Sử dụng kỹ thuật biến nạp di truyền cải tạo một số đặc tính nông sinh học ở Ngô và Lúa Mì

Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn
Viện Di truyền Nông nghiệp








Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật Đề tài
S
S
ử
ử

d
d
ụ
ụ
n
n
g
g


k
k
ỹ
ỹ


t
t
h
h
u
u
ậ
ậ
t
t


b
b

i
i
ế
ế
n
n


n
n
ạ
ạ
p
p


d
d
i
i


t
t
r
r
u
u
y
y

ề
ề
n
n


c
c
ả
ả
i
i


t
t
ạ
ạ
o
o


m
m
ộ
ộ
t
t

s
s
ố
ố


đ
đ
ặ
ặ
c
c


t
t
í
í
n
n
h
h


n
n
ô
ô
n
n

g
g


s
s
i
i
n
n
h
h


h
h
ọ
ọ
c
c
ở
ở


n
n
g
g
ô
ô

v
v
à
à


l
l
ú
ú
a
a


m
m
ỳ
ỳ







Chủ nhiệm Đề tài: PGS. TS. Lê Huy Hàm
Cơ quan chủ trì: Viện Di truyền Nông nghiệp
Cơ quan chủ quản: Bộ Nông nghiệp & PTNT

Thời gian thực hiện: 1/2002 12/2004






5885
19/6/2006

Hà Nội, 2006
Bản báo cáo viết xong ngày 1/04/2006
Tài liệu này đợc chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện Đề tài Nghị định th hợp tác KHCN với CHLB Đức







Lời cảm ơn



Chủ nhiệm đề tài xin chân thành cảm ơn Viện Di truyền Nông nghiệp đã ủng hộ,
tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị và nhân lực cho cán bộ chủ trì và các cán bộ
tham gia thực hiện đề tài này.
Chủ nhiệm đề tài và cán bộ thực hiện đề tài xin chân thành cảm ơn Vụ Quản lý
Khoa học & Công nghệ các ngành kinh tế của Bộ Khoa học & Công Nghệ; Vụ Hợp tác
Quốc tế của Bộ Khoa học & Công Nghệ; Bộ Nông nghiệp và PTNT đã tạo điều kiện về

kinh phí và quản lý quá trình thực hiện các nội dung nghiên cứu của đề tài trong suốt thời
gian qua.



Hà Nội, ngày tháng năm 2006


Cơ quan chủ trì đề tài Chủ nhiệm đề tài







PGS. TS. Lê Huy Hàm

Mục lục

Danh sách những ngời tham gia thực hiện đề tài 1
Bài tóm tắt 2
Những chữ viết tắt 4
Lời mở đầu 5
Chơng 1. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nớc và ngoài nớc 8
1.1. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và trong nớc 8
1.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng cây chuyển gen 8
1.3. Công nghệ sinh học và ứng dụng trong chọn tạo giống ngô ở Việt nam 11
1.3.1. Các nghiên cứu về nuôi cấy bao phấn ngô 11
1.3.2. Nuôi cấy noãn cha thụ tinh 12

1.4. Các nghiên cứu chuyển gen ở cây ngô 12
1.5. Một số hớng mới nhằm cải tạo giống ngô 13
1.5.1. Chọn tạo giống chín sớm 13
1.5.2. Chọn tạo giống có khả năng chịu lạnh 14
1.5.3. Tăng cờng khả năng hấp thụ nitơ 14
Chơng 2. Lựa chọn đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 16
2.1. Mục tiêu của đề tài 16
2.2. Nội dung nghiên cứu cần thực hiện 16
2.2.1. Tách chiết và tái tổ hợp gen, thiết kế vectơ mang gen 16
2.2.2. Xây dựng hệ thống tái sinh và biến nạp di truyền 16
2.2.2.1. Xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non và mô đơn bội ở ngô 16
2.2.2.2. Thiết lập hệ thống chuyển gen ở cây ngô 17
2.2.2.3. Chuyển gen vào ngô với các gen quan tâm 18
2.2.2.4. Phân tích cây chuyển gen 18
2.3. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 18
2.3.1. Vật liệu 18
2.3.1.1. Vật liệu thực vật 18
2.3.1.2. Các chủng vi khuẩn Agrobacterium, plasmid DNA, vật t và hoá chất 19
2.3.2. Phơng pháp 20
2.3.2.1. Phơng pháp thí nghiệm đồng ruộng 20
2.3.2.2. Phơng pháp nuôi cấy mô tế bào 20
2.3.2.3. Cải thiện khả năng tái sinh của các dòng ngô Việt Nam bằng phơng pháp di truyền 20
2.3.2.4. Phơng pháp biến nạp gen 21
2.3.2.5.Phơng pháp đánh giá cây chuyển gen 21
2.4. Dạng sản phẩm kết quả tạo ra 22
2.5. Nhu cầu kinh tế, xã hội và địa chỉ áp dụng 22
Chơng 3. Những nội dung và kết quả đã thực hiện 23
3.1. Xây dựng hệ thống tái sinh 23
3.1.1. Xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non 23
3.1.1.1. Cơ sở khoa học và các nghiên cứu về hệ thống tái sinh in vitro 23

3.1.1.2. Vật liệu và phơng pháp 27
3.1.1.3. Hoàn thiện hệ thống nuôi cấy và tái sinh cây từ phôi non 29
3.1.1.4. Quy trình tái sinh cây từ phôi non ở ngô 39
3.1.1.5. Đánh giá khả năng tái sinh của một số dòng ngô Việt Nam 41
3.1.2. Xây dựng hệ thống tái sinh phôi từ nuôi cấy bao phấn 42
3.1.2.1. Đặt vấn đề 42
3.1.2.2. Vật liệu và phơng pháp 43
3.1.2.3. Phản ứng của các giống ngô Việt Nam trong nuôi cấy bao phấn 45
3.1.2.4. Tối u hoá quy trình tái sinh phôi từ nuôi cấy bao phấn 46
3.1.2.5. Quy trình tái sinh cây từ bao phấn 51
3.1.3. Tạo các dòng ngô Việt Nam có khả năng tái sinh cao bằng phơng pháp di
truyền 52
3.1.3.1. Vật liệu và phơng pháp 53
3.1.3.2. Kết quả chọn tạo các dòng ngô Việt Nam có khả năng tái sinh cao 53
3.1.4. Kết luận 57
3.2. Xây dựng hệ thống chuyển gen 59
3.2.1. Xây dựng hệ thống chuyển gen bằng súng bắn gen 59
3.2.1.1. Cơ sở khoa học và thực tiễn của việc chuyển gen bằng súng bắn gen 59
3.2.1.2. Vật liệu và phơng pháp 62
3.2.1.3. Hoàn thiện quy trình chuyển gen bằng súng bắn gen 64
3.2.1.4. Kết luận 74
3.2.1.5. Quy trình biến nạp bằng súng bắn gen 75
3.2.2. Xây dựng hệ thống biến nạp gen thông qua Agrobacterium 77
3.2.2. 1. Cơ sở khoa học và thực tiễn của việc chuyển gen thông qua
Agrobacterium 77
3.2.2. 2. Vật liệu và phơng pháp 79
3.2.2.3. Hoàn thiện quy trình chuyển gen thông qua Agrobacterium 82
3.2.2.4. Quy trình biến nạp gen thông qua Agrobacterium 90
3.2.2.5. Đánh giá khả năng biến nạp gen của một số dòng ngô thuần và ngô lai 92
3.2.2.6. Kết luận 94

