phát hiện người lành mang gen đột biến cyp21a2 gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thẻ thiểu enzym 21-hydroxylase để tư vấn di truyền đọc thêm phát hiện

1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
NGÔ THỊ THU HƯƠNG
PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN
ĐỘT BIẾN CYP21A2 VÀ CHẨN ĐOÁN
TRƯỚC SINH CHO BỆNH TĂNG SẢN
THƯỢNGTHẬN BẨM SINH THỂ THIẾU
ENZYM 21-HYDROXYLASE
Chuyên ngành: Nội tiết – Chuyển hóa
Mã số: 62.72.16.45
ĐỀ CƯƠNG DỰ TUYỂN NGHIÊN
CỨU SINH
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Arg Arginine
ARN Acid ribonucleic
Asn Asparagine
CYP Cytochrome P450
CYP21 Cytochrome P450 21( steroid 21- hydroxylase)
CYP21 Gen steroid 21 - hydroxylase
DNA Acid deoxyribonucleic
E Exon
Gln Glutamine
I Intron
Ile Isoleucine
I2g Đột biến điểm ở intron 2 ( 656A/C →G)
HLA Human leukocyte antigen
KCĐ Không cổ điển
Lys Lysine
Met Methionin

MM Mất muối
NST Nhiễm sắc thể
NHĐT Nam hóa đơn thuần
PCR Polymerase Chain Reaction
Pro Prolin
Phe Phenylalanine
Stop Mã kết thúc
Trp Tryptophan
TSTTBS Tăng sản thượng thận bẩm sinh
Val Valine
3β- HDS 3β- hydroxysteroid dehydrogennase
17-OHP 17 – hydroxyprogesteron
2
21-OH 21- hydroxylase
∆8bp Mất 8bp ở exon 3
3
ĐẶT VẤN ĐỀ
Tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21-hydroxylase là bệnh
gây nên do đột biến gen lặn CYP21A2 định khu trên nhiễm sắc thể số 6, gen
mã hóa để tổng hợp enzym 21-OH, tham gia vào quá trình tổng hợp cortisol
từ cholesteron của vỏ thượng thận. Đột biến gen CYP21A2 gây hậu quả
không tổng hợp hoặc giảm tổng hợp hormon vỏ thượng thận cortisol và
aldosteron, tăng tổng hợp testosteron dẫn đến hình ảnh lâm sàng suy thượng
thận, nam hóa ở trẻ gái và dậy thì sớm giả ở trẻ trai. Thể thiếu enzym 21-OH
chiếm 90% - 95% các thể bệnh của bệnh TSTTBS [5],[16]. Tỷ lệ mắc bệnh
trên thế giới là 1/14.000-1/15.000, trong đó thể thiếu enzym 21-OH chiếm tỷ
lệ 1/13.000 trẻ sinh ra [25],[30],[35]. Ở Việt Nam, chưa có đề tài nghiên cứu
về tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ người lành mang gen bệnh trong khi tại Khoa Nội
tiết Chuyển hóa -Di truyền Bệnh viện Nhi Trung ương, số lượng bệnh nhân
hàng năm mới được chẩn đoán tăng lên, trung bình cứ mỗi năm 40 – 70 trẻ

mới mắc và được điều trị tại khoa và tính tới hết tháng 6 năm 2010 số bệnh
nhân lên đến 512 trẻ [27].
Bệnh không được chẩn đoán sớm và điều trị thích hợp sẽ dẫn đến cơn
suy thượng thận cấp đe dọa tử vong cho trẻ, nếu không được điều trị hay dùng
liều thuốc chưa thích hợp sẽ gây dậy thì sớm giả ở trẻ trai, nam hóa ở trẻ gái.
Bệnh có thể điều trị được bằng liệu pháp hormon thay thế suốt đời. Liệu pháp
gen cũng đã được nghiên cứu nhưng chưa được ứng dụng. Bệnh có thể dự
phòng bằng phương pháp tư vấn di truyền như sàng lọc phát hiện người lành
mang gen bệnh để chẩn đoán trước sinh. Trên thế giới tỷ lệ người lành mang
gen ước tính khoảng 1/60 tùy theo từng chủng tộc [16]. Từ những năm 1970
-1980 nhờ sự phát triển kỹ thuật khuếch đại gen (PCR) người ta đã xác định
được nguyên nhân gây bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH là do đột biến
4
gen CYP21A2 [4],[28] do vậy, trong trường hợp cả hai bố mẹ đều có mang
gen đột biến bệnh thì khả năng sinh con bị bệnh là 25% việc chẩn đoán trước
sinh cho các bà mẹ mang gen đột biến trong gia đình khi mang thai là thực sự
cần thiết để chẩn đoán sớm trước sinh cho con, đặc biệt khi thai bị bệnh là
giới nữ, để giúp trẻ phát triển bình thường, không bị nam hóa từ trong bào
thai, tránh cho trẻ không phải chịu cuộc phẫu thuật chỉnh hình sau sinh. Ngoài
ra, khi biết bà mẹ mang thai trẻ bị bệnh là giới nam các bác sĩ cần lập kế
hoạch chăm sóc điều trị ngay sau sinh để phòng tránh cơn suy thượng thận
cấp và đem lại sự phát triển bình thường về sau cho trẻ [1],[10]. Do vậy chẩn
đoán trước sinh có vai trò rất quan trọng. Để góp phần điều trị sớm bệnh và tư
vấn di truyền cho các gia đình mang gen bệnh chúng tôi tiến hành nghiên cứu
đề tài này với hai mục tiêu:
1. Phát hiện người lành mang gen bệnh cho các thành viên gia đình bệnh
nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH.
2. Nghiên cứu áp dụng quy trình chẩn đoán trước sinh cho một số thai
phụ mang gen đột biến gây bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH và tư
vấn di truyền cho gia đình bệnh nhân.

