protein không cấu trúc (không là đơn vị tạo thành hạt virus) được
tổng hợp trong quá trình nhân lên của virus và có nhiệm vụ cắt ARN và kích
thích sự phiên mã trong quá trình nhân lên của virus [1].
9
Hình 2.1. Virus H5N1 (cytokinestorm.com)
2.3.2. Tính đa dạng và độc lực của virus
Các virus cúm type A gây nhiễm cho gia cầm được chia làm hai nhóm:
Loại virus có độc lực thấp - LPAI và chủng virus có độc lực cao - HPAI bao
gồm các virus thuộc phân type H5 và H7 [22]. Độc lực của các phân type virus
cúm A trên gia cầm thay đổi tuỳ theo loài vật chủ (gà, vịt, chim hoang dại ), và
có thể biến chuyển mức độ độc lực theo thời gian hoặc khi xảy ra hiện tượng tái
tổ hợp gen với các phân type virus cúm khác [28].
Hiện nay, virus cúm A có tất cả 16 kháng nguyên H (H1 – H16), 9 kháng
nguyên N (N1 – N9) và hầu hết chúng đều liên quan đến động vật. Chúng có thể
tạo ra 144 chủng virus cúm và hơn 256 dạng cúm. Tuy nhiên, trong những năm
gần đây, subtype virus cúm A/H5N1 có độc lực đã gây nhiễm chéo giữa các loài
và có thể gây nhiễm cho người [15], [18], [21].
Độc lực của virus cúm gia cầm được đánh giá bằng cách gây bệnh cho gà
4-6 tuần tuổi: Tiêm vào tĩnh mạch cánh 0,2 ml nước trứng đã được gây nhiễm
virus với tỉ lệ pha loãng 1/10, sau đó đánh giá mức độ bệnh của gà để cho điểm.
- Loại virus có độc lực cao: Sau 10 ngày tiêm tĩnh mạch cho gà, virus phải
làm chết 75 – 100% số gà thực nghiệm. Sau khi phân lập virus từ gà bệnh thì
virus phải phát triển tốt và gây bệnh tích tế bào đặc trưng trong môi trường nuôi
cấy tế bào không có Trypsine.
10
- Loại virus có độc lực trung bình: Là những chủng virus gây bệnh với triệu
chứng lâm sàng rõ rệt nhưng không chết quá 15% gà bị nhiễm bệnh tự nhiên
hoặc không quá 20% số gà mẫn cảm thực nghiệm.
- Loại virus có độc lực thấp (nhược độc): Là những virus phát triển tốt

trong cơ thể gà, có thể gây ra dịch cúm nhưng không có triệu chứng lâm sàng rõ
rệt, không tạo bệnh tích đại thể và không làm chết gà.
2.3.3. Cơ chế xâm nhập, nhân lên và gây bệnh của virus cúm
Virus cúm A/H5N1 kí sinh nội bào bắt buộc, quá trình xâm nhiễm và nhân
lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa
của cơ thể nhiễm có những nét đặc trưng như sau:
- Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A được mở đầu bằng sự kết hợp của
HA và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào này, và cuối cùng là giải
phóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm (Hình 2.2).
- Quá trình nhân lên của ARN virus cúm A chỉ xảy ra trong nhân của tế
bào, đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy ra trong
nguyên sinh chất), và cuối cùng là giải phóng các hạt virus ra khỏi tế bào nhiễm
nhờ vai trò của enzyme neuraminidase. Thời gian một chu trình xâm nhiễm và
giải phóng các hạt virus mới của virus cúm chỉ khoảng vài giờ (trung bình 6h).
Sự tạo thành các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng các tế bào
này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử, và rơi vào quá trình chết theo
chương trình (apoptosis) làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ.
- Sau khi được giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gen của
virus sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của virus và các
ARN vận chuyển phụ thuộc ARN (ARN - dependent ARN transcription). Phức
hợp protein – ARN của virus được vận chuyển vào trong nhân tế bào.
- Trong nhân tế bào các ARN hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương
từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên
ARN hệ gen của virus mới nhờ ARN - polymerase. Các sợi này không được
Adenine hóa (gắn thêm các Adenine - gắn mũ) ở đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp
với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein (RNP) hoàn chỉnh
và được vận chuyển ra bào tương tế bào. Đồng thời, các ARN thông tin của
virus cũng sao chép nhờ hệ thống enzyme ở từng phân đoạn gen của virus, và
được enzyme PB2 gắn thêm 10 - 12 nucleotide Adenin ở đầu 5’-, sau đó được
vận chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các