3.3. Chuyển gen vào ngô với các gen quan tâm 95
3.3.1.Vật liệu và phơng pháp 95
3.3.1.1. Vật liệu 95
3.3.1.2. Phơng pháp 96
3.3.2. Kết quả và thảo luận 97
3.3.3. Những khó khăn tồn tại 104
3.3.4. Kết luận 105
3.4. Phân tích cây chuyển gen 106
3.4.1. Vật liệu và phơng pháp 106
3.4.1.1. Vật liệu 106
3.4.1.2. Phơng pháp 107
3.4.2. Kết quả đánh giá biểu hiện bền vững của gen chỉ thị trong các dòng ngô chuyển gen 109
3.4.2.1. Biểu hiện bền vững của gen gfp trong các dòng ngô chuyển gen 109
3.4.2.2. Biểu hiện bền vững của gen gus trong các dòng ngô chuyển gen 111
3.4.3. Kết quả phân tích PCR các dòng ngô chuyển gen 113
3.4.3.1. Phân tích PCR các dòng ngô chuyển gen gfp và pat 113
3.4.3.2. Phân tích PCR các dòng ngô chuyển gen gus và nptII 114
3.4.4. Kết quả phân tích lai Southern các dòng ngô chuyển gen 115
3.4.4.1. Phân tích lai Southern các dòng ngô chuyển gen pat 115
3.4.4.2. Phân tích lai Southern các dòng ngô chuyển gen nptII 117
3.4.5. Thử nghiệm cây chuyển gen trong nhà kính 119
3.4.6. Kết luận 122
Chơng 4. Tổng quát hoá và đánh giá kết quả thu đợc 123
4.1. Kết quả về khoa học 123
4.2. Kết quả nổi bật và khả năng áp dụng 124
4.3. Trình độ công nghệ 126
4.4. Khả năng áp dụng 126
4.5. Đào tạo 126
4.6. Sản phẩm khoa học của đề tài 127
4.7 Hợp tác quốc tế 128

4.8. Tình hình sử dụng kinh phí 128
4.9. Danh sách các công trình công bố 129
4.10. Hạn chế của đề tài 129
Chơng 5. Kết luận và đề nghị 131
5.1. Kết luận 131
5.2. Đề nghị 132
Tài liệu tham khảo 134
Tài liệu Tiếng Việt 134
Tài liệu Tiếng Anh 135.
Phụ lục



Mục lục các bảng

Bảng 1 Đánh giá một số chỉ tiêu nông học của các dòng ngô nhập n
ộ
i HR8 và HR9 qua
các thời vụ trồng trong điều kiện Việt nam
30
Bảng 2 Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8 32
Bảng 3 Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR9 32
Bảng 4
ảnh hởng của kích thớc phôi nuôi cấy (tuổi phôi) lên khả năng tạo mô sẹo và
tái sinh cây
33
Bảng 5
ảnh hởng của AgNO
3
đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8

36
Bảng 6
ảnh hởng của thành phần môi trờng và AgNO
3
đến khả năng tạo mô sẹo và
tái sinh dòng HR8
37
Bảng 7
ảnh hởng của 2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo của phôi non dòng ngô HR8
38
Bảng 8 Đánh giá khả năng tái sinh của các dòng ngô Việt Nam 41
Bảng 9 Phản ứng của các giống ngô Việt Nam trong nuôi cấy bao phấn 45
Bảng 10
ảnh hởng của thời gian cấy chuyển đến tần số tạo phôi và tái sinh cây từ nuôi
cấy bao phấn
46
Bảng 11
ảnh hởng của xử lý áp suất thẩm thấu đối với phản ứng của bao phấn ngô
48
Bảng 12
ảnh hởng của kinetin đến khả năng tái sinh cây từ phôi tạo thành trong nuôi
cấy bao phấn
49
Bảng 13
ảnh hởng của BAP lên quá trình nhân nhanh cụm chồi ngô
50
Bảng 14
ảnh hởng của auxin tới sự tạo rễ cây ngô
51
Bảng 15 Đánh giá khả năng tái sinh từ phôi non của các dòng ngô lai giữa dòng ngô Việt

Nam và dòng nhập nội HR8/HR9
54
Bảng 16 Phản ứng tái sinh in vitro của các dòng ngô chọn tạo bằng phơng pháp lai
ngợc giữa dòng ngô Việt Nam và dòng nhập nội HR8
55
Bảng 17
ảnh hởng của thời gian tiền nuôi cấy phôi đến biểu hiện tạm thời của gen gus
và khả năng tái sinh
65
Bảng 18
ảnh hởng của khoảng cách bắn và áp lực khí đến biểu hiện gen tạm thời
68
Bảng 19 Biểu hiện gen tạm thời của phôi non dòng ngô HR8 sau khi bắn gen với các
plasmid mang các đoạn khởi động khác nhau
69
Bảng 20
ảnh hởng của xử lý áp suất thẩm thấu đến biểu hiện gen tạm thời
71
Bảng 21
ảnh hởng hàm lợng hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus và khả
năng tái sinh
72
Bảng 22
ảnh hởng kích thớc hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus và khả năng
tái sinh
73
Bảng 23 Thành phần môi trờng nuôi cấy và chuyển gen thông qua vi khuẩn
Agrobacterium ở ngô
81
Bảng 24 Biểu hiện tạm thời của gen gus khi biến nạp các chủng Agrobacterium và

vector khác nhau vào phôI non dòng ngô HR8
83
Bảng 25 Tơng tác giữa kích thớc phôi nuôi cấy và mức độ xâm nhiễm của vi khuẩn
Agrobacterium trong biến nạp gen ở ngô
85
Bảng 26
ảnh hởng của thời gian tiền nuôi cấy phôi đến hiệu quả chuyển gen thông qua
Agrobacterium
87
Bảng 27
ảnh hởng của acetosyringone (AS) đến biểu hiện tạm thời của gen gus
89
Bảng 28 Phản ứng của các dòng ngô khác nhau trong biến nạp gen thông qua
Agrobacterium
93
Bảng 29 Trình tự các đoạn mồi (Biozym) sử dụng trong nghiên cứu 97
Bảng 30 Kết quả chọn lọc và tái sinh cây sau khi biến nạp phôi non dòng HR8 với các
gen quan tâm
98
Bảng 31 Tóm tắt các thí nghiệm chuyển gen quan tâm vào phôi non dòng HR8 100
Bảng 32 Trình tự các đoạn mồi (Biozym) sử dụng trong nghiên cứu 108
Bảng 33 Tóm tắt các thí nghiệm chuyển gen bằng súng bắn gen vào phôi non dòng ngô
HR8
109
Bảng 34 Tóm tắt các thí nghiệm chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium 111
Bảng 35 Theo dõi sinh trởng và phát triển của các dòng HR8 chuyển gen trồng trong
nhà kính
120