5
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
2.1. Giới thiệu về bệnh TSTTBS thể thiếu enzym - 21 hydroxylase
2.1.1. Khái niệm về bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh
Tăng sản thượng thận bẩm sinh là một bệnh di truyền gen lặn nằm trên
NST thường, gây ra do giảm hoặc mất hoàn toàn một trong năm enzym tham
gia vào quá trình tổng hợp corticosteroid, dẫn đến rối loạn quá trình tổng hợp
hormon vỏ thượng thận. Trong đó, thể thiếu enzym 21-OH là thể bệnh hay
gặp nhất chiếm tỷ lệ 90-95%, thứ hai thể 11β-hydroxylase chiếm 5-9%, còn
thiếu hụt enzym khác gây các thể bệnh: 3β-HSD,17α-hydroxylase và 20, 22-
desmolase ít gặp hơn.
Tùy theo từng loại đột biến dẫn đến mức độ thiếu hụt enzym 21-OH
một phần hay hoàn toàn mà gây ra các thể lâm sàng: MM, NHĐT, không cổ
điển hay thể khởi phát muộn [1],[7],[13].
2.1.2. Lịch sử nghiên cứu bệnh
Quy luật di truyền của bệnh TSTTBS đã được nhận biết từ những năm
1930 (Broster 1934, Jacobziner 1936) và được mô tả chi tiết vào năm 1951,
bệnh di truyền đơn gen lặn, nằm trên nhiễm sắc thể thường.
Năm 1984, Hite và cs xác định được gen CYP21A2 và giả gen
CYP21A2P có kích thước 3,4kb; nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 6
[23].
Năm 1986, Higashi và cs đã phân tích trình tự nucleotide toàn bộ gen
CYP21A2 và giả gen CYP21A2P. Sau đó, các đột biến đặc hiệu của gen
CYP21A2 đã được tìm thấy là nguyên nhân chính gây thiếu hụt enzym 21-
OH [20].
2.1.3 Vị trí, cấu trúc, chức năng gen CYP21
6
Vị trí gen CYP21 nằm trên NST số 6

Hình 1.1 Nhiễm sắc thể số 6 và vị trí các gen CYP21[16]
Gen CYP21 gồm có 2 bản sao CYP21A2 và giả gen CYP21A2P, cả hai cùng
nằm bên trong phức hợp hòa hợp mô chủ yếu MHC trên cánh ngắn của NST
số 6 vùng 6p21.3. Trong vùng này, gen CYP21A2 và CYP21A2P nằm xen kẽ
với hai gen mã hóa cho bổ thể C4A và C4B mã hóa cho thành phần của C4 bổ
thể [15], [37].
7
Hình 1.2 Cấu trúc phân tủ của gen CYP21 [15]
Gen mã hóa cho enzym 21-OH của vỏ thượng thận là gen CYP21A2,
có kích thước 30 kb và cùng với giả gen không chức năng (nonfunctional
pseudogene), CYP21A2P, nằm trên cánh ngắn, nhiễm sắc thể số 6 (6p21.3),
trong vùng phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (major histocompatibility complex-
MAC) cạnh gen HLA. Gen CYP21A2 và gen tương đồng của nó CYP21A2P,
nằm xen kẽ với hai gen mã hóa cho bổ thể C4A và C4B. Mỗi gen CYP21A2
và CYP21A2P bao gồm 10 exon trình tự nucleotide của hai gen này tương
đồng 98% trong các exon và khoảng 96% trong các intron do vậy trong quá
trình phân bào giảm nhiễm có thể do sự đột biến mất đoạn giữa hai allen hoặc
nhân đoạn một cách hoàn toàn dẫn đến thay đổi cấu trúc của gen CYP21A2 bị
thay thế một đoạn của giả gen CYP21A2P hoặc gây mất đoạn của gen
CYP21A2P. Các thay đổi này gây nên sự bất hoạt của gen CYP21A2 bình
thường và gây nên bệnh lý [16],[22],[38].
Chức năng gen CYP21
8
Gen CYP21 mã hóa cho enzym 21-OH gồm 494 acid amin, có vai trò
phiên mã tổng hợp ARNm tiền thân. Phân tử này trải qua quá trình cắt các
intron nối chính xác các exon với nhau và tạo ra phân tử ARNm hoàn chỉnh.
Phân tử này sẽ được sử dụng làm khuôn dịch mã tổng hợp enzym 21-OH [17]

Hình 1.3 Quá trình tổng hợp enzym 21-OH từ gen CYP21A2 [17]
2.1.4 Một số đột biến gen CYP21

