nghiên cứu ứng dụng và hoàn thiện quy trình nuôi tạo tấm biểu mô niêm mạc miệng

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hội chứng suy giảm tế bào gốc biểu mô giác mạc là một trong những
di chứng thường gặp của tổn thương bề mặt nhãn cầu (BMNC). Ở Việt Nam,
một trong những nguyên nhân phổ biến gây tổn thương BMNC là bỏng mắt
do hoá chất hoặc nhiệt. Biểu hiện của hội chứng này là mất độ trong của giác
mạc do màng xơ mạch từ phía kết mạc xâm lấn qua vùng rìa lên bề mặt giác
mạc. Hội chứng suy giảm tế bào gốc của giác mạc cũng có thể gây nên hiện
tượng loét biểu mô giác mạc khó hàn gắn, tróc biểu mô giác mạc tái phát. Vì
vậy, thị lực mắt bị bệnh bị suy giảm ở nhiều mức độ khác nhau. Để điều trị,
các nhà nhãn khoa đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như: ghép màng
ối đơn thuần, ghép kết mạc rìa tự thân hoặc dị thân, ghép giác-củng mạc
vùng rìa. Mục đích của các phẫu thuật nhằm làm tăng số lượng tế bào gốc
biểu mô giác mạc hoặc cải thiện môi trường vùng rìa củng giác mạc và hỗ trợ
quá trình tái tạo lớp biểu mô giác mạc. Tuy nhiên, phương pháp ghép kết mạc
rìa, ghép giác-củng mạc rìa tự thân, mảnh mô dùng để ghép được lấy từ mắt
lành phải khá lớn. Mặt khác, phương pháp này cũng không thể thực hiện được
ở các trường hợp bệnh nhân bị tổn thương cả hai mắt [3,4,5, 25].
Đối với các trường hợp bệnh nhân bị tổn thương BMNC cả hai mắt,
trước đây, các bác sỹ nhãn khoa đã sử dụng phẫu thuật ghép vùng rìa dị thân,
ghép kết mạc - rìa dị thân hoặc ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy dị thân.
Tuy nhiên, những bệnh nhân này phải dùng thuốc chống thải loại mảnh ghép
và nguy cơ thải mảnh ghép khá cao.
Trong cơ thể, biểu mô giác mạc và biểu mô lợp niêm mạc miệng là
những biểu mô lát tầng không sừng hoá. Những tế bào lớp đáy của cả hai loại
biểu mô này có khả năng phân chia để duy trì quá trình tái tạo sinh lý. Về
nguồn gốc phôi thai, hai loại biểu mô này đều có nguồn gốc là ngoại bì da.
Năm 2003, Nakamura và cộng sự đã nuôi cấy thành công tế bào biểu mô niêm
mạc miệng và ghép tự thân cho thỏ bị bỏng giác mạc. Việc sử dụng tấm biểu
mô niêm mạc miệng nuôi cấy để điều trị tổn thương giác mạc là một lựa chọn
1
tốt cho các bệnh nhân bị tổn thương cả hai mắt và không còn vùng rìa. Với

phương pháp này, người bệnh không phải dùng thuốc chống thải loại mảnh
ghép như khi ghép vùng rìa hoặc ghép kết mạc-rìa dị thân.
Với mong muốn đưa một phương pháp điều trị tổn thương BMNC mới
vào Việt Nam, trong phạm vi đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng và
hoàn thiện quy trình nuôi tạo tấm biểu mô niêm mạc miệng”, chúng tôi tiến
hành một phần nghiên cứu với mục tiêu sau đây:
Xác định ưu nhược điểm của hai phương pháp tạo tấm biểu mô niêm
mạc miệng thỏ: bằng dịch treo và bằng mảnh mô niêm mạc miệng.
2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.Cấu trúc của bề mặt nhãn cầu(BMNC)
1.1.1. Sơ lược giải phẫu lớp vỏ ngoài của nhãn cầu
Lớp vỏ ngoài của nhãn cầu hay còn gọi là lớp áo xơ là một màng liên
kết xơ khá dày và dai, gồm có hai phần: giác mạc trong suốt chiếm 1/6 phía
trước, củng mạc màu trắng đục chiếm 5/6 phía sau. Vùng giáp ranh giữa củng
mạc và giác mạc gọi là vùng rìa. Vùng rìa củng-giác mạc có vai trò rất quan
trọng trong việc tái tạo biểu mô bề mặt nhãn cầu.
1.1.2. Định nghĩa bề mặt nhãn cầu
Về mặt giải phẫu, bề mặt nhãn cầu là toàn bộ biểu mô được giới hạn
bởi hai đường xám của mi trên và mi dưới. Về mặt mô học, biểu mô bề mặt
nhãn cầu gồm biểu mô giác mạc, biểu mô kết mạc và biểu mô vùng rìa.
1.1.3. Biểu mô giác mạc
Biểu mô giác mạc là biểu mô lát tầng không sừng hoá, dày khoảng
50µm, chiếm khoảng 10% chiều dày giác mạc. Biểu mô giác mạc gồm 5-6
hàng tế bào, chia thành ba lớp: lớp bề mặt, lớp trung gian và lớp đáy. Biểu mô
này có khả năng tái tạo rất cao. Các tế bào biểu mô ở lớp bề mặt liên tục bong
ra và mất đi trong màng nước mắt và sẽ được thay thế bởi những tế bào mới
nhờ sự phân chia của các tế bào gốc cư trú ở vùng rìa củng-giác mạc. Biểu mô
giác mạc được chứng minh là có sự đổi mới toàn bộ hằng định sau khoảng 7-
10 ngày.

