Khảo sát các điều kiện tách chiết hợp chất có hoạt tính sinh học asiaticoside trong rau má (centella asiatica)

PHẦN 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ xa xưa con người đã biết biết tận dụng nguồn thực vật phong phú
trong thiên nhiên để làm dược thảo chữa các bệnh thông thường.
Theo thời gian cùng với sự phát triển của các ngành khoa học kĩ thuật
thì dược tính của các bài thuốc từ thực vật ngày càng được chứng tỏ và càng
sử dụng rộng rãi. Với tính chất dễ kiếm lại ít gây tác dụng phụ cho con người
các loài thực vật trong thiên nhiên đã thu hút được sự quan tâm của các nhà
nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực. Trong các loài thực vật được quan tâm
nghiên cứu có rau má.
Rau má (Centella asiatica) hay còn gọi là tích tuyết thảo, thường được
chế biến theo nhiều cách khác nhau để làm ra các món ăn thức uống bổ mát
như ép nước hoặc các loại trà giải khát có tác dụng thanh nhiệt, giải độc dùng
rất tốt trong mùa hè hay để chế biến thành những món ăn hằng ngày.
Theo y học cổ truyền, rau má có vị đắng, hơi ngọt, tính bình, có tác
dụng dưỡng âm, thanh nhiệt, nhuận gan, giải độc, lợi tiểu. Rau má thường
được dùng để làm thuốc bổ dưỡng, sát trùng, chữa thổ huyết, tả lỵ, khí hư,
bạch đới, mụn nhọt, rôm sẩy, giúp vết thương mau lành [4], [23].
Theo những nghiên cứu của y học hiện đại từ những năm 1940 đã nêu
ra thì rau má có chứa nhiều những hoạt chất thuộc nhóm saponins (còn được
gọi là tripernoids) bao gồm asiaticoside, madecassoside, madecassic acid và
asiatic acid có thể chữa được nhiều bệnh như tim mạch, các bệnh về da hay
một số loại bênh ung bướu…[17], [23]. Trong đó hoạt chất asiaticoside đã
được ứng dụng trong điều trị bệnh phong và bệnh lao [23].
Ngoài ra, trong rau má còn còn chứa một số các hợp chất ursolic,
oleanolic và boswellic acid, các triterpenes liên hệ đến asiatic acid (là chất
terpene chính có trong rau má) mà các nghiên cứu về tác dụng của chúng
trong vấn đề ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư cũng đã được tiến hành
(Journal of Ethnopharmacology Số 48-1995)
1
Mặt khác, rau má do có đặc điểm dễ trồng khả năng phát triển nhanh

nên việc mở rộng diện tích và tăng năng suất tương đối lớn. Hiện nay một vài
nơi trồng đại trà rau má để bán làm rau ăn, làm thuốc và nguyên liệu chế biến
nước giải khát.
Khả năng phát triển về sản lượng cùng với những lợi ích mà cây rau má
có thể đem tới cho con người nói chung và các ngành khoa học nói riêng thì
việc tiến hành những nghiên cứu nhằm gia tăng lợi ích sử dụng của cây rau
má là hết sức cần thiết.
Từ những vấn đề trên chúng tôi đã chọn đề tài: “Khảo sát các điều
kiện tách chiết hợp chất có hoạt tính sinh học asiaticoside trong rau má
(Centella asiatica)” với nguồn nguyên liệu từ xã Quảng Thọ, huyện Quảng
Điền, tỉnh Thừa Thiên Huế để thu nhận hợp chất sinh học có lợi này trong rau
má với mục đích chính tìm hướng sản xuất nguyên liệu bổ sung và góp phần
phát triển các loại thực phẩm chức năng sau này.
2
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cây rau má
Rau má Centella asiatica là loài rau dại mọc tương đối phổ biến ở các
vùng đất nhiệt đới đặc biệt là ở Châu Á. Mỗi vùng thường có một cái tên
riêng biệt như: Tích tuyết thảo (Trung Quốc), Phanok (Lào), Trachiek - kranh
(Miên), và Gotu-kola (SriLanka), Pegagan (Indonesia), Takip - kohol
(Philippine), hay Bua-bok (Thái Lan). Tiếng Anh gọi là Pennywort Tuy tên
gọi mỗi vùng khác nhau nhưng chúng đều thuộc loài Centella asiatica và có
nhiều tác dụng tốt đối với con người [4], [31].
1.1.1. Vị trí phân loại
Theo phân loại khoa học:
Giới: Plantae
Bộ: Apiales
Họ : Apiaceae
Phân họ : Mackinlayoideae

Chi : Centella
Loài : C. asiatica
1.1.2. Đặc điểm phân bố Hình 1.1. Cây rau má
Rau má Centella asiatica là loài thực vật mọc bò lan trên mặt đất có lá
trông giống như những đồng tiền tròn được xếp nối tiếp nhau nên còn gọi là
Liên tiền thảo, thích hợp mọc ở những nơi ẩm ướt như thung lủng, bờ
mương, ruộng thuộc những vùng đất nhiệt đới.
Ở Việt Nam, rau má mọc hoang khắp nơi, thường gặp ở các bãi cỏ,
bờ ruộng, ven suối, sườn đồi, quanh các làng bản, những vùng ẩm ướt.
Rau má có thể thu hái cả bốn mùa nên khả năng nhân rộng diện tích và
tăng năng suất dễ dàng.
Việc trồng rau má không đòi hỏi đầu tư nhiều và việc chăm sóc tương
đối nhẹ nhàng. Người ta thường chỉ trồng rau má một lần là có thể thu hoạch
trung bình trong 10 năm. Ở chân đất bùn, rau má có thể đạt năng suất 1-1.2
tấn/ 500m
2
/ lứa thu hoạch, ở chân đất cao thì năng suất chừng 500kg/ 500m
2
/
3
lứa. Mỗi năm có thể thu hoạch 7-10 lứa, và thường thời gian còn lại thì nông
dân tiến hành làm cỏ. Giá bán rau má khoảng 4000- 8000 đồng/ kg [29].
1.1.3. Đặc điểm hình thái
Thân cây rau má gầy và nhẵn, thuộc loại thân bò lan, màu xanh lục hay
lục ánh đỏ, có rễ ở các mấu. Nó có các lá hình thận, màu xanh với cuống dài và
phần đỉnh lá tròn, kết cấu trơn nhẵn với các gân lá dạng lưới hình chân vịt. Các
lá mọc ra từ cuống dài khoảng 5-20 cm. Bộ rễ bao gồm các thân rễ, mọc thẳng
đứng có màu trắng kem và được che phủ bằng các lông tơ ở rễ [2], [4], [7].
Hoa rau má có màu từ ánh hồng tới đỏ, mọc thành các tán nhỏ, tròn gần
mặt đất. Mỗi hoa được bao phủ một phần trong 2 lá bắc màu xanh. Các hoa