protein của virus (Hình 2.2).
11
Hình 2.2. Quá trình xâm nhập và nhân lên của virus trong tế bào vật chủ
- Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn
lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện tượng
“nảy chồi” của virus. NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại nhân tế bào
để kết hợp với ARN thành RNP của virus. Sau cùng các RNP của virus được
hợp nhất với vùng “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” virus gắn chặt vào màng tế
bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid. Các NA phân cắt các
liên kết này và giải phóng các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế
bào khác.
2.3.4. Sức đề kháng của virus
Điều kiện ngoại cảnh có ảnh hưởng rõ rệt tới sức đề kháng của virus cúm
H5N1. Virus thường sống lâu hơn trong không khí ở độ ẩm tương đối thấp,
trong phân ở điều kiện nhiệt độ thấp và độ ẩm cao.
Virus có thể sống trong chuồng gà tới 35 ngày, trong phân gia cầm bệnh tới
3 tháng.
Virus cúm dễ dàng bị tiêu diệt ở nhiệt độ 60 - 70
0
C trong 5 phút. Trong tủ
lạnh và tủ đá, virus sống được hàng tháng.
Những chất sát trùng thông thường đều diệt được virus cúm gia cầm như:
Xút 2%, Formol 3%, Crezin 5%, Chloramin B 3%, cồn 70 - 90
0
, vôi bột hoặc
nước vôi 10%, nước xà phòng đặc, Người ta có thể dùng các chất này để tổng
12
tẩy uế chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi và các thiết bị chăn nuôi khi cơ sở bị đe
dọa [6], [24].
2.4. DỊCH TỄ HỌC

2.4.1. Động vật cảm nhiễm
Virus cúm type A gây bệnh chủ yếu cho gia cầm (đặc biệt ở gà), người và
động vật có vú khác.
Phần lớn các loài gia cầm non đều mẫn cảm với virus cúm type A (từ 4 - 66
tuần tuổi). Tuổi mắc bệnh sớm nhất ở gà, vịt, ngan theo thứ tự là 26, 28, 24 ngày
tuổi. Đồng thời, tuổi mắc bệnh cao nhất theo thứ tự là 10, 18, 14 tháng tuổi. Ở
vịt, tuổi mắc bệnh tập trung vào 2 - 11 tháng tuổi [18]. Gia cầm có sức sản suất
càng cao thì càng mẫn cảm với bệnh cúm gà. Gia cầm mái dễ bị cúm hơn so với
gia cầm trống.
Vịt nuôi cũng bị cảm nhiễm virus cúm nhưng ít phát bệnh do vịt có sức đề
kháng với virus bệnh, kể cả những chủng có độc lực cao gây bệnh nặng cho gà,
gà tây.
Tuy nhiên, năm 1961, ở Nam Phi đã phân lập được virus cúm type A
(H5N1) gây bệnh cho cả gà và vịt. Hiện nay, đã phân lập được virus cúm từ vịt
bầu, ngỗng, chim cút, gà Nhật, gà gô, gà lôi… [3].
13
Ngoài ra, virus cúm type A còn gây bệnh cho nhiều loài động vật có vú như
lợn, ngựa, chồn, hải cẩu và thú hoang dã ở nhiều nơi trên thế giới.
Lợn mắc bệnh cúm thường do phân type H1N1 và H3N2.
Loài chồn cảm nhiễm cao với virus cúm. Trong một ổ dịch tại một trại nuôi
chồn ở Thụy Điển, đã phân lập được virus cúm type A (H4N1). Phân type này
cũng đang lưu hành trong quần thể gia cầm [3].
2.4.2. Động vật mang virus
Hầu hết các loài chim hoang dã như: Vịt trời, thiên nga, hải cẩu, vẹt, mòng
biển, diều hâu, chim sẻ, đều mang virus cúm. Tuy nhiên, tần suất và số lượng
virus cúm phân lập ở các loài thuỷ cầm cao hơn ở các loài khác. Kết quả điều tra
thuỷ cầm di trú ở Bắc Mỹ cho thấy trên 60% chim con bị nhiễm virus do tập hợp
đàn trước khi di trú. Trong các loài thuỷ cầm di trú thì vịt trời có tỉ lệ nhiễm cao
hơn các loài khác [3]. Những virus này không gây độc đối với vật chủ mà được
nhân lên trong đường hô hấp và tiêu hóa, sau đó virus được bài thải ra ngoài, nó