Hầu hết các đột biến gen gây thiếu enzym 21-OH là hậu quả của một
trong hai kiểu tái tổ hợp giữa 2 gen CYP21A2 và CYP21A2P. Trên thế giới
đã tìm thấy gần 100 đột biến khác nhau gây bệnh TSTTBS do thiếu hụt
enzym 21- OH hay gặp là đột biến điểm, mất đoạn, thêm đoạn hoặc thay đổi
cấu trúc gen. Trong đó hay gặp mất đoạn 8bp ở exon 3, dịch khung exon 7 và
đột biến vô nghĩa ở exon 8 [21],[31].
9
Bảng 1. Các đột biến gen CYP21 thường gặp gây TSTTBS cổ điển [2],[32],
[36]
Đột biến
Vị trí
nucleotide
Exon/Intron Tỷ lệ % Kiểu hình
Mất đoạn gen 25-30 Mất muối
Pro30Leu 89C→T Exon 1 5-10 Không cổ điển
I2g 656A/C→G Intron 2 20-25 Mất muối – Nam
hóa đơn thuần
Mất 8bp ∆708-715 Exon 3 5-10 Mất muối
Ile 172Asn 1001T→A Exon 4 5-10 Nam hóa đơn thuần
Ile236Asn,
Val237Glu,
Met239Lys
1382T→A,
1385T→A,
1391T→A
Exon 6 5-10 Mất muối
Val281Leu 1685G→T Exon 7 5-10 Không cổ điển
Phe306+1nt 1759+T Exon 7 <5 Mất muối
Gln318Stop 1996C→T Exon 8 5-10 Mất muối
Arg356Trp 2110C→T Exon 8 10 Mất muối

2.1.5 Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh
10
11-βOH
17- OHP
17,20 lyase
DOC
ACTH
Cholesterol
Pregnenolon
Progestero
n
Corticosteron
Aldosteron
450
SCC
17-OH (NST 10p24-25))
3β-HSD
18-OH
21-OH (NST6, CYP21)
17-OH
17OH-Pregnenolon
DHEA
Δ4 androstenedion
11-deoxycortisol
Testosteron
Cortisol
Ostradiol
3β-HSD (NST 1p13)
11-βOH (NST 8q22)
21-OH

aromase
3β-HSD
17 ketoreductase

Sơ đồ 1.1 Sơ đồ sinh tổng hợp hormon vỏ thượng thận [16]
TSTTBS thể thiếu hụt enzym 21-OH chiếm 90-95% các thể bệnh, do
thiếu hụt enzym 21-OH nên gây thiếu hụt hormon Cortisol và Aldosteron
đồng thời gây tăng tiền chất 17-OHP và tăng tổng hợp testosteron. Do vậy,
ngay từ trong thời kỳ bào thai nồng độ androgen đã tăng cao ít làm biến đổi ở
thai nhi nam, nhưng gây nam hóa của thai nhi nữ dẫn đến tình trạng mơ hồ
giới tính. Biểu hiện lâm sàng của cả trẻ trai và trẻ gái sau sinh bị mắc bệnh
TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH: âm vật phì đại ở trẻ gái, phát triển sớm kích
thước dương vật ở trẻ trai, có rối loạn điện giải ở thể mất muối. Nếu không
được điều trị sớm sẽ gây dậy thì sớm giả ở trẻ trai như mọc lông mu, tăng
phát triển dương vật, lớn nhanh, rậm lông, mọc trứng cá, đặc biệt là cốt hóa
các đầu xương dài sớm gây lùn sau này. Đối với trẻ gái nếu không điều trị
biểu hiện xạm da, ngoại hình nam, rậm lông, bộ phận sinh dục phì đại, rối
loạn kinh nguyệt và vô sinh ở nữ [9],[18],[24].
2.2 Đặc điểm di truyền của bệnh. Phát hiện người lành mang gen bệnh
11
2.2.1 Đặc điểm di truyền của bệnh
TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH là một bệnh di truyền đơn gen lặn,
nằm trên NST thường số 6 và tuân theo quy luật của Mendel. Bệnh chỉ xảy ra
ở người mang đồng hợp tử gen lặn.
Sơ đồ 1.2 Phả hệ một gia đình có con bị bệnh di truyền lặn trên NST thường
(Autosome Recessive). Thế hệ I, II không có người bị bệnh, thế hệ III có người bị bệnh.
Bệnh xảy ra không liên tục, ngắt quãng qua các thế hệ. Thường gặp
bệnh xuất hiện trong cùng một thế hệ. Tỷ lệ nam và nữ bị bệnh là như nhau.
+ Nếu cha mẹ là hai dị hợp tử (Aa x Aa) khả năng con bị bệnh (aa) là
25%, con dị hợp tử (Aa) mang gen lặn là 50%, con bình thường hoàn toàn

(AA) là 25%. Trong quần thể trường hợp này hay gặp nhất.
+ Nếu cha (hoặc mẹ) là người bình thường (AA) kết hôn với người
mang gen dị hợp tử (Aa) thì khả năng sinh ra con bình thường (AA) là 50%,
con bị dị hợp tử (Aa) là 50%.
+ Nếu cha (hoặc mẹ) là người bình thường kết hôn với người bị bệnh
(aa) thì khả năng sinh con mang gen dị hợp tử (Aa) là 100% .
Nguy hiểm của bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường là có người
lành mang gen bệnh, bề ngoài là người hoàn toàn bình thường, khỏe mạnh
nhưng khi xây dựng gia đình sinh con thì truyền bệnh cho con theo tỷ lệ phân
ly gen bệnh của qui luật Mendel. Bệnh truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác.
12
AA
I
IIII
IIII
AA
AA
Aa
Aa
AA
Aa
Aa
Aa
AA
Aa
AA
AA
AA
Aa
Aa