lưỡng tính này khá nhỏ (nhỏ hơn 3mm), với 5-6 thùy tràng hoa. Hoa có 5 nhị
và 2 vòi nhụy, quả có hình mắt lưới dày đặc. Quả của nó chín sau 3 tháng và
toàn bộ cây, bao gồm cả rễ, được thu hái thủ công [2].
1.1.4. Thành phần hóa học
Một số nghiên cứu phân tích cho thấy thành phần hóa học của rau má
gồm: nước 88.2%, protein 3.2%, carbohydrate 1.8%, cellulose 4.5%; theo mg
%: calcium 2.29%, phosphorus 2%, iron 3.1%, β-caroten 1.3%, vitamin B1
0.15% và vitamin C 37%. Ngoài ra còn có sterol, saponin, alkaloid, flavonol,
saccharide, magnesium, manganese, potassium, zinc, các loại vitamin, B2,
B3, B
6
và K. Tuỳ theo khu vực trồng hoặc mùa vụ thu hoạch mà tỷ lệ các hoạt
chất trong rau má có thể sai khác nhau [7] [14] [23].
Toàn bộ cây rau má đều chứa tinh dầu, dầu béo. Chất béo chủ yếu
là glyceride của các loại acid: oleic, linolic, linolenic, lignoceric, palmitic
và stearic. Trong rau má còn chứa một lượng alkaloid hydrocotylin, chất
đắng vellarin và đặc biệt là glucoside asiaticoside. Lượng asiaticoside này
khi thủy phân cho asiatic acid và glucose, rhamnose [2] [4] [7]. Hàm
lượng asiaticoside trong mô rau má theo từng bộ phận khác nhau sẽ chiếm
các tỷ lệ khác nhau.
Trong thành phần hóa học của rau má, nhóm saponin hay còn gọi là
triterpene được xem là nhóm chất đặc biệt có ý nghĩa nhất, nó bao gồm triterpene
acid và triterpene glycoside. Triterpene acid có chứa asiatic acid, brahmic acid,
isobrahmic acid, madecassic acid, và betulinic acid. Còn hợp chất triterpene
4
glycoside có chứa asiaticoside, madecassoside, brahmoside, brahminoside và
thankuniside [21]. Đây là nhóm những hoạt chất được nghiên cứu khá nhiều trong
lĩnh vực y dược nhằm phục vụ việc chữa bệnh cho con người.
1.1.5. Tác dụng dược lý và công dụng của cây rau má
Rau má là loại rau tương đối phổ biến thường thu hái loại rau má riêng

lẻ, cả lá và dây, rửa sạch, làm món rau sống trong bữa ăn hoặc có thể giã nát
(hoặc xay) vắt lấy nước, bỏ thêm ít đường uống giải nhiệt, giải khát trong
những ngày nắng nóng, hay dùng để làm các bài thuốc trị bệnh thông thường
cảm cúm, sốt, nhức đầu, viêm họng, cổ đau.
Theo y học cổ truyền, rau má có vị đắng, hơi ngọt, tính bình, vào Can,
Tỳ Vị có tác dụng dưỡng âm, thanh nhiệt, nhuận gan, giải độc, lợi tiểu. Rau
má thường dùng để làm thuốc bổ dưỡng, sát trùng, chữa thổ huyết, tả lỵ, khí
hư, bạch đới, mụn nhọt, rôm sẩy.
Rau má có chứa nhiều hoạt chất rất tốt có thể chữa được nhiều bệnh:
Đối với thần kinh
Một số hoạt chất trong rau má như bracoside B có tác dụng lên hoạt
động của hệ thần kinh trung ương, tăng cường các chất chuyển hóa
(neurotransmitters), làm giảm căng thẳng tâm lý, tăng cường khả năng tập
trung tư tưởng và giúp cải thiện trí nhớ của người già. Người ta cho rằng dịch
chiết rau má có hiệu quả tốt với bệnh Alzheimer nhờ vào những dẫn xuất của
chất asiaticoside có khả năng bảo vệ các tế bào thần kinh khỏi tác động của
các độc tố beta-amyloid [2] [10].
Đối với tim mạch
Hoạt chất bracoside A kích thích sự bài tiết nitric oxide của mô để làm
dãn nở vi động mạch cùng mao quản, nên lượng máu di chuyển qua mô được
nhiều hơn nên có khả năng chấm dứt được các cơn đau tim, đồng thời các
chất độc dễ được đào thải giúp tế bào sống thoải mái trong một môi trường
lành mạnh. Khám phá quan trọng này mang lại giải thưởng Nobel về Y năm
1998 cho 3 Giáo Sư Hoa Kỳ R. Furchgott, L. Ignarro và F. Murad [31].
Trong tuần hoàn huyết, những hoạt chất của rau má có tác dụng cải
thiện vi tuần hoàn ở các tĩnh mạch, mao mạch, bảo vệ lớp áo trong của thành
mạch và làm gia tăng tính đàn hồi của mạch máu. Do đó rau má cũng thường
5
được dùng trong các chứng tăng áp lực tĩnh mạch ở các chi dưới. Trong thực
tế người ta thường uống dịch rau má để trị các bệnh về tĩnh mạch như sa tĩnh

mạch hoặc sưng phù ở chân.
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy các hoạt chất nằm ở trong chất xơ
(cellulose) của rau má, nếu chúng ta chỉ giã vắt lấy nước, bỏ phần bả thì sẽ
mất đi các hoạt chất này. Một số công trình nghiên cứu khác còn cho thấy các
chất xơ có thể "kéo" cholesterol ra khỏi cơ thể nên cũng có tác dụng rất tốt
với tim mạch, vì vậy nếu ăn các loại rau có nhiều chất xơ sẽ giúp cơ thể đào
thải dần lượng cholesterol ra khỏi cơ thể [2].
Đối với da
Vì tác dụng vào tuần hoàn và làm tế bào da vững mạnh nên rau má
cũng được ứng dụng dùng làm kem bôi mặt ở Pháp để làm bớt những vết
nhăn cho nét mặt được trẻ trung.
Theo nhiều công trình nghiên cứu và kết quả lâm sàng đều cho thấy dịch
chiết rau má có khả năng kích hoạt các tiến trình sinh học trong việc phân chia tế
bào và tái tạo mô liên kết giúp vết thương chóng lành và mau lên da non. Hiện
nay các chế phẩm từ rau má đã được sử dụng rất đa dạng dưới nhiều hình thức
thuốc tiêm, thuốc bột, thuốc mở để điều trị tất cả các chứng bệnh về da như vết
bỏng, vết thương do chấn thương, do giải phẩu, cấy ghép da, những vết lở loét
lâu lành, vết lở do ung thư, bệnh phong, vẩy nến [2] [20] [27]…
Đối với bệnh ung thư
Phần dịch chiết chứa các triterpenoids của rau má được cho là có khả
năng tiêu diệt được các tế bào ung thư loại lymphoma Dalton và Ehrlich,
nhưng vẫn chưa xác định chính xác là loại triterpenoid nào. Và các nghiên
cứu về cấu trúc hóa học của các triterpenoid trong Centella cũng được đánh
giá có thể chống được ung thư (nhờ vào hoạt tính đối kháng hoạt động
collagen )[30] [32].
Trong rau má, các triterpenoids loại ursane như ursolic và oleanolic
acid có hoạt tính diệt bào mạnh. Các nghiên cứu ‘in vitro’ về ursolic và
oleanolic acid ghi nhận khả năng ngăn chặn sự phát triển của một số dòng tế
bào ung thư có liên quan tới hoạt tính diệt bào của các acid này (Anticancer
Research Số 16-1996 và Cancer Letter Số 10-1996).