Mục lục các hình

Hình 1 Mô tả hình thái, sinh trởng và phát triển của hai dòng ngô nhập nội HR8 và
HR9 qua các thời vụ trồng trong điều kiện Việt Nam
31
Hình 2 Tạo mô sẹo và tái sinh cây từ phôi non dòng ngô nhập nội HR8 32
Hình 3 Các giai đoạn phát triển của phôi ngô 34
Hình 4 Tạo mô sẹo và tái sinh cây ở các phôi nuôi cấy có kích thớc khác nhau 35
Hình 5
ảnh hởng của AgNO
3
đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dòng HR8
37
Hình 6
ảnh hởng của 2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo của phôi non dòng ngô HR8
39
Hình 7 Khả năng tái sinh của các dòng ngô Việt Nam 42
Hình 8 Khả năng tái sinh cây từ phôi non của các dòng ngô lai giữa dòng Việt Nam và

dòng HR8/HR9
54
Hình 9 Tạo mô sẹo và tái sinh cây từ phôi non của các dòng ngô 55
Hình 10 Chọn tạo các dòng ngô FNBcr2 56
Hình 11 Sơ đồ cấu trúc các plasmid sử dụng trong các thí nghiệm biến nạp gen bằng
súng bắn gen
63
Hình 12 Mô đích sử dụng cho bắn gen 65
Hình 13 Biểu hiện gus tạm thời ở phôi sau khi bắn gen 66
Hình 14 Tạo mô sẹo phôi hoá và tái sinh chồi từ phôi non bắn gen 67
Hình 15 Biểu hiện gus tạm thời ở phôi ngô non sau khi biến nạp với plasmid mang đoạn
khởi động khác nhau
70
Hình 16 Biêủ hiện tạm thời của gen gus ở phôi non dòng HR8 sau 2 ngày bắn gen 72
Hình 17 Sơ đồ cấu trúc vectơ pBINGUSINT và pSB11-PAT-ubi-GUSINT sử dụng cho
các nghiên cứu biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
80
Hình 18 Biểu hiện tạm thời của gen gus ở phôi non dòng HR8 biến nạp với các chủng
Agrobacterium mang các vector khác nhau
84
Hình 19 Biểu hiện tạm thời của gen gus ở các phôi non có kích thớc khác nhau sau khi
biến nạp với Agrobacterium ATHV(pBINGUSINT)
86
Hình 20 Biểu hiện tạm thời của gen gus ở các phôi non đợc tiền nuôi cấy 88
Hình 21 Biểu hiện tạm thời của gen gus ở các phôi non lây nhiễm trong môi trờng có
bổ sung AS
90
Hình 22 Biểu hiện tạm thời của gen gus ở các phôi non dòng ngô HR8, GA35 và GC8
sau khi biến nạp với ATHV(pBINGUSINT)
93

Hình 23 Sơ đồ cấu trúc vectơ pBIN4F4 và pBINIIIE9 sử dụng trong các thí nghiệm biến
nạp gen ở ngô thông qua Agrobacterium.
96
Hình 24 Kết quả phân tích PCR các dòng ngô HR8 chuyển gen 100
Hình 25 Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng ngô HR8 đợc biến nạp với vectơ
pPLANTA195ZAP1 mang gen chín sớm ZAP1
101
Hình 26 Kết quả phân tích PCR các cây ngô HR8 đợc biến nạp với vectơ
pPLANTA195Zmm4 mang gen chín sớm Zmm4
102
Hình 27 Kết quả phân tích PCR các dòng ngô HR8 đợc biến nạp với vectơ pBIN4F4
mang gen chịu lạnh 4F4
103
Hình 28 Kết quả phân tích PCR các dòng ngô HR8 đợc biến nạp với vectơ pBINIIIE9
mang gen chịu lanh IIIE9
104
Hình 29
Sơ đồ cấu trúc plasmid p35PAT sử dụng cho các nghiên cứu chuyển gen bền vững vào
phôi ngô non bằng súng bắn gen
107
Hình 30 Biểu hiện bền vững của gen gfp ở mô sẹo tạo thành từ phôi non bắn gen và rễ
cây chuyển gen tái sinh
110
Hình 31 Biểu hiện của gen gus ở chồi và rễ cây ngô tái sinh đã chuyển gen 112
Hình 32 Kết quả phân tích PCR các dòng ngô HR8 đã đợc chuyển gen gfp 113
Hình 33 Kết quả phân tích PCR các dòng ngô HR8 đã đợc chuyển gen pat 113
Hình 34 Kết quả phân tích PCR các dòng ngô HR8 và GA35 đã đợc chuyển gen gus 114
Hình 35 Kết quả phân tích PCR các dòng ngô HR8 đã đợc chuyển gen nptII 115
Hình 36 Kết quả phân tích PCR các dòng ngô HR8 đã đợc chuyển gen thông qua
Agrobacterium

115
Hình 37 Kết quả lai DNA của các dòng ngô HR8 chuyển gen pat (cắt bằng NcoI) 116
Hình 38 Kết quả lai DNA của các dòng ngô HR8 chuyển gen pat (cắt bằng SacI) 117
Hình 39 Kết quả lai Southern của các dòng ngô GA35 chuyển gen nptII 118
Hình 40 Dòng ngô GA35 chuyển gen hữu thụ trồng trong nhà kính 119
Hình 41 Đánh giá biểu hiện bền vững của gen pat ở các dòng ngô HR8 chuyển gen
trồng trong nhà kính
121














Báo cáo Tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề ti

1

Danh sách những ngời tham gia thực hiện đề ti


TT Họ và tên Cơ quan công tác

A Chủ nhiệm đề tài
PGS.TS Lê Huy Hàm
Phòng thí nghiệm trọng
điểm Công nghệ tế bào thực
vật, Viện Di truyền Nông
nghiệp
B Cán bộ tham gia nghiên cứu
1 PGS.TS. Đỗ Năng Vịnh Phòng thí nghiệm trọng
điểm Công nghệ tế bào thực
vật, Viện Di truyền nông
nghiệp
2 Th.S. Phạm Thị Lý Thu nt
3 TS. Đinh Đoàn Long nt
4 CN. Lê Thu Về nt
5 Th.S. Nguyễn Khánh Vân nt
6 CN. Lu Thị Mỹ Dung nt
7 ThS. Hà Thị Thuý nt
8 CN. Phạm Minh Thợi nt
9 KS. Vũ Thị Sơn nt


Báo cáo Tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề ti

2
Bi tóm tắt

ở Việt Nam, ngô là cây lơng thực quan trọng thứ hai đứng sau lúa. Trong
lĩnh vực chọn tạo giống ngô mặc dù đã có những chuyển biến hết sức tích cực
nhng công nghệ sinh học vẫn cha đợc áp dụng rộng rãi vào công tác chọn tạo
giống ngô, đặc biệt là việc tạo ra các giống ngô có các đặc tính mới bằng kỹ thuật di

truyền. Những hạn chế làm giảm hiệu quả của việc ứng dụng các phơng pháp sinh
học phân tử trong chọn tạo giống ngô ở nớc ta là: i) Chúng ta cha có hệ thống tái
sinh có hiệu quả sử dụng cho chuyển gen; ii) Chúng ta cha có nguồn gen (gen có
giá trị kinh tế) và các vật liệu sử dụng cho chuyển gen (các plasmid, các chủng
Agrobacterium, các promotor đặc hiệu ); iii) Chúng ta cha có cán bộ lành nghề
trong lĩnh vực tạo cây trồng chuyển gen. Đề tài Sử dụng kỹ thuật biến nạp di truyền
cải tạo một số đặc tính nông sinh học ở ngô và lúa mỳ đợc thực hiện trên cơ sở
hợp tác khoa học với Trung tâm nghiên cứu PLANTA/KWS (CHLB Đức) là một
trong những cố gắng theo hớng khắc phục các nhợc điểm trên để tiến tới ứng
dụng thành công công nghệ gen vào cải tạo giống cây trồng.
Mục tiêu của đề tài phía Việt Nam tập trung vào giải quyết các vấn đề sau: i)
Xây dựng hệ thống tái sinh sử dụng cho chuyển gen thích hợp với điều kiện về
giống và khí hậu ở Việt nam; ii) Hoàn thiện quy trình chuyển gen vào ngô bằng cả
hai phơng pháp dùng súng bắn gen và Agrobacterium; iii) Đào tạo cán bộ lành
nghề trong lĩnh vực chuyển gen tạo giống cây trồng và tăng cờng tiềm lực trong
lĩnh vực này nh thu thập các plasmid vectơ, các chủng Agrobacterium, các vật liệu
khác sử dụng cho chuyển gen thông qua hợp tác với đối tác nớc ngoài; và iv)
Chuyển một số gen có giá trị kinh tế mà phía bạn đã phân lập, thiết kế vào ngô.
Theo kế hoạch dự kiến, phía CHLB Đức sẽ phân lập và thiết kế 3 gen (chín sớm,
chịu lạnh và tăng cờng hấp thụ nitơ) để chuyển vào ngô. Tuy nhiên, trên thực tế 2
gen (chín sớm, và chịu lạnh) đã đợc thiết kế và chuyển vào ngô, gen tăng cờng
hấp thụ nitơ không phân lập thành công.
Báo cáo Tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề ti