trở thành nguồn gieo rắc virus cho các loài khác, đặc biệt là gia cầm [25].
Vịt bài thải một số lượng lớn virus (103.5 – 105.5/ml) theo đường hô hấp
cũng như theo phân. Lượng virus H5N1 bài thải từ vịt đủ để lây truyền trực tiếp
virus từ vịt có biểu hiện lâm sàng khoẻ mạnh sang gà. Lượng virus bài thải ở vịt
nuôi có biểu hiện khoẻ mạnh cũng xấp xỉ với lượng virus do gà bệnh và gà có
biểu hiện ốm bài thải. Điều này cho thấy vịt là vật chủ tàng trữ “thầm lặng” đối
với virus cúm H5N1 gây bệnh thể độc lực cao cho gà [23].
Virus cúm H5N1 hiện đang lưu hành ở châu Á đã tăng độc lực của nó với
gà và chuột, đồng thời mở rộng phổ vật chủ của nó trên các động vật có vú như
các động vật họ mèo, lợn, ngựa, hải cẩu, chồn. Vì vậy, các động vật trên đóng
vai trò quan trọng trong việc tàng trữ và phát tán mầm bệnh [23].
2.4.3. Sự truyền lây bệnh
Khi gia cầm nhiễm cúm, virus được nhân lên trong đường hô hấp và đường
tiêu hoá. Sự truyền lây bệnh được thực hiện theo 2 phương thức là trực tiếp và
gián tiếp.
- Truyền trực tiếp giữa con mắc bệnh và con khoẻ mạnh. Lây trực tiếp do con
vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnh thông qua các hạt khí dung được thải ra
từ đường hô hấp hoặc qua phân, thức ăn và nước uống có chứa mầm bệnh.
- Lây gián tiếp thông qua không khí, gió đưa bụi phân có chứa virus đi xa,
dụng cụ chăn nuôi, thức ăn, nước uống, xe vận chuyển, côn trùng, chim, chuột,
vật nuôi, phân rác hoặc tay chân, giày dép của người có tiếp xúc gia cầm mắc
bệnh và vô tình truyền mầm bệnh đi nơi khác [6].
14
Đối với gia cầm nuôi, nguồn dịch đầu tiên thường thấy là:
- Từ các loại gia cầm nuôi khác nhau ở trong cùng một trang trại hoặc trang
trại khác liền kề như vịt lây sang gà hoặc từ gà tây sang gà.
- Từ gia cầm nhập khẩu.
- Từ chim di trú, đặc biệt thủy cầm được coi là đối tượng chính dẫn nhập
virus vào đàn gia cầm nuôi.
- Từ người và các động vật có vú khác. Phần lớn các ổ dịch cúm gia cầm

gần đây đã có sự lây lan thứ phát thông qua con người [3].
2.4.4. Mùa vụ mắc bệnh
Bệnh cúm xảy ra quanh năm nhưng cũng chịu tác động thúc đẩy bởi các yếu
tố stress có hại như sự thay đổi đột ngột về thời tiết, thức ăn, nước uống, [18].
Mùa đông xuân với nhiệt độ trung bình và độ ẩm không khí thấp hơn có thể
là một yếu tố làm tăng nguy cơ mắc cúm cả trên gia cầm và người. Dịch cúm gia
cầm có thể bùng phát vào những tháng nóng nếu có điều kiện phù hợp [4].
2.5. TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH
2.5.1. Triệu chứng
Sự lây nhiễm virus cúm ở gia cầm gây ra nhiều triệu chứng lâm sàng khác
nhau bao gồm nhiễm không biểu hiện triệu chứng, bệnh đường hô hấp từ nhẹ
đến nặng, giảm sức sản xuất [9].
Thời kỳ ủ bệnh ngắn: Chỉ vài giờ đến 3 ngày sau khi virus cúm xâm nhập
vào cơ thể.
Triệu chứng bệnh phụ thuộc rất nhiều yếu tố như: Độc lực, khối lượng
virus, tuổi gà, tính biệt, sức khỏe đàn gà, mật độ, tiểu khí hậu chuồng nuôi.
Các triệu chứng hô hấp thường xuất hiện đầu tiên và điển hình như: Khẹt,
lắc đầu, vảy mỏ, chảy nước mũi, nước mắt, khó thở, mí mắt bị viêm, sưng
mọng. Mào và tích dày lên do thủy thũng, có nhiều điểm hoặc đám xuất huyết,
nhiều trường hợp thấy hoại tử ở mào và tích. Thịt gà bị bệnh thân xám, xuất
huyết dưới da vùng chân.
Các biểu hiện thần kinh: Đi lại không bình thường, chuệnh choạng, run rẩy,
mệt mỏi, nằm li bì tụm đống với nhau.
Gà bị tiêu chảy, phân loãng trắng hoặc trắng xanh.
Bệnh lây lan nhanh, năng suất trứng giảm rõ rệt [18].
15
2.5.2. Bệnh tích
Bệnh tích đại thể
Trường hợp bệnh nhẹ:
- Viêm mũi từ thể cata, serofibrin đến nhầy mủ (mucopurulent) và bị casein