Aa
aa
Aa
Aa
AA
AA
aa
aa
Tần xuất người mang gen bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21–OH là
1/60 tùy thuộc vào chủng tộc. Tần số đột biến tự nhiên mới phát sinh cần có
cả hai đột biến về cùng một gen ở cả hai bên bố mẹ nên xác xuất xảy ra vô
cùng nhỏ. Sự kết hôn trong dòng họ hoặc trong quần thể cô lập làm tăng khả
năng sinh con bị bệnh và tăng tần số người mang gen bệnh lặn trong quần thể
[1],[16],[29].
2.2.2 Biểu hiện lâm sàng của người mang gen dị hợp tử
Mặc dù người ta cho rằng những cá thể mang gen dị hợp tử có thể có các triệu
chứng của thừa androgen hơn những người không mang gen nhưng các
nghiên cứu bệnh chứng không ủng hộ quan điểm này.
Về mặt xét nghiệm, người mang gen dị hợp tử các đột biến gen
CYP21A2 có tăng nhẹ nồng độ 17-OHP, cortisol sau khi kích thích thượng
thận hơn những người bình thường không mang gen [16],[22].
Chẩn đoán bệnh dựa vào lâm sàng và xét nghiệm định lượng nồng độ
17-OHP, testosteron, xét nghiệm tìm đột biến gen CYP21A2. Trong đó, nồng
độ 17-OHP có giá trị cao trong chẩn đoán bệnh, đây là tiền chất trước chỗ tắc
do thiếu hụt enzym 21-OH nên giá trị 17-OHP tăng sớm và tăng cao ở trên
bệnh nhân và người mang gen, người ta còn ứng dụng giá trị này làm sàng lọc
sơ sinh để chẩn đoán sớm bệnh ở các nước phát triển [8],[16].
* Phát hiện người lành mang gen bệnh
Người mang gen bệnh (dị hợp tử) rất khó phát hiện ở bệnh di truyền lặn
vì không biểu hiện tính trạng ra ngoài. Người mang gen bệnh thường có dấu

hiệu về lâm sàng hoặc sinh học nhẹ hoặc hoàn toàn không có dấu hiệu gì. Tuy
vậy có thể phát hiện dị hợp tử bằng phương pháp sinh hóa. Người ta định
lượng 17-OHP cho những người là thành viên của gia đình người bệnh, với
17-OHP <300ng/ml thì là bình thường và 17-OHP >300 - 1499ng/ml thì là dị
hợp tử sau nghiệm pháp kích thích bằng corticotropin (Lee HH el al 2000).
13
Do thiếu hụt enzym 21-OH có liên quan đến typ HLA, nên có thể xác định
đột biến gen CYP21A2 hoặc phát hiện người lành mang gen bằng cách phân
loại typ huyết thanh HLA dựa trên các dấu ấn của bệnh nhân và tế bào ối thai
nhi hoặc đối tượng có nguy cơ cao. Nếu kết quả typ HLA giống nhau và có
thể chẩn đoán thai nhi bị bệnh TSTTBS thể thiếu hụt enzym 21-OH hoặc
người lành mang gen với độ tin cậy cao [2],16].
Hình 1.4 Giá trị 17-OHP sau nghiệm pháp kích thích ACTH trong các
thể bệnh và người mang gen dị hợp tử [33]
Phòng bệnh TSTTBS bằng sàng lọc người mang gen được tiến hành ở gia
đình, dòng họ của trẻ bị bệnh hoặc trong quần thể có tỷ lệ mắc bệnh cao để
quản lý người mang gen và người bệnh. Qua sàng lọc này để có thể đưa ra lời
khuyên di truyền phù hợp nhằm tránh khả năng kết hôn cùng dòng họ cũng
như tránh kết hôn giữa những người mang gen bệnh (Aa x Aa) hoặc giữa
người mang gen bệnh với người bị bệnh (Aa x aa). Nếu kết hôn phải quản lý
thai nghén về phương diện di truyền [2].
2.3 Chẩn đoán trước sinh
2.3.1 Khái niệm về chẩn đoán trước sinh (Prenatal diagnosis)
Chẩn đoán trước sinh là sử dụng các phương pháp xét nghiệm siêu âm,
sinh hóa, di truyền tế bào, di truyền phân tử để xác định xem thai nhi có bị
14
Nồng độ
17-OHP sau
nghiệp pháp
kích thích