3
Đề tài đã thực hiện đầy đủ các nội dung nghiên cứu và thu đợc những kết
quả chính sau:
Xây dựng hệ thống tái sinh sử dụng cho chuyển gen
: Phơng pháp nuôi cấy
mô tế bào đã đợc áp dụng để xây dựng và hoàn thiện quy trình tái sinh cây từ phôi

non và tái sinh phôi từ nuôi cấy bao phấn có tần suất tái sinh cao. Bằng phơng
pháp lai hữu tính kết hợp tái sinh cây từ phôi non đề tài đã tạo đợc 5 dòng ngô có
khả năng tái sinh cao và thích ứng tốt trong điều kiện Việt Nam.
Hoàn thiện quy trình chuyển gen
: Hệ thống chuyển gen vào cây ngô đã đợc
hoàn thiện. Các quy trình biến nạp gen bằng súng bắn gen và thông qua
Agrobacterium đã đợc xây dựng và cải thiện trên cơ sở tối u hoá các yếu tố chính
ảnh hởng đến quá trình biến nạp.
Chuyển các gen vào ngô
: Sử dụng các quy trình biến nạp đã xây dựng để
chuyển các gen: gfp/gus, pat/nptII, các gen mang các đặc tính quan tâm: chín sớm,
chịu lạnh vào ngô. Đề tài đã nhận đợc 10 dòng ngô HR8 chuyển gen kháng thuốc
diệt cỏ và 6 dòng ngô GA35 chuyển gen mang gen nptII. Các dòng ngô chuyển gen
đã đợc phân tích và đánh giá bằng các phơng pháp sinh học phân tử. Hạt R1 của
các dòng chuyển gen này cũng đã nhận đợc.
Nói tóm lại, đề tài đã thực hiện tốt các nội dung nghiên cứu đặt ra và thu
đợc những kết quả bớc đầu rất khả quan. Các kết quả nghiên cứu đạt đợc mang
tính khoa học và lý luận.

Báo cáo Tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề ti

4
Những chữ viết tắt

2,4- D: Dichlorophenoxy acetic acid
Act1: rice actin promoter : đoạn gen khởi động tách từ cây lúa
Adh1: alcohol dehydrogenase 1 promoter: đoạn gen khởi động Adh1
AS: acetosyringone
bar / pat: gen mã hoá phosphinothricin acetyl transferase
gus: - Glucuronidase gene = gen mã hoá -glucuronidase

bp: base pair
CNSH: Công nghệ Sinh Học
DNA: Axit Deoxyribonucleic
EC: embryogenic callus: mô sẹo phôi hoá
EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetace Axit
Et-Br: Ethidium bromide
gfp: green fluorescent protein: gen chỉ thị mã hoá cho protein phát huỳnh quang màu
xanh
nptII: Neomycin phosphotransferase gene = gen mã hoá neomyciphosphotransferase
CaMV35S- P: Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter
CTAB: Cetyltrimeethylammonium bromide
Ubi1: maize ubiquitin promoter
X-gluc: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide
GMC: Cây trồng chuyển gen
GMO: Sinh vật chuyển gen
HR8 = C18: Dòng ngô nhập nội A188
HR9= C19: Dòng ngô nhập nội H99
Km: Kanamycine
Kp: Kilobase
LB: Luria and Bertani
MS: Môi trờng nuôi cấy theo Murashige & Skoog (1962)
NOS-P: Nopaline Synthase Promotor
PCR: Polymerase Chain Reaction
STF (%): tần số chuyển gen bền vững (%)
T-DNA: Transfer- DNA= DNA chuyển
Ti- Plasmit: Tumor inducing plasmit= plasmit gây khối u thực vật
TTF (%): tần số chuyển gen tạm thời (%)
Vir : Virulence Region = Vùng gây độc có khả năng tạo khối u
Báo cáo Tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề ti

5

Lời mở đầu
Công nghệ sinh học hiện đại và các cây trồng biến đổi di truyền đang đợc
ứng dụng rộng rãi và có nhiều đóng góp có giá trị cho sản xuất nông nghiệp, đặc
biệt trên lĩnh vực tạo giống cây trồng mới. Công nghệ sinh học sử dụng kỹ thuật di
truyền để cải tạo cây trồng bằng cách đa trực tiếp những gen có giá trị vào hệ gen
của thực vật, cho phép tạo ra hàng loạt cây trồng mang các gen hữu ích, có những
đặc tính nông học quan trọng nh kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ, chín sớm và các
đặc tính có lợi khác.
Trong thập niên vừa qua, thế giới đã chứng kiến các bớc phát triển vợt bậc
của công nghệ sinh học. Từ những nghiên cứu cơ bản trong những năm 70-80 của
thế kỷ trớc, con ngời đã bớc đầu tạo ra đợc giống cây trồng nh ý muốn. Đó là
các giống ngô, bông, đậu tơng, cải dầu kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ. Đó là
thế hệ cây chuyển gen đầu tiên đã hiện thực hoá giấc mơ cải tạo thiên nhiên của con
ngời. Trên diện tích trồng cây chuyển gen, năng suất cây trồng cao hơn, hoá chất
sử dụng ít hơn và lợi nhuận thu đợc cao hơn. Đó chính là lý do vì sao diện tích cây
trồng chuyển gen lan nhanh trên toàn thế giới. Tính đến năm 2005, trên thế giới đã
có 90 triệu ha cây trồng chuyển gen, 8,5 triệu nông dân đã trồng cây chuyển gen.
Dự kiến đến năm 2010, trên thế giới sẽ có khoảng 150 triệu ha cây trồng chuyển
gen và số nớc áp dụng công nghệ này sẽ lên tới 30 nớc (Clive, 2005) [59]. Năm
2005, ngô có hàm lợng lysin cao đã đợc đa vào sản xuất, mở đầu cho thế hệ ngô
chuyển gen thứ hai: cải tiến hàm lợng dinh dỡng và các đặc tính nông sinh học.
Tuy nhiên, các đặc tính rất quan trọng khác nh hàm lợng chất vi lợng, tính chín
sớm (ngắn ngày), khả năng hấp thụ nitơ, chịu hạn, chịu lạnh còn cha đợc chú ý.
ở Việt Nam, chúng ta cha tạo ra đợc giống cây trồng chuyển gen, các
nghiên cứu chuyển gen chỉ là những nghiên cứu lẻ tẻ, không mang tính chất hệ
thống và chỉ giới hạn trong phòng thí nghiệm. Để làm chủ đợc công nghệ hiện đại
tạo giống cây trồng nh ý muốn của con ngời, chúng ta cần phải làm chủ đợc
công nghệ tái tổ hợp ADN, trong đó có xác định các gen có ích, phân lập và thiết kế

