SẢN XUẤT ENZYME PECTINASE TỪ CHỦNG ASPERGILLUS NIGER

Công nghệ sản xuất enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger
ĐỀ TÀI : CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME PECTINASE
TỪ CHỦNG ASPERGILLUS NIGER
MỤC LỤC
GVHD: Phạm Thị Hương 1 Lớp 10SH – Nhóm 5
Công nghệ sản xuất enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger
Lời Mở Đầu
Công nghệ enzyme được phát triển rất mạnh từ đầu thế kỷ XX đến
nay, đem lại những thuận lợi lớn và mở ra sự phát triển mạnh mẽ hơn
nữa cho ngành công nghệ thực phẩm.
Enzyme pectinase thường được dùng trong công nghiệp thực phẩm
và dược phẩm đặc biệt, nó có vai trò hết sức quan trọng trong quá trình
bảo quản trái cây và rau quả.
Pectinase có thể được sản xuất từ nhiều loại vi khuẩn và nấm mốc,
nhưng Aspergillus là nguồn chủ yếu. Sản phẩm từ Aspergillus niger cũng
được Cục quản lý thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) chứng nhận là
sản phẩm an toàn. Ngoài ra, Aspergillus niger còn là một nấm mốc có
khả năng phát triển nhanh chóng trên các cơ chất rẻ tiền và tiết ra
enzyme vào trong môi trường, dễ dàng thu hồi [2].
GVHD: Phạm Thị Hương 2 Lớp 10SH – Nhóm 5
Công nghệ sản xuất enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger
1. Tổng quan về enzyme pectinase
1.1. Khái niệm
Pectinase là nhóm enzyme xúc tác sự phân cắt các hợp chất pectin
thành các hợp phần khác nhau như axit galacturonic, arabinose,
galactose, methanol….[3].
1.2. Phân loại [5]
Dựa vào tính đặc hiệu, cơ chế tác dụng kiểu phản ứng, pH tối ưu của
enzyme. Năm 1966, Koller và Neukom phân loại chia pectinase thành hai
nhóm chính: hydrolase và transeliminase. Cả hai nhóm này đều có đặc
điểm chung là gỉam độ nhớt của dung dịch pectin và làm giảm khối lượng

phân tử của các sản phẩm tạo thành.
Dựa vào cơ chế tác dụng của chúng gồm các loại như sau:
pectinesterase (PE), Polymethylgalacturonic (PMG), polygalacturonase
(PG), Pectate lyase (PEL). Ngoài ra còn có: pectin-transelimiase (còn gọi
là poly-α-1,4 galacturonite- methylesteglucanoliase) là enzyme tác dụng
trên pectin và trên pectinic acid. Polygalacturonate-transelimiase (còn gọi
là poly-α-1,4 D-galacturonite- glucanoliase) là enzyme tác động trên
pectic acid và pectinic acid. Pectin lyase (PNL) xúc tác sự phân cách các
đơn vị galacturonate đã bị ester hoá. Tất cả các PNL đều là endo –
enzyme.
1.3. Cơ chế tác động [4]
Pectinesterase ( PE ): Enzyme này xúc tác sự thuỷ phân liên
kết ester phức tạp của pectin và protopectin, sản phẩm tạo thành là rượu
methylic và acid pectinic hay acid polygalalacturonic. Người ta nhận thấy
rằng PE chỉ phân cách liên kết ester giữa các nhóm metoxyl và -COOH tự
do.
PE tách gốc methyl khỏi phân tử pectin làm lộ ra các nhóm
carboxyl rất linh động, dễ kết hợp với các ion kim loại như Ca
2+
để tạo
thành các muối không hoà tan, kết lắng lại và có thể tách ra dễ dàng.
PE của nấm mốc sẽ thuỷ phân trước tiên là nhóm methylester nằm
giữa hai nhóm carboxyl tự do. Và enzyme sẽ thuỷ phân lần lượt các liên
kết ester dọc theo phân tử pectin. Chẳng hạn đối với tác dụng của PE từ
nấm mốc Asp. Niger cần thiết có pectin ester hoá ở mức độ cao từ 70 %
trở lên.
GVHD: Phạm Thị Hương 3 Lớp 10SH – Nhóm 5
Công nghệ sản xuất enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger
pH tối ưu của PE từ nấm mốc là 4.5 -5.5, còn của chế phẩm đã loại
bỏ enzyme polygalacturonase sẽ có pH tối ưu từ 2.0 – 6.5. Nhiệt độ tối ưu

của PE từ nấm mốc là 40 – 45
0
C, từ 55- 62
0
C thì vô hoạt. Các ion kim
loại đặc biệt là Na
+
và Ca
2+
và các muối clorua của chúng sẽ hoạt hoá PE
từ nấm mốc Asp.niger. Trái lại , các cation hoá trị 3 và 4 ( thuỷ phân
nitrat, FeCl
2
, Al
2
(SO
4
)
3
) sẽ kìm hãm tác dụng của PE.
Ảnh hưởng của các ion kim loại khi kích hoạt enzyme PE có thể có
liên quan đến tương tác của nó với cơ chất. Polygalacturonic acid là một
chất ức chế cạnh tranh trong phản ứng thuỷ phân nhờ sự xúc tác của PE.
Sự liên kết của các ion kim loại và các nhóm carboxylate trong trường
hợp này có khuynh trung hoà ảnh hưởng ức chế của cơ chất pectin lên
enzyme. Tuy nhiên lượng dư các ion này trên thực tế gây ra sự bất hoạt
của PE vì các ion kim loại bị bao vây bởi các nhóm carboxylate nằm kế
cận với các liên kết ester cần thiết cho phản ứng thuỷ phân xảy ra.
Polymethylgalacturonase ( PMG): Là enzyme tác động trên
acid polygalacturonic đã được metoxyl hoá ( tức là pectin). Enzyme này