6
Cả oleanolic acid và ursolic acid đều làm giảm sự sinh sản của tế bào
nội mạc (Planta Medica Số 64-1998) nên có thể sẽ hữu dụng để trị ung thư
bằng cách ngăn chặn tiến trình angiogenesis (tiến trình tăng trưởng của các
mạch máu tân tạo để nuôi dưỡng tế bào tân sinh) cần đến sự sinh sản của các
tế bào nội mạc để tạo ra các mạch máu mới.
Các acid oleanolic và ursolic cũng có các tác động chống u bướu (in
vivo) (Cancer Letter Số 111-1997). Vì vậy ở Nhật một đặc chế của các chất
này được dùng để trị ung thư máu loại leukemia nonlymphatic.
Một acid khác cũng được xếp vào nhóm hợp chất triterpenoid (như
asiatic acid) có trong rau má là boswellic acid. Acid này đã được nghiên cứu
khá nhiều và đã được ghi nhận về khả năng ức chế sự sinh sôi nẩy nở và tạo
ra sự phân cắt của các dòng tế bào ung thư hệ thần kinh trung ương và ung
thư leukemia [30].
Thực tế có một nghiên cứu xác định được tính chất diệt bào của
boswellic acid. Có ít nhất ba nghiên cứu trên các u bướu thú vật ghi nhận
boswellic acid có khả năng ức chế sự tăng trưởng của các tế bào ung thư não
và ung thư leukemia được chuyển sang cho loài gậm nhấm. Có 2 nghiên cứu
thực hiện nơi người cho thấy dịch chiết từ Boswellia hay boswellic acid có
khả năng làm giảm sự phù nơi não nên có thể có hoạt tính điều trị bổ sung
trong các trường hợp ung thư não [30].
Asiaticoside một hoạt chất chiếm hàm lượng tương đối lớn trong rau
má cũng đã góp phần không nhỏ ngặn chặn sự phát triển của các tế bào ung
thư. Người ta cho rằng khi hấp thụ vào cơ thể asiaticosie sẽ phân cắt tạo thành
khoảng 62% asiatic acid và các glycosid. Asiatic acid này cũng có thể có các
hoạt tính tốt như oleanolic acid và ursolic [31].
Ngoài những tác dụng trên thì rau má còn có tác dụng trị khớp. Trong
những năm gần đây, nhiều phương tiện thông tin đã phổ biến cách chữa bệnh
thấp khớp mãn tính bằng cách ăn hai lá rau má tươi mỗi ngày. Một chương
trình phóng sự của đài truyền hình số 9 ở Sydney công bố vào tháng 12/2003

cũng cho biết một số người ở Úc đã chữa khỏi bệnh thấp khớp bằng cách
này. Phương pháp này phát xuất từ quyển sách “Arthritis and Paradoxycal
Pennywort” (Bệnh thấp khớp và lá rau má) của ông Russ Maslen [24] [32].
7
Ở Việt Nam, hiện nay các công ty dược phẩm đã nghiên cứu và sản
xuất nhiều loại thuốc có nguồn gốc từ rau má, đặc biệt là hàm lượng vitamin
trong rau má có tác dụng chữa trị nhiều loại bệnh, ứng dụng vào lĩnh vực
dược phẩm, thực phẩm, kết quả định luợng vitamin trong rau má được phân
tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao áp, hàm lượng vitamin trong rau má trồng
tại Việt Nam là: 128.6 mg vitamin B1, 73.6mg vitamin B2, 384.1 mg vitamin
B6, 532.9 mg vitamin C, 741.5 mg vitamin PP [7].
1.2. Tổng quan về các hoạt chất sinh học asiaticoside
1.2.1. Khái niệm về asiaticoside
Theo nhiều nguồn tài liệu nghiên cứu thì rau má có chứa rất nhiều hoạt
chất sinh học có lợi cho con người trong đó asiaticoside được xem một chất
điển hình với nhiều công dụng.
Asiaticoside có [25] [17]:
Công thức phân tử: C
48
H
78
O
19
Khối lượng phân tử: 959.12 g/mol
Cấu trúc phân tử
Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của asiaticoside
1.2.2 Tính chất lý hóa của asiaticoside
Asiaticoside tan tốt trong cồn, sản phẩm tinh thể hình kim màu trắng,
nhiệt độ nóng chảy là 230÷233
o

C [4] [14].
1.2.3. Tác dụng dược học của asiaticoside
Từ những năm 1940, y học hiện đại bắt đầu nghiên cứu những tác dụng
của rau má. Những hợp chất chính có giá trị ở rau má là asiaticoside,
8
madecassoside và asiatic acid đã được phát hiện, nghiên cứu và ứng dụng.
Trong đó có asiaticoside là một triterpene glycoside nó được xem như một
kháng sinh. Asiatociside giúp chữa lành vết thương nhanh chóng nhờ vào cơ
chế kích thích tạo collagen và sự tổng hợp glycosaminoglycan [2] [14].
Hoạt chất asiaticoside cũng đã được ứng dụng trong điều trị bệnh
phong và bệnh lao. Người ta cho rằng trong những bệnh này, vi khuẩn được
bao phủ bởi một màng ngoài giống như sáp khiến cho hệ kháng nhiễm của cơ
thể không thể tiếp cận. Chất asiaticoside trong dịch chiết rau má có thể làm
tan lớp màng bao này để hệ thống miễn dịch của cơ thể tiêu diệt chúng [2]
[14] [27].
Năm 1990, Maquart và cs đã có công trình nghiên cứu công bố khả
năng làm lành vết thương bị lở loét của asiaticoside. Dược tính đáng kể của
hoạt chất này là giảm bớt kích thước của vùng vết thương trên da ở lưng
chuột sau 9 ngày thử nghiệm [14].
Theo nghiên cứu của Inhee và cs (1999) cho thấy, các dẫn xuất của
chất asiaticoside có khả năng bảo vệ thần kinh, chống lại độc tố β-amyloid
gây hại đối với nơtron thần kinh. Ba trong số 28 dẫn xuất của asiaticoside có
thể được đưa vào nghiên cứu điều trị bệnh Alzheimer nhờ khả năng bảo vệ
các tế bào thần kinh khỏi tác động của β-amyloid. Một số báo cáo được xuất
bản từ 1967 đến 1999 mô tả việc sử dụng thuốc mỡ chứa đựng những liều cao
từ 0,1-0,2% dịch chiết của rau má để tăng cường phục hồi vết thương bị bỏng
[11] [13].
Asiaticoside kích thích hệ reticuloendothelial nên sức miễn nhiễm của
cơ thể được mạnh hơn. Asiaticoside giúp tế bào da chống oxy hóa, phát triển
mô liên kết, nên làm mạnh tế bào da, mô da căng trẻ, và giúp cho vết mổ, vết