Báo cáo Tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề ti

6
vectơ biểu hiện ở các loài thực vật khác nhau, xây dựng hệ thống chuyển gen và
đánh giá biểu hiện của gen chuyển, làm cơ sở cho việc tạo ra các giống cây trồng
mới, đáp ứng với yêu cầu của sản xuất và xã hội.
Cây ngô là một trong những đối tợng quan trọng để áp dụng các phơng
pháp công nghệ sinh học. ở nớc ta đây là cây lơng thực quan trọng thứ hai đứng
sau lúa. Trong lĩnh vực chọn tạo giống ngô mặc dù đã có những chuyển biến hết sức
tích cực nhng công nghệ sinh học vẫn cha đợc áp dụng rộng rãi vào công tác
chọn tạo giống ngô. Chúng ta mới chỉ giới hạn ở việc ứng dụng các công nghệ nh
công nghệ đơn bội, đánh giá khoảng cách di truyền vào chọn tạo giống ngô ở quy
mô rất hạn chế. Do đó, đóng góp của công nghệ sinh học vào sản xuất ngô hầu nh
cha đáng kể. Trong khi đó, do đặc thù của điều kiện tự nhiên nớc ta, từ Nam ra
Bắc với 6 vùng sinh thái khác nhau đặt ra cho công tác chọn tạo giống những đòi
hỏi rất đặc thù, thậm chí nghiêm ngặt cho từng vùng. Việc nghiên cứu ứng dụng
công nghệ gen để tạo ra các giống ngô có các đặc tính mới mà phơng pháp truyền
thống không tạo ra đợc là hết sức cần thiết để tạo ra các giống ngô thích hợp với
các vùng sinh thái khác nhau, nâng cao năng suất và sản lợng ngô.
Do đặc thù của nền nông nghiệp luân canh nhiều vụ nên ở đồng bằng Bắc Bộ
ngô thờng đợc trồng xen giữa hai loài cây trồng khác. Do vậy, việc tạo ra các
giống ngô ngắn ngày sẽ góp phần tăng cờng luân canh xen vụ. Qua đó làm tăng
diện tích trồng trọt và sản lợng.
ở Việt Nam, vụ ngô đông bị ảnh hởng bởi gió lạnh cuối tháng 10. Các
giống ngô không chịu lạnh thờng có tỷ kệ kết hạt rất thấp nếu tung phấn vào các
dịp thời tiết lạnh. Ngời trồng ngô khắc phục hiện tợng này bằng cách trồng giống
ngắn ngày hoặc trồng sớm để tránh thời tiết lạnh. Nh vậy sẽ ảnh hởng đến vụ thu
hoạch trớc đó. Vì thế các giống ngô chịu lạnh sẽ đảm bảo an toàn cho vụ ngô đông
tại các vùng trồng ngô phía Bắc.
Các nghiên cứu gần đây đã cho thấy rằng các giống cây trồng ngắn ngày,

chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trờng nh lạnh, hạn có thể đợc tạo ra
bằng kỹ thuật di truyền. Trong hàng loạt các yêu cầu cần phải có để tạo đợc giống
Báo cáo Tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề ti

7
chuyển gen thì việc xây dựng đợc quy trình chuyển gen thuận lợi và có hiệu quả
cao là một trong những đòi hỏi cần thiết. Các cây ngũ cốc chính bao gồm ngô và lúa
mì là những đối tợng chuyển gen quan trọng kể từ khi các cây chuyển gen đợc tái
sinh thành công (Rhodes & CS, 1988; Vasil & CS, 1992) [88], [110]. Một trong
những hạn chế làm giảm hiệu quả của việc chuyển gen vào cây trồng nói chung và
đối với cây ngô nói riêng là tần số tái sinh thấp. Để nâng cao hiệu quả tạo cây
chuyển gen ngời ta đã xây dựng hệ thống tái sinh cây với tần số tái sinh cao từ
nuôi cấy phôi non. Tuy vậy, chỉ có một số giống ngô ôn đới: A188 và H99, một số
giống ngô có nguồn gốc Trung quốc: G10, G11 là những giống có khả năng tái
sinh cao, đợc dùng làm đối tợng trong các nghiên cứu chuyển gen ở ngô (Stamp
1994) [101]. Một trong những nhợc điểm lớn của các giống ngô này là chúng chỉ
thích nghi với điều kiện khí hậu ôn đới mà rất khó thích nghi với điều kiện khí hậu
nhiệt đới nh ở nớc ta., vì vậy cần phải có các nghiên cứu để thích ứng các quy
trình tái sinh trên trong các điều kiện của Việt Nam.
Mặt khác, nguồn gen để cải tạo giống cây trồng bằng kỹ thuật di truyền hiện
nay cha có đợc ở trong nớc. Trong thoả thuận hợp tác nghiên cứu với đối tác
nớc ngoài là Trung tâm nghiên cứu PLANTA, thuộc Công ty giống hàng đầu của
CHLB Đức (Công ty KWS), nguồn gen ngắn ngày và gen chịu lạnh sẽ đợc
PLANTA phân lập, thiết kế và chuyển giao cho phía Việt Nam sử dụng. Các vật liệu
khác sử dụng cho chuyển gen, nh giống ngô có khả năng tái sinh cao, các chủng
Agrobacterium đặc hiệu cũng đợc chuyển giao cho Việt Nam.
Xuất phát từ những đòi hỏi thực tế trên và khả năng của đối tác nớc ngoài
bổ sung những thiếu hụt của nớc ta trong vấn đề áp dụng kỹ thuật di truyền cải tạo
giống cây trồng, Viện Di truyền Nông nghiệp đã đợc Bộ Khoa học Công nghệ cho
phép thực hiện đề tài Sử dụng kỹ thuật biến nạp di truyền cải tạo một số đặc tính

nông sinh học ở ngô và lúa mỳ. Đây là một trong những đề tài thuộc chơng trình
hợp tác khoa học công nghệ giữa Việt Nam và CHLB Đức, đề tài vừa có định h
ớng
ứng dụng lại vừa có ý nghĩa tiếp thu công nghệ, xây dựng tiềm lực tiến tới làm chủ
lĩnh vực công nghệ ADN cải tạo giống cây trồng.