Lớp tế bào bề mặt thường gồm hai hàng tế bào đa diện dẹt. Các tế bào
này liên kết với nhau rất chặt chẽ nhờ các cấu trúc liên kết: vòng dính, dải bịt,
thể liên kết. Chính sự liên kết chặt chẽ này đã tạo ra một hàng rào vững chắc
ở biểu mô giác mạc ngăn không cho nước và các chất ở bên ngoài thấm qua.
3
Ở mặt tự do của tế bào có rất nhiều vi nhung mao, các vi nhung mao này có
lớp áo glycocalyx. Các vi nhung mao làm tăng diện tích bề mặt tế bào biểu
mô tạo điều kiện thuận lợi cho việc trao đổi chất dinh dưỡng và oxy qua màng
tế bào. Hơn nữa, các vi nhung mao cùng với lớp glycocalyx đã góp phần tạo
ra sự ổn định cho lớp phim nước mắt, chống khô giác mạc và hạn chế xâm
nhập của các tác nhân bệnh lý.
Lớp tế bào trung gian gồm 2-3 hàng tế bào đa diện. Đây là lớp chuyển
tiếp giữa lớp tế bào đáy và lớp tế bào bề mặt.
Tế bào lớp đáy có hình trụ, xếp thành một hàng bám chặt vào màng
đáy,dán vào màng Bowman chính thức. Tế bào đáy có khả năng gián phân để
tạo ra các tế bào lớp trên của giác mạc.
1.1.4. Biểu mô kết mạc
Kết mạc là một bộ phận phụ thuộc nhãn cầu, trải từ vùng rìa củng giác
mạc đến đường xám của bờ mi, được chia thành 3 phần. Kết mạc mi lợp mặt
trong của mi mắt, thuộc loại biểu mô trụ tầng không sừng hoá. Kết mạc nhãn
cầu lợp mặt trước nhãn cầu (trừ diện giác mạc), thuộc loại biểu mô lát tầng
không sừng hoá. Kết mạc cùng đồ tiếp nối kết mạc nhãn cầu với kết mạc mi.
Biểu mô của kết mạc nhãn cầu gồm 6-8 hàng tế bào, các tế bào biểu mô
kết mạc không đều đặn và có kích thước nhỏ hơn so với các tế bào biểu mô
giác mạc. Đặc biệt, xen kẽ với các tế bào nằm trên cùng của kết mạc có một
số tế bào hình đài, chiếm khoảng 5-10% số lượng tế bào biểu mô bề mặt nhãn
cầu. Trong bào tương của chúng có nhiều không bào chứa các hạt nhày.
Chức năng của chúng là tiết dịch nhày tạo thành phần của lớp phim nước mắt.
Bản chất của chất nhày là glycoprotein do đó khi nhuộm P.A.S và quan sát
trên kính hiển vi quang học thấy các tế bào hình đài bắt màu khác so với các

tế bào xung quanh. Các tế bào hình đài chỉ có trong kết mạc, không có ở giác
mạc. Vì vậy về mặt mô học, sự có mặt của các tế bào hình đài ở vùng trung
tâm giác mạc là bằng chứng thuyết phục của hiện tượng xâm lấn kết mạc
vào giác mạc - hậu quả của suy giảm tế bào gốc vùng rìa củng-giác mạc.
Lớp đệm của kết mạc là mô liên kết thưa với nhiều mạch máu, mạch bạch
4
huyết và nhiều loại tế bào: lympho bào, dưỡng bào, tương bào và bạch cầu đa
nhân. Những tế bào này có thể đi vào lớp biểu mô.
1.1.5. Biểu mô vùng rìa củng-giác mạc và tế bào gốc vùng rìa giác mạc
 Vùng rìa là vùng tiếp nối giữa củng mạc với giác mạc, ở đây có sự chuyển
tiếp từ biểu mô giác mạc thành biểu mô kết mạc nhãn cầu. Về mặt mô học,
mốc xác định của vùng rìa là: tại đây không có màng Bowman và màng
Descemet. Việc phân định ranh giới giữa vùng rìa và kết mạc là tương đối
khó. Nhưng có thể xác định được vị trí tương ứng, đó là nơi gặp nhau giữa
mống mắt và mô nền giác mạc; hơn nữa, khác với kết mạc, biểu mô vùng rìa
không có tế bào hình đài tiết nhày [1].
Về mặt cấu tạo, vùng rìa củng-giác mạc là một vùng hình nhẫn nằm
giữa củng mạc và giác mạc. Vòng nhẫn này rộng hơn ở phía trên (1,5mm) và
phía dưới (1mm), còn ở hai bên thì hẹp, khoảng 0,8mm [4].
Biểu mô vùng rìa củng giác mạc gồm 7-10 hàng tế bào, các tế bào liên
kết chặt chẽ với nhau giống như các tế bào của biểu mô giác mạc. Bên dưới
màng đáy, mô liên kết của vùng rìa tập trung nhiều dây thần kinh và giàu mạch
máu, ngoài ra còn thấy sự có mặt của một số tế bào trung mô.
 Tế bào gốc biểu mô giác mạc
Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các tế bào gốc của biểu mô
giác mạc tập trung ở lớp đáy của biểu mô vùng rìa. Để chứng minh được giả
thuyết này, các nhà nghiên cứu đã đưa ra nhiều bằng chứng thuyết phục:
- Trước hết, Keratin 3 (K3) được biết là dấu ấn của các tế bào biểu mô giác
mạc biệt hoá ở mức cao. K3 biểu lộ ở tất cả các tế bào biểu mô vùng trung
tâm giác mạc, nhưng ở biểu mô vùng rìa K3 chỉ biểu lộ ở các tế bào trên lớp

đáy.
- Một bằng chứng nữa cho quan niệm tế bào gốc biểu mô giác mạc cư
trú ở vùng rìa là từ những nghiên cứu về nuôi cấy tế bào. Thực nghiệm cho
thấy các tế bào đáy vùng rìa thể hiện đặc điểm tăng sinh của các tế bào gốc.
5
Trong nuôi cấy, các tế bào này có khả năng tăng sinh mạnh mẽ hơn nhiều so
với các tế bào biểu mô ở trung tâm giác mạc.
Có những nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc vùng rìa để lý giải cho sự tồn
tại của những tế bào gốc ở đây. Với chức năng tái tạo các cơ quan, tế bào gốc
cơ thể trưởng thành có mặt rải rác khắp cơ thể. Nhưng chúng chỉ cư trú trong
những nơi có điểu kiện bảo vệ tốt. Năm 1978, Shofield đã nêu một giả thuyết
về “ổ tế bào gốc” để giải thích trạng thái không biệt hoá của tế bào gốc. Theo
đó, “ổ tế bào gốc” được xem như một ổ vi môi trường đặc biệt có tính tổ chức
cao, trong đó có chứa nhiều yếu tố khác nhau được cho rằng có vai trò trong
việc duy trì trạng thái không biệt hoá của tế bào gốc như: các cytokine, sự
tương tác giữa các tế bào gốc với mô đệm, sự kết dính giữa các tế bào [28].
Thật vậy, vùng rìa giác mạc tập hợp tất cả những điều kiện tối ưu để bảo
vệ các tế bào gốc khỏi các kích thích làm chúng biệt hoá. Tại đây, bên cạnh các
tế bào gốc còn có nhiều hắc tố bào, có các tế bào trình diện kháng nguyên
Langerhans và những lympho bào T hỗ trợ. Chúng được cho rằng có vai trò
bảo vệ các tế bào gốc. Hắc tố bào có những nhánh bào tương xoè rộng ra xung
quanh bao lấy tế bào biểu mô lớp đáy, chúng tổng hợp và vận chuyển sắc tố
melanin vào tế bào biểu mô do đó làm giảm đến mức tối thiểu những tổn
thương gây ra bởi bức xạ cực tím. Ngoài ra, không như ở giác mạc, màng đáy
biểu mô vùng rìa có cửa sổ và lồi lõm do mô đệm có nhú. Cấu trúc hình thái
này ở vùng rìa cho thấy các tế bào gốc có sự liên hệ mật thiết với các tế bào ở
mô đệm phía dưới. Cấu tạo đặc biệt của màng đáy vùng rìa được xem như là
yếu tố quyết định sự phân bố các tế bào gốc trong ổ của nó.
1.1.6. Hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa giác mạc
 Nguyên nhân

Hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa có thể nguyên phát, liên
quan tới những bệnh lý làm thay đổi vi môi trường của tế bào gốc, ví dụ
như: tật không mống mắt, viêm giác mạc liên quan tới suy nhiều tuyến nội
tiết, chứng đỏ da dày sừng bẩm sinh; hoặc có thể là hậu quả thứ phát của
sự phá huỷ tế bào gốc do các yếu tố bên ngoài như: bỏng hoá chất, bỏng
6
nhiệt, hội chứng Stevens Jonhson, đeo kính áp tròng hoặc do nhiễm khuẩn
lan rộng [11, 29, 30, 31].
 Biểu hiện lâm sàng của hội chứng suy giảm vùng rìa
Suy giảm vùng rìa có thể xảy ra lan tràn toàn bộ hoặc chỉ ở một góc của
vùng rìa. Trong trường hợp suy giảm một phần vùng rìa, sự xâm lấn của biểu
mô kết mạc chỉ ảnh hưởng tới một phần bề mặt giác mạc.
Triệu chứng chủ quan của người bệnh: Nhìn mờ, cộm chói, chảy nước
mắt, co quắp mi mắt và có thể có những đợt đau đỏ mắt tái phát.
Trong suy giảm tế bào gốc một phần sự xâm nhập tổ chức xơ mạch ở
vùng rìa biểu hiện ở nhiều mức độ khác nhau, trong khi biểu mô giác mạc ở
trung tâm vẫn còn bình thường.
Trong suy giảm tế bào gốc toàn bộ, mức độ tổn thương phụ thuộc vào
nguyên nhân do thứ phát hay nguyên phát. Biểu hiện lâm sàng c ó thể chỉ là
giác mạc mờ đục, bề mặt gồ ghề không đều, có tân mạch nông hoặc sâu trong
bề dày giác mạc hoặc kết mạc hóa giác mạc. Nặng hơn nữa có thể là ổ loét
giác mạc khó hàn gắn, bờ ổ loét ranh giới rõ và gồ lên, xung quanh ổ loét có
thể tồn tại tổ chức xơ tân mạch, BMNC gồ ghề với biểu hiện của một quá
trình viêm mãn tính, nhuyễn giác mạc, giác mạc mỏng hoặc thủng giác mạc
có thể xảy ra trong trường hợp nặng.
 Phương pháp điều trị
Có nhiều phương pháp điều trị hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa
giác mạc. Việc nuôi tạo tấm biểu mô giác mạc từ tế bào gốc vùng rìa giác mạc
để ghép điều trị cho các bệnh nhân bị hội chứng suy giảm vùng rìa do các
nguyên nhân khác nhau là một phương pháp hiện đại và hiệu quả. Tuy nhiên,

xung quanh phương pháp này còn nhiều vấn đề cần nghiên cứu và trong một
số trường hợp như thiếu hụt tế bào gốc vùng rìa toàn bộ cả hai bên mắt thì
ghép đồng loại hoặc sử dụng nguồn tế bào biểu mô tự thân thay thế là giải
pháp phải lựa chọn, mô vùng rìa đồng loại có thể lấy từ giác mạc của tử thi
hoặc của người hiến tình nguyện. Rất nhiều các nghiên cứu về khả năng và
thành công của ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy đã được thông
báo. Sử dụng tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy là một lựa chọn hợp lý
7
và tỏ ra có nhiều tiến bộ hơn các phương pháp ghép dị thân vì khi ghép dị
thân bệnh nhân phải sử dụng thuốc ức chế miễn dịch để chống thải loại mảnh
ghép, vừa gây ra nhiều tác dụng phụ không mong muốn vừa gây ra sự tốn
kém về kinh tế cho bệnh nhân, vả lại nếu có sử dụng lâu dài thì cũng không
thể chắc chắn được sự tồn tại của mảnh ghép trên cơ thể người bệnh. Một ưu
điểm nữa của phương pháp ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng đó là niêm
mạc miệng được cho là ở giai đoạn biệt hoá thấp hơn so với tế bào sừng ở da,
nó có khả năng phân chia rất nhanh duy trì trong khoảng thời gian dài ở điều
kiện nuôi cấy mà không hoá sừng. Hơn thế nữa, K3 thể hiện ở cả biểu mô
giác mạc và biểu mô niêm mạc miệng chứ không có ở biểu mô da, chứng tỏ
sự gần gũi hơn của biểu mô niêm mạc miệng và giác mạc.
Sử dụng tấm biểu mô kết mạc để cấy ghép cũng có thể dùng để điều trị
tổn thương bề mặt nhãn cầu có thể thay thế kết mạc hoặc giác mạc tổn
thương. Nicol Scuderi và cộng sự năm 2002 đã nuôi cấy thành công tấm biểu
mô kết mạc và ghép tự thân tấm này trên mắt của 4 bệnh nhân tổn thương kết
mạc, kết quả cho thấy bệnh nhân đã nhanh chóng cải thiện được về mặt thẩm
mỹ, biểu mô tồn tại tốt [24]. Mặc dù khi cấy ghép tấm biểu mô niêm mạc
miệng hay biểu mô kết mạc đều có thể xảy ra hình thành tân mạch ngoại vi
giác mạc nên có thể mất khả năng nhìn của người bệnh, song nghiên cứu cho
thấy ở tấm biểu mô niêm mạc miệng, do sự thể hiện FGF2 của tế bào gây ra
và để tránh biến chứng hình thành tân mạch việc sử dụng kháng FGF2 có thể
khắc phục được, mặt khác thủ thuật lấy tấm biểu mô niêm mạc miệng đơn