loét mau lành [31].
Trong kết quả nghiên cứu của Boiteau và cs (2001), tác dụng của
asiaticoside được tìm thấy đó là tiềm năng làm giảm trầm cảm ở chuột.
Những thử nghiệm được tiến hành trên chuột và những kết quả cho thấy rằng
asiaticoside có thể có hoạt động giống như chất chống trầm cảm, giúp chuột
hoạt động, nhận và xử lý thông tin nhanh hơn [20] .
9
Nghiên cứu của Mahato (2000) và cs đã thí nghiệm tác dụng của
asiaticoside trên chứng bệnh sưng phù và viêm khớp. Asiaticoside có trong
dịch chiết đã làm giảm bớt bàn chân phình của chuột thử nghiệm. Kiểm tra
hoạt dịch tại điểm viêm khớp trên chân chuột cho thấy sự thoái hóa sụn khớp
do sự tăng sản sinh những tế bào viêm ở chuột được ức chế bởi asiaticoside.
Cơ chế tích cực của asiaticoside có thể liên quan đến việc ngăn chặn sự tăng
nhanh của bạch cầu [14] [20].
1.3. Tổng quan về tách chiết hoạt chất sinh học
1.3.1.Khái niệm
Tách chiết còn gọi là trích ly là quá trình tách một hay một số chất tan
trong chất lỏng hay chất rắn bằng một chất lỏng khác còn gọi là dung môi.
Nếu quá trình tách chất hòa tan trong chất lỏng bằng một chất lỏng khác gọi là
trích ly lỏng - lỏng. Nếu quá trình tách chất hòa tan trong chất rắn bằng một
chất lỏng thì gọi là trích ly rắn- lỏng [1] [8].
1.3.2. Mục đích của quá trình trích ly
Tách được các cấu tử quý.
Thu được dung môi có nồng độ đậm đặc (đối với trích ly lỏng- lỏng).
Cũng như chưng luyện trích ly là một trong những phương pháp chủ
yếu để phân tách một hỗn hợp đồng nhất thành các cấu tử thành phần.
Trích ly kết hợp với quá trình khác như ép nhằm nâng cao hiệu suất thu
hồi sản phẩm.
1.2.3.3. Yêu cầu của dung môi trong trích ly
Chất lượng và hiệu quả của quá trình trích ly phụ thuộc chủ yếu vào

dung môi, nên yêu cầu dung môi:
Có tính hòa tan chọn lọc, nghĩa là chỉ hòa tan cấu tử cần tách,
không hoặc hòa tan rất ít các cấu tử khác.
Không độc, không ăn mòn thiết bị.
Rẻ tiền, dễ kiếm.
Không có khuynh hướng hình thành nhũ tương. Không có phản
ứng thuận nghịch giữa dung môi và chất tan.
Dễ dàng tách chất cần tách ra khỏi dung môi.
10
1.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly
1.3.4.1. Nồng độ của dịch trích ly
Thực chất quá trình trích ly là quá trình khuyếch tán, nên đòi hỏi có sự
chênh lệch nồng độ giữa pha lỏng (dung môi) với pha chứa chất cần trích ly.
Khi nồng độ các chất hòa tan trong dung môi thấp thì lượng chất trích
ly từ nguyên liệu tăng, thời gian trích ly giảm. Vì vậy để đảm bảo quá trình
trích ly tốt người ta thường thực hiện tăng tỷ lệ dung môi so với nguyên liệu.
1.3.4.2. Đặc điểm của nguyên liệu
Vật liệu rắn có kích thước càng nhỏ thì khả năng trích ly càng lớn do
diện tích tiếp xúc giữa chúng và dung môi tăng lên tạo điều kiện cho quá trình
trích ly dễ dàng hơn. Phương pháp nghiền nhỏ hay băm nhỏ là phương pháp
thường áp dụng, tuy nhiên nếu kích thước vật liệu quá nhỏ cũng gây trở ngại
cho quá trình trích ly vì nó có thể làm tắc các ống mao dẫn và làm phức tạp
cho các quá trình xử lý tiếp theo.
Ngoài ra cấu trúc bên trong hay thành phần hóa học, tính chất của vật
liệu cũng ảnh hưởng đến quá trình trích ly, nếu độ ẩm cao thì nước có thể
tác dụng với thành phần protein và các chất háo nước khác có thể ngăn cản
sự di chuyển của dung môi thấm sâu vào nguyên liệu làm chậm quá trình
khuyếch tán. Hay đối với vật liệu non, mềm thì dung môi thấm vào dễ dàng
nên khi xay chỉ cần xay thô không cần xay mịn để tránh trích ly nhiều tạp
chất vào dịch chiết…

1.3.4.3. Nhiệt độ
Nhiệt độ có tác dụng làm tăng khả năng khuyếch tán và giảm độ nhớt
của dung môi, phần tử hòa tan có thể chuyển động khuyếch tán dễ dàng giữa
các phân tử dung môi. Tuy nhiên nhiệt độ là một yếu tố giới hạn vì có khả
năng gây ra các phản ứng không mong muốn.
Đối với những chất kém bền ở nhiệt độ cao: nhiệt độ tăng cao sẽ gây
phá hủy một số chất như vitamin, glycosid, akaloid…
Đối với tạp chất: khi nhiệt độ tăng không những độ tan của hoạt chất
tăng mà độ tan của các tạp chất cũng tăng, dịch chiết sẽ có nhiều tạp. Nhất là
đối với một số hợp chất như các chất nhầy… khi nhiệt độ tăng sẽ bị trương
nở, tinh bột hồ hóa, độ nhớt của dịch sẽ tăng gây khó khăn cho quá quá trình
chiết xuất và tinh chế.
11
Đối với dung môi dễ bay hơi khi nhiệt độ tăng thì dung môi dễ hao hụt
khi đó để khắc phục thiết bị phải kín và có có bộ phận thu hồi dung môi.
Đối với một số chất đặc biệt có quá trình hòa tan tỏa nhiệt: khi nhiệt độ
tăng độ hòa tan của chúng giảm do đó để tăng độ hòa tan ta phải giảm nhiệt độ.
Tùy thuộc vào loại nguyên liệu, loại dung môi, phương pháp chiết
xuất… mà lựa chọn nhiệt độ chiết thích hợp.
1.3.4.4.Thời gian
Thời gian trích ly dài thì hàm lượng chất trích ly tăng nhưng việc kéo
dài thời gian phải có giới hạn, nếu để mức độ trích ly đạt mức tối đa mà kéo
dài thời gian có thể sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế, và nếu trích ly ở điều
kiện nhiệt độ cao trong thời gian dài thì cũng gây ảnh hưởng đến sản phẩm
cần thu hồi. Thời gian chiết xuất chịu sự chi phối của loại nguyên liệu,
phương pháp chiết, nhiệt độ chiết, loại dung môi…
1.3.4.5. Khuấy trộn
Khi dung môi tiếp xúc với nguyên liệu dung môi sẽ thấm vào nguyên
liệu, hòa tan chất tan, chất tan sẽ khuyếch tán từ nguyên liệu vào dung môi
qua màng tế bào. Sau một thời gian khuyếch tán nồng độ chất tan trong tế bào

