TÍCH HỢP GIÁO DỤC ĐẠO ĐỨC GIA ĐÌNH TRONG DẠY HỌC MÔN GIÁO DỤC CÔNG DÂN CHO HỌC SINH TRƯỜNG THPT VIỆT TRÌ – PHÚ THỌ

Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học
LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ biết ơn sâu sắc đến T.S Nguyễn Thị Hoài Hà và
Th.S Phạm Thị Bích Đào, các thành viện trong nhóm đề tài nhánh: “Phân lập,
sàng lọc vi tảo biển dị dưỡng họ Thraustochytrid ở rừng ngập mặn Xuân Thủy,
Nam Định” Phòng Sinh học Tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học
Quốc gia Hà Nội đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ trong quá trình thực tập và thực hiện
khóa luận. Xin cảm ơn Cô và Chị đã luôn động viên giúp đỡ trong từng công việc.
Tôi đã học hỏi được ở cô và chị sự cẩn thận, nghiêm túc trong nghiên cứu khoa học.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Th.S Mai Thị Đàm Linh người
đã tận tình giảng dạỵ, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tơi hoàn thành
khóa luận.
Tơi xin cảm ơn tới Thầy, Cô trong Bộ môn vi sinh vật học, Khoa Sinh Học
trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên đã giảng dạy, truyền đạt những kiến thức quý báu
và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn đến Gia đình, Anh, Chị, Em và các Bạn đồng môn đã luôn
đồng hành và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận và cuộc sống. Các chị,
các bạn và các em để lại cho tôi nhiều kỷ niệm vui và đáng nhớ trong thời gian
nghiên cứu.
Hà Nội, tháng 5 năm 2014
Sinh viên
Lê Đình Tương

MỤC LỤC


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học

Chương I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................................2
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu...................................................................................................................12

2.3.3. Phương pháp lên men thu sinh khối tao trong hệ thống bình lên men 10 lít...............15
2.3.4. phương pháp xác định lipid và tách acid béo.............................................................16
2.3.4.2. Phương pháp tách acid béo.......................................................................................................17

3.3. Lên men...................................................................................................................... 26
3.4. Xác định lipid và phân tích thành phẩn acid béo............................................................28
3.4.1. Xác định lipid nội bào....................................................................................................................28


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Các chữ viết tắt

Tên đầy đủ

ω-3

Omega-3

ω-6

Omega – 6

AA

Arachidonic acid

DHA

Docosahexaenoic acid

DPA

Docopentaenoic acid

EPA

Eicosapentaenoic acid

LCPUFA
MUFA
HPLC
PCB
PUFA

VTBDD

Long Chain Polyunsanturated fatty acid - Acid béo không
no đa nối đôi mạch dài
Monounsanturated fatty acid - Acid béo không no một nối
đôi

High performance liquid chromatography - Sắc ký lỏng
cao áp
Polychlorobiphenyl
Polyunsanturated fatty acid - Acid béo không no đa nôi đôi
Vi tảo biển dị dưỡng

RNM

Rừng ngập mặn

TLK

Trọng lượng khô


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Chăn ni gia cầm [27]....................................................................................2
Hình 1.2. Schizochytrium quan sát dưới kính hiển vi (×40)..............................................7
Hình 1.3. Vịng đời của Schizochytrium [21]....................................................................7
Hình 1.4. Hình dạng tế bào trong từng chu kỳ phát triển của Schizochytrium..................8
A) Sự giải phóng các động bào tử, B) Tế bào trưởng thành............................................8
C) Sự phân chia liên tiếp của tế bào, D) Hình thành các túi động bào tử,........................8
E) Hình thành tế bào dạng amip.....................................................................................8
Hình 3.6. Sơ đồ quá trình lên men................................................................................15
Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào của VTBDD Schizochytrium XT41 (× 40)............19
Hình 3.2. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của Schizochytrium XT41.......................21

Hình 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của Schizochytrium XT41..........22
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng của Schizochytrium XT41..23
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ glucose đến sự sinh trưởng của Schizochytrium XT41
.....................................................................................................................................25
Hình 3.8. Đường cong sinh trưởng của VTBDD Schizochytrium XT41 trong hệ thống bình
lên men 10 lít................................................................................................................27
Hình 3.9. Tế bào bắt màu vàng (trái) và tế bào trước khi nhuộm Nile red (phải) của các
hạt lipid trong tế bào VTBDD Schizochytrium XT41.......................................................28