Báo cáo Tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề ti

8
Chơng 1.
Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nớc
v ngoi nớc

1. 1. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và trong nớc
Vào những năm cuối thế kỷ 20 nghề trồng ngô đã có bớc phát triển vợt bậc
nhờ những ứng dụng rộng rãi công nghệ giống ngô lai và các thành tựu khoa học về
di truyền tạo giống.
Diện tích trồng ngô trên thế giới biến động từ 130-145 triệu ha, trong đó Mỹ
là nớc có diện tích trồng ngô lớn nhất, gần 30 triệu ha. Tổng sản lợng ngô hạt thế
giới năm 2004 đạt 705 triệu tấn, năng suất bình quân đạt trên 4,8 tấn/ha. ở châu á,
Trung Quốc là cờng quốc về ngô lai, có diện tích trồng ngô trên 25 triệu ha, năng
suất bình quân 5,1 triệu tấn/ha (Ngô Hữu Tình & CS, 1997) [13].
ở Việt nam ngô đợc trồng trong các điều kiện sinh thái khác nhau trên
nhiều vùng, các thời vụ trồng ngô chủ yếu căn cứ vào tác động của chế độ nhiệt,
lợng ma. Trong vài năm gần đây diện tích và sản lợng ngô tăng rất mạnh (Ngô
Hữu Tình & CS, 1997) [13].
1. 2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng cây chuyển gen
Năm 1984, trên thế giới đã có một số nghiên cứu thành công khi chuyển gen
vào cây trồng. Đến nay, vấn đề cải biến giống cây trồng đã phát triển vợt bậc, góp
phần nâng cao năng suất cây trồng, giảm chi phí phòng trừ sâu bệnh, tạo ra những

giống cây thích ứng với nhiều vùng sinh thái khắc nghiệt Những thành tựu này có
ý nghĩa rất quan trọng không chỉ đối với Việt Nam mà trên toàn cầu, đặc biệt khi
dân số thế giới ngày càng tăng cùng nguồn tài nguyên thiên nhiên bị giảm sút.
Hiện nay, phần lớn những nghiên cứu về GMO đều đợc tiến hành ở các
nớc phát triển, chủ yếu là ở Bắc Mỹ và Tây âu. Tại các nớc công nghịêp, các
công ty công nghệ sinh học đã đi đầu trong việc ứng dụng kỹ thuật biến đổi gen vào
cây trồng nông nghiệp. Đó là các công ty: Aventis, Dow AgroSciences,
Báo cáo Tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề ti

9
DuPont/Pioneer, Monsanto và Syngenta. Tuy nhiên, gần đây, nhiều nớc đang phát
triển cũng đang bắt đầu những nghiên cứu về công nghệ gen.
Thử nghiệm ngoài đồng ruộng đầu tiên là cây thuốc lá biến đổi gen kháng
thuốc diệt cỏ, đợc tiến hành ở Mỹ và Pháp năm 1986. Trong giai đoạn 1986-1997,
tức là bắt đầu thời điểm thơng mại hoá cây trồng biến đổi gen, trên toàn cầu có tới
25000 thử nghiệm trên đồng ruộng đối với các cây trồng biến đổi di truyền. Các thử
nghiệm này tập trung vào 10 loại tính trạng trên đối tợng là 60 loại cây trồng.
Trong thời kỳ này, những loại cây biến đổi gen đợc thử nghiệm là: Ngô, cà chua,
đậu nành, cải dầu, khoai tây và bông với các đặc tính đợc quan tâm nhất nh
kháng thuốc diệt cỏ, kháng sâu và kháng virus. Cho tới năm 2004 ớc tính có 63
quốc gia áp dụng kỹ thuật biến đổi gen ở cây trồng.
Từ thời điểm 1996, diện tích GMO thơng mại bắt đầu tăng liên tục và ổn
định. Từ năm 1996-2004 tổng số diện tích trồng cây biển đổi gen là 385 ha. Theo
báo cáo của cơ quan quốc tế về các ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp
(ISAAA), năm 2004 đợc đánh giá là năm có thành tích phát triển nhanh thứ hai
diện tích trồng cây biến đổi gen tăng 13,3 triệu ha. Diện tích trồng đạt 81 triệu ha
tại 17 nớc. Năm 2003 tổng diện tích cây trồng biến đổi gen trên toàn thế giới đạt
67,7 triệu ha, tăng 15%, trong đó 1/3 diện tích là ở các nớc đang phát triển (tỉ lệ
này trong năm 2002 là 1/4). Năm 2003 có khoảng 7 triệu ngời làm nông nghiệp
thuộc 18 nớc trên thế giới sử dụng loại cây trồng biến đổi gen, tăng 1 triệu ngời

so với năm 2002, trong đó 85% là ở các nớc đang phát triển. Số hộ nông dân trồng
cây biến đổi gen tăng từ 7 triệu của năm 2003 lên 8,25 triệu năm 2004, trong số đó
chiếm 90% (7,5 triệu ngời) là nông dân sản xuất nhỏ tại các nớc đang phát triển.
Số lợng các nớc đang phát triển trồng cây biến đổi gen là 11 nớc, gần gấp đôi số
lợng các nớc công nghiệp.
Diện tích trồng cây biến đổi gen ở các nớc đang phát triển đã tăng 7,2 triệu
ha (35%) trong năm 2004 so với 6,1 triệu ha (13%) ở các n
ớc công nghiệp. Năm n-
ớc đang phát triển Trung Quốc, ấn Độ, Argentina, Brazil và Nam Phi với tổng số
dân là 2,6 tỉ ngời, chiếm 40% dân số toàn thế giới, hiện là các nớc đứng đầu về
Báo cáo Tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề ti

10
cây chuyển gen, đã trồng 26 triệu ha cây biến đổi gen trong năm 2004, tơng đơng
với 1/3 diện tích trồng cây chuyển gen toàn thế giới. Trung Quốc và Nam Phi là
những nớc phát triển mạnh nhất việc sử dụng cây trồng biến đổi gen. Năm 2004
Trung Quốc có 7 triệu nông dân đang trồng cây bông kháng sâu Bt. Khoản lợi
nhuận 5 tỉ USD đợc dự tính vào năm 2010 thu đợc từ cây lúa và bông biến đổi
gen. Ngời dân ấn Độ đã chấp nhận cây bông kháng sâu Bt từ năm 2002; diện tích
trồng loại cây này tăng gấp 5 lần, đạt 500.000ha vào năm 2004; Bên cạnh đó, hơn
15 giống cây biến đổi gen đang trong giai đoạn thử nghiệm. Argentina là nớc đứng
thứ 2 về cây biến đổi gen diện tích trồng cây chuyển gen chiếm 20% diện tích
trồng cây chuyển gen trên toàn thế giới. Lợi nhuận đạt đợc 2 tỉ USD/năm từ đậu t-
ơng, ngô và bông chuyển gen. ở Brazil cây đậu tơng chuyển gen đã đợc ngời
dân chấp nhận vào năm 2003; diện tích trồng đạt 5 triệu ha năm 2004. Lợi nhuận
đạt đợc 1 tỉ USD/năm từ đậu tơng, ngô và bông chuyển gen. Nam Phi là một nớc
đứng đầu về công nghệ sinh học ở châu Phi. Từ năm 2004 các cây ngô, đậu tơng
và bông biến đổi gen đã đợc phép trồng thơng mại. Trong Liên minh Châu âu
(EU), Tây Ban Nha là nớc có diện tích trồng cây biến đổi gen lớn nhất, trong đó
riêng ngô chuyển gen đã chiếm tới 32.000 ha, đậu tơng biến đổi gen vẫn đứng đầu

trong các loại cây trồng biến đổi gen, chiếm 55% diện tích trồng trọt của thế giới
(Clive, 2005) [59].
Một số nớc ASEAN nh Thái lan, Philippin, Malaysia cũng đã tham gia vào
lĩnh vực nghiên cứu cây trồng biến đổi gen. ở Việt Nam, nghiên cứu chuyển gen
kháng côn trùng vào cây trồng cũng đã bắt đầu với mong muốn tạo ra và đa vào
ứng dụng các giống cây trồng có khả năng tự chống chịu sâu bệnh. Tại Viện Công
nghệ Sinh học, gen mã hoá lectin và -AI ở đậu cô ve đã đợc phân lập và tạo dòng
(Lê Thị Thu Hiền & CS, 1999) [7], gen mã hoá RIP cũng đ
ợc phân lập và biểu
hiện thành công trong vi khuẩn, nấm men (Nguyễn Văn Đạt & CS, 2000; Nguyễn
Thuý Hà & CS, 1999; Nguyễn Huy Hoàng & CS, 2000) [3], [4], [8].
Đặc biệt, phơng pháp chuyển gen nhờ A. tumefaciens cũng đã đợc áp dụng
ở một số phòng thí nghiệm và thu đợc những kết quả khả quan trên các loại cây
Báo cáo Tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề ti