giản hơn nhiều so với lấy tấm biểu mô kết mạc.
Như vậy, trong trường hợp không thể sử dụng tấm biểu mô giác mạc
nuôi cấy, việc lựa chọn phương pháp ghép biểu mô niêm mạc miệng là lựa
chọn khả quan giúp cải thiện tầm nhìn cho bệnh nhân, bảo vệ phần còn lại của
nhãn cầu và giảm các triệu chứng khó chịu gây ra cho người bệnh.
1.2. Cấu trúc biểu mô lợp bề mặt khoang miệng
Niêm mạc lợp mặt trong thành miệng gồm mặt trong hai má, mặt dưới
vòm miệng và 2 mặt lưỡi. Niêm mạc miệng gồm hai phần chính: biểu mô bề
mặt được hỗ trợ bởi lớp mô liên kết xơ chun và lớp dưới biểu mô.
8
Ở nhiều vùng của miệng, niêm mạc miệng gắn chặt vào cấu trúc mô phía
dưới bởi thành phần mô liên kết lỏng lẻo là tầng dưới niêm mạc, trừ ở vùng vòm
miệng lớp đệm của niêm mạc miệng dính chặt vào màng xương. Ba lớp này có
cấu trúc tương tự như cấu trúc của biểu mô, chân bì và hạ bì của da [18].
Biểu mô niêm mạc miệng là loại biểu mô tầng, nó có thể sừng hoá hoặc
không sừng hoá tuỳ thuộc vào từng vùng của niêm mạc miệng. Biểu mô lợp
niêm mạc môi và niêm mạc má là biểu mô lát tầng không sừng hóa giống với
biểu mô trước giác mạc, các tế bào lớp bề mặt không có hạt keratohyaline, ở
lớp đáy có các tế bào gốc. Ngoài ra, biểu mô khoang miệng còn có các loại tế
bào khác không thuộc dòng sừng hoá: tế bào sắc tố, tế bào Langerhans, tế bào
Merkel. Các tế bào biểu mô liên kết với nhau bởi thể liên kết. Ở lớp đáy, các
tế bào liên kết với thành phần lớp đệm nhờ thể bán liên kết và màng đáy,
màng này chứa nhiều collagen type IV, laminin và fibronectin.
Các xơ trung gian trong tế bào được tìm thấy ở tất cả các loại biểu mô
và là các dấu ấn cơ bản nhất của sự biệt hoá tế bào. Thông tin về xơ keratin
trong tế bào phản ánh cả kiểu loại và tình trạng biệt hoá của tế bào, vị trí phân
lớp của biểu mô. Xơ keratin có đường kính từ 6-11nm, là lớp phụ của xơ
trung gian đó là những protein dạng sợi dài. Trong tế bào biểu mô xơ này
luôn có cấu trúc cặp, gồm 1 keratin type I (acide) có trọng lượng phân tử
khoảng 50-60 kD và 1 keratin type II (trung tính hoặc base) có trọng lượng

phân tử khoảng 50-70kD, những cặp xơ keratin này kết hợp chặt chẽ xoắn
nhau để tạo thành chuỗi xuắn. Nó hình thành một mạng lưới khắp bào tương,
các xơ này gắn kết với thể liên kết và thể bán liên kết, nó neo các tế bào biểu
mô với nhau và với các màng đáy [1].
Như vậy, về mặt cấu trúc mô học niêm mạc má là loại biểu mô giống
với biểu mô giác mạc, nó còn có chung nguồn gốc, có thể nuôi cấy thành
công và thay thế được biểu mô giác mạc.
1.3. Những nghiên cứu về nuôi tạo tấm biểu mô niêm mạc miệng và ứng
dụng
9
1.3.1. Lựa chọn nền nuôi cấy
Để nuôi cấy tế bào biểu mô niêm mạc miệng, việc đầu tiên là chuẩn bị
nền nuôi cấy cho phù hợp và đảm bảo hỗ trợ được cho các tế bào. Có rất
nhiều loại nền nuôi cấy khác nhau, có thể là nền tự nhiên như màng ối, nền
tổng hợp hoặc phối hợp hai loại trên [18]. Về thành phần và cấu trúc thì màng
ối có rất nhiều ưu điểm vượt trội so với các màng sinh học khác bởi tính chun
giãn, trong suốt, mềm mại, nhẵn bóng, mỏng và khó rách.
Việc sử dụng màng ối sử dụng làm chất nền nuôi cấy niêm mạc miệng
và dùng trong tái thiết bề mặt nhãn cầu đã được Nakamura và cộng sự nghiên
cứu năm 2003. Khi nuôi cấy tấm biểu mô niêm mạc miệng trên nền màng ối
người, kết quả là tấm biểu mô có rất nhiều thể liên kết và dính chặt vào màng
đáy bằng thể bán liên kết, tế bào thể hiện keratin 3, 4 và 13 [19]. Theo nghiên
cứu của tác giả Fukuda K. và cộng sự (1999), màng đáy của màng ối hoàn
toàn giống với màng đáy của kết mạc vì có chứa collagen typ IV, V,
fibronectin, laminin-1, laminin-5, vì thế màng ối được sử dụng để thay thế kết
mạc. Các thành phần này đóng vai trò quan trọng trong sự biệt hoá và sự tăng
sinh của các tế bào biểu mô [7]. Mặt khác, hiệu quả chống viêm và bảo vệ bề
mặt nhãn cầu của màng ối được giải thích qua sự có mặt nhiều loại cytokin
chống viêm. Màng ối có chức năng của một biểu mô phủ, là biểu mô chế tiết
và có khả năng trao đổi chất qua đường tế bào và gian tế bào. Màng ối còn có

khả năng kháng khuẩn nên nguy cơ nhiễm trùng hậu phẫu ít hơn so với ghép
các màng sinh học khác. Việc bóc tách màng ối ra khỏi màng đệm rất dễ
dàng, cùng với tính chun giãn tốt của màng ối tạo điều kiện cho các thao tác
dàn trải trong quá trình phẫu thuật được dễ dàng. Màng ối là một nguyên liệu
sẵn có, dễ lấy, dễ xử lý. Màng ối được bảo quản ở nhiệt độ - 80
O
C có thể để
được nhiều tháng [6, 12, 20].
Như vậy, màng ối là một màng sinh học có nhiều ưu điểm vượt trội,
được sử dụng để che phủ trên bề mặt nhãn cầu đạt hiệu quả cao.
Trong đề tài cấp bộ “Nghiên cứu nuôi cấy tế bào rìa giác mạc và ứng
dụng trong điều trị một số tổn thương giác mạc” chúng tôi đã nghiên cứu và đưa
ra được quy trình xử lý màng ối làm nền nuôi cấy tế bào gốc vùng rìa giác mạc.
10
Công trình đã được nghiệm thu và đánh giá tốt. Nghiên cứu này giúp chúng tôi
có một nền thích hợp để nuôi cấy tế bào biểu mô niêm mạc miệng.
1.3.2. Phương pháp nuôi cấy
Có hai phương pháp chính để nuôi tạo được tấm biểu mô niêm mạc
miệng đó là nuôi cấy bằng mảnh mô và nuôi cấy bằng dịch treo tế bào.
 Phương pháp nuôi cấy bằng mảnh mô
Trong phương pháp này, màng ối được sử dụng rộng rãi với vai trò vừa
là chất nền vừa là chất mang của các tế bào biểu mô nuôi cấy. Tấm biểu mô
niêm mạc miệng được đặt trực tiếp lên bề mặt màng đáy của màng ối (mặt
biểu mô hướng lên trên) và để nó dính chặt vào đấy. Khi đã gắn chặt, màng ối
và mảnh mô được dìm ngập trong môi trường nuôi cấy. Môi trường này bao
gồm các chất dinh dưỡng và các tác nhân phân bào kích thích các tế bào gốc
niên mạc miệng tăng sinh rồi di cư ra khỏi phạm vi của mảnh mô để bao phủ
bề mặt của tấm màng ối.
Có một vài điểm khác nhau trong kỹ thuật nuôi cấy giữa các công bố
trên thế giới. Năm 2007, tác giả Madhira và cộng sự khi nghiên cứu trên