giảm, nồng độ chất tan trong dung môi tăng lên, chênh lệch nồng độ bên trong
và bên ngoài tế bào giảm dần làm cho quá trình khuyếch tán cũng giảm nên
quá trình trích ly chậm dần. Lúc này cần phải khuấy trộn để di chuyển lớp
dịch chiết ở phía sát màng tế bào ra xa và dung môi ở phía xa vào sát màng tế
bào để tạo ra sự chênh lệch nồng độ cho quá trình khuyếch tán.
1.3.5. Một số phương pháp chiết xuất dược liệu
Chiết xuất dược liệu nhằm mục đích thu nhận các hoạt chất có lợi tồn
tại trong dược liệu ở dạng tinh khiết có thể, để tạo nguồn nguyên liệu cung
cấp cho quá trình bán tổng hợp một số thuốc mới nhằm tăng ưu điểm cho
thuốc: Tăng tác dụng điều trị, giảm bớt các tác dụng phụ của thuốc hay tạo ra
những tác dụng mới. Ngoài ra nó còn làm cho việc bảo quản dược liệu dễ
dàng và lâu hơn, phương pháp kiểm nghiệm rõ ràng và có thể làm gia tăng
mục đích sử dụng.
12
1.3.5.1. Phân loại phương pháp chiết xuất
Có nhiều cách phân loại dựa vào các yếu tố sau:
Dựa vào nhiệt độ
Chiết nóng
Chiết nguội (chiết ở nhiệt độ thường)
Dựa vào chế độ làm việc của quá trình chiết
Chiết gián đoạn
Chiết liên tục
Chiết bán liên tục
Dựa vào chuyển động tương hỗ giữa hai pha
Ngược dòng
Xuôi dòng
Chéo dòng
Dựa vào áp suất
Áp suất thường
Áp suất giảm (áp suất chân kông)

Áp suất cao (làm việc có áp lực)
Dựa vào trạng thái của hai pha
Ngâm
Ngấm kiệt
Dựa vào những biện pháp kỹ thuật đặc biệt
Phương pháp siêu âm
Phương pháp tạo dòng xoáy
Chiết xuất bằng khí hóa lỏng siêu tới hạn
1.3.5.2. Một số phương pháp chiết xuất điển hình
Ngâm [3]
Là phương pháp đơn giản nhất và đã có từ thời cổ xưa. Dược liệu đã xử
lý sơ bộ người ta cho vào bình chiết xuất sau đó đổ dung môi ngập dược liệu,
ngâm một thời gian nhất định (tùy loại dược liệu), lấy dịch chiết rồi rửa lại bã
bằng dung môi thích hợp. Để tăng cường hiệu quả chiết rút có thể tiến hành
khuâý trộn hoặc tuần hoàn cưỡng bức dung môi.
Có nhiều cách ngâm: ngâm tĩnh, ngâm động, ngâm nóng, ngâm lạnh,
ngâm một hoặc nhiều lần.
13
Phương pháp này có ưu điểm thiết bị đơn giản, rẽ tiền, dễ thực hiện
nhưng nó cũng có nhiều nhược điểm như năng suất thấp, phải thao tác thủ
công. Nếu chỉ chiết xuất một lần thì hiệu suất thu hồi thấp, còn nếu chiết
nhiều lần thì tốn dung môi và thời gian.
Phương pháp chiết xuất ngấm kiệt [3]
Ngâm dược liệu vào dung môi trong bình ngấm kiệt sau một thời gian
xác định ta rút nhỏ giọt dịch chiết ở phía dưới, đồng thời bổ sung thêm dung
môi ở phía trên bằng cách cho dung môi chảy rất chậm và liên tục qua lớp vật
liệu nằm yên. Lớp dung môi trong bình chiết thường phải ngập lớp vật liệu
khoảng 3-4 cm.
Ngấm kiệt đơn giản: là phương pháp ngấm kiệt luôn sử dụng dung môi
mới để chiết đến kiệt hợp chất trong nguyên liệu.

Ngấm kiệt phân đoạn (tái ngấm kiệt): là phương pháp ngấm kiệt có sử
dụng dịch chiết loãng để chiết mẻ mới hoặc chiết các mẻ chiết có mức độ
chiết khác nhau.
Ưu điểm của phương pháp này là dược liệu được chiết kiệt hơn, đỡ tốn
dung môi hơn phương pháp ngâm.
Nhược điểm là năng suất thấp, phải thao tác thủ công, thao tác phức táp
hơn phương pháp ngâm. Đối với ngấm kiệt đơn giảm thì tốn nhiều dung môi.
Phương pháp chiết xuất ngược dòng [3]
Phương pháp chiết xuất ngược dòng: Là phương pháp sử dụng một số
chuỗi thiết bị chiết xuất, cho dung môi và dược liệu chuyển động ngược chiều
nhau trong thiết bị. Dịch chiết di chuyển trong thiết bị nhờ những cơ cấu
chuyên dùng khác nhau. Dược liệu trước khi lấy ra khỏi thiết bị được tiếp xúc
với dược liệu mới nên dịch chiết thu được đậm đặc hơn, bã dược liệu trước khi
ra khỏi thiết bị được tiếp xúc với dung môi mới nên bã được tách kiệt hơn.
Ưu điểm:
Năng suất làm việc cao, không phải thao tác thủ công.
Dịch chiết thu được đậm đặc.
Dược liệu được chiết kiệt, ít tốn dung môi.
Có thể cơ giới hóa, tự động hóa được quá trình.
Nhược điểm:
Thiết bị có cấu tạo phức tạp, đắt tiền, khó vận hành
14
Chiết xuất bằng khí hóa lỏng siêu tới hạn [23]
Phương pháp chiết xuất chất lưu siêu tới hạn (SFE): Là phương pháp
tận dụng chất lưu ở trạng thái siêu tới hạn làm chất chiết xuất, chiết xuất
thành phần hiệu quả trong dược liệu từ trong chất rắn hoặc chất lỏng rồi tiến
hành phân tách.
Chất lỏng siêu tới hạn hình thành khi nhiệt độ và áp suất vượt quá điểm
tới hạn (critical point). Ở trạng thái này, tỷ trọng của pha lỏng và pha khí bằng
nhau, ranh giới phân biệt giữa 2 pha biến mất.