có tên hệ thống là poly- α - 1,4 galacturonic –
methylesterglucanohydrolase ( E.C.3.2.1.41), lại được chia thành hai
nhóm nhỏ:
 Endo – glucosidase – polymethylgalacturonase kiểu 1 (Endo PMG
I) : Là enzyme dịch hoá, pectin có mức độ metoxyl càng cao thì bị thuỷ
phân bởi enzyme này càng nhanh và càng có hiệu quả cao. Trong dung
dịch khi có mặt của enzyme pectinesterase thì hoạt độ của enzyme này
thường bị giảm. Enzyme này phổ biến ở một số nấm mốc như: Asp.niger,
Asp.awamori,Botrytis cinerea…
 Exo – glucosidase – polymethylesterase kiểu III ( Exo- PMG-III): Là
enzyme đường hoá, enzyme này có thể cắt từng acid galacturonic ra khỏi
pectinic hay pectin. Exo – PMG- III có ái lực với các gốc acid galacturonic
đã được metoxyl hoá nghĩa là phân cắt liên kết α - 1,4 glucoside ở đầu
mạch nằm giữa hai gốc acid galacturonic có nhóm -COOCH
3
.
 Polygalacturonase ( PG) : Là enzyme tác dụng trên acid
pectinic hoặc pectic. PG lại được chia thành hai nhóm nhỏ:

Endo – glocosidase – polygalacturonase kiểu II (Endo
– PG II): Là enzyme dịch hoá, enzyme này có thể thuỷ phân acid pectinic
hay acid pectic và chỉ tác dụng khi có mặt nhóm _COOH tự do.
GVHD: Phạm Thị Hương 4 Lớp 10SH – Nhóm 5
Công nghệ sản xuất enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger
Hoạt độ của Endo-PG II sẽ tăng lên nhiều khi cơ chất được xử
lý sơ bộ bằng PE. Đa số vi khuẩn và nấm mốc là những vi sinh vật tổng
hợp được enzyme này.

Exo – glucosidase – polygalacturonase kiểu IV ( Exo-
PG-IV): Enzyme này thường có ái lực mạnh đối với các liên kết glucoside

ở cuối mạch phân tử acid pectinic hay acid pectic nhưng bên cạnh đó
không có nhóm methyl.
Có lẽ để tạo được phức enzyme - cơ chất thì trong phân tử cơ
chất phải có nhóm carboxyl tự do liền kề với liên kết bị đứt.
 Pectate lyase ( PEL): Năm 1960, P. Abershim lần đầu tiên
đưa ra thông báo về phân huỷ phân tử pectin không bằng con đường
thuỷ phân. Enzyme tham gia vào quá trình đó gọi là pectate lyase.
Enzyme này xúc tác phá vỡ mối liên kết α - 1,4 glucoside, tiến tới làm
mất hoạt tính nguyên tử hydro ở C5, tạo thành mối liên kết đôi giữa C4
và C5.
Dựa trên cơ chế tác dụng của pectate lyase, người ta chia nó thành
hai nhóm:
 Endo – pectatelyase: Tham gia thuỷ phân phân tử
polygalacturonic ở chỗ khác nhau của dãy tạo nên acid galacturonic.
 Exo – pectatelyase: Tham gia phân huỷ thành phần mạch
vòng của acid digalacturonic.
Pectate lyase (PEL ) là enzyme vi sinh vật ngoại bào.
1.4. Nguồn thu nhận enzyme pectinase [5]
Thực vật: Enzyme pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong
chanh, cà chua, trong một số quả khác Thường là có nhiều enzyme
pectinesterase (PE ).[4
Đặc điểm của pectinesterase thực vật: Enzyme này thường tồn tại
dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm trong phần vỏ tế bào. PE ở thực vật
nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi kiềm. Các cation kim
loại ở nồng độ thấp, như Ca
2+
chẳng hạn, có khuynh hướng làm tăng
nồng độ hoạt động của enzyme. Các PE có nguồn gốc thực vật phản ứng
theo kiểu làm hình thành các khối pectin chứa các nhóm carboxylate dọc
theo mạch pectin.

Vi sinh vật: Nhiều vi sinh vật trong đất, trong nước có khả năng
phân giải pectin. Chúng có ý nghĩa quan trọng không những đối với vòng
GVHD: Phạm Thị Hương 5 Lớp 10SH – Nhóm 5
Công nghệ sản xuất enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger
tuần hoàn carbon trong tự nhiên mà còn đối với một số ngành sản xuất
công nghiệp (ngâm đay, gai, làm bia, làm giấy…). Một số vi sinh vật có
khả năng phân giải pectin mạnh mẽ: Aspergillus ccum, Aspergillus
niger, Aspergillus awamori, Clostridium roserum…
Đặc điểm của E. pectinase ở vi sinh vật: Tất cả các vi sinh vật để
thu nhận enzyme pectinase đều là hiếu khí. Sự phân bố các kiểu enzyme
pectinase ở vi sinh vật không giống nhau: có cơ thể chỉ tạo được một
enzyme song đa số cơ thể khác lại tạo ra được một phức hệ enzyme
pectinase khác nhau, tuỳ theo loài.
Ví dụ: Sac. Fragilis chỉ tạo ra duy nhất một loại enzyme phân giải
pectin là endopolygalaturonase. Còn ở nấm mốc Aspergillus niger thường
tạo được một phức hệ enzyme pectinase khác nhau.
Các enzyme pectinase ở vi sinh vật có thể là enzyme cảm ứng hoặc
enzyme bản thể. Ngoài ra enzyme pectinase ở vi sinh vật còn khác nhau
ở một số tính chất.
1.5. Giới thiệu về cơ chất pectin
Pectin là polysaccarit của thực vật, tồn tại dưới 2 dạng : Protopectin
không tan (tồn tại chủ yếu dưới dạng liên kết ở thành tế bào) và dạng
Pectin hòa tan (tồn tại chủ yếu ở dịch tế bào).Pectin hòa tan là
polysaccarit, cấu tạo từ các gốc α-D-galacturonic, các đơn vị này nối với
nhau nhờ liên kết 1-4 glucozit [11], trong đó, một số gốc axit có chứa
nhóm thế metoxy (-OCH3) [8].
Trong pectin tự nhiên có khoảng ¾ số nhóm axit bị metyl hóa.
GVHD: Phạm Thị Hương 6 Lớp 10SH – Nhóm 5
Công nghệ sản xuất enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger
Khối lượng phân tử pectin trong khoảng 3.000 – 280.000, từ nguồn