11
trồng nh lúa, cải bắp, bông, đu đủ, khoai tây, khoai lang, ngô(Nguyễn Thị Liên
Chi & CS, 1994; Trần Bích Lan & CS, 1998; Hoàng Kim Oanh & CS, 1998;
Nguyễn Thị Thanh & CS, 1999; Mai Trờng & CS, 1998; Đặng Trọng Lơng, 2001;
Đặng Trọng Lơng & CS, 2001; Nguyễn Hữu Hổ & CS, 2003) [2], [11], [12], [14],
[16], [9], [10], [6]. Tuy nhiên, nghiên cứu về biến nạp gen ở cây ngô vẫn còn rất ít
ỏi. Các nghiên cứu trên cơ sở dự án hợp tác giữa Viện Di truyền Nông nghiệp và
Công ty KWS là những nghiên cứu mở đầu đối với đối tợng cây trồng quan trọng
này.
1.3. Công nghệ sinh học và ứng dụng trong chọn tạo giống ngô ở Việt nam
Thành công của kỹ thuật gen trong tạo giống cây trồng phụ thuộc vào 3 yếu
tố cơ bản sau:
- Thiết kế hợp lý gen và hệ điều hành của gen.
- Kỹ thuật chuyển và lắp ghép gen vào vị trí thích hợp trong nhiễm sắc thể và hệ
gen của tế bào.

- Hệ thống nuôi cấy và tái sinh tế bào thành cây hoàn chỉnh.
Thành tựu nổi bật trong lĩnh vực này là hệ thống tái sinh cây lúa từ nuôi cấy
tế bào phôi hoá. Thông qua chuyển gen vào hệ thống tế bào có khả năng tái sinh cao
này, vài nghìn dòng lúa chuyển gen với các tính trạng khác nhau đã đợc tạo ra
(Cheng & CS, 1998) [37]. ở ngô và một số cây trồng khác, ngời ta cha thể
chuyển các gen mong muốn vào các dòng giống có giá trị thơng mại một cách trực
tiếp do các giống này không có hoặc có khả năng tái sinh rất yếu trong nuôi cấy in
vitro. Vì vậy, trớc hết ngời ta chuyển gen vào hệ thống tế bào nuôi cấy tái sinh
mạnh. Sau khi tạo ra cây mang gen mới, ngời ta phải thực hiện phép lai ngợc
(back-cross) để tạo ra dòng thuần có giá trị thơng mại (Đỗ Năng Vịnh, 1989) [45].
Sử dụng các giống có khả năng tái sinh cao in vitro là cơ sở không thể thiếu
của các thao tác chuyển gen. Viện Di truyền NN đã thành công trong việc xây dựng
hệ thống nuôi cấy và tái sinh cây ngô in vitro từ tế bào phôi non, nuôi cấy noãn và
bao phấn ngô.
1.3.1. Các nghiên cứu về nuôi cấy bao phấn ngô
Báo cáo Tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề ti

12
Nghiên cứu về đơn bội ở ngô đã bắt đầu tại Viện Di truyền nông nghiệp từ
năm 1995. Các nghiên cứu này đã khẳng định khả năng ứng dụng có hiệu quả của
quy trình nuôi cấy bao phấn trong chọn giống ngô ở Việt nam.
1.3.2. Nuôi cấy non cha thụ tinh
Ngoài nuôi cấy bao phấn, Viện Di truyền Nông nghiệp cũng phát triển công
nghệ tạo dòng thuần bằng nuôi cấy noãn cha thụ tinh. Phơng pháp này có khả
năng khắc phục các nhợc điểm của phơng pháp nuôi cấy bao phấn, tạo dòng
thuần với hiệu quả cao hơn và dễ ứng dụng hơn trong điều kiện ở Việt Nam. Bằng
phơng pháp này, Viện Di truyền Nông nghiệp đã tạo ra một số cặp lai có triển
vọng đang đợc khảo nghiệm để phát triển thành giống.
Viện Di truyền Nông nghiệp đã trao đổi nguồn gen với các đồng nghiệp quốc
tế và nhập nội các dòng ngô có khả năng tái sinh cao dùng để chuyển gen. Viện đã

tiến hành lai các dòng nhập nội này với các giống ngô Việt Nam để chuyển nguồn
gen có khả năng tái sinh cao, thích hợp cho chuyển gen vào ngô Việt Nam. Quy
trình tái sinh cây từ phôi non các dòng ngô nhập nội có khả năng tái sinh cao đã
đợc nghiên cứu hoàn thiện.
1.4. Các nghiên cứu chuyển gen ở cây ngô
Trên cơ sở chuyển gen vào tế bào trần ở ngô nhiều quy trình chuyển gen
khác nhau ở ngô đã đợc thiết lập. Những thành công đầu tiên đợc tiến hành bằng
các phơng pháp xung điện hay sử dụng polyethylene glycol. Tuy nhiên, hệ thống
tái sinh từ tế bào trần ở ngô có hiệu quả rất thấp do thời gian tạo tế bào huyền phù
lâu, trong khi đó khả năng tái sinh của tế bào giảm nhanh cùng với thời gian nuôi
(Fromm & CS, 1985; Rhodes & CS, 1988) [53], [88].
Nghiên cứu của Graves và Goldman (1986) [57] cho thấy các tế bào phôi và
tế bào lá mầm của hạt ngô nảy mầm đã đợc lây nhiễm với Agrobacterium để tạo ra
các cây chuyển gen. Shen & CS (1993) [96] đã nhận đợc cây ngô chứa gen ngoại
lai GUS thông qua phơng pháp chuyển gen gián tiếp Agrobacterium. Ishida & CS
(1996) [67] đã thành công trong chuyển gen vào phôi non bằng cách lây nhiễm với
Agrobacterium. Nghiên cứu của Yuji và CS (1996) [30], biến nạp gen có hiệu quả
Báo cáo Tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề ti

13
đối với dòng ngô A188 ở giai đoạn hợp tử, với tần số biến nạp đạt 5-30%, phần lớn
các thể biến nạp đã thể hiện rõ sự phát sinh hình thái bình thờng, trên 70% cá thể
trổ cờ, phun râu tốt. Các con lai F1 giữa A188 và 5 dòng nội phối khác mang gen
ngoại lai ở tần số thấp. Đặc biệt với nghiên cứu gần đây nhất của Frame và CS
(2002) [51] đã thu đợc các cây ngô chuyển gen (tần số biến nạp gen đạt 5,5%) khi
sử dụng dòng lai Hi II và chủng A. tumefaciens EHA 101 mang vectơ nhị phân chứa
gen bar và gen gus.
Các yếu tố ảnh hởng tới hiệu quả chuyển gen cũng đã đợc tối u hoá
(chủng Agrobacterium, kiểu gen thực vật, thành phần môi trờng nuôi cấy, nhiệt
độ ) (Kaeppler & CS, 2001) [71].

