Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu sản xuất enzyme celllulase từ nấm mốc - Chương 4

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN
45
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1. Chọn loài nấm mốc sinh tổng hợp enzym cellulase có hoạt tính cao
nhất.
Ta có 9 giống nấm mốc lấy từ PTNVS: A.Niger, A.awamori, A.aculactum,
A.oryzae, T.konigii, T.hazianum, T.viride, P.citrinum, Rhizopus.sp.
4.1.1.Thí nghiệm 1: Thử nhanh xác đònh loài nấm mốc có hoạt tính enzym
cellulase.
4.1.1.1.Kết quả thí nghiệm
P.citrinum A.awamori
46
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

A.aculactum A. Niger
Hình 4.1-Kết quả thử nhanh hoạt tính cellulase của 4 loài nấm mốc
4.1.1.2.Nhận xét và bàn luận
Phương pháp chọn lọc sơ bộ VSV có khả năng sinh hoạt tính cellulase dựa trên
sự bắt màu của thuốc thử Congo đỏ với polysaccharide (CMC). Thuốc thử Congo đỏ
có khả năng bắt màu với liên kết hidrogen của polysaccharide. Khi CMC bò phân hủy
tạo thành các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp hơn thì sự bắt màu với Congo đỏ
không còn nữa. Vùng trong suốt trên nền đỏ là nơi enzym tác dụng và phân hủy cơ
chất. Tuy nhiên màu ở vùng này còn tùy thuộc vào sản phẩm cuối của quá trình thủy
phân cellulose. Trong thí nghiệm này vùng thủy phân có màu vàng. Như vậy sản
phẩm cuối không chỉ là đường đơn mà còn các chất khác có trọng lượng phân tử cao
hơn.
Ngoài ra, trong phương pháp này dung dòch enzym thu được từ môi trường lỏng
cần được lọc để loại bỏ tế bào nấm mốc trước khi tiến hành thử trên hộp petri. Làm
như vậy ta loại bỏ được ảnh hưởng của sợi nấm mốc đến khả năng bắt màu với thuốc
thử Congo đỏ.
Trong 9 loài nấm mốc ở trên thì chỉ có 4 loài A.Niger, A.awamori, A.aculactum

và P.citrinum có xuất hiện vùng màu vàng trên nền đỏ. Vùng này chính là vùng CMC
47
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
bò phân giải bởi enzym. Như vậy với điều kiện thí nghiệm, trong 9 loài nấm mốc đã
chọn thử hoạt tính thì 4 loài này là có khả năng sinh enzym cellulase.
Kết quả thu được chỉ là tương đối, bởi vì trong 9 loài nấm mốc mà ta chọn thuộc
4 giốngï: Aspergillus, Trichoderma, Rhizopus và Penicillium. Mỗi giống này có tốc độ
sinh trưởng khác nhau. Do đó, thời gian để chúng sinh tổng hợp enzym có hoạt tính
cao nhất cũng khác nhau. Mà thí nghiệm này ta chỉ sử dụng ở cùng một thời điểm là 3
ngày, cho nên dựa trên kết quả này ta chỉ chọn được sơ bộ một số loài VSV có hoạt
tính enzym cellulase chứ chưa chọn được loài VSV có hoạt tính enzym cellulase cao
nhất. Muốn có kết quả chính xác ta cần khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym theo
thời gian.
4.1.2.Thí nghiệm 2: Chọn loài nấm mốc có hoạt tính enzym cao nhất
Tiếp tục ta nuôi 4 loài nấm mốc này trên môi trường CZ với nguồn cơ chất là
CMC 1%. Sau đó ta tiến hành xác đònh hoạt tính enzym bằng phương pháp đo đường
khử. Kết quả được đo ở ngày thứ 2, 3, 4, 5.
4.1.2.1. Kết quả thí nghiệm
Bảng 4.1– Hoạt tính CMCase của các loài nấm mốc theo thời gian (UI/ml)
Thời gian
(ngày)

Nấm mốc
2 3 4 5
A.Niger
0,040
0,053
0,033 0,028
A.awamori
0,047

0,067
0,047 0,032
A.aculactum
0,029
0,066
0,047 0,036
P.citrinum
0,034 0,102
0,123
0,100
48
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0 1 2 3 4 5 6
Thời gian (ngày)
CMCase (UI/ml)
A.Niger
A.awamori
A.aculactum
P.citrinum
Hình 4.2- Đồ thò biểu diễn hoạt tính CMCase theo thời gian của 4 loài nấm mốc
4.1.2.2. Nhận xét và bàn luận
Dựa vào đồ thò 4.2 ta thấy rằng nấm mốc P.citrinum có hoạt tính CMCase cao