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học
DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần môi trường nuôi cấy..................................................................12
Bảng 3.1. Hàm lượng lipid tổng số và trọng lượng khô của VTBDD Schizochytrium XT41
phân lập từ RNM Xuân Thủy, Nam Định.......................................................................20
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của Schizochytrium XT41..................20
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của Schizochytrium XT41.........22
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sự sinh trưởng của Schizochytrium XT41.23
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ glucose đến sự sinh trưởng của VTBDD
Schizochytrium XT41.....................................................................................................25
Bảng 3.6. Theo dõi quá trình lên men...........................................................................26
Bảng 3.7. Thành phần acid béo của VTBDD Schizochytrium XT41..................................29


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học

MỞ ĐẦU

Ngày nay, khi xã hội phát triển càng cao, các vấn đề về chất lượng và an toàn
thực phẩm ngày càng chiếm một vị trí quan trọng.Tuy vậy hiện nay trong lĩnh vực
sản xuất, kinh doanh và chăn ni gia cầm cịn tồn tại nhiều vấn đề đáng lo ngại.
Thức ăn chăn nuôi được sử dụng các chất kích thích tăng trưởng, hormone tăng
trọng thúc đẩy sinh trưởng để tạo ra những sản phẩm "siêu nạc". Theo đó, một
lượng lớn các hóa chất, kháng sinh tồn dư trong sản phẩm chăn nuôi, gây nguy hại
nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng. Vì vậy, việc chủ động tìm nguồn dinh
dưỡng thay thế bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để đảm bảo chất lượng thực phẩm là
vô cùng cần thiết.
Theo nhiều nghiên cứu, vi tảo có giá trị sử dụng khơng giới hạn trong thực
phẩm sấy khô và thức ăn chăn nuôi. Vi tảo có tốc độ sinh trưởng nhanh, năng suất
tạo sinh khối cao, dễ ni trồng, ít cạnh tranh với đất nơng nghiệp, đặc biệt giàu các
chất dinh dưỡng có khả năng tiêu hóa cao, đa phần là các acid béo không no đa nối
đôi (Polyunsanturated fatty acid - PUFAs) và carbohydrates ở dạng tinh bột,
glucose, polysaccharides. Trong số khác vi tảo được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi,
loài vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) được sử dụng rộng rãi. Một số loài VTBDD sản
xuất

nhiều

ω-3

như:

Thrautochytrium

aureum,

Schizochytrium

spp.,

Crypthecodinium cohnii, Ulkenia spp., Amphidinium carterae và Labyrinthula spp.,
trong đó loài Schizochytrium cho sản lượng DHA cao nhất, đạt đến 138 mg/l/h. Mặt
khác, việc sử dụng VTBDD để sản xuất DHA có rất nhiều ưu điểm như: dễ dàng
duy trì điều kiện nuôi cấy tối ưu và thuần, không bị ảnh hưởng bởi mùa vụ và khí
hậu, có thể kiểm sốt được q trình sản xuất và chất lượng sản phẩm.Vì vậy, việc
sàng lọc được vi tảo cho sản xuất thức ăn chăn nuôi là hết sức quan trọng. Tuy
nhiên, giá trị dinh dưỡng loại vi tảo này thay đổi tùy theo điều kiện môi trường và
yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, độ mặn, ánh sáng. Xuất phát từ thực tế trên chúng
tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy vi tảo biển
dị dưỡng schizochytrium XT41 ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi gia cầm ".
Với mục đích: xác địch điều kiện tối ưu cho Schyzochytrium sinh trưởng và
phát triển. Tách chiết được các hợp chất quan trọng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi
như PUFAs, Asthaxanthin.
Lê Đình Tương

1


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học

Chương I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Thức ăn chăn ni gia cầm
1.1.1. Tình hình thức ăn chăn ni gia cầm tại Việt Nam
Trong 10 năm gần đây, chăn nuôi nước ta phát triển mạnh, với tốc độ tăng

trưởng 6%/năm. Theo thống kê của Phịng Thức ăn chăn ni (Cục Chăn ni - Bộ
Nơng Nghiệp và Phát triển Nông thôn), giai đoạn 2002 - 2011, mức tăng trưởng
trung bình của sản lượng toàn ngành thức ăn chăn nuôi công nghiệp đạt khoảng
13,5%/năm. Đây là một minh chứng đáng mừng cho sự phát triển của ngành chăn
ni nói chung và chăn ni cơng nghiệp nói riêng của nước ta [18].