ACTH
Nồng độ 17-OHP ng/dl
bệnh di truyền, dị tật bẩm sinh, khi thai còn trong tử cung trước khi đứa trẻ
được sinh ra [3],[10].
Đối với bệnh TSTTBS người ta sử dụng các phương pháp siêu âm thai,
di truyền phân tử để phát hiện xem thai có mang gen đột biến CYP21A2
không từ lúc thai tuần thứ 5 đến tuần thứ 14. Nếu thai nhi nữ thì cần điều trị
sớm từ tuần thứ 7 – 8 của thai kỳ bằng cách sử dụng dexamethason cho mẹ.
Nếu thai nhi nam thì ngưng điều trị nhưng phải lập kế hoạch chăm sóc sau
sinh phòng cơn suy thượng thận cấp ở thể mất muối [13],[14],[19].
Mục đích của chẩn đoán trước sinh với bệnh TSTTBS không phải phát
hiện bệnh để đình sản mà mục đích phát hiện sớm để điều trị vì đây là bệnh di
truyền điều trị được bằng phương pháp thay thế hormon suốt đời. Nhưng nếu
gia đình lựa chọn đình sản thì sẽ phải giúp đỡ bà mẹ đình sản.
2.3.2 Các phương pháp sử dụng để chẩn đoán trước sinh với bệnh
TSTTBS
*Các đối tượng cần chẩn đoán trước sinh với bệnh TSTTBS
+ Những bà mẹ đã được phát hiện là dị hợp tử mang gen đột biến
CYP21A2 khi mang thai cần được chẩn đoán trước sinh.
+ Các bà mẹ đã một lần sinh con bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-
OH có thai cần thiết chẩn đoán trước sinh.
+ Các bà mẹ mang thai mà trong gia đình nội, ngoại có cô, chú, bác
ruột, cậu ruột, dì ruột, bị bệnh thì cũng cần thiết chẩn đoán trước sinh.
+ Các anh, chị em họ bị bệnh cùng thế hệ với thai nhi.
*Các phương pháp sử dụng chẩn đoán trước sinh đối với bệnh TSTTBS
- Phương pháp siêu âm: siêu âm thai được sử dụng trong chẩn đoán trước sinh
từ năm 1972 là phương pháp chẩn đoán thai không xâm phạm, an toàn cho
thai. Do vậy, siêu âm thai là phương pháp can thiệp không thể thiếu trong
15
sàng lọc phát hiện bệnh dị tật của thai nhi. Trong bệnh TSTTBS siêu âm giúp

cho quan sát thai và định khu rau thai [7].
- Chẩn đoán tế bào gai rau: năm 1960 phương pháp sinh thiết gai rau đã được
sử dụng nhưng đến năm 1983 nhờ có siêu âm chỉ dẫn nên phương pháp này
mới được sử dụng rộng rãi giúp cho chẩn đoán thai sớm 3 tháng đầu khi mà
phương pháp chẩn đoán bằng tế bào ối được tiến hành muộn hơn là 3 tháng
giữa. Kỹ thuật sinh thiết gai rau tiến hành qua đường bụng hoặc đường âm
đạo dưới sự hướng dẫn của siêu âm. Thường tiến hành thủ thuật vào thai tuần
thứ 8 đến tuần thứ 11[16],[34].
- Phương pháp di truyền phân tử để phát hiện gen đột biến bằng phương pháp
PCR. Từ những năm 1970 -1980 nhờ kỹ thuật khuyếch đại gen (PCR) mà
người ta đã xác định được một số gen đột biến gây dị tật ở thai nhi [4],[28].
- Phương pháp xác định tế bào và DNA của thai từ máu mẹ: mặc dù tỷ lệ
DNA con trong máu mẹ thấp, có thể chiết tách DNA có nguồn gốc từ thai
trong máu mẹ cho các xét nghiệm phân tử trong chẩn đoán trước sinh.
Phương pháp này rất tốt để chẩn đoán trước sinh TSTTBS vì rất cần kết quả
sớm từ khi thai 5 – 6 tuần để điều trị cho thai nhi nữ nhưng so với sinh thiết
gai rau và chọc ối phương pháp này vẫn còn nhiều hạn chế [10].
Do vậy, để chẩn đoán bệnh trước sinh cho bệnh TSTTBS, có thể sử
dụng một số phương pháp giúp chẩn đoán như định lượng nồng độ 17-OHP
trong nước ối, xác định týp HLA của tế bào gai rau và tế bào nước ối, phân
tích di truyền phân tử của các tế bào gai rau và tế bào nước ối để tìm đột biến
gen CYP21A2 [16].
Năm 1975, người ta đã phát hiện nồng độ 17-OHP nước ối tăng cao ở
phụ nữ có con mắc bệnh TSTTBS thể mất muối. Năm 1976, chẩn đoán trước
sinh bệnh này được tiến hành ở Pháp bằng phương pháp đo 17- OHP trong
nước ối vào thời kỳ 3 tháng giữa của thai sản [26]. Trong nghiên cứu có 274
16
phụ nữ mang thai có nguy cơ sinh con mắc bệnh TSTTBS đã được chẩn đoán
trước sinh bằng các phương pháp khác nhau cho phép kết luận: việc phân tích
steroid trong nước ối là một phương pháp chính xác nhưng cho kết quả muộn