người tình nguyện từ 18 tới 60 tuổi không có tiền sử hút thuốc lá và viêm
nhiễm khoang miệng, súc miệng bằng Bentadin 3 ngày liền, lấy kích thước
miếng niêm mạc miệng là 3x3mm sau khi gây tê tại chỗ. Vị trí lấy mẫu ở
niêm mạc má, dưới kính vi phẫu loại bỏ hoàn toàn lớp dưới biểu mô và mô
mỡ. Mẫu niêm mạc miệng sau đó được rửa 3 lần với PBS có chứa kháng sinh
penicillin, streptomicin, gentamicin, amphotericin. Mảnh mô được cắt nhỏ và
đặt vào màng ối đã loại bỏ biểu mô, không sử dụng nền tế bào 3T3, sau đó
được nuôi trong môi trường HCE trong đó có chứa MEM và Ham’s F12 với tỉ
lệ 1:2 cùng với các yếu tố khác như EGF, insulin, penicillin, streptomicin,
amphotericin, gentamicin, 10% huyết thanh bào thai bê trong vòng 3-4 tuần
trong điều kiện 37
0
C, 5%CO
2
. Kết quả: Sau 3-4 tuần nuôi cấy, tấm biểu mô
niêm mạc miệng quan sát bằng kính hiển vi điện tử, thấy giữa các tế bào
biểu mô có liên kết khe và thể liên kết. PCR cho kết quả tế bào biểu mô
niêm mạc miệng nuôi cấy biểu lộ markers của tế bào biệt hoá như CK 3, 4,
11
13, 15 và connecxin 43, có tế bào thể hiện markers tế bào gốc biểu mô như
các đồng dạng của p63, p75 đó là các markers cho tế bào gốc biểu mô niêm
mạc miệng [16].
 Phương pháp nuôi cấy bằng dịch treo
Phương pháp này sử dụng enzyme dispase có tác dụng làm tan rã
collagen của màng đáy để tách các tế bào biểu mô ra khỏi mô đệm của chúng
và enzyme trypsin để ly giải những đám tế bào biểu mô niêm mạc miệng
thành dạng dịch treo chứa những tế bào riêng rẽ. Dịch treo này sẽ được cấy
lên bề mặt màng ối hoặc đáy của giếng nuôi cấy. Thêm môi trường vào giếng
nuôi cấy.
Ở đây, màng ối đóng vai trò làm chất mang cho các tế bào biểu mô.

Nakamura và cộng sự năm 2003, khi nuôi tấm biểu mô niêm mạc
miệng của thỏ đã lấy mảnh mô có kích thước từ 4-6mm
2
trong điều kiện gây
mê tĩnh mạch. Mảnh mô được loại bỏ mô liên kết phía dưới biểu mô, sau đó
được rửa trong môi trường PBS 3 lần trong 10 phút ở nhiệt độ phòng có pha
50UI/ml kháng sinh penicillin-streptomycin và 5µg/ml amphotericin B. Các
mảnh mô sau đó ủ với dispase 1,2UI ở 37
0
C trong vòng 1 giờ, xử lý tiếp theo
bằng 0,25% trypsin-EDTA trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, dừng tác dụng của
enzyme bằng cách rửa bằng môi trường 1DMEM:1Ham’s F12 có bổ sung
10% FBS, insulin 5µg/ml, cholera toxin 0,1nmol/l, EGF người tái tổ hợp
10ng/ml, penicillin-streptomycin 50UI/ml, hỗn hợp tế bào sau đó ly tâm 1000
vòng/phút trong vòng 5 phút rồi pha với môi trường nuôi cấy ở nồng độ
100000 tế bào/ml, gieo trên nền màng ối đã loại bỏ biểu mô có nền 3T3 đã xử
lý bằng mitomycin, nuôi cấy trong vòng 2 tuần, kỹ thuật tạo tầng được áp
dụng trong vòng 1 tuần ở điều kiện 37
0
C, 5%CO
2
[19].
Cũng tác giả này, năm 2004 khi tiến hành nghiên cứu trên 6 mắt của 4
bệnh nhân đã có lời khuyên: trước khi lấy mảnh niêm mạc miệng để nuôi cấy,
bệnh nhân cần được các nha sỹ khám và có sự chuẩn bị trước như đánh răng
thường xuyên, không sử dụng thuốc lá, súc miệng bằng Iodine. Sau khi lấy,
mảnh niêm mạc miệng người cũng được xử lý giống như đối với thỏ [21].
Còn tác giả Nishida và cộng sự (2004), đã lấy mẫu niêm mạc má của bệnh
12
nhân để nuôi cấy với kích thước là 3x3mm và nuôi cấy tế bào biểu mô niêm

mạc miệng bằng dịch treo trên nền màng polymer nhạy với nhiệt trên nền
3T3. Ở 37
0
C, các tế bào biểu mô gắn chặt và tăng sinh trên nền polymer,
nhưng khi hạ nhiệt độ xuống thì tấm biểu mô sẽ tách rời khỏi màng này. Ưu
điểm của phương pháp này là không cần enzyme để giải phóng tấm biểu mô
khỏi màng nuôi cấy [22].
Trong nghiên cứu của DH. Ma và cộng sự năm 2009, mảnh niêm mạc
miệng lấy để nuôi cấy lại có kích thước lớn hơn (6x6mm), mảnh mô được xử
lý với dispase II 1,2UI ở 37
0
C trong vòng 1 giờ, tiếp đó được xử lý bằng
trypsin-EDTA ở 37
0
C, cứ 3 phút lại nạo nhẹ miếng mô cuối cùng dung dịch tế
bào được hoà với SHEM có 5% huyết thanh bê, dịch tế bào được gieo lên
màng ối đã loại bỏ biểu mô, kết thúc nuôi cấy không tiến hành tầng hoá bằng
cách cho mẫu tiếp xúc với không khí [15].
Như vậy, tuỳ từng tác giả, mảnh mô lấy để nuôi cấy có kích thước khác
nhau, phương pháp xử lý bằng enzym cũng hoàn toàn khác nhau. Vì thế, một
trong các mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi là lựa chọn phương pháp nuôi
cấy thích hợp.
1.4. Môi trường nuôi cấy
Môi trường thông dụng nhất sử dụng cho nuôi cấy tế bào gốc là môi
trường Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) có nồng độ glucose
cao. DMEM là môi trường nuôi cấy đệm bicarbonate được thiết kế để duy trì
pH từ 7,2 đến 7,4 với nồng độ CO
2
là 5%. Môi trường nuôi cấy cũng có thời
hạn sử dụng nhất định, đặc biệt khi chúng đã được bổ sung thêm huyết thanh