hóa gây tịt mũi, thối mí mắt.
- Khí quản phù nề, đọng nhiều dịch rỉ (exudate), viêm sero đến casein,
nhiều đờm.
- Túi khí dày lên, có nhiều casein bám dính.
- Phúc mạc bị viêm nặng từ cata đến fibrin.
- Buồng trứng bị viêm xuất huyết, trứng non dập vỡ, ống dẫn trứng viêm
dịch rỉ đến casein.
- Ruột bị viêm xuất huyết từ cata đến fibrin. Nặng nhất là vùng ruột non,
ruột thừa và hậu môn.
Trường hợp bệnh nặng:
Một số chết quá nhanh không để lại bệnh tích điển hình, nhưng đại bộ phận
những gà khác thì các biến đổi đại thể lại thể hiện khá rõ.
- Mũi bị viêm tịt.
- Mào tích thâm tím, sưng dày lên, xuất huyết điểm và hoại tử. Khi cắt đôi
mào hoặc tích thấy chúng có màu vàng xám, óng ánh như gelatin.
- Mí mắt và mặt phù nề, đầu sưng to.
- Xuất huyết dưới da: chân, kẽ móng chân, lưng, đùi
- Xác gà béo nhưng thịt thâm và khô.
- Viêm teo, xuất huyết và gây hoại tử ở gan, lách, thận.
Các bệnh tích khác
Ở gà: Dạ dày tuyến, van hồi manh tràng, niêm mạc hậu môn bị viêm xuất
huyết, tụy teo do mất nước, bao tim tích nước vàng, xuất huyết điểm, viêm dính
phúc mạc và túi khí, xuất huyết dưới da và cơ ở vùng đùi, ngực, bụng, bao tim
màng treo ruột và niêm mạc khí quản. Trong khí quản thường chứa nhiều đờm, dãi.
16
Ở ngan, vịt: Một trong hai lá phổi luôn bị viêm xuất huyết nặng, gan hóa
(khi bỏ vào nước thì phổi bị chìm: > 2/3 nằm dưới mặt nước), bao tim tích nước
vàng và bị xuất huyết điểm nặng, xuất huyết bên trong lồng ngực, đường ruột
chứa rất ít thức ăn.
Bệnh tích vi thể

Các biến đổi đặc trưng bao gồm: Phù nề, xung huyết, xuất huyết, thâm
nhập lympho đơn nhân ở cơ vân, cơ tim, lách, phổi, mào tích, gan, thận, mắt và
thần kinh. Ngoài tế bào lympho đơn nhân hình thái còn có tế bào đặc trưng cho
phản ứng viêm hoại tử [18].
2.6. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN
2.6.1. Dựa vào triệu chứng, bệnh tích
2.6.1.1. Dựa vào triệu chứng
• Gia cầm bị bệnh thường bị xù lông, ũ rủ, bỏ ăn, giảm đẻ.
• Đầu, mặt sưng, phù quanh mắt. Mào yếm sưng, xuất huyết.
• Mắt bị viêm kết mạc và có thể bị xuất huyết.
• Chân giữa vùng bàn và khuỷu bị xuất huyết.
• Có các triệu chứng ở đường hô hấp.
• Nếu virus có độc lực cao thì gia cầm có thể chết nhanh, gia cầm thường
chết trong vòng 24h – 48h sau khi xuất hiện các triệu chứng đầu tiên.
2.6.1.2. Dựa vào bệnh tích
• Xuất huyết lan tràn ở các cơ quan nội tạng.
• Dưới da vùng đầu, cổ, ngực bị phù thũng.
• Miệng chứa nhiều dịch.
• Khí quản xuất huyết chứa nhiều dịch nhầy.
• Đường tiêu hóa xuất huyết.
• Gà đẻ buồng trứng xuất huyết hoặc bị viêm, có nhiều trứng non vỡ.
2.6.2. Phân lập và định danh virus
Đây là phương pháp chẩn đoán cơ bản có ý nghĩa quyết định.
Để phân lập virus thường sử dụng mẫu bệnh phẩm là phổi, khí quản, não,
lách. Sau khi xử lý bệnh phẩm ta tiêm vào phôi gà 9 – 11 ngày tuổi, ấp 37
0
C trong
7 ngày thì thu hoạch trứng. (Virus cũng có thể phân lập trên môi trường tế bào).
17
Sau khi phân lập được virus từ môi trường tế bào hoặc trên phôi trứng thì