CO
2
nhờ có các đặc điểm là bản thân không độc, không ăn mòn, điều
kiện tới hạn thích hợp nên trở thành chất lưu siêu tới hạn được dùng phổ biến
nhất trong phương pháp chiết xuất này.
CO
2
khi ở điểm tới hạn có nhiệt độ cao và áp suất cao sẽ chịu hai
khuynh hướng. Nhiệt độ cao thì sẽ bay hơi, áp suất cao thì hóa lỏng. Thế nên
ở khoảng nhiệt độ và áp suất nào đó, 2 pha khí và lỏng cùng tồn tại, đó là
trạng thái siêu tới hạn. Khi mang tính chất của chất khí (dễ khuyếch tán vào
chất rắn) và chất lỏng (hòa tan chất khác). Người ta thường cho CO
2
hóa lỏng
ở áp suất cao để tạo điều kiện trích ly các chất trong nguyên liệu rồi sau đó
giảm áp suất để CO
2
hóa khí để thu hồi tái sử dụng.
Phương pháp chiết này có ưu điểm:
Khả năng chiết tách cao.
Tốc độ phản ứng lớn.
Có khả năng tái sử dụng vì vậy chi phí rẻ hơn
An toàn, độ tinh khiết cao
Chiết siêu âm [3][29]
Phương pháp chiết xuất siêu âm: Là phương pháp ngâm chiết tận dụng
sóng siêu thanh tăng tần số và tốc độ vận động phân tử của vật chất, tăng khả
năng thẩm thấu, tăng tốc độ và số lần thấm ra, rút ngắn thời gian chiết xuất.
Tác dụng của sóng siêu âm:
Làm tăng diện tích tiếp xúc giữa hai pha bằng cách phân tán chúng
thành hạt nhỏ.

Phá vỡ một phần tế bào.
Tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp.
Có tác dụng làm nóng tại chỗ.
Phương pháp siêu âm tuy làm tăng cường quá trình chiết xuất nhưng
phương pháp này chỉ mới được nghiên cứu ở quy mô phòng thí nghiệm.
15
1.4. Một số nghiên cứu về tách chiết asiaticoside trong rau má
Việc nghiên cứu quá trình chiết để thu hồi asiaticoside có trong rau má
đã được khá nhiều nhà nghiên cứu ở nước ngoài tiến hành và công bố nhưng
ở nước ta thì chưa thấy có nghiên cứu nào được công bố.
Một số nghiên cứu về ảnh hưởng của dung môi và phương pháp chiết
xuất asiaticoside đã được các tác giả Wan Joo Kim và các đồng sự ở Hàn
Quốc (KIST: Korea institute of Science and Technology) tiến hành. Các ông
đã khảo sát khả năng tách asiaticoside của các dung môi ethanol, methanol, và
nước riêng lẻ ở nhiệt độ sôi của dung môi bằng phương pháp chiết ngược
dòng với thời gian 5h và kết quả thu được ở phương pháp này là sử dụng
ethanol sẽ cho hiệu quả tốt nhất [22].
Tuy nhiên, một nghiên cứu khác về khảo sát khả năng chiết asiaticoside
bằng phương pháp ngâm lắc trong 4h với các loại dung môi Chloroform, etyl
acetat, methanol, ethanol, nước của nhóm các nhà nghiên cứu R. K. Verma và
các đồng sự ở Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, PO
CIMAP, Lucknow 226015, India tiến hành lại không cho như vậy. Và kết kết
quả họ đưa ra đã cho rằng khả năng thu hồi asiaticoside khi chiết bằng
methanol là tốt nhất với hàm lượng 0.36% theo khối lượng chất khô còn
ethanol chỉ đạt mức 0,04% [18]. Điều này đã nói lên việc lựa chọn dung môi
tối ưu cho quá trình quả trình chiết chưa có một sự thống nhất.
Nhóm nghiên cứu của Wan Joo Kim còn so sánh khả năng chiết khi sử
dụng phương pháp chiết SCCO
2
và phương pháp kết hợp giữa SCCO

2
có hỗ
trợ của dung môi chiết, và họ cho rằng việc sử dụng phương pháp phương
pháp chiết kết hợp giữa SCCO
2
có kết hợp của dung môi sẽ cho kết quả tốt
hơn. Việc so sánh hàm lượng asiticosde chiết ra bằng soxhlet khi sử dụng
ethanol tinh khiết và hỗn hợp của ethnol- nước cũng được nhóm này thực hiện
với kết quả thu được là sự có mặt của nước trong dung môi ethanol làm cho
hiệu suất chiết tăng lên [22].
Bên cạnh các nghiên cứu về sự ảnh hưởng của các yếu tố trong quá
trình chiết một số nhà nghiên cứu cũng đã tiến hành nghiên cứu hàm lượng
asiticoside trong rau má ở các bộ phận khác nhau:
Năm 2003 Tae Kim và các đồng sự đã công bố kết quả về đề tài này
với hàm lượng asiaticoside ở phần lá chiếm 82,6%, phần rễ 1,5%, phần cuống
lá 15,9% còn các mấu ở thân 0% so với hàm lượng asiaticoside tổng số [14].
16
Qua kết quả này thì các ông đã khả định hàm lượng asiaticoside trong phần lá
chiếm tỉ lệ cao nhất so với các phần khác. Năm 2008 một kết quả tương tự do
nhà nghiên cứu N.A.Zainol, S.C.Voo tiến hành cũng đã được công bố [16].
Ngoài ra, người ta còn tiến hành nghiên cứu sự ảnh hưởng của các khu
vực trồng khác nhau tới sự tích lũy của asiaticoside trong rau má. Nghiên cứu
này được nhóm nghiên cứu của Denis Randriamampionoma thực hiện ở
Madagascar, các kết quả đưa ra cho thấy ở các vùng có khí hậu khác nhau thì
hàm lượng asiaticosidetích lũy trong rau má sẽ khác nhau. Theo các tác giả
này thì ở những vùng có nhiệt độ và độ ẩm lớn thường sẽ có hàm lượng
asiaticoside cao hơn các vùng có nhiệt độ và độ ẩm thấp [13].
17
PHẦN 3
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Rau má
Đối tượng nghiên cứu của chúng tôi là cây rau má (Centella asiatica L)
lấy từ làng Phước Yên xã Quãng Thọ huyện Quãng Điền tỉnh Thừa Thiên Huế.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất trong quá trình nghiên cứu
Thiết bị:
Hệ thống soxhlet Gerhadt 6 chỗ dùng cho loại bình 500ml .
Hình 2.1. Bộ soxhlet 6 chỗ
Máy lọc hút chân không Gast Manufacturing, Inc/ USA với bình lọc
GG17- Shuniu 1000ml.
Hình 2.2. Hệ thống máy lọc chân không
18
Máy lắc của Trung Quốc.
Hình 2.3. Máy lắc tách béo
Máy sấy WTC Binder 7853 Tuttling/ Germany.
Hình 2.4. Máy sấy
Máy xay khô MX- J210PN Panasonic