hoặc glutamin vì khả năng chuyển đổi của L-glutamine và D-glutamine. Điều
kiện bảo quản môi trường thích hợp nhất là trong tối ở 4
o
C. Huyết thanh bổ
sung vào môi trường nuôi cấy thường được dùng là huyết thanh bào thai bê
(Fetal Bovine Serum- FBS) hoặc huyết thanh bò (Bovine Serum - BS). Trong
nuôi cấy biểu mô niêm mạc miệng thông thường được sử dụng đó là DMEM
và Ham’s F12 tỷ lệ 3:1 có bổ sung rất nhiều thành phần khác nhau. FBS được
nhiều tác giả sử dụng để bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào gốc. FBS
đóng vai trò cung cấp năng lượng cho tế bào nuôi cấy và cung cấp các yếu tố
13
kích thích tăng sinh như yêú tố kích thích sinh trưởng tiểu cầu (PDGF), yếu tố
tế bào gốc (stem cell factor). Bên cạnh đó FBS còn làm tăng độ nhớt trong
môi trường và duy trì một áp suất thẩm thấu thích hợp cho các tế bào được
nuôi cấy. Tuy nhiên giá thành của FBS rất cao.
1.5. Ứng dụng của tấm biểu mô niêm mạc miệng
Sau những thành công nuôi cấy trên thực nghiệm, các nhà khoa học đã
thành công trong nuôi cấy tế bào biểu mô niêm mạc miệng để ghép giác mạc
tự thân trên người. Theo Nakamura và cộng sự (2004), khi tiến hành nghiên
cứu trên 6 mắt của 4 bệnh nhân, kết quả sau 2 ngày cấy ghép, bề mặt giác mạc
của bệnh nhân phẳng và trong, biểu mô hoá hoàn toàn. Tân mạch ngoại vi bề
mặt hình thành chỉ thấy ở vùng ngoại biên, không thấy xuất hiện ở trung tâm
giác mạc. Không thấy có biến chứng gì sau mổ. Không có biến chứng gì về
mặt lâm sàng ngoại trừ một số trường hợp bị tổn thương biểu mô nhỏ. Khả
năng nhìn của tất cả các mắt tiến hành phẫu thuật đều cải thiện từ 2 dòng trở
lên ở thời điểm 11 tháng sau phẫu thuật. Với thời gian theo dõi trung bình là
13,8 tháng tình trạng các mắt đều ổn định, biểu mô tồn tại tốt [21].
Theo Nishida K. và cộng sự (2004) báo cáo kết quả trên 4 bệnh nhân bị
LSCD hai bên mắt. Tấm biểu mô nuôi cấy sau 2 tuần được cấy ghép cho kết
quả biểu mô hoá hoàn toàn giác mạc xảy ra trong vòng 1 tuần ở cả 4 mắt, độ

trong của giác mạc được cải thiện tốt trong thời gian theo dõi là 14 tháng và
không thấy xuất hiện biến chứng gì [22]. Leonard P.K. và cộng sự năm 2006
đã công bố kết quả cấy ghép tấm biểu mô niêm mạc miệng người lên giác
mạc bị thiếu hụt hoàn toàn vùng rìa. Các tấm biểu mô giống nhau về mặt hình
thái được tạo ra, chỉ sau 2-5 ngày biểu mô hoá hoàn toàn đã được tạo ra, 19
tháng sau ghép bề mặt giác mạc vẫn ổn định, thị lực của 9 trên 10 mắt tăng
gấp đôi [14]. Nghiên cứu của Inatomi và cộng sự năm 2006 cho thấy: khi tiến
hành trên 15 mắt ở 12 bệnh nhân thiếu hụt tế bào gốc vùng rìa do hội chứng
Stevens-Johnson, bị bỏng nhiệt và hoá học, sau khi được cấy ghép tấm biểu
mô niêm mạc miệng với thời gian theo dõi là 34 tháng thấy bề mặt nhãn cầu
ổn định và tầm nhìn được cải thiện và không có biến chứng gì ở 10 mắt, trong
5 mắt còn lại chỉ có 2 mắt phải phẫu thuật lại [9]. Nghiên cứu của DH. Ma và
cộng sự năm 2009, cho thấy khi áp dụng kỹ thuật này trên 2 mắt bệnh nhân
14
bỏng kiềm cấp, 1 mắt bỏng kiểm mãn và 2 mắt bị bỏng nhiệt mãn. Bệnh nhân
theo dõi với thời gian là 29,6±3,6 tháng (26-34 tháng) đưa ra kết luận về khả
năng áp dụng của tấm biểu mô niêm mạc miệng có thể kích thích quá trình
biểu mô hoá giảm viêm nhiễm trong trường hợp bỏng cấp tính và tái thiết bề
mặt nhãn cầu trong trường hợp mãn tính [15]. Như vậy, đối với bệnh nhân bị
tổn thương BMNC cả hai mắt thì việc sử dụng tấm biểu mô niêm mạc miệng
nuôi cấy để ghép giác mạc là lựa chọn đúng đắn và bức thiết trong giai đoạn
hiện nay.
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng
− Thỏ ta thuần chủng cả hai giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 2,0 ± 0,2 kg.
Thỏ được nuôi trong cùng điều kiện phòng thí nghiệm 5 ngày trước khi làm thí
nghiệm.
− Bánh rau của sản phụ được mổ lấy thai tại bệnh viện Phụ sản Hà Nội.
Tiêu chuẩn chọn là những sản phụ khoẻ mạnh, không có bệnh nhiễm trùng
toàn thân, chưa vỡ ối hoặc vỡ ối trước 6 giờ và có phản ứng huyết thanh âm

tính với: HIV, HBsAg, giang mai.
− Màng ối lấy từ màng rau của bánh rau đã xử lý theo quy trình của bộ
môn Mô-Phôi Trường Đại học Y Hà Nội.
2.2. Địa điểm nghiên cứu
Bộ môn Mô –Phôi Trường Đại học Y Hà Nội.
2.3. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 10/2010 đến tháng 8/2012.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
15
Lấy mô vùng niêm mạc miệng thỏ
Xử lý mẫu
Thu hoạch, định danh tấm biểu mô Nhận định kết quả
Nuôi cấy bằng dịch treo
Nuôi cấy bằng mảnh mô
2.4.1. Mô hình nghiên cứu
Hình1. Mô hình nghiên cứu
16
2.4.2. Chuẩn bị lồng nuôi cấy
 Dụng cụ, vật liệu:
− Lồng nuôi cấy đường kính 24mm, bằng nhựa polycarbonate của hãng
Corning Incorporate của Mỹ.
− Các tấm màng ối 3x3cm đã được xử lý theo quy trình của bộ môn Mô-
Phôi Trường Đại học Y Hà Nội.
 Quy trình xử lý màng ối (Theo Bộ môn Mô-Phôi trường đại học Y Hà Nội) :
− Cắt màng rau ra khỏi bánh rau, sử dụng màng rau trong khoảng 10 cm kể từ
mép bánh rau.
− Rửa màng rau bằng mước muối sinh lý có pha kháng sinh trong 10 phút.
− Nạo sạch máu ở màng rau bằng nạo tế bào. Cắt màng rau thành những miếng
3x3cm.
− Rửa màng rau lần lượt qua hai lần PBS có pha kháng sinh.