có thể giám định virus bằng các HI test để giám định subtype H và N.
Gần đây, phương pháp real time PCR (RT – PCR) trực tiếp sử dụng nguồn
gen của virus cúm A và cúm A/H5N1 từ mẫu bệnh phẩm cũng được đưa vào
ứng dụng cho phép chẩn đoán chính xác, tin cậy cao và phân biệt sự hiện diện
của các chủng virus cúm A gây bệnh chỉ với một lượng nhỏ mẫu bệnh phẩm.
Ngoài ra, còn có các phương pháp chẩn đoán khác như: kỹ thuật ELISA, kỹ
thuật khuếch tán trên thạch, phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)…
2.6.3. Dựa vào dịch tễ
Bệnh cúm gia cầm có tính lây truyền nhanh, mạnh.
Loài mắc bệnh thường là gia cầm và chim. Chim hoang dã là nguồn truyền
lây bệnh.
Một số động vật có vú cũng có thể mắc bệnh: người, lợn, ngựa…
2.7. PHÒNG BỆNH
2.7.1. Phòng bệnh bằng vệ sinh
2.7.1.1. Các biện pháp vệ sinh tổng hợp
Do đặc điểm dịch tễ của bệnh cũng như đặc tính biến đổi kháng nguyên bề
mặt của virus khá phức tạp. Do vậy, để phòng bệnh và ngăn chặn bệnh xảy ra thì
các biện pháp vệ sinh thú y tổng hợp như: vệ sinh chuồng trại, khu vực chăn
nuôi, thiết bị cho ăn uống… phải được áp dụng định kỳ ở những vùng chưa có
dịch. Đối với những vùng nguy cơ có dịch, vùng có dịch thì phải được áp dụng
một cách thường xuyên và nghiêm ngặt.
2.7.1.2. Phòng bệnh đối với những địa phương chưa có dịch xảy ra hoặc
nguy cơ có dịch
Trong thời gian xảy ra dịch ở các địa phương khác thì các trại chăn nuôi gia
cầm giống áp dụng các biện pháp an toàn sinh học nhằm ngăn cản mầm bệnh
đưa vào. Dụng cụ chăn nuôi, xe chuyên chở, dụng cụ bảo hộ lao động và con
người ra vào trại phải được vệ sinh, khử trùng. Thức ăn, nước uống, chất độn
chuồng phải đảm bảo không chứa mầm bệnh.
Trên các trục đường giao thông chính thành lập các chốt kiểm dịch tạm thời
nhằm ngăn chặn việc dịch chuyển gia cầm, sản phẩm gia cầm từ các địa phương

có dịch vào. Các phương tiện giao thông ra vào phải được tiêu độc.
18
Tăng cường kiểm tra, giám sát phát hiện bệnh và tiêu hủy tất cả gia cầm,
sản phẩm gia cầm có nguồn gốc từ các địa phương đang có dịch. Đồng thời, tiến
hành tổ chức dập dịch nhanh chóng khi còn ở diện hẹp.
2.7.1.3. Khống chế dịch ở các địa phương đang có dịch xảy ra
Là bệnh có tính lây lan nhanh, do vậy chúng ta cần tiến hành chẩn đoán
phát hiện bệnh một cách nhanh chóng và chính xác dựa trên triệu chứng, bệnh
tích điển hình. Đồng thời, tiến hành lấy mẫu xét nghiệm.
Cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm, do vậy sự bùng phát của bệnh vẫn
tuân theo những quy luật chung của quá trình sinh dịch. Do vậy khống chế bệnh
chính là tác động vào các khâu của quá trình sinh dịch nhằm phá vỡ vòng truyền
lây tác nhân gây bệnh, đó là 3 yếu tố: nguồn bệnh, động vật cảm thụ, yếu tố
truyền lây bệnh truyền nhiễm nói chung. Theo khuyến cáo của OIE thì đó là các
hoạt động:
• Loại trừ tác nhân gây bệnh: tiêu hủy gia cầm, sản phẩm gia cầm nhiễm
bệnh và tiến hành sát trùng, tiêu độc.
• Giảm tiếp xúc giữa tác nhân và vật chủ: sử dụng vacxin phòng bệnh, tăng
cường chăm sóc nuôi dưỡng nhằm nâng cao sức đề kháng.
• Thay đổi môi trường sống: thực hiện các biện pháp an toàn sinh học,
ngăn chặn tác nhân gây bệnh xâm nhập vào môi trường bằng cách cách ly triệt
để toàn bộ khu vực có dịch.
Song song với những việc làm đó tiến hành tuyên truyền cho tất cả các chủ
vật nuôi gia cầm biết cách phát hiện và phòng bệnh cúm gia cầm.
2.7.2. Phòng bệnh bằng vacxin
2.7.2.1. Các loại vacxin cúm đang được sử dụng
Các chủng virus cường độc A/H5N1 sau năm 1996, qua thời gian tiến hóa
có xu hướng biến đổi nội gen nhằm tăng tính gây bệnh và thay đổi thành phần
nội gen kháng nguyên làm mất tương quan miễn dịch giữa chúng và các chủng
vacxin được tạo ra. Do vậy, vấn đề này phải được hết sức chú ý trong chiến lược