trong việc chẩn đoán trước sinh (3 tháng giữa của thai kỳ) như vậy là quá
muộn để bắt đầu điều trị trước sinh bằng dexamethasone để ngăn ngừa sự
nam hóa ở thai nhi nữ, bởi vì dexamethason nên được bắt đầu dùng ở phụ nữ
mang thai có nguy cơ sinh con mắc bệnh TSTTBS bắt đầu từ tuần thứ 6 – 7
của thai nhi. Phương pháp này ít có giá trị khi bà mẹ đã được uống
dexamethason để ức chế sự nam hóa ở thai nhi nữ (bởi 17-OHP đã bị ức chế)
trừ khi thuốc được dừng trước khi chọc ối 5 – 7 ngày. Năm 1978, ở Mỹ chẩn
đoán trước sinh TSTTBS thể thiếu enzym 21- OH đã được tiến hành cho 624
phụ nữ mang thai tại một bệnh viện của Trường Đại học Y thuộc Đại học
tổng hợp New York. Khi týp HLA được phát hiện liên quan đến bệnh
TSTTBS, phân tích di truyền phân tử bằng cách sử dụng DNA chiết tách từ tế
bào gai rau hay tế bào ối đối với gen CYP21, C4 và HLA lớp I, II [38].
Chẩn đoán trước sinh nhằm mục đích xác định thai bệnh để điều trị
trước sinh. Nếu thai nhi nam bị bệnh thì không phải điều trị trước sinh. Nếu
thai nhi nữ bị bệnh thì cần điều trị trước sinh bắt đầu từ tuần thứ 6 – 7 của
thai kỳ cho đến lúc sinh bằng cách sử dụng dexamethason cho mẹ với liều
chuẩn là 20μg/kg/ngày, tối đa 1,5mg/ngày chia làm 3 lần để ức chế sản xuất
androgen thượng thận của bào thai và làm giảm hiện tượng nam hóa gây phì
đại âm vật, tránh cho trẻ phải chịu đựng một cuộc phẫu thuật chỉnh hình bộ
phận sinh dục sau này. Đến tuần thứ 11–14 sẽ xét nghiệm lại, ngừng điều trị
nếu kết quả xét nghiệm gen cho biết thai nhi không bị bệnh.
Đồng thời, cần lập kế hoạch điều trị ngay sau sinh để phòng cơn suy
thượng thận cấp và đem lại sự phát triển bình thường về sau cho trẻ [13],[16].
2.4 Chẩn đoán sau sinh
17
* Sàng lọc sơ sinh
Mục đích chính của sàng lọc sơ sinh là phát hiện sớm những trẻ bị bệnh
TSTTBS để giúp chẩn đoán bệnh sớm, ngăn chặn trẻ có nguy cơ xuất hiện
cơn suy thượng thận cấp đe dọa tính mạng và ngăn ngừa nhận định sai lầm
giới tính nam ở trẻ nữ bị lưỡng giới cơ quan sinh dục ngoài. Ngoài ra, sàng

lọc sơ sinh còn giúp điều trị để ngăn ngừa nồng độ androgen tăng cao và theo
dõi các biểu hiện lâm sàng để giúp cho trẻ có sự phát triển và dậy thì bình
thường, cải thiện chiều cao cuối cùng. Vì vậy sàng lọc sơ sinh bị bệnh
TSTTBS rất có ích và được khuyến cáo cho tất cả trẻ mới ra đời [1],[27].
Ở các nước phát triển, sàng lọc bệnh TSTTBS bằng phương pháp đo
nồng độ 17-OHP trong máu trên giấy thấm máu ở gót chân vào ngày thứ 2 - 3
sau sinh tăng cao. Ở trẻ đẻ non, trẻ mắc bệnh lý hay stress giá trị 17-OHP có
xu hướng tăng cao hơn những trẻ đủ tháng và thường gặp dương tính giả.
Ngưỡng cắt của nồng độ 17-OHP được khuyến cáo tùy theo cân nặng, đối với
trẻ < 1300 gram là từ 165 ng/ml và đối với trẻ > 2200gram là từ 40ng/ml tại
Wisconsin (Miền tây Hoa Kỳ). Tại Thụy Điển, ngưỡng cắt 17-OHP là
400nmol/l đối với trẻ đẻ non trước 35 tuần và 150 nmol/l đối với trẻ 35-36
tuần. Kết quả sàng lọc dương tính cần được khẳng định bằng định lượng lần 2
nồng độ 17-OHP máu, các steroid nước tiểu hay phân tích gen CYP21A2
[17].
Sàng lọc di truyền phân tử, phân tích gen CYP21A2 không những cần
thiết cho chẩn đoán mà còn có ích giúp khẳng định bản chất của đột biến,
giúp tư vấn di truyền và thiết lập chẩn đoán trong những trường hợp nghi ngờ.
2.5 Tình hình nghiên cứu bệnh TSTTBS trong nước
Năm 1990, Nguyễn Thị Nhạn và cộng sự đã tổng kết 36 bệnh nhân mắc
hội chứng sinh dục thượng thận trong giai đoạn 1981-1990, chiếm tỷ lệ 1,9%
tổng số bệnh nhân nội tiết, có tỷ lệ tử vong là 5,5% [6].
18
Năm 1993, Nguyễn Thị Phượng đã nghiên cứu về phương diện di truyền
trên 31 bệnh nhân hội chứng sinh dục thượng thận tại Bệnh viện Nhi Trung
ương từ năm 1980 – 1990. Tác giả đã nhận thấy bệnh mang đủ các đặc tính di
truyền lặn nằm trên NST thường [7].
Năm 1994, Nguyễn Thị Nhạn tổng kết các dấu hiệu lâm sàng, cận lâm
sàng chung của 55 bệnh nhân TSTTBS điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương
với phác đồ điều trị cấp cứu cơn suy thượng thận hiện nay, gần 95% bệnh