gốc thực vật. Dung dịch pectin có độ nhớt cao.
Độ hòa tan của pectin trong nước phụ thuộc vào mức độ ester hóa
nhóm cacbonyl. Mức ester hóa càng cao độ hòa tan càng cao. Pectin hòa
tan dưới tác dụng của kiềm loãng hay enzym pectase sẽ giống nhóm
metoxyl tạo rượu metylic và axit pectic tự do.
1.6. Ứng dụng của enzyme pectinase [1]
- Trong công nghiệp thực phẩm, pectinase được sử dụng rộng rãi
để tăng tốc độ lọc, tăng hiệu suất ép nước quả, giúp nước quả trong
trong quá trình tồn trữ không có hiện tượng đục do pectin bị lắng
trở lại, trong sản xuất nước quả, enzyme pectinase được sử dụng
cho mục đích bẻ gãy liên kết C-C hay –C-O- trùng hợp như pectin,
hemixenlulo, tinh bột. Vì vậy làm tăng hàm lượng nước ép trái cây,
cải tiến những chất trong nước quả như hàm lượng acid, chất thơm
chất màu, giảm độ nhớt và tăng độ trong đến hiệu suất cao nhất.
- Enzym pectinase được dùng trong công nghệ y dược với mục
đích trích ly dược liệu. Khắc phục được nhược điểm của phương
pháp trích ly thông thường tốn nguyên liệu, thời gian, tách không
kiệt được chất trong bã thuốc, dược liệu bị keo nhầy không chiết
được, hoặc bị đục trở lại sau thời gian tồn trữ.
- Pectinase còn được sử dụng trong quá trình ngâm đay, gai để tách
sợi cellulose nhưng không phá hủy sợi, ứng dụng trong chế biến trà,
ca cao, nước táo và các loại nước giải khát.
2. Tổng quan về chủng Aspergillus niger
2.1. Giới thiệu chung
Aspergillus niger là loài phổ biến nhất trong chi Aspergillus, phân bố
rộng rãi trên các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm nông công nghiệp
và ở nhiều vùng địa lư khác nhau trên thế giới. Hiện nay, A. niger được sử
dụng chủ yếu trong công nghiệp sản xuất enzyme (điển hình như α -
amylase, glucoamylase, pectinase, protease, cellulase), trong công
nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp sản xuất

một số acid hữu cơ như acid citric, acid gluconic,…(Pansear et al., 2010).
2.2. Phân loại khoa học [6, 10]
Sinh giới: Eukaryot
Giới: Fungi
Ngành: Amastigomycota
Ngành phụ: Ascomycotina
GVHD: Phạm Thị Hương 7 Lớp 10SH – Nhóm 5
Công nghệ sản xuất enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger
Lớp: Ascomycetes
Lớp phụ: Plectomycetidae
Bộ: Eurotiales
Họ: Eurotiaceae
Giống: Aspergillus
Loài: Aspergillus niger
Nguồn: umbali, (2005)
2.3. Đặc điểm cấu tạo [6]
Tên nấm mốc Đặc điểm khuẩn lạc Đặc điểm vi thể
A.niger
[6]
Khóm nấm mốc có
đường kính 4 ¸ 5 cm
trên thạch Czapek sau
5 ngày. Khóm nấm
mốc màu đen hoặc
nâu đen lấm tấm như
bã cafe.
Bông hình cầu có màu
đen. Bọng hình cầu.
Thể bình 1 hoặc 2
tầng, ở đa số loài thể

bình 2 tầng, Metulae
dài gấp đôi tầng
Phialides. Vách cuống
conidi trơn. Hạt đính
hình cầu đến gần cầu,
có gai rõ.
Trụ nấm tách biệt và có hyalin. Các bào tử có nguồn gốc xuất phát
từ các tế bào chân đáy trên trụ đỡ và kết thúc bằng một túi nấm ở đầu.
Túi này là một sự hình thành đặc trưng cho giống nấm Aspergillus. Hình
thể và màu sắc của các bào tử nấm khác nhau giữa các loài. Aspergillus
có bào tử màu đen.
Cơ thể dạng sợi, gọi là khuẩn ty hay sợi nấm (hypha), nhiều sợi
(lypha), hợp lại thành hệ sợi nấm (mycelium).
Khuẩn ty của nấm mốc A.niger tăng trưởng ở ngọn, vừa dài ra vừa
ngăn vách tạo thành nhánh. Khuẩn ty có 2 loại:
GVHD: Phạm Thị Hương 8 Lớp 10SH – Nhóm 5
Công nghệ sản xuất enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger
Khuẩn ty cơ chất (hay khuẩn ty dinh dưỡng) có kích thước nhỏ, màu
trắng, bám chặt vào cơ chất môi trường và hấp thu các chất dinh dưỡng.
Các khuẩn ty này bện thành khối. Khi già hệ sợi nấm mốc ngả sang màu
vàng.
Khuẩn ty khí sinh (hay khuẩn ty sinh sản) có kích thước lớn hơn
khuẩn ty cơ chất nhiều lần, trong suốt trên bề mặt cơ chất và từ khuẩn ty
khí sinh sẽ có 1 sợi phát triển thành cơ quan sinh sản đặc biệt, mang bào
tử.
Thành của khuẩn ty nấm có cấu tạo sợi, thành phần hóa học chính là
chitin và glucan.
2.4. Đặc điểm sinh lý [6]
Loại Aspergillus niger phân bố nhiều trong tự nhiên, trong đất, ở xác
bã thực vật, hoa quả và đặc biệt có nhiều ở vùng khí hậu ấm áp.