Hình 1.1. Chăn nuôi gia cầm [27]
Ngun liệu chính để sản xuất thức ăn chăn ni là ngơ, thóc, gạo, khoai, sắn
chiếm từ 70-80% khối lượng thức ăn hỗn hợp, nhóm thức ăn giàu protein, khống
chất, vitamin và amino acid chiếm 20-30% khối lượng thức ăn hỗn hợp gồm có lạc,
cá, bột xương. Trên thực tế, nguồn cung cấp nguyên liệu chế biến thức ăn chăn nuôi
rất phong phú bao gồm các sản phẩm khai thác nuôi trồng và sản phẩm phụ của
ngành công nghiệp thủy sản. Tuy nhiên, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng
cung ứng của nguồn này đến ngành sản xuất thức ăn chăn ni trong nước. Cụ thể,
diện tích ngơ và sắn khó mở rộng thêm, đậu tương cho năng suất thấp, khơng có
quỹ đất chun canh, diện tích vụ đơng khó mở rộng do giá lao động nơng thơn
tăng cao. Chính vì vậy nhiều năm qua, ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi trong nước
ta phải phụ thuộc nhiều vào nhập khẩu. Theo Cục Chăn nuôi, năm 2011, nước ta
nhập khẩu xấp xỉ 8.9 triệu tấn nguyên liệu thức ăn chăn nuôi, tăng 3 lần so với năm

Lê Đình Tương

2


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học

2006. Trong đó, nhóm thức ăn giàu năng lượng như ngô, lúa mỳ, cám mỳ là 3.86

triệu tấn (chiếm khoảng 43%), thức ăn giàu đạm như đỗ tương, khô dầu các loại, bột
cá, bột thịt xương... chiếm gần 5 triệu tấn (khoảng 54%), thức ăn bổ sung khoảng
0.2 triệu tấn (chiếm 3%). Riêng 8 tháng đầu năm 2012 cả nước đã nhập 1.1 triệu tấn
ngô và 1.8 triệu tấn lúa mỳ. Việc phụ thuộc quá nhiều vào nguyên liệu nhập khẩu
khiến cho giá thành sản xuất bị đẩy lên quá cao, các doanh nghiệp buộc phải nhiều
lần điều chỉnh giá bán sản phẩm, khiến cho thị trường thức ăn liên tục biến động
[19].
Một trong những giải pháp quan trọng là tìm ra nguồn nguyên liệu mới bổ sung
cùng lúa, ngô và giải quyết tình trạng phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu nhập khẩu.
Việc chủ động tối ưu hóa nguồn nguyên liệu trong nước để sản xuất và cung cấp
nguồn thức ăn giàu protein là cần thiết.
Do nhu cầu sử dụng protein trong thức ăn cho gia cầm ngày một tăng cao nên
nhiều nguồn dinh dưỡng từ VTBDD với hàm lượng docosahexaenoic acid (DHA)
và các acid béo có chất lượng cao đang được xem xét để bổ sung vào chế độ ăn cho
gia cầm.
1.1.2. Sử dụng vi tảo biển dị dưỡng trong thức ăn chăn nuôi gia cầm
Các vấn đề liên quan đến sức khỏe và an toàn thực phẩm đang gây áp lực đến
việc tìm kiếm các loại nguyên liệu tốt hơn mở ra một thị trường rộng lớn cho sinh
khối vi tảo. Ngoài việc cải thiện dinh dưỡng, khi bổ sung vi tảo vào thức ăn cịn có
thể mang lại sức khỏe cho động vật. Đây là nguyên liệu duy nhất có thể thu hoạch
quanh năm do đó chúng có thể cung cấp nguồn nguyên liệu cho thị trường thức ăn
chăn nuôi ổn định và an toàn.
Vi tảo là các sinh vật thủy sinh có thể sản xuất tinh bột, dầu, protein, vitamin,
sắc tố và các chất hữu cơ. Chúng phát triển nhanh hơn nhiều so với cây trồng vì
không cần sử dụng năng lượng cho rễ, thân, lá. Tuy không được cung cấp nhiều
nguồn năng lượng nhưng mỗi ngày sinh khối của chúng vẫn có thể tăng gấp 3 hoặc
4 lần. Tảo có thể phát triển theo tất cả các hướng nên tốn ít diện tích ni trồng, 1
hecta ni trồng tảo có thể sản xuất cùng một lượng protein trong một năm so với
21 hecta đậu nành hoặc 49 hecta ngô [24].
Ở điều kiện phát triển trong hệ thống mở, hầu hết vi tảo tự dưỡng phải phụ