nhân được cứu sống [5].
Năm 2000, Võ Thị Kim Huệ, Nguyễn Thu Nhạn và Nguyễn Thị Phượng
công bố nghiên cứu chẩn đoán và điều trị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-
OH ở 43 bệnh nhân khám và điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương 1989-
1997. Nghiên cứu đưa ra các dấu hiệu lâm sàng và giới hạn giá trị của 17-
OHP, progesteron và testosteron giúp chẩn đoán và sử dụng Hydrocortison và
Florinef điều trị bệnh thay cho Prednisolon đặc biệt tác giả đã sử dụng kỹ
thuật khuếch đại gen (PCR) để phát hiện đột biến [1].
Năm 2001, Thái Thiên Nam nghiên cứu phát hiện đột biến gen cho bệnh
nhân bị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH và thành viên gia đình [4].
Năm 2006, Trần Kiêm Hảo đã nghiên cứu xác định một số đột biến gen
CYP21A2 gây bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH và phát hiện người lành
mang gen bệnh [2].
Năm 2010, tôi đã tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu giá trị 17-OHP trong
theo dõi điều trị bệnh TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH tại Bệnh viện Nhi
Trung ương”
Ngoài ra, đã có một vài đề tài nghiên cứu về phát hiện đột biến gen
CYP21A2 cho các bệnh nhân còn với gia đình bệnh nhân chỉ có một đề tài
của Trần Kiêm Hảo với 5 gia đình được làm xét nghiệm đột biến bằng
phương pháp PCR với mẫu bệnh phẩm là tóc. Vì vậy, chúng tôi tiến hành
19
nghiên cứu đề tài này để giúp cho các bác sĩ nhi khoa có cơ sở vững chắc để
tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh cho gia đình bệnh nhân có nguy cơ.
CHƯƠNG 3
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 1: Đối tượng nghiên cứu là cha,
mẹ, anh, chị, em ruột của bệnh nhân TSTTBS đã được phát hiện đột biến gen
CYP21A2 đang theo dõi và điều trị tại Khoa Nội tiết - Chuyển hóa- Di truyền
Bệnh viện Nhi Trung ương.

Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 2: Các bà mẹ hoặc chị (hoặc em
gái) ruột của bệnh nhân TSTTBS đã được phát hiện là người lành mang gen
đột biến CYP21A2 hiện tại đang mang thai ở tuần thứ 6 trở lên.
Tiêu chuẩn loại trừ:
Gia đình không hợp tác để tiến hành sàng lọc và chẩn đoán trước sinh
3.2 Địa điểm nghiên cứu
20
- Khoa Nội tiết – Chuyển hóa – Di truyền Bệnh viện Nhi Trung ương nơi
chẩn đoán, điều trị và quản lý bệnh nhân TSTTBS.
- Trung tâm Gen và Protein Trường Đại học Y Hà Nội nơi tiến hành các
kỹ thuật di truyền phân tử.
3.3 Thời gian nghiên cứu
Thời gian từ tháng 9 năm 2011 đến 9 năm 2015.
3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp nghiên cứu:
Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu cắt ngang mô tả
Mỗi đối tượng nghiên cứu sẽ có một hồ sơ nghiên cứu bao gồm các
thông tin về bệnh nhân: lâm sàng, chẩn đoán, kết quả đột biến gen và phả hệ
của gia đình, các thông tin về anh, chị, em ruột của bệnh nhân
3.4.2 Cỡ mẫu nghiên cứu
+ Dự kiến cỡ mẫu = 50 gia đình (tương ứng 150 cha, mẹ, anh, chị, em
bệnh nhân)
+ Dự kiến cỡ mẫu để chẩn đoán trước sinh =5- 10 bà mẹ mang thai.
3.4.3. Các nội dung nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu cho mục tiêu 1:
- Lập phả hệ gia đình bệnh nhân TSTTBS.
- Xét nghiệm 17-OHP cho bố, mẹ, anh, chị, em bệnh nhân.
- Kết quả phân tích đột biến gen CYP21A2 cho bố, mẹ, anh, chị, em
bệnh nhân TSTTBS đã tìm thấy đột biến.
Nội dung nghiên cứu cho mục tiêu 2:

- Các thông tin về tình trạng thai sản của các bà mẹ hoặc chị, em gái ruột
bệnh nhân TSTTBS đang mang thai ở tuần thứ 6 trở lên: test HCG, siêu
âm thai, định lượng 17-OHP, testosteron trong dịch ối.
21
- Xác định giới tính thai nhi phương pháp PCR
- Phân tích gen CYP21A2 cho thai nhi
- Điều trị cho thai nhi nữ bị bệnh theo phác đồ
3.4.4 Các bước tiến hành nghiên cứu
Các bước tiến hành cho mục tiêu 1:
- Các bệnh nhân được chẩn đoán TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH đang được
điều trị và theo dõi tại Khoa Nội tiết - Chuyển hóa-Di truyền Bệnh viện Nhi
Trung ương được chẩn đoán xác định TSTTBS dựa vào [1],[8],[9],[25]:
• Lâm sàng
+ Thể mất muối: có biểu hiện suy thượng thận cấp, có phì đại âm vật ở
trẻ gái và phì đại dương vật ở trẻ trai.
+ Thể nam hóa đơn thuần: dậy thì sớm giả ở trẻ trai, chuyển giới bộ
phận sinh dục ngoài ở trẻ gái phát triển thể lực nhanh và xuất hiện các dấu
hiệu dậy thì sinh dục phụ.
• Cận lâm sàng :17-OHP >6nmol/L. Nồng độ Progesteron >1,1nmol/L.
Nồng độ Testosteron máu >1nmol/L, ĐGĐ: Na
+
giảm <133mmol/l,
K
+
tăng >5,2mmol/l (ở thể mấtmuối), NST 46XX (trẻ gái)
+ Có xét nghiệm tìm thấy đột biến gen CYP21A2.
- Lập phả hệ cho gia đình bệnh nhân.
- Các thành viên trong gia đình bệnh nhân bị TSTTBS đã phát hiện đột biến
gen CYP21A2 đều được lấy máu ngoại vi để làm xét nghiệm định lượng nồng
độ