Chúng là những cơ thể hiếu khí sống hoại sinh hoặc kí sinh, không có
khả năng quang hợp tạo chất hưu cơ mà sống nhờ khả năng hấp thụ các
loại chất hữu cơ có sẵn qua bề mặt khuẩn ty.
2.5. Đặc điểm sinh hóa [6]
Khả năng đồng hóa các loại đường khác nhau : A.niger đồng hóa tốt
các loại đường như glucose, fructose, saccharose, mannose. Đối với
đường sorbose, galactose, A.niger đồng hóa ở mức khá tốt, còn đường
lactose thì đồng hóa ở mức trung bình.
Nguồn dinh dưỡng nitơ : A.niger có khả năng sử dụng ure làm nguồn
N và chất điều chỉnh pH, dưới tác dụng của enzyme urease, ure phân hủy
thành CO
2
và NH
3
. A.niger đồng hóa các muối amon. Việc sử dụng nguồn
N hữu cơ, urease và các muói amon đều gắn liền với việc tách NH
3
ra rồi
hấp thụ vào cơ thể. Như vậy NH
3
là trung tâm của con đường dinh dưỡng
nitơ của vi sinh vật.
Nguồn dinh dưỡng khoáng phospho : Sự có mặt của các hợp chất
phospho và nồng độ của chúng trong môi trường có ảnh hưởng rất lớn
đến quá trình trao đổi chất trong tế bào vi sinh vật. Thay đổi nồng độ các
hợp chất phospho trong môi trường sẽ dẫn đến thay đổi các quá trình
tổng hợp hàng loạt các chất hợp phần của tế bào có chứa phospho, tế
bào và chất nhân. Ngoài ra, phospho có trong môi trường còn có tác
dụng điều chỉnh hoạt tính hệ enzyme đồng hóa các loại thức ăn cacbon.
GVHD: Phạm Thị Hương 9 Lớp 10SH – Nhóm 5

Công nghệ sản xuất enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger
Khả năng sinh tổng hợp enzyme : A.niger có khả năng sinh các
enzyme như amylase, protease, peptinase, và đặc biệt là hệ enzyme
cellulase.
2.6. Đặc điểm sinh sản [6]
A.niger có thể sinh sản theo hai hình thức chính:
- Sinh sản sinh dưỡng: từ một đoạn khuẩn ty riêng lẻ có thể phát
triển thành một hệ sợi nấm. Khuẩn ty của nấm mốc có thể lẫn vào bụi,
không khí bay đi khắp nơi, gặp điều kiện thuận lợi sẽ nhanh chóng phát
triển thành khuẩn lạc mới.
- Sinh sản vô tính: Reaper và thơm (1968) cho rằng A.niger sinh
sản vô tính bằng bào tử trần (conidium). Hầu như các bào tử trần là các
bào tử ngoại sinh, nghĩa là được hình thành ở bên ngoài tế bào sinh bào
tử trần (conidiogenóu cell). Các bào tử này sinh ra trực tiếp trên khuẩn ty
hoặc đặc biệt là cuống bào tử trần (conidiophone).
GVHD: Phạm Thị Hương 10 Lớp 10SH – Nhóm 5
Công nghệ sản xuất enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger
3. Thu nhận enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger
3.1. Cơ chế sinh tổng hợp enzyme
( 2 enzyme tiêu biểu : PE, PG)
Tùy theo nguồn cơ chất sử dụng mà chủng A. niger sinh ra các loại
enzyme khác nhau trong hệ pectinase như PE, PG. V.vv.
3.1.1.Các cơ chất thường hay sử dụng
Cơ chất pectin từ nguồn phụ phẩm nông nghiệp được ưa chuộng
nhất (Patil và Dayanand, 2006). Hàm lượng pectin cao (15 - 25%) trong
các phụ phẩm nông nghiệp như cám mì , bã mía, bã củ cải đường, xác
đậu cô ve, vỏ chanh và bã táo là những nguồn cơ chất thích hợp cho việc
sản xuất enzyme pectinase nguồn gốc vi sinh. Ngoài ra, độ methoxyl hóa
cao (65 ÷ 75% DE) của pectin trong phụ phẩm nông nghiệp chính là điều
kiện thuận lợi cho hoạt động sinh tổng hợp PME (PE) 10].

3.1.2.Các nghiên cứu trước đây liên quan tới việc tổng hợp
enzyme pectinase từ Aspergillus niger
• Maria A. Martos và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của các
điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh enzyme PE và PG của chủng A.Niger
N
0
300 trên môi trường tổng hợp có chứa pectin. Kết quả tối ưu hóa bằng
quy hoạch thực nghiệm cho thấy điều kiện nuôi cấy tối ưu để tổng hợp
PG cao ( đạt 1032U/l) là pH = 4,1, hàm lượng pectin : 20g/l, thời gian lên
men là 74h trên môi trường lỏng. Tại điều kiện này, quá trình tổng hợp PE
là thấp.[13]
• Năm 2010, Vivek Rangrajan và cộng sự, tiến hành nghiên cứu tổng hợp
pectinase từ cơ chất là bột vỏ cam sấy khô và chiết xuất vỏ cam có bổ
sung nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ, sử dụng chủng A. Niger. Kết quả cho
thấy hàm lượng pectinase tổng hợp được cao nhất trong môi trường chiết
xuất vỏ cam bổ sung peptone và môi trường vỏ cam bổ sung sữa đậu
nành. Hoạt độ endopectinase lớn nhất ( 6800U/g) đạt được khi nuôi cấy
chìm trong môi trường chiết xuất vỏ cam có bổ sung nguồn nito hữu cơ là
peptone. Hàm lượng pectinase tổng hợp trong môi trường bổ sung nguồn
nitơ vô cơ bằng phương pháp chìm và nuôi cấy trên môi trường rắn đều
thấp.[14]
• R.R.Siva Kiran và cộng sự đã nghiên cứu tối ưu hóa quá trình tổng hợp
endo-polygalacturonase bởi chủng A.niger đột biến trên môi trường rắn.
Nghiên cứu đã sử dụng mô hình Plackett –Burman và tối ưu hóa bằng
GVHD: Phạm Thị Hương 11 Lớp 10SH – Nhóm 5
Công nghệ sản xuất enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger
phương pháp quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa môi trường nuôi cấy và
hoạt lực tổng hợp endo-polugalacturonase là 4266U/l.
• Nghiên cứu khả năng sản xuất pectinase của các chủng A.niger trên môi
trường rắn của Nazneen Akhter và cộng sự (2011) đã đạt được 1 số kết