Hình 2.5. Máy xay
19
Máy sắc kí
Hình 2.6. Hệ thống sắc kí
Dụng cụ: Phễu Beune, bình tam giác (100ml, 250ml, 500ml), cốc
đong (250ml, 500ml), ống nghiệm, rây 0.5mm…
Hóa chất:
Methanol: Merck (HPLC).
Màng lọc: 0.45µm (Whaman).
Asiaticoside chuẩn của Sigma (Singaphore).
Các loại hóa chất khác: ethanol, methanol, ethyl acetat…
2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm.
Trước tiên chúng tôi tiến hành phân tích thành phần hóa học cuả
nguyên liệu rau má (Centella asiatica). Sau đó nguyên liệu sẽ được đưa đi xử
lý (sấy khô – xay mịn – tách béo) rồi tiến hành chiết để khảo sát các yếu tố
ảnh hưởng đến khả năng thu hồi asiaticode. Các yếu tố được khảo sát bao
gồm: lựa chọn dung môi, tỉ lệ dung môi, thời gian, nhiệt độ chiết và khảo sát
hàm lượng asiaticoside có trong các bộ phận của rau má.
Tất cả các thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 thí nghiệm
song song. Sau đó các mẫu khảo sát của cùng một yếu tố sẽ được gọp lại để
tiến hành cô cạn, định lượng bằng sắc kí HPLC và so sánh với mẫu chuẩn
asiaticoside của Sigma (Singaphore).
Khảo sát lựa chọn dung môi với 3 công thức:
Công thức 1: CT
1
= Methanol
Công thức 2: CT
2
= Ethanol
Công thức 3: CT
3
= Ethyl acetat
20
Khảo sát tỉ lệ dung môi với 6 công thức:
Công thức 1: CT
4
= 40:60
Công thức 2: CT
5
= 50:50
Công thức 3: CT

6
= 60:40
Công thức 4: CT
7
= 70:30
Công thức 5: CT
8
= 80:20
Công thức 6: CT
9
= 90:10
Khảo sát thời gian chiết với 5 công thức:
Công thức 1: CT
10
= 3h
Công thức 2: CT
11
= 4h
Công thức 3: CT
12
= 5h
Công thức 4: CT
13
= 6h
Công thức 5: CT
14
= 7h
Khảo sát nhiệt độ chiết với 3 công thức:
Công thức 1: CT
15

= 71
0
C
Công thức 2: CT
16
= 76
0
C
Công thức 3: CT
17
= 81
0
C
Khảo sát hàm lượng asiaticoside trong từng bộ phận rau má
Công thức 1: CT
18
= Rễ
Công thức 2: CT
19
= Thân
Công thức 3: CT
20
= Lá
2.2.2. Phương pháp hóa lý
2.2.2.1. Xác định độ ẩm:[6]
Phương pháp sấy đến khối lượng không đổi
Nguyên lý
Sấy mẫu ở nhiệt độ 100-150
o
C làm bay hết hơi nước. Cân trọng lượng

nguyên liệu trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong
nguyên liệu.
Tiến hành
21
Tiến hành cân 9 cốc sấy, đem sấy khô ở nhiệt độ 100-150
o
C đến khối
lượng không đổi. Để nguội trong bình hút ẩm.
Cân chính xác 9 mẫu, mỗi mẫu có khối lượng 5g cho vào 9 cốc sấy.
Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy ở 60-80
o
C trong vòng 2 giờ. Sau đó nâng
nhiệt độ lên 100-150
o
C, sấy khô liên tục trong 3h. Lấy ra để nguội trong bình
hút ẩm, đem cân ghi kết quả lần 1. Cho lại tủ sấy 100-150
o
C trong 30 phút,
lặp lại như trên đến khối lượng không đổi.
Tính kết quả
Độ ẩm theo % ( X) tính bằng công thức:
X = [(G
1
- G
2
) * 100]/ (G
1
– G)
Trong đó: X: Độ ẩm của thực phẩm (%).
G: Khối lượng cốc sấy (g).

G
1
: Khối lượng cốc sấy và mẫu thử trước khi sấy (g).
G
2
: Khối lượng cốc sấy và mẫu thử sau khi sấy (g).
2.2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng tro tổng số [6]
Nguyên lý
Dùng sức nóng (550 – 660
0
C) nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ.
Phần còn lại đem cân và tính ra hàm lượng tro toàn phần của rau má.
Tính kết quả
Hàm lượng tro theo phần trăm (X) tính bằng công thức:
X= (G
2
– G
1
) *100/ (G
1
– G)
Trong đó:
G
1
: Khối lượng chén nung và mẫu (g)
G: Khối lượng chén nung (g)
G
2
: Khối lượng chén nung và tro trắng (g)
2.2.2.3. Phương pháp chiết bằng Soxhlet

Nguyên lý
Nguyên tắc tách chiết bằng soxhlet là dung môi được đun sôi đến nhiệt
độ bay hơi đi lên trên gặp ống sinh hàn thì hơi được làm lạnh và ngưng tụ lại
ngấm dần vào nguyên liệu tạo điều kiện trích li các chất trong rau má. Dịch
trích ly theo thời gian tăng dần lên chứa ở phần thân nhờ hệ thống thông nhau
giữa phần thân và bình cầu mà khi dịch chiết đạt độ cao nhất định sẽ chảy trở
22
lại bình cầu và tiếp tục được đun sôi để bay hơi. Quá trình này tuần hoàn liên
tục trong thời gian khảo sát. Dịch chiết thu được lấy ra ở bình cầu.
Tiến hành
Cân 2g bột rau má cho vào giấy lọc buộc kĩ để tránh bột rau chảy ra
ngoài. Sau đó cho gói bột vào phần thân của bình soxhlet, còn dung môi cho
khoảng 250ml vào bình cầu bên dưới rồi tiến hành tách chiết ở nhiệt độ sôi
của dung môi.
Ưu, nhược điểm
Hệ thống soxhlet cho phép thu hồi lại dung môi, tiết kiện được thời
gian chiết và dung môi sử dung cho quá trình chiết do dung môi bay hơi và
ngưng tụ liên tục làm cho dịch chiết thay đổi tránh được sự bão hòa trong dịch
chiết. Tuy nhiên dịch chiết thu hồi ở bình cầu luôn chịu tác dụng của nhiệt
đun sôi nên các hoạt chất có thể thay đổi tính chất và làm giảm hàm lượng thu
hồi.
2.2.2.4. Phương pháp sắc kí
Mẫu sau khi chiết được xử lý qua các công đoạn lọc tinh sẽ cho dịch
chiết bay hơi bớt hàm lượng dung môi còn khoảng 30ml, tiến hành pha loãng
dịch chiết 30 lần và lấy 50µl để chạy HPLC pha ngược.
Điều kiện chạy HPLC như sau: cột C
18
(150×4.6mm), pha động ethanol
100%, tốc độ dòng 1.0ml/phút, tốc độ hấp phụ quang được đo ở 254nm, nhiệt
độ cột là nhiệt độ phòng. Mẫu chuẩn là asiaticoside có nồng độ 2mg/ml trong