17- OHP trong máu đồng thời lấy máu ngoại vi để chiết tách DNA theo
phương pháp Phenol/ chloroform. Tiến hành phát hiện đột biến điểm bằng kỹ
thuật giải trình tự gen và đột biến mất đoạn bằng kỹ thuật MLPA Theo quy
trình sau: [11]
3.4.4.1. Chiết tách DNA
22
Lấy 2ml - 5ml máu ngoại vi của các thành viên trong gia đình bệnh
nhân, sử dụng kít tách chiết DNA của QUIAGEN. Đo và kiểm tra nồng độ
DNA bằng máy đo nồng độ Nano Drop 1000, chỉ những mẫu DNA có độ tinh
sạch 1,8-2 mới được sử dụng để phát hiện đột biến.
3.4.4.2 Giải trình tự gen CYP21A2 và phân tích kết quả.
Phương pháp phát hiện chính xác các đột biến điểm của gen CYP21A2.
Kết quả được phân tích bằng phần mềm Chromas và Chromas Pro, sau đó
được so sánh với trình tự chuẩn của Gene Bank.
- Sử dụng hai mẫu DNA đã được khuếch đại: Mẫu DNA thứ nhất có trình tự
bao gồm cả vùng promoter và toàn bộ gen (cặp mồi A). mẫu DNA thứ hai
(cặp mồi B) bao gồm exon 1 đến exon 6.
- Các mồi xuôi của A và mồi ngược của B là những mồi đặc hiệu. Còn các
mồi ngược của A và mồi xuôi của B có thể bắt gặp được với cả gen
CYP21A2 và gen CYP21A2P.
- Giải trình tự gen của cả hai mẫu DNA trên có thể nhận biết được các chuyển
đoạn lớn, nhỏ.
Quy trình thực hiện
1. Tinh sạch sản phẩm PCR.
2. Phân tích 0,1 thể tích DNA trên gel agarose chứa 1µg/ml ethidium
bromide.
3. Pha trộn hỗn hợp trong ống Eppendof gồm: hỗn hợp mastemix,
Terminator Ready Reaction mã, Primer và sản phẩm PCR. Mỗi phản ứng
PCR sequencing sử dụng duy nhất một mồi. Chạy mẫu với chu trình nhiệt tối
ưu. Tinh chế sản phẩm bằng ABI phenol/ chloroform. Thu tủa DNA bằng ly

tâm. Loại bỏ Ethanol. Để khô qua đêm.
Các đột biến trên toàn bộ gen CYP21A2 được phát hiện bằng kỹ thuật giải
trình tự trên máy ABI-3100 phân tích bằng phần mềm CLCmain Workbench.
23
Phương pháp phân tích kết quả
- Các nucleotid trên gen sẽ được biểu hiện bằng các đỉnh (peak) với 4 mầu
tương đương với 4 loại nucleotid A,T,G,C. So sánh trình tự gen của bệnh
nhân với trình tự gen chuẩn của Gen Bank.
- Lập biểu đồ đột biến gen cho từng gia đình bệnh nhân.
Các đột biến gen CYP21A2 tìm thấy được mô tả theo quy ước quốc tế.
Hình 3.1 Phân tích đột biến bằng giải trình tự gen và phương pháp singleplex
minisequencing cho gia đình có con bị TSTTBS thể thiếu enzym 21-OH ở Đức [29]
24
Hình 3.2. Hình ảnh đột biến điểm bằng phương pháp giải trình tự gen của trong gia
đình bệnh nhân TSTTBS ở Trung Quốc. Gia đình thứ 1 có hai con gái bị bệnh. Hình
a,c: con gái thứ 1 bị bệnh; hình b,d: con gái thứ 2 bị bệnh, hình e: bố bệnh nhân;
hình f: mẹ bệnh nhân. Gia đình thứ 2: hình g: con gái bị bệnh, hình h: em trai bệnh
nhân mang gen dị hợp tử; hình i: bố bệnh nhân mang gen dị hợp tử [20]
3.4.4.3 Phát hiện đột biến mất đoạn bằng kỹ thuật MLPA (Multiplex
ligation – dependent probe amplification)
Sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC- Holland) sàng lọc 06 đột biến
thường gặp: P30L (Exon 1), mất đoạn 8bp (Exon 3), I172N (Exon 4), exon 6
Cluster (Exon 6), Q318 (Exon 8), mất toàn bộ gene CYP21A2, mất đoạn
30Kb (Exon 3 hybrid)
Probe hỗn hợp sử dụng trong chẩn đoán đột biến gene CYP21A2 gọi là
P050-B2. Hỗn hợp probe này bao gồm 5 probe cho exon 1, 3, 4, 6 và 8 của
gene CYP21A2, tương đương với các đột biến mất đoạn 8bp, I172, E6 cluster
và Q318. Hơn nữa, Probe hỗn hợp này còn bao gồm 3 probe đặc hiệu cho
gene CYP21A2P, 3 probe cho vùng TNXB, 2 probe cho bổ thể C4A, C4B và
1 probe cho gene CREBL1 nằm ở vị trí cánh dài của vùng TNXB. 19 probe

đặc trưng cho gene của người cũng được sử dụng trong hỗn hợp để làm đối
chứng trong đó có 3 probe trên NST số 6 nhưng ngoài vùng 6p21.3. Kỹ thuật
25