quả đáng quan tâm. Nghiên cứu đã được thực hiện trên 7 chủng Asp.
Niger phân lập được từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó chủng Asp.
Niger IM6 là chủng sản xuất pectinase đạt hiệu quả nhất. Hoạt độ
enzyme cao nhất (142,44U/g) đạt được sau 7 ngày nuối cấy ở nhiệt độ
40
0
C trong bình nón 750ml. Trong nghiên cứu này, tác giả đã sử dụng
nguồn nitơ là (NH
4
)
2
SO
4
với hàm lượng 1,69%. Với các nguồn cơ chất cám
mì, tinh bột sắn, tinh bột khoai tây, cám gạo, kết quả cho thấy nguồn cơ
chất là cám mì và tinh bột khoai tây cho hoạt độ enzyme cao (85,54U/g).
Khi thêm 9,68% pectin thì sự sản sinh enzyme tăng lên đạt 11,6U/g.
Cũng theo nghiên cứu này, quá trình sản xuất pectinase của chủng
A.Niger IM6 đạt tối ưu 98,34U/g khi độ ẩm ban đầu của môi trường nuôi
cấy là 60%. Sự thông thoáng cũng ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình sinh
pectinase.[7]
• Sun Zhong-Tao (2008) đă nghiên cứu sản xuất pectinase từ hai dòng
Aspergillus niger đã được phân lập trên cơ chất bã táo (apple pomace).
[2]
• Với thành phần pectin trong hạt hướng dương là 21,36%, Patil và Da
yanand (2006) đã xác nhận tính khả thi của việc sử dụng hạt hướng
dương trong sản xuất PME từ Aspergillus niger cho cả hai trường hợp lên
men rắn và lên men chìm .
• PME đã được phân lập bằng việc lên men các dòng Aspergillus (Polizeli,
1991), đặc biệt là A. niger đă được khảo sát khá chi tiết với hai phương

thức lên men chìm và lên men nổi (Joshi et at., 2006) trên nhiều loại cơ
chất khác nhau (Schmitz,2002). [2]
• Năm 2008, nghiên cứu “ Thu nhận emzyme pectinase từ A. Niger – tinh
sạch bằng phương pháp lọc gel và lọc màng “ do Huỳnh Ngọc Anh, Trần
Ngọc Hùng, Trường ĐHBK – ĐH Quốc Gia TP Hồ Chí Minh tiến hành. Theo
kết quả nghiên cứu này, chế phẩm enzyme pectinase được sản xuất từ
chủng A. niger trên môi trường có chứa chất cảm ứng bột cà rốt sau 48h
đạt hoạt độ cao nhất ( 30,01UI/g).
• Năm 2009, các tác giả Trần Thị Thanh Thuần, Nguyễn Đức Lượng đã thực
hiện nghiên cứu enzyme cellulose và pectinase từ chủng Trichoderma
viride và Aspergillus niger nhằm xử lý nhanh vỏ cà phê. Nghiên cứu đã
GVHD: Phạm Thị Hương 12 Lớp 10SH – Nhóm 5
Công nghệ sản xuất enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger
xác định các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình sản xuất 2 enzyme này :
ĐK tối ưu sản xuất enzyme pectinase của chủng A. Niger là : 2 ngày, độ
ẩm 62%.
3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme
3.2.1.Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu
Thành phần môi trường là yếu tố cơ bản nhất quyết định khả năng
sinh PME cũng như các enzyme khác từ vi sinh vật . Trong đó, thành phần
pectin giữ vai trò rất quan trọng (Patil, 2006). Hàm lượng pectin cao được
biế t đến như nguồn cơ chất thích hợp cho việc sản xuất pectinase nguồn
gốc vi sinh .[2]
3.2.2.Ảnh hưởng của thành phần đa lượng
Tỉ lệ carbon, nitrogen có ý nghĩa lớn đối với sinh tổng hợp sinh khối
của vi sinh vật và sự tạo thành enzyme. Nghiên cứu của Hossam ( 2005)
cho thấy sự có mặt NH
4
NO
3

, NH
4
Cl trong môi trường nuôi cấy giúp cải
thiện hoạt tính pectate lyase thu nhận.
Ngoài ra, do acid amin là những cấu tử hợp thành phân tử enzyme,
acid amin có ảnh hưởng tốt đến sinh lý của vi sinh vật cũng như quá
trình sinh tổng hợp enzyme. Acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn
carbon, nguồn nitrogen và là nguồn năng lượng [10].
3.2.3.Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng
Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất và
nhiều coenzyme, đồng thời để phosphoryl hóa glucid trong quá trình oxy
hóa sinh học. Phospho ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh sản của nấm sợi
và các vi sinh vật khác. Cation Mg
2+
có ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của
enzyme tuy nhiên MgSO
4
sẽ có ảnh hưởng xấu đến sự tổng hợp enzyme
bởi nấm sợi. Trong

khi đó, lưu huỳnh - có mặt trong các acid amin quan
trọng như methionine, cysteine, có vai trò tích cực trong việc kích thích
sự hình thành enzyme. Ngoài ra, calcium, mangan, corban,… cũng ảnh
hưởng đến sự tổng hợp enzym.[10]
3.2.4.Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ nuôi cấy không có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của hệ
enzyme pectinase nói chung. Trong khoảng nhiệt độ nuôi cấy 25 ÷ 40°C
hầu như không có tác động đến sự hình thành sinh khối của pectinase.
Nhiệt độ tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp PME cũng thay đổi phụ thuộc
vào nguồn nấm mốc sử dụng, cơ chất nuôi cấy và điều kiện khí hậu