nhất. Trong thí nghiệm này ta thấy các giống Aspergillus có hoạt tính enzym cao ở
ngày thứ 3 còn P.citrinum ở ngày thứ 4. Tuy tốc độ phát triển của A.Niger, A.awamori,
A.aculactum nhanh hơn P.citrinum nhưng hoạt tính enzym cao nhất của chúng thì lại
thấp hơn. So sánh hoạt tính cao nhất của các loài này ta thấy loài A.Niger bằng 43%,
A.awamori bằng 55%, A.aculactum bằng 54% hoạt tính của P.citrinum.
Trong thực tế người ta thường sản xuất enzym cellulase từ A.Niger, T.reesei,
A.awamori. Có rất ít nghiên cứu trên các loài Penicillium do tốc độ phát triển chậm và
thường trong quá trình phát triển chúng tạo ra các chất kháng sinh gây khó khăn cho
quá trình tinh sạch enzym sau này. Nhưng theo thí nghiệm trên đây thì loài có khả
năng sinh hoạt tính enzym cao nhất là P.citrinum, đây có thể là một hướng nghiên cứu
mới để sản xuất enzym cellulase. Mặt khác ở đây ta chỉ khảo sát hoạt tính CMCase
biểu thò hoạt tính enzym EG. Còn hoạt tính enzym CBH và β-glucosidase thì chưa
khảo sát nên ta chỉ có thể kết luận loài này sinh tổng hợp enzym EG cao nhất trong
các loài nấm mốc đã chọn.
49
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.2. nh hưởng nguồn carbon (cellulose) đến khả năng sinh tổng hợp enzym
4.2.1. T
hí nghiệm 3: chọn nguồn carbon thích hợp cho nấm mốc P.citrinum
Rơm, bã mía, mùn cưa sau khi xử lý được dùng làm nguồn carbon cho vào môi
trường nuôi cấy với hàm lượng 1%. Sau 4 ngày ta đo hoạt tính enzym trong dòch nuôi
cấy và chọn ra nguồn carbon thích hợp nhất cho nấm mốc P.citrinum.
4.2.1.1. Kết quả
Bảng 4.2- Hoạt tính enzym của nấm mốc P.citrinum trên 3 nguồn carbon khác nhau
Nguồn carbon Rơm Bã mía Mùn cưa
CMCase (UI/ml)
0,911 0,755 0,223
4.2.1.2. Nhận xét và bàn luận
Dựa vào bảng kết quả trên thì cơ chất rơm là tốt nhất đối với loài nấm mốc này.
Từ kết quả trên thì môi trường rơm là tốt nhất.

Bảng 4.3-Thành phần của nguyên liệu rơm, bã mía, mùn cưa [20]
Cơ chất Cellulose
(%)
Hemicellulas
e (%)
Lignin
(%)
Rơm 38,2 24,7 23,4
Bã mía 50,0 30,0 18,0
Mùn cưa 41,9 21,6 27,1
Dựa vào bảng trên ta thấy nếu dựa trên hàm lượng cơ chất thì đáng lẽ bã mía
phải cho hàm lượng đường và hoạt tính enzym cao hơn. Thế nhưng kết quả thí nghiệm
lại hoàn toàn khác.Ta thấy rằng hàm lượng đường và hoạt tính enzym trên nguyên
liệu rơm là cao nhất, kế đến bã mía và thấp nhất là mùn cưa. Nghiên cứu của
Solomon et al. thủy phân bã mía, mùn cưa và lõi bắp bởi nấm mốc A.flavus thì mùn
cưa có hoạt tính enzym cao nhất (0,0743UI/ml), bã mía (0,0573 UI/ml) và lõi bắp
(0,0502 UI/ml) [7]. Theo như kết quả nghiên cứu thì hoạt tính CMCase trên mùn cưa
là 0,223UI/ml cao hơn kết quả nghiên cứu của Solomon et al. (2003) 3 lần; còn trên bã
mía là 0,755 UI/ml cao hơn kết quả của Solomon et al. (2003) 13 lần. Như vậy loài
50
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
nấm mốc P.citrinum có khả năng sinh hoạt tính CMCase cao hơn rất nhiều so với loài
A.flavus trong nghiên cứu của Solomon et al. mặc dù trên cùng một cơ chất. Tuy nhiên
điều này cũng phụ thuộc rất nhiều yếu tố. Khi thủy phân cơ chất ligno-cellulose thì
thành phần gây cản trở khả năng tiếp xúc enzym với cơ chất cellulose chính là lignin.
Lignin có cấu trúc vô cùng vững chắc rất khó phân cắt. Việc tiền xử lý nguyên liệu
bằng NaOH là nhằm mục đích phá vỡ liên kết của lignin, nhưng việc xử lý này chỉ
làm giảm được ½ lượng lignin. Tuy nhiên nguyên liệu khác nhau khả năng giảm lignin
cũng khác nhau. Mặt khác, tỉ lệ vùng kết tinh và vùng vô đònh hình trên nguyên liệu
khác nhau thì khác nhau. Cây càng lâu năm thì lượng cellulose kết tinh càng nhiều.

Chính vì vậy mà hàm lượng cellulose kết tinh của mùn cưa là cao nhất, kế đến là bã
mía và cuối cùng là rơm. Như vậy có thể rằng loài nấm mốc này có khả năng sản sinh
lượng lớn enzym EG – một loại enzym cellulase có khả năng phân cắt tốt trên cơ chất
cellulose vô đònh hình.
Nhìn chung theo kết quả này thì loài nấm mốc P.citrinum hứa hẹn rất nhiều khả
năng ứng dụng để sản xuất enzym cellulase trong công nghiệp.
4.2.2. T
hí nghiệm 4: khảo sát hàm lượng rơm tốt nhất cho vào môi trường nuôi cấy
Ta tiến hành thí nghiệm ở các nồng độ rơm 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%,
3,5%.
4.2.2.1 Kết quả thí nghiệm
Bảng 4.4- Hoạt tính CMCase của P.citrinum với các nồng độ rơm khác nhau
51