Lê Đình Tương

3


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học

thuộc chặt chẽ vào nguồn năng lượng ánh sáng để cố định CO 2 tạo nguồn cung cấp
carbon . Tuy nhiên, hệ thống này gặp phải một số nhược điểm lớn như: ánh sáng
khuyếch tán không đều trên khắp hệ thống nuôi cấy, dễ nhiễm các loại vi sinh vật
khác hay các sinh vật phù du. Do đó, các loại VTBDD với khả năng chuyển hóa
trao đổi năng lượng từ các hợp chất hữu cơ đơn giản, và phát triển với số lượng tế
bào khá cao trong quá trình lên men đã được xem xét để sản xuất sinh khối lớn, sử
dụng quá trình lên men để làm giảm chi phí ni trồng. Ước tính chi phí cho việc
sản xuất 1kg sinh khối VTBDD thấp hơn 5 dollar so với chi phí sản xuất ở hệ thống
quang sinh học đối với tảo tự dưỡng [26].
VTBDD được sử dụng cho sản xuất DHA thương mại như Cryptothecodinium
cohnii thuộc ngành Dinophyta, và Schizochytrium spp., thuộc ngành Heterokonta.
Việc sử dụng các loài khác nhau thuộc chi Thraustochytrium và Ulkenia trong
ngành Heterokonta với cùng một mục đích hiện đang được nghiên cứu.
Tuy nhiên, do nguồn gốc VTBDD là loài sống cộng sinh nên sinh khối của nó
khó thuần nhất và lưu giữ. Nguyên nhân là do chưa có phương pháp phân lập tối ưu,
nuôi giữ giống thuần chủng trong điều kiện phịng thí nghiệm và quy trình cơng
nghệ ni chưa thích hợp để đảm bảo nhân nhanh sinh khối từ giống ban đầu. Hiện
nay, ở Việt Nam, các chủng giống tảo sử dụng trong ngành chế biến thức ăn chăn
ni chủ ́u có nguồn gốc nhập ngoại, quy trình cơng nghệ ni trồng chưa thích
hợp với điều kiện khí hậu trong nước nên hiệu quả đem lại chưa cao. Do vậy, việc

phân lập, định loại và sử dụng vi tảo làm thức ăn vẫn gặp nhiều khó khăn, chưa khai
thác hết vai trò của vi tảo cũng như chưa đáp ứng được nhu cầu thực tế.
1.1.3 Nhu cầu sử dụng VTBDD Schizochytrium trong thức ăn chăn nuôi gia cầm
Sử dụng vi tảo làm thức ăn chăn nuôi cho động vật được bắt đầu từ đầu những
năm 70, ước tính có khoảng 30% sản lượng vi tảo trên thế giới được dùng cho sản
xuất thức ăn chăn nuôi. Một số nghiên cứu đã chỉ ra các chất béo có trong VTBDD
bao gồm: glycerol có khả năng este hóa các acid béo no và khơng no, một số khác
có tầm quan trọng đặc biệt như ω-3 và ω-6. Ngoài ra, tảo là nguồn cung cấp các
vitamin thiết yếu như: A, B1, B2, B3, B12, C, E, nicotinic acid, biotin, folic acid, và
bantothinic acid, và giàu các sắc tố chlorophyl (chiếm 0.5% đến 0.1% trọng lượng
khô) và carotenoids (chiếm 0.1% đến 0.2% trọng lượng khô). Trong khẩu phần ăn

Lê Đình Tương

4


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học

của gia cầm, có thể sử dụng 5-10% sinh khối vi tảo thay thế một phần các protein
thơng thường. Chất béo cịn cung cấp các acid béo thiết yếu như acid linoleic, acid
linolenic và acid arachidonic. Chất béo giúp hòa tan các vitamin A, D, E và K, các
sắc tố để cho cơ thể dễ hấp thu làm da và mỡ vàng, tăng màu vàng của lịng đỏ
trứng. Gà khi được ni bằng sinh khối vi tảo thì các đặc điểm như màu vàng của
da, cũng như lòng đỏ trứng được cải thiện đáng kể [4].
Ngoài ra chất béo trong thức ăn cũng có tác dụng làm giảm độ bụi giúp giảm
thiếu các bệnh về đường hô hấp. Khi bổ sung chất béo vào thức ăn cần chú ý bổ
sung các chất chống oxy hóa để bảo vệ các axit béo khơng no, bảo vệ các vitamin

trong thức ăn.
Vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium là một lựa chọn thay thế lý tưởng cho các
nguồn ω-3 truyền thống (dầu cá) trong chế độ ăn cho gà thịt. Theo nhiều báo cáo,
Schizochytrium không những giàu DHA, mà cịn khơng chứa các chất độc hại cũng
như khơng có khả năng gây bệnh. Các phân tích hóa sinh cho thấy các chủng
Schizochytrium khơng có sự xuất hiện của các loại độc tố tảo thông thường [17].
Hàm lượng PUFA n-3 và DHA trong gà Broiler tăng từ 2.8 đến 4.0 lần khi
ni với chế độ ăn có bổ sung 2.2% Schizochytrium. Đối với gà mái đẻ trứng, trong
chế độ