chế tạo vacxin.
Đối với bệnh truyền nhiễm, vacxin được coi là biện pháp có tính chiến
lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch. Đối với dịch cúm A/H5N1
ở gia cầm và dự phòng dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vacxin không
những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm, mà còn khống chế nguồn
19
truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người. Kháng thể đặc hiệu có thể
được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên trong vacxin, và đó là các
kháng thể kháng HA, NA, MA và nhiều loại hình khác của virus đương nhiễm,
góp phần vô hiệu hóa virus cúm đúng đối tượng khi chúng xâm nhập vào. Các
vacxin phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loại chính: vacxin truyền thống
và vacxin thế hệ mới.
• Vacxin truyền thống:
Bao gồm vacxin vô hoạt đồng chủng và dị chủng.
Vacxin vô hoạt đồng chủng (homologous vaccine), đó là các loại vacxin
được sản xuất chứa cùng những chủng virus cúm gà giống như chủng gây bệnh
trên thực địa.
Vacxin vô hoạt dị chủng (heterologous) là vacxin sử dụng các chủng virus
có kháng nguyên HA giống chủng virus trên thực địa, nhưng có kháng nguyên
NA dị chủng.
• Vacxin thế hệ mới hay vacxin công nghệ gen: là loại vacxin được sản
xuất dựa trên kỹ thuật gen loại bỏ các vùng “gen độc” đang được nghiên cứu và
đưa vào sử dụng phổ biến, bao gồm:
Vacxin tái tổ hợp có vector đậu gia cầm dẫn truyền: sử dụng virus đậu
gia cầm làm vector tái tổ hợp song gen H5 và N1 phòng chống virus type
H5N1 và H7N1.
Vacxin dưới nhóm chứa protein kháng nguyên NA, HA tái tổ hợp và tách
chiết làm vacxin.
Vacxin tái tổ hợp có vector dẫn truyền: sử dụng adenovirus hoặc Newcastle
virus hoặc virus đậu chim làm vector dẫn truyền, lắp ghép gen kháng nguyên H5

vào hệ gen của adenovirus, tạo nên virus tái tổ hợp làm vacxin phòng chống
virus cúm A/H5N1.
Vacxin ADN: sản phẩm ADN plasmid tái tổ hợp chứa gen HA, NA, NP,
M2 đơn lẻ hoặc đa gen.
Có 3 loại vacxin đã được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công nhận về độ
an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản xuất vacxin trên thế giới
hiện nay, đó là NIBRG-14 (NIBSC), VN/04xPR8-rg (SJCRH) và VNH5N1-
PR8/CDC-rg (CDC).
20
2.7.2.2. Tình hình sử dụng vacxin trên thế giới và khuyến cáo OIE
Các nhà khoa học của tổ chức OIE, WHO…đã khuyến cáo các nước có
cúm gia cầm như sau:
- Sử dụng vacxin vào mục đích khống chế dịch bệnh cúm gia cầm chỉ là
một giải pháp hỗ trợ để dập dịch, khoanh vùng dịch và khống chế dịch và vacxin
chỉ hạn chế bài xuất virus cường độc ra ngoài môi trường chứ không loại bỏ
được tận gốc bệnh cúm.
- Chỉ tiêm phòng vacxin khi thật khẩn cấp.
- Để có quyết định tiêm phòng phải dựa vào năng lực và điều kiện sau:
• Phải có hệ thống chẩn đoán đủ năng lực xác định được cúm gia cầm độc
lực cao (HPAI) hay có độc lực thấp (LPAI).
• Phải có ngân hàng vacxin đủ các chủng loại kháng nguyên H và N nhằm
hạn chế tối đa hậu quả biến chủng virus cúm sau khi tiêm phòng.
• Phải có hệ thống kiểm soát thú y chặt chẽ từ trung ương đến địa phương
nhằm kiểm soát những đàn đã sử dụng vacxin với những đàn chưa sử dụng
vacxin.
Với những điều kiện trên thì nước ta còn gặp nhiều khó khăn, do vậy việc
tiêm phòng, quản lí tiêm phòng chưa được triệt để. Tuy nhiên, với những nổ lực
của ngành trong năm 2004, 2005 đã có nhiều đề tài, dự án, thử nghiệm và khảo
nghiệm vacxin cúm đã được triển khai và thu được kết quả khả quan.
21