GVHD: Phạm Thị Hương 13 Lớp 10SH – Nhóm 5
Công nghệ sản xuất enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger
( Maldonadoo và Callieri, 2005; Joshi et al,2006; Mandhania et al,2011)
[10].
3.2.5.Độ ẩm môi trường
Độ ẩm của môi trường liên hệ đến sự kết dính, ảnh hưởng đến độ
thoáng khí. Từ đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm
sợi cũng như khả năng tạo enzyme[2]. Độ ẩm thấp quá sẽ kìm hãm sự
sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như khả năng tạo enzyme (
50 – 55%); trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi
trường : 58-60%; nếu tăng lên 70% thì làm giảm độ thoáng khí.[10].
3.2.6.Thời gian nuôi
Thời gian nuôi để thu được lượng enzyme lớn thường được xác định
bằng thực nghiệm. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì
thường làm giảm hoạt tính enzyme. Đối với nấm sợi A. niger, sự tạo
enzyme cực đại thường kết thúc khi nấm bắt đầu sinh đính bào tử[2].
3.2.7.pH
Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt thường ít ảnh hưởng do môi
trường có dung dịch đệm cao và hàm ẩm thấp, pH không thay đổi trong
quá trình nuôi. Tuy nhiên, pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng
không nhỏ đến sự phát triển của nấm sợi và sự tạo thành enzyme. pH tối
thích của enzyme có nguồn gốc vi sinh vật trong khoảng 4,5 ÷ 5,5.[2]
GVHD: Phạm Thị Hương 14 Lớp 10SH – Nhóm 5
Công nghệ sản xuất enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger
4. Quy trình công nghệ sản xuất enzyme pectinase
4.1. Các phương pháp sản xuất
Hiện nay người ta thu nhận pectinase chủ yếu từ VSV. Có 2 phương
pháp sản xuất pectinase:
 Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề mặt
 Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề sâu

Tuy nhiên, lý do vi sinh vật sản xuất ra enzyme trên môi trường rắn
SSF có hoạt tính cao hơn trường hợp sử dụng môi trường lỏng SmF vẫn
chưa được giải thích cụ thể. Nhìn chung, sự khác biệt quan trọng giữa
quá trình lên men SmF và SSF là độ ẩm môi trường. Do độ hoạt động của
nước trong môi trường lên men SmF rất cao nên mức độ nhiễm vi sinh
vật không mong muốn gia tăng (Patil et al., 2006). Hesseltine (1977) đã
chỉ ra một số thuận lợi và bất lợi của SSF so với SmF.[10]
i. thuận lợi [10]
- Môi trường nuôi cấy đơn giản.
- Một số cơ chất có thể được sử dụng trực tiếp làm môi trường rắn hoặc bổ
sung thêm một số chất dinh dưỡng.
- Sản phẩm thu nhận có nồng độ cao, dễ dàng tinh sạch.
- Sử dụng kết hợp các cơ chất tự nhiên có nguồn gốc thực vật, bào tử hoặc
tế bào.
- Độ ẩm thấp và mật số nấm mốc lớn nên hạn chế được sự lây nhiễm của
nhiều loại vi sinh vật khác.
- Lượng tạp chất sinh ra thấp hơn trong SmF.
- Enzyme ít nhạy cảm với các chất ức chế dị hóa hoặc cảm ứng.
- Trong điều kiện thiết bị đơn giản, không có thiết bị phản ứng sinh học,
việc lên men SSF là phương thức hiệu quả, dễ thực hiện, có tính khả thi
cao.
- Sản phẩm enzyme thô sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản.
[2].
ii. Bất lợi [10]
- Các vi sinh vật nuôi cấy bởi phương pháp SSF bị hạn chế bởi rào cản về
độ ẩm của môi trường.
- Việc xác định các thông số như độ ẩm, pH, oxy tự do, CO2 là một vấn đề
khó khăn do thiếu thiết bị kiểm tra.
- Nghiên cứu của Nguyen et al. (2010) cũng cho thấy, khi nghiên cứu sinh
tổng hợp

GVHD: Phạm Thị Hương 15 Lớp 10SH – Nhóm 5
Công nghệ sản xuất enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger
- PME từ A. niger theo phương pháp SSF, sử dụng cơ chất bã táo ta và vỏ
cam sành, hoạt tính PME thu được cao hơn gần 5 lần khi so sánh với mẫu
enzyme nuôi cấy trên môi trường lên men SmF.[10].
- Với đặc điểm của quá trình lên men bề mặt trong môi trường rắn là lượng
nước tự do có trong canh trường sau khi lên men rất ít (Palit và Banerjee,
2001), các enzyme tiết ra thường ở trạng thái liên kết chặt chẽ với các
thành phần cơ chất lên men, ngăn cản việc chiết tách và thu nhận
enzyme (Rezaei et al., 2011). Chính vì vậy, việc bổ sung một tỷ lệ dung
môi thích hợp để thực hiện quá trình ly trích lỏng- rắn nhằm cải thiện tối
đa hiệu quả thu nhận enzyme từ canh trường bề mặt (Castilho et al.,
1999).[10].
4.2. Nguyên liệu
Môi trường rắn thường là các nguyên liệu tự nhiên: cám mì, cám
gạo, ngô mảnh, bột đậu tương… nhưng thường dùng nhất là cám, đặt
biệt cám mì vì trong đó có tương đối đầy đủ các chất dinh dưỡng và khi
làm ẩm sẽ tạo ra cấu trúc cần thiết cho nấm mốc phát triển, sinh ra
nhiều enzyme. Muốn nâng cao hoạt tính một số enzyme cần thêm vào
cám các chất cảm ứng như bã củ cải, đường giàu pectin.
Môi trường lỏng thường là các mật rỉ đường, dịch thủy phân từ thóc
mầm, nước bã rượu… có pha thêm muối khoáng. Môi trường lỏng ít dùng
để nuôi cấy nấm mốc theo phương pháp này.
4.3. Quy trình sản xuất
Sơ đồ công nghệ
Nguyên liệu