− Bóc màng ối ra khỏi màng rau.
− Ngâm màng ối trong Ammonium 10%.
− Nạo sạch cả 2 mặt của màng ối tới khi trong suốt tương đối.
 Rửa lại 2 lần bằng PBS. Các miếng màng ối sẵn sàng được sử dụng
hoặc sẽ được bảo quản trong DMSO 15%.
 Tiến hành căng màng ối vào đáy của lồng nuôi cấy, để khô.
2.4.3. Quy trình lấy mẫu nuôi cấy
− Gây mê tĩnh mạch tai thỏ, sử dụng thiopental liều 20mg/kg cân nặng
 V ị trí trích thủ:

Trích thủ mảnh niêm mạc miệng vùng giữa của má thỏ
kích thước 8x8mm trong phương pháp nuôi bằng dịch treo và 3x3mm
trong phương pháp nuôi bằng mảnh mô. Tiến hành nuôi cấy theo 2
phương pháp.
17
TB biểu mô niêm mạc miệng phát triển ra ngoài mảnh mô
Màng ối
Mảnh niêm mạc miệng
Giếng nuôi cấy
Lồng nuôi cấy
2.4.4. Quy trình xử lý mảnh niêm mạc miệng nuôi cấy
• Rửa mảnh niêm mạc miệng bằng PBS có bổ sung kháng sinh, kháng
nấm.
* Nuôi cấy mảnh mô
• Cắt mảnh mô thành các miếng nhỏ 1 x 1mm.
• Ủ trong dung dịch Dispase 2,4UI/ml trong tủ ấm 37
0
trong 7 phút. Dừng
tác động của Dispase bằng EDTA 0,02% ở nhiệt độ phòng, thời gian 2-3 phút.
• Mảnh niêm mạc miệng sau khi qua sử lý được đặt trực tiếp lên đáy của lồng

nuôi cấy, mặt biểu mô hướng lên phía trên.
• Bơm môi trường nuôi cấy vào lồng nuôi và giếng nuôi.
Giếng nuôi cấy được đặt trong tủ ấm 37
0
C, 5%CO
2
. Thay môi trường
đều đặn 2 ngày/lần. Thời gian nuôi cấy thường kéo dài 14 đến 16 ngày.

Hình 2. Mô hình nuôi cấy bằng mảnh mô
* Nuôi bằng dịch treo tế bào:
• Ủ mảnh niêm mạc miệng trong dispase II 1,2 UI/ml trong tủ 37
0
C, 5% CO
2
,
thời gian 1 giờ.
• Bóc tách lấy phần biểu mô.
• Ủ trong Tripsin 0,1% +EDTA 0,1%.
18
Màng ối
Những cụm tế bào biểu mô niêm mạc miệng
Lồng nuôi cấy
Giếng nuôi cấy
• Nạo lấy lớp đáy của biểu mô.
• Ly tâm lạnh ở nhiệt độ 4
0
C các tế bào biểu mô.
• Đếm tổng số tế bào thu được.
• Tạo dịch treo có mật độ tế bào 5x10

5
tế bào/ml.
• Nuôi cấy trong lồng nuôi cấy:
+ Cho 1 ml dịch treo tế bào vào lồng nuôi cấy.
+ Thêm môi trường vào giếng đặt lồng nuôi cấy.
+ Đặt giếng nuôi cấy trong tủ ấm 37
o
C, 5% CO
2.
Thay môi trường đều
đặn 2 ngày 1 lần. Thời gian nuôi cấy khoảng 14-16 ngày.

Hình 3. Mô hình nuôi cấy bằng dịch treo
2.4.5. Môi trường nuôi cấy, quy trình nuôi cấy và theo dõi
Môi trường SEM (Supplemental Hormonal Epithelial Medium) gồm:
DMEM/F12 tỉ lệ 1:1 của Gibco, bổ xung: peniciline 100UI/ml. Streptomycin
100µg/ml, Amphotericin B 200 µg/ml, Insulin 5µg/ml, 5% FBS, tri-
iodothyronine, isopropranolol.
* Nuôi cấy mảnh mô hoặc dịch treo của biểu mô niêm mạc miệng trong
tủ 37
0
C, 5% CO
2
. Thay môi trường 2 ngày/lần. Theo dõi sự phát triển của các
tế bào biểu mô giác mạc bằng kính hiển vi soi nổi. Khi các tế bào đã phủ kín
19
đáy của lồng nuôi cấy, sử dụng kỹ thuật tạo tầng (air-lifting) để tăng số hàng
cho tấm biểu mô nuôi cấy trong thời gian 2-4 ngày.
Quy trình tạo tầng cho tấm biểu mô nuôi cấy như sau:
+ Khoảng ngày thứ 12 của nuôi cấy, khi thấy các tế bào biểu mô mọc

kín giếng nuôi cấy, tiến hành tạo tầng cho tấm biểu mô.
+ Bơm môi trường vào giếng nuôi cấy và lồng nuôi cấy
+ Hút hết môi trường trong lồng nuôi cấy bỏ đi, để cho các tế bào biểu
mô tiếp xúc với không khí.
+ Đặt giếng nuôi cấy trong tủ ấm 37
o
C, 5%CO
2
.
+ Thay môi trường trong giếng nuôi cấy hàng ngày.
* Lấy tấm biểu mô nuôi cấy để định danh.
2.4.6. Thu hoạch và định danh tế bào nuôi cấy
Sau khi nuôi cấy được tấm biểu mô kích thước 4 cm
2
, tiến hành định
danh tế bào của tấm biểu mô nuôi cấy bằng các kỹ thuật hiển vi quang học,
hoá mô, hoá mô miễn dịch.
a Nhuộm giemsa
Mục đích: quan sát bề mặt của tấm biểu mô nuôi cấy
Tấm biểu mô vừa lấy ra khỏi giếng nuôi cấy được trải phẳng lên lam
kính, cố định bằng cồn Ethylen 100
0
trong 15 phút, sau đó nhuộm giemsa
trong 10 phút. Rửa lam kính dưới vòi nước chảy, để khô, dán lamelle, sau đó
kiểm tra trên kính.
b Nhuộm Hematoxylin-Eosin
Mục đích: quan sát mặt cắt đứng của tấm biểu mô
Tấm biểu mô vừa lấy ra khỏi giếng được cố định ngay bằng dung dịch
Bouin trong 1-2 giờ khử nước bằng cồn 70
o