PHẦN 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là vịt bán tại một số chợ buôn bán gia cầm
sống được lựa chọn theo dự án 604, và gia cầm ốm chết, nghi ngờ mắc bệnh
cúm gia cầm H5N1 trên địa bàn tỉnh Hà Tĩnh được các hộ gia đình chăn nuôi
gửi đến Cơ quan thú y vùng III để chẩn đoán.
3.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI
− Thời gian nghiên cứu: Từ ngày 09/01/2012 đến ngày 05/05/2012
− Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được tiến hành tại Tổ sinh học phân tử
thuộc trạm chẩn đoán bệnh động vật – Cơ quan thú y vùng III, (thành phố
Vinh - Nghệ An).
3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1) Tình hình lưu hành virus cúm A/H5N1 ở vịt lấy tại các chợ của tỉnh
Hà Tĩnh.
2) Xác định tỉ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1 trên gia cầm ốm chết hoặc có
biểu hiện nghi bị cúm gia cầm.
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Dụng cụ và máy móc
- Các loại tủ lạnh: - 20
0
C, - 80
0
C, 4
0
C
- Buồng an toàn sinh học cấp độ II
- Hệ thống chiết tách ARN bằng chân không hoặc ly tâm
- Ly tâm lạnh ống eppendorf
- Ly tâm ống lớn, ly tâm ống nhỏ

- Bể hấp cách thủy
- Vortex
- Hệ thống máy real time PCR
- Các loại ống đựng nguyên liệu 15 ml, 50 ml, ống eppendorf và giá đỡ
22
- Micropipet đơn kênh giới hạn 0,5-10, 5-40, 40-200, 200-1000 µl
- Đầu típ có lọc các loại 0,5-10, 5-40, 40-200, 200-1000 µl không có men
phá hủy ARN/ADN
- Cối, chày sứ để nghiền mẫu bệnh phẩm, dao, kéo, panh kẹp
- Găng tay, áo bảo hộ, khẩu trang, …
3.4.2. Hóa chất và nguyên liệu
− Hóa chất:
Cồn tuyệt đối, MgCl
2
25 mM, RLT, RPE, PBS, virkon 1%, nước dùng cho
sinh học phân tử không có men ARNase.
− Nguyên liệu:
+ Kít chiết tách RNA (Qiagen

RNeasy Extraction Kít)
+ One-Step RT-PCR Qiagen

hoặc Invitrogen One-Step RT-PCR
+ Các mồi và mẫu dò (probe) được liệt kê ở bảng 3.1 sau:
Bảng 3.1. Danh sách mồi và mẫu dò
Ô
Gen
Mồi/Mẫu dò
(probe)
Trình tự nucleotide (5’ - 3’)

M
probe 5’-FAM-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-BHQ1-3’
Mồi xuôi (F) CATGGARTGGCTAAAGACAAGACC
Mồi ngược (R) AGGGCATTTTGGACAAAKCGTCTA
H5
probe 5’-HEX-TCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA-BHQ1-3’
Mồi xuôi (F) ACGTATGACTACCCGCAGTATTCA
Mồi ngược (R) AGACCAGCTACCATGATTGC
N1
probe 5’-FAM-TGGTCTTGGCCAGACGGTGC-BHQ1-3’
Mồi xuôi (F) TGGACTAGTGGGAGCAGCAT
Mồi ngược (R) TGTCAATGGTTAAGGGCAACTC
3.5. PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU, XỬ LÝ VÀ BẢO QUẢN MẪU
23
3.5.1. Đối với mẫu phủ tạng
∗
Nghiền mẫu bằng cối chày sứ:
Phun sát trùng bên ngoài hộp đựng mẫu bệnh phẩm bằng dung dịch sát
trùng (virkon 1%).
Lấy 2g bệnh phẩm (não, phổi, lách, hạch) cho vào cối sứ nghiền và cho 2g
bệnh phẩm vào ống falcon để lưu mẫu. Nghiền mẫu bệnh phẩm, pha thành
huyễn dịch 10-20% với PBS, cho vào ống falcon dùng giấy thấm dung dịch
virkon 1% lau xung quanh sau đó cho vào tủ -40
0
C 1 giờ thì lấy ra giải đông.
Còn mẫu lưu được cho vào tủ -80
0
C trong thời gian dài trong phòng lưu mẫu.
Mẫu xét nghiệm sau 1 giờ được lấy ra giải đông, sau đó cho vào ly tâm
8000 vòng/phút trong 5 phút và dùng pipet hút lấy dung dịch nổi để xét nghiệm.