Trộn

Làm ẩm

Thanh trùng bằng nhiệt

Làm nguội, làm tơi

Gieo giống vi sinh vật Nuôi cấy
giống

Chuyển vào dụng cụ nuôi cấy
GVHD: Phạm Thị Hương 16 Lớp 10SH – Nhóm 5
Công nghệ sản xuất enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger

Thu nhận phế phẩm enzyme thô Chế phẩm enzyme thô
đem đi sử dụng

Chế phẩm enzyme thô đem tinh chế

Nghiền mịn

Trích ly

Lọc Bã

Kết tủa enzyme

Thu nhận kết tủa

Sấy kết tủa

Tinh chế kết tủa

Thu nhận chế phẩm enzyme tinh khiết

Enzyme kết tinh
4.3.1.Nuôi cấy nấm mốc
Nhằm đủ lượng bào tử giống cho toàn bộ môi trường nuôi cấy. Quy
trình công nghệ thực hiện tương tự như trong sản xuất lớn nhưng phải
thực hiện các điều kiện kỹ thuật đặc biệt và khắt khe hơn như : nguyên
liệu phải tốt, giàu chất dinh dưỡng hơn, điều kiện nuôi cấy khống chế
nghiêm ngặt hơn, thời gian nuôi cấy dài hơn ( gần gấp đôi ) để nấm mốc
hình thành nhiều bào tử và đều.
Thường nuôi cấy trong môi trường thạch czapek, malt.
 Nguyên liệu làm môi trường[11]
- Malt: là thành phần chính của môi trường malt để nuôi cấy nấm mốc.
Malt rất giàu đường và các khoáng chất cho sự phát triển của nấm mốc.
- Cám: trong cám gạo có chứa nhiều chất dinh dưỡng giúp cho nấm mốc
phát triển tốt như: protein, lipid, tro, cellulose; các loại khoáng Na, Ca, K,
Zn, Fe và các loại vitamin.
GVHD: Phạm Thị Hương 17 Lớp 10SH – Nhóm 5
Công nghệ sản xuất enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger
- Trấu: được đưa vào môi trường với mục đích tạo độ thoáng, xốp, tạo điều
kiện cho nấm mốc phát triển tốt. Đồng thời theo một số nghiên cứu cho
thấy trấu là nhân tố kích thích hệ enzyme cellulase rất tốt ở các loài nấm
mốc.
- Cà rốt: là thành phần kích thích sự tổng hợp của enzyme pectinase.
- Agar
- Muối sunfat amon (NH4)2SO
4
là nguồn đạm bổ sung cho sự phát triển
bình thường của nấm mốc.

 Tiến hành quá trình nuôi cấy[9]
Sau khi gieo giống và phân phối vào các dụng cụ nuôi ( mành hay
khay đục lỗ ) rồi chuyển vào phòng nuôi có điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm
tương đối của không khí (
ϕ
) cũng như mức độ thông khí. Quá trình nuôi
cấy nấm mốc kéo dài 33-48 giờ/mẻ được trải qua 3 giai đoạn :
- Giai đoạn 1 : Từ khi nuôi cấy nấm mốc giống đến giờ nuôi cấy thứ
10-12. Xảy ra sự trương nở bào tử và xuất hiện cuống nấm. Để đảm bảo
sự nảy mầm nhanh và hạn chế nhiễm tạp, cần giữ độ ẩm nguyên liệu 55-
60%,
ϕ
= 96-100%, T= 30-32
0
C.
- Giai đoạn 2 : Kéo dài trong 10-18 giờ. Nấm mốc phát triển mạnh,
lan khắp bề mặt và trong toàn khối môi trường ( khuẩn ti ăn sâu vào cơ
chất) dẫn đến hiện tượng kết bánh. Quá trình hô hấp và tỏa nhiệt mạnh
làm môi trường bị khô xốp, tăng hàm lượng CO
2
, nhiệt độ phòng nuôi
tăng lên 38-40
0
C. Để khống chế nhiệt độ thích hợp 28-30
0
C cần thông gió
( quạt ) và bão hòa ẩm không khí phòng nuôi.
- Giai đoạn 3 : Kéo dài trong 10-20 giờ và đặc trưng nhất vì tạo ra
enzyme nhiều nhất. Cường độ trao đổi chất giảm đi chút ít, nhiệt tỏa ra ít
hơn nên tốc độ bốc hơi nước của môi trường nuôi cấy cũng giảm theo.

Quá trình nuôi cấy được chấm dứt khi mấm mốc đạt độ già chín sinh lý
và bắt đầu tạo thành bào tử.
4.3.2.Môi trường nhân giống, lên men :
- Theo bài báo : “Pectinase production by solid fermentation from
Aspergillus niger by a new prescription experiment, Jing Debing và
cs(2006) ” thì môi trường tối ưu cho A. niger là dextrose 8,5%, cám
bột mì 24,5 %, amoni sunfat 5,7%, nước cất 61,3%, Tween 80 ko có
lợi cho nuôi cấy nên bỏ đi, pH = 6,5. Nuôi một mẻ trong 72 giờ, 30
độ ở 30 giờ đầu tiên và 23 độ ở 42 giờ tiếp theo. Độ ẩm 60 %, thông
gió tự nhiên.[15]
GVHD: Phạm Thị Hương 18 Lớp 10SH – Nhóm 5
Công nghệ sản xuất enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger
- Hoặc nuôi cấy môi trường nhân giống có thành phần: cà rốt 9 %,
trấu 15 %, cám 75 % và(NH4)2SO4 1 %, độ ẩm 64 %, thời gian 40
giờ[4]