ethanol.
Mẫu được phân tích trên hệ thống HPLC LC-20 Prominence của
Shimadzu (Nhật Bản) Với đầu dò 2000, sử dụng phần mêm LC- Solution.
Hóa chất để chạy sắc kí HPLC là hóa chất của Merck ( Đức) và chất chuẩn
của hãng Sigma (Singapore).
Hàm lượng asiaticoside (X) được tính theo công thức:
M
AS
S
X x A x 30
S
=
Trong đó: S
AS
: diện tích peak của asiaticoside chuẩn.
S
M
: diện tích peak của asiaticoside trong mẫu.
A: nồng độ mẫu asiaticoside chuẩn.
23
K: hệ số pha loãng của mẫu khi chạy HPLC.
2.2.3. Phương pháp hóa sinh
2.2.3.1. Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl
Nguyên lý
Dùng H
2
SO
4
đậm đặc và chất xúc tác đặc biệt để vô cơ hóa, chuyển
toàn bộ nitơ trong nguyên liệu về dạng muối (NH

4
)
2
SO
4
. Sau đó dùng NaOH
đẩy NH
3
ra và dùng hơi nước lôi cuốn NH
3
ra khỏi thiết bị chưng cất vào cốc
hứng chứa H
2
SO
4
0,1N dư, cuối cùng dùng NaOH 0,1N chuẩn độ lại H
2
SO
4
dư, từ đó ta tính được hàm lượng nitơ tổng số.
Tính kết quả
Nitơ toàn phần (%) = V.1,42.100/P
Trong đó:
V: số ml H
2
SO
4
0.1N chuẩn độ.
1,42: Số mg N tương ứng với 1 ml H
2

SO
4
0.1N.
P: Lượng mẫu phân tích tính bằng mg.
2.2.3.2. Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand
Nguyên lý
Gluxit trực tiếp khử oxy có tính chất khử Cu(OH)
2
ở môi trường kiềm
mạnh, làm cho nó kết tủa dưới dạng Cu
2
O màu đỏ gạch. Số lượng Cu
2
O tương
ứng với số lượng gluxit khử oxy.
Cu
2
O có tính chất khử oxy, tác dụng với muối Fe
3+
làm cho muối này
chuyển hóa thành muối Fe
2+
ở môi trường axit.
Fe
2+
có tính chất khử, nên dùng KMnO
4
để chuẩn độ ở môi trường axit.
Từ số ml KMnO
4

0,1N dùng để chuẩn độ Fe
2+
hình thành, tra bảng để
có số mg đường glucose, maltose, lactose hoặc saccarose, nhân với hệ số pha
loãng, ta có hàm lượng đường trong 100g nguyên liệu.
Tóm tắt quá trình định lượng đường khử theo sơ đồ sau:
RCHO + Cu(OH)
2

→
RCOOH + Cu
2
O + H
2
O
Cu
2
O + Fe
2
(SO
4
)
3
+ H
2
SO
4

→
2FeSO

4
+ 2CuSO
4
+ H
2
O
10FeSO
4
+ KMnO
4
+ 8H
2
SO
4

→
5Fe
2
(SO
4
)
3
+ 2MnSO
4
+ K
2
SO
4
+ 8H
2

O
Các phương pháp định lượng glucid bằng phương pháp hoá học đều
dựa vào tính chất khử của nhóm aldehy hay aceton tự do trong phân tử glucid,
24
cho nên muốn định lượng glucid rất phức tạp phải thuỷ phân các chất này
thành các monaosaccharid. Mặt khác, các hợp chất protêin, lipid, đều ảnh
hưởng đến định lượng glucid nên cần phải được khử trước khi chuẩn độ
glucid. Do đó, trong chuẩn bị dịch thử có hai khâu kỹ thuật quan trọng cần
chú ý là:
Cách thuỷ phân: Cho 5g mẫu đã nghiền vào bình tam giác 250ml, sau
đó cho thêm 50ml nước cất vào, 5ml HCl tinh khiết và thuỷ phân trên nồi
cách thuỷ như sau: thuỷ phân đường saccharose duy trì nhiệt độ 70
0
C trong 5
phút.
Sau khi thuỷ phân cần làm lạnh ngay dưới vòi nước nóng.
Trung hoà lại bằng NaOH 30%, sau đó bằng NaOH 1N, rồi NaOH 0,1N
với dung dịch phenolphtalein cho tới khi dung dịch chuyển màu hồng.
Khử tạp chất bằng chì acetat:
Dịch đã thuỷ phân và trung hoà được cho vào bình định mức dung tích
100ml, cùng với nước rửa. Sau đó cho 7ml dung dịch chì acetat 30% lắc đều
và để lắng trong 5 phút, nếu thấy xuất hiện một lớp chất lỏng trong suốt ở bên
trên lớp cặn thì việc khử tạp chất đã xong.
Cho vào 18–20ml Na
2
SO
4
để loại chì acetat thừa. Lắc đều và để lắng tủa
xuống. Thêm nước cất vừa đủ 100ml. Lắc đều và lọc qua giấy qùy.
Tính kết quả

Hàm lượng đường toàn phần biểu thị bằng đường glucose hoặc đường
nghịch chuyển ( g/100g thực phẩm ) tính bằng công thức.
X = [(G
1
* 100)/ (G
2
* 1000)]* độ pha loãng
Trong đó: G
2
: Khối lượng thực phẩm cân lúc đầu.
1000: hệ số chuyển đổi từ mg sang g
G
1
: Khối lượng đường nghịch chuyển hoặc đường glucose (mg)
tương ứng với số ml KMnO
4
0,1N đọc ở bảng
2.2.3.3. Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet
Nguyên lý
Dùng ete nóng để hòa tan và chiết rút tất cả lipid tự do trong nguyên liệu
trong thiết bị Soxhlet. Sau khi làm bay hơi hết ete, sấy mẫu đến khối lượng không
đổi, cân và tính ra hàm lượng lipid trong thực phẩm.
25