∗
Nghiền mẫu bằng máy Homogenate:
Lựa chọn trích 0,1-0,2g cho vào ống eppendorf 1,5 ml chứa sẵn bột thủy
tinh đã ghi sẵn ký hiệu cho thêm vào 600 µl PBS đậy nắp lại đặt vào máy nghiền
mẫu và nhấp phím “run” thực hiện trong 2 phút. Sau khi nghiền mẫu cho vào
máy ly tâm mini (spin down) ly tâm trong vòng 15 giây và làm đông cho vào tủ
lạnh -40
0
C trong 20 phút. Sau 20 phút lấy mẫu ra giải đông, trộn đều (vortex)
cho vào máy ly tâm lạnh ly tâm 9000 vòng/phút trong 5 phút, lấy dịch nổi trên
để chiết tách ARN.
3.5.2. Đối với mẫu hầu họng
− Đưa tăm bông vào sâu trong họng rồi ngoáy thu dịch nhầy, sau đó từ từ
rút ra rồi đưa vào ống chứa dung dịch bảo quản, bẻ que cho vừa với chiều dài
của ống, đóng kín nắp. Que ngoáy được bảo quản trong dung dịch BHI (Brain
heart influsion).
− Mẫu swab gửi đến được bảo quản trong dung dịch chứa trong lọ
penicyclin hoặc lọ chuyên đựng mẫu swab. Vortex các lọ trên, sau đó trộn lẫn
hai lọ vào một rồi tiếp tục vortex. Sau đó chia dung dịch trong lọ penicyclin đó
vào các ống eppendorf. Tùy vào lượng dung dịch mà chia thành 1 hoặc 2 ống
eppendorf. Quá trình trộn lẫn giữa các mẫu chỉ được tiến hành trong một lô mẫu.
24
− Sau khi xử lí mẫu các ống eppendorf được bảo quản ở nhiệt độ bình
thường nếu tiến hành tách ARN ngay sau đó. Nếu mẫu không được tách ARN
ngay thì sẽ được bảo quản trong tủ âm sâu -80
0
C và trước khi tách mẫu được
mang ra giải đông.
3.5.3. Nguyên lý phản ứng Real Time PCR (RT – PCR)
Phản ứng RT – PCR là một kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá

trình sao chép ADN. Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại
được phát hiện qua phân tích điểm kết thúc bằng cách điện di ADN trên gen
agarose khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, RT – PCR cho phép phát hiện và
định lượng sự tích lũy ADN khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra. Khả
năng này được phát hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát quang.
Những hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết ADN và
những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với primer gọi là probe. Khi
ADN tương hợp với primer thì quá trình sao chép sẽ xảy ra và sự gia tăng
lượng tín hiệu huỳnh quang tỉ lệ với sự gia tăng lượng ADN. Khi sử dụng máy
Bio – Rad, máy có bộ phận camera có thể chụp được tín hiệu huỳnh quang khi
quá trình khuếch đại xảy ra. Ban đầu, tín hiệu huỳnh quang còn ở tín hiệu nền ta
không thể phát hiện sự gia tăng tín hiệu cho dù có quá trình khuếch đại và sản
phẩm đã tăng theo hàm mũ. Đến một thời điểm xác định, sản phẩm khuếch đại
đã tạo ra đủ tín hiệu huỳnh quang có thể phát hiện được. Chu kỳ này được gọi là
chu kỳ ngưỡng Ct (Cycle of threshold). Đây cũng là giá trị để đánh giá kết quả
phản ứng.
Cúm gia cầm type A có vật chất di truyền là ARN nên trong phản ứng
real time PCR có thêm quá trình sao chép ngược từ ARN thành ADN gọi là
Reverse transcription nên phương pháp này được gọi là real time RT – PCR.
* Nguyên lý hoạt động của probe:
Có nhiều loại hóa chất phát huỳnh quang dựa trên primer và probe, hóa
chất được sử dụng trong phản ứng real time RT - PCR là Taqman probe.
Taqman probe được sử dụng như một trình tự Oligonucleotide đặc hiệu,
gắn chất huỳnh quang gọi là mẫu dò Taqman probe, cùng với các primer.
25