4.3.3.Thu nhận chế phẩm enzyme thô
Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme
pectinase, chế phẩm này được gọi là enzyme thô ( vì ngoài thành phần
enzyme ra còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước
trong môi trường).
Để đảm bảo chế phẩm enzyme pectinase không bị mất hoạt tính
nhanh người ta thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp.
Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phẩm thô không cần
phải quá trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết khác, ta cần
phải tiến hành làm sạch enzyme. Để sản xuất enzyme tinh khiết người ta
phải tiến hành như sau:
- Toàn bộ khối lượng enzyme thô pectinase được đem đi nghiền nhỏ. Mục
đích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các
thành phần của chế phẩm thô. Khi thành tế bào được phá vỡ, các

enzyme nội bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát ra khỏi tế
bào. Phần lớn enzyme pectinase ngoại bào khi được tổng hợp và thoát ra
khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường. Khi ta nghiền
nhỏ, enzyme thoát ra khỏi thành phần này dễ dàng hơn.
- Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền trong
trường hợp này được dùng là cát thạch anh và bột thủy tinh. Các chất
này là những chất vô cơ không tham gia vào phản ứng và khả năng tăng
mức độ ma sát trước khi sử dụng cát thạch anh và bột thuỷ tinh phải
được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 100
o
C để loại bỏ nước và tiêu
diệt vi sinh vật
- Trích ly:
Sau khi nghiền mịn người ta cho nước vào để trích ly enzyme
pectinase.
Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người
ta thường dùng nước như một dung môi hòa tan.Cứ một phần chế phẩm
enzyme thô, người ta cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy
dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩm gia súc(chú ý cần loại bỏ
GVHD: Phạm Thị Hương 19 Lớp 10SH – Nhóm 5
Công nghệ sản xuất enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger
các thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súc
ăn ).
Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô vì trong đó
chứa nước và các chất hòa tan khác từ khối lượng môi trường nuôi cấy.
Việc tiếp theo là làm sao tách enzyme ra khỏi vật chất này.
4.3.4.Quá trình kết tủa enzyme pectinase
- Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác nhân
gây kết tủa. Trong công nghệ tinh chế enzyme, người ta thường dùng cồn
và sunfat amon. Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với

những tác nhân gây kết tủa khác.
- Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzyme
thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzyme. Khi
đổ chất làm kết tủa enzyme vào dung dịch enzyme thô phải hết sức từ từ
để tránh hiện tượng biến tính.
- Trong quá trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sunfat amon với liều
lượng như sau:
Cứ một phần dung dịch enzyme thô người ta cho 2 đến 2.5 lần cồn
hoặc sulfat amon.
Khi cho chất kết tủa vào dung dịch enzyme thô, người ta tiến hành
khuấy nhẹ sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường là 4-7
o
C)
theo thời gian các enzyme sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người
ta tiến hành gạn và lọc thu nhận kết tủa dạng paste ( độ ẩm lớn hơn
70%W), ở trạng thái này enzyme rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để
dễ bảo quản người ta sấy kết tủa enzyme pectinase cho đến khi độ ẩm
cuối cùng đạt W = 5-8%.
Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzyme pectinase ở dạng kết tủa
vẫn hoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đó còn chứa 1 số
enzyme ta quan tâm.
GVHD: Phạm Thị Hương 20 Lớp 10SH – Nhóm 5
Công nghệ sản xuất enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger
Tài Liệu Tham Khảo
[1] />9947/.
[2]Luận văn Nghiên Cứu Khả Năng Sinh Aspergillus Niger PECTIN
METHYLESTERASE Trên Cơ Chất Bã Táo,Nguyễn Thị Kim Ngân,Cần Thơ,
2009.
[3] Công nghệ enzyme, Nguyễn Trọng Cẩn.
[4] Đề tài Nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme pectinase và cellulose từ

Asp.niger và ứng dụng xử lí vỏ cà phê trong sản xuất phân hữu cơ, Lê
Hồng Phú, TP Hồ Chí Minh,2003.
[5] Đề tài Thu nhận enzyme pectinase từ Aspergillus niger, ĐH Tôn Đức
Thắng, 2009.
[6] Đề tài Khảo sát khả năng sinh enzyme pectinase từ Asp,niger và
Asp.oryza, báo cáo thực tập, Lê Hoàng Bảo Vi.
[7] Nazeen Akhter và cs, “ Production of pectinase by Aspergillus Niger
Cultured in solid state media ”, International Journal of Bioscience,
1(1),pp.33-42.
[8]Giáo trình hóa sinh 1, PGS.TS Trần Thị Xô.
[9] />11551/.
[10] Luận án tiến sĩ sinh học “ Phân lập và tuyển chọn một số dòng
Aspergillus niger sinh pectin methyesterase”, Trần Thanh Trúc, Cần Thơ,
2013.
[10] Khóa luận tốt nghiệp “Bước đầu nghiên cứu sản xuất bột cacao bằng
phương pháp lên men có bổ sung vi sinh vật”, Hoàng Văn Tiến, TP Hồ Chí
Minh, 2005.
[12]Luận văn thạc sĩ kỹ thuật : “ Nghiên cứu khả năng tổng hợp
pectinesterase và polygalacturonase của Aspergillus niger”, Lê Thị Thu
Trang, Đà Nẵng 2011.
[13]Martos và cộng sự, “ Production of pectinase by A.niger : Inšuence of
fermentation conditions ”, Brazilian archives of biology and technology,
52(3),pp.567-72.
[14] Rangarjan và cộng sự (2010). “ Pectinase production from orange
peel extract and dried organe peel solid as substrates using Aspergillus
GVHD: Phạm Thị Hương 21 Lớp 10SH – Nhóm 5
Công nghệ sản xuất enzyme pectinase từ chủng Aspergillus niger
niger”, International Journal of Biotechnology and Biochemistry, 6(3),
pp.445-53.
[15] ,Jing Debing và cộng sự (2006), “Pectinase production by solid

fermentation from Aspergillus niger by a new prescription experiment”,
GVHD: Phạm Thị Hương 22 Lớp 10SH – Nhóm 5