, 80
o
, 90
o
, 95
o
, 100
o
. Sau khi làm
trong miếng mô bằng cách ngâm lần lượt qua 3 lọ Tuluen tiến hành đúc
miếng mô trong khuôn nến. Cắt mẫu thành những lát mỏng 3-5µm. Nhuộm
màu theo phương pháp Hematoxylin-Eosin (H.E). Quan sát bằng kính hiển vi
quang học.
20
c. Kỹ thuật hiển vi điện tử
Tấm biểu mô được kiểm tra bằng cả kính hiển vi điện tử quét (SEM) và
kính hiển vi điện tử xuyên (TEM).
Mục đích: quan sát cấu trúc siêu vi của tấm biểu mô, tìm các cấu trúc
liên kết giữa các tế bào biểu mô với nhau và giữa tế bào biểu mô với màng ối.
Tấm biểu mô vừa lấy ra khỏi giếng được cố định ngay bằng dung dịch
glutaraldehyde 2,5% pha với đệm PBS trong 2giờ, rửa 3 lần trong 15 phút với
PBS, tiếp tục cố định trong 1giờ 30 phút bằng dung dịch osmium

tetroxide
1%. Sau đó rửa lại miếng mô thêm 3 lần nữa bằng PBS trước khi chuyển qua
cồn để khử nước (50
0
, 70
0
, 80

0
, 90
0
,

95
0
, và 100
0
).
Với TEM, miếng mô sẽ được đúc trong khuôn nhựa epon, cắt lát siêu
mỏng (300-400A
o
). Những lát cắt này sẽ được đặt trên lưới đồng, và được
nhuộm bằng uranyl acetate và citrate chì. Mẫu được đọc trên kính Jeol
1010tại viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương.
Với SEM, miếng mô sẽ được chuyển qua dung dịch hexamethyldisilazane
trong vòng 10 phút, sau đó để khô trong không khí. Khi đã khô, miếng mô được
mạ phủ vàng, sau đó kiểm tra trên kính tại viện 69 Bộ tư lệnh Lăng Chủ Tịch
Hồ Chí Minh.
2.5. Chỉ tiêu nghiên cứu
− Tỷ lệ nuôi tạo thành công tấm biểu mô.
− Chất lượng của tấm biểu mô nuôi cấy.
− Thời gian nuôi cấy.
− Cấu trúc vi thể của tấm biểu mô nuôi cấy.
− Cấu trúc siêu vi thể của tấm biểu mô nuôi cấy.
2.6. Tiêu chuẩn tấm biểu mô niêm mạc miệng nuôi cấy
− Mặt tấm biểu mô phẳng, đều.
− Diện tích khoảng 4cm
2

.
− Nền màng ối đáp ứng được kỹ thuật khâu ghép.
− Tế bào biểu mô hình đa diện, liên kết với nhau, bám dính vào màng ối.
− Có từ 2 đến 5 hàng tế bào biểu mô.
− Không nhiễm khuẩn, nhiễm nấm.
21
1
2
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1.Kết quả
3.1.1. Màng ối làm nền nuôi cấy
 Màng ối chưa xử lý
Màng ối người dùng làm giá đỡ trong nuôi cấy được lấy ở vùng 10cm
tính từ rìa bánh rau.
Khi nhuộm bề mặt bằng giemsa, biểu mô màng ối quan sát được thuộc biểu
mô đơn, các tế bào đa diện khá đều đặn xếp sát nhau, ranh giới rõ (Hình 4).
Hình 4. Bề mặt màng ối người (Giemsa, x 1000)
1. Nhân TBBM màng ối 2. Ranh giới TBBM màng ối
22
1
2
3
4
Trên lát cắt đứng dọc, màng ối gồm 3 lớp rõ: trên cùng là biểu mô
vuông đơn, dưới biểu mô là màng đáy mỏng, dưới màng đáy là một lớp trung
mô vô mạch và thuần nhất (Hình 5).
Hình 5. Màng ối cắt đứng dọc (HE x 800)
1. TBBM màng ối 2. Màng đáy 3. Lớp đặc 4. Màng đệm
 Màng ối đã xử lý
Sau khi ủ với amonium 10% trong vòng 10 phút và nạo sạch cả hai mặt

bằng cái nạo tế bào, màng ối còn lại là một màng rất mỏng, dai, mềm mại và
gần như trong suốt. Khi căng màng ối vào đáy lồng nuôi cấy, xác định mặt
trên của màng ối nhờ vào sự xuất hiện những nếp nhăn trên bề mặt khi làm
màng ối trùng lại. Đây có thể là di tích của các tế bào biểu mô màng ối đã bị
nạo sạch. Một đặc điểm khác có thể phân biệt hai mặt của màng ối sau xử lý
đó là mặt dưới màng ối gồ ghề và ướt hơn so với mặt trên.
23
Cấu trúc vi thể của tấm màng ối nạo biểu mô bằng dung dịch Amonium
10%: màng ối rất mỏng, lớp biểu mô và lớp trung mô đã bị nạo bỏ toàn bộ, phần
còn lại chỉ là lớp màng đáy hoặc còn dính một số lá sợi collagen nhỏ .
Hình 6. Màng ối nạo biểu mô bằng Amonium 10% (HE x 800)
3.1.2 Hình thái vi thể mảnh niêm mạc miệng tại vi trí trích thủ
Biểu mô lợp niêm mạc môi và niêm mạc má là biểu mô lát tầng không
sừng hóa gồm rất nhiều hàng tế bào, các tế bào lớp bề mặt dẹt và vẫn còn
nhân. Lớp tế bào đáy có hình trụ, nhân hình trứng, bào tương rất ưa base. Mô
liên kết dưới biểu mô tạo thành các nhú chân bì cao. Trong mô liên kết chứa
nhiều mạch máu và các tế bào liên kết (Hình 7).
24
Hình 7. Biểu mô niêm mạc miệng (HE x 800)
a. Biểu mô b. Mô liên kết c. Lớp đáy của biểu mô
3.1.3. Tỷ lệ nuôi tạo thành công tấm biểu mô niêm mạc miệng
Sau khi nghiên cứu quy trình trích thủ và xử lý mảnh niêm mạc miệng ổn định, chúng tôi đã Iến hành
nuôi cấy nhiều đợt bằng cả hai phương pháp: nuôi mảnh mô và nuôi dịch treo. Kết quả nuôi tạo thành
công tấm biểu mô niêm mạc miệng được thể hiện trong Bảng 1.
Bảng 1. TY lệ nuôi cấy thành công tấm biểu mô niêm mạc miệng
Phương pháp
nuôi bằng mảnh
mô
Phương pháp
nuôi bằng dịch

treo
Tổng số
Số mẫu nuôi 60 25 85
Số mẫu mọc 37 18 55
Tỷ lệ mọc (%) 61,67% 72% 64,7%
P > 0,05
25
a
c
b