Năm 1996, Artzen đã tìm ra phơng pháp tăng cờng hiệu quả chuyển gen ở
cây một lá mầm thông qua Agrobacterium bằng cách làm tổn thơng mô trớc khi
lây nhiễm.
1.5. Một số hớng mới nhằm cải tạo giống ngô
1.5.1. Chọn tạo giống chín sớm
Do mùa hè ở các nớc Tây Âu ngắn nên thời gian sinh trởng của ngô bị hạn
chế hơn so với các vùng trồng ngô ở Mỹ và Nam Âu. Vì thế, việc tạo ra các giống
ngô ngắn ngày là mối quan tâm chung của các nhà nghiên cứu trên thế giới.
ở Việt nam, với đặc thù của nền nông nghiệp luân canh nhiều vụ nên ngô
thờng đợc trồng xen giữa hai loài cây trồng khác do vậy mà các nhà chọn giống
Việt nam cũng rất quan tâm đến các giống ngô ngắn ngày (giống ngắn ngày không
làm ảnh hởng đến vụ thu hoạch trớc và sau ngô).
Một trong những hớng mới trong chọn tạo các giống ngô ngắn ngày là
phơng pháp sử dụng kỹ thuật di truyền để xác định các gen liên quan tới quá trình
điều khiển thời gian ra hoa và sử dụng các gen này để biến đổi các dòng chín muộn
thành các giống chín sớm.
Một trong những gen có tiềm năng rút ngắn thời gian sinh trởng của cây
trồng là phân đoạn ADN đợc tách chiết từ Sinapis alba - FPF1 - Flower Promoting
Báo cáo Tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề ti

14
Factor. Sau khi chuyển vào Arabidopsis thailiana đã rút ngắn rất đáng kể thời gian
sinh trởng của Arabidopsis. Nhiều phòng thí nghiệm đang nghiên cứu chuyển gen
này vào cây ngô cũng nh các loại cây trồng khác nhằm rút ngắn thời gian sinh
trởng của cây.
1.5.2. Chọn tạo giống có khả năng chịu lạnh
Tác động lạnh là một vấn đề chính ảnh hởng đến sản xuất ngô ở các vùng
ôn đới. Khả năng mẫn cảm với nhiệt độ lạnh ở ngô là do nguồn gốc nhiệt đới của
nó. Nhiệt độ lạnh là nhiệt độ từ 5-16
0

C ảnh hởng không tốt đến cây ngô con trong
giai đoạn sinh trởng đầu tiên, ảnh hởng tới sự hình thành lá và sự phát triển của
bộ máy quang hợp trong sinh trởng dị dỡng của cây con mới nảy mầm (Artus &
CS, 1996; Jaglo-Ottosen & CS, 1998) [21], [68].
Các yếu tố stress của môi trờng nh nhiệt độ thấp, mất nớc đều dẫn đến
tổn thơng màng tế bào hoặc làm tăng các radical tự do trong tế bào. Một số gen
mã hoá các protein làm ổn định cấu trúc màng hay tiêu diệt các radical tự do nh
dehydrine, superoxy dismutase, peroxidase, catalase là những gen hiện nay đang
đợc quan tâm để tách chiết và chuyển vào cây trồng với mục đích làm tăng khả
năng chống chịu đối vơi các điều kiện bất lợi của môi trờng (Stamp, 1994;
Thomashow, 1998) [101], [103].
1.5.3. Tăng cờng khả năng hấp thụ ni tơ
ở các nớc công nghiệp, việc sử dụng phân nitơ ngày càng tăng trong vài
thập kỷ qua. Điều này dẫn đến làm ô nhiễm nớc bề mặt bởi nitrat. Bên cạnh các
yếu tố về môi trờng, việc nhập khẩu phân bón cũng cần phải đợc xem xét. Cộng
đồng châu Âu đang giảm dần trợ cấp giá cho các sản phẩm nông nghiệp. Hậu quả
của các yếu tố này là lợi nhuận của việc nhập khẩu phân bón đang giảm. Do vậy cải
tạo cây trồng với việc cải thiện hiệu quả sử dụng nitơ là rất cần thiết để đáp ứng nhu
cầu của hệ thống sản xuất nông nghiệp trong tơng lai (Engels & Marschner, 1995)
[47].
Các nghiên cứu về ngô nhiệt đới và ngô Corn-Belt cho thấy chọn giống ngô
thích nghi với điều kiện thiếu nitơ là có thể thực hiện đợc. Các nghiên cứu về hiệu
Báo cáo Tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề ti

15
quả sử dụng nitơ ở trờng Đại học Hohenheim (Đức) cũng đã khẳng định rằng khả
năng thay đổi về mặt di truyền thích nghi với hàm lợng nitơ trong đất thấp tồn tại
sẵn trong các giống ngô lai châu Âu (Agrama & CS, 1999) [17]. Các giống ngô có
kiểu gen cố định nitơ có khả năng quang hợp cao hơn và kết hạt tốt hơn so với các
giống ngô trồng trong điều kiện cung cấp nitơ cao. Thời kỳ ra hoa và giai đoạn ngắn

sau khi ra hoa là giai đoạn phát triển quan trọng cần nhiều nitơ (Presterl & CS,
1997) [83].
Các nhà khoa học Đức ở các công ty KWS và Planta hiện nay đã phân lập
đựơc các gen khử nitơ, gen vận chuuyển nitrat, gen vận chuyển ammonium, urea,
aminoacid, gen nitrate reductase. Một trong các gen này sẽ đợc lựa chọn để
chuyển vào ngô.
Báo cáo Tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề ti

16
Chơng 2.
Lựa chọn đối tợng v phơng pháp nghiên cứu

2.1. Mục tiêu của đề ti
Đề tài tập trung giải quyết các mục tiêu và nội dung nghiên cứu sau đây:
Xây dựng quy trình chuyển gen hiệu quả cao ở ngô (tại Việt nam) và lúa mỳ (tại
CHLB Đức) sử dụng phơng pháp biến nạp thông qua Agrobacterium và súng bắn
gen. Trên cơ sở đó thực hiện việc chuyển các gen ngắn ngày, gen tăng cờng hấp
thụ nitơ, gen chịu lạnh và một số gen kháng bệnh khác vào ngô và lúa mỳ nhằm
mục đích cải thiện các đặc tính chất lợng quan trọng ở hai cây trồng quan trọng
này.
2.2. Nội dung nghiên cứu cần thực hiện
2.2.1. Tách chiết và tái tổ hợp gen, thiết kế vectơ mang gen
Các vectơ mang gen chỉ thị (gus, gfp) & gen chọn lọc nptII, các gen chín sớm,
gen chịu lạnh, gen tăng cờng khả năng hấp thụ nitơ, do phía đối tác là Công ty
KWS/PLANTA (CHLB Đức) thiết kế. Các vectơ chuyển gen này sẽ đợc chuyển
giao cho Viện Di truyền Nông nghiệp để chuyển vào cây ngô.
2.2.2. Xây dựng hệ thống tái sinh và biến nạp di truyền
Nội dung nghiên cứu của đề tài đợc tiến hành trên hai đối tợng cây trồng:
ngô và lúa mỳ, trong đó Viện Di truyền Nông nghiệp (Việt Nam) sẽ thực hiện các
nghiên cứu trên cây ngô, Trung tâm nghiên cứu PLANTA/KWS (CHLB Đức) sẽ

triển khai các nghiên cứu ở cây lúa mỳ.
2.2.2.1. Xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non và mô đơn bội ở ngô
2.2.2.1.1. Tái sinh cây từ phôi non
Các dòng ngô H99 và A188 là những dòng ngô có khả năng tái sinh cây từ
phôi non rất cao. Phần lớn các công trình chuyển gen ở ngô trên thế giới đều dựa
vào hệ thống tái sinh của 2 dòng này hoặc các con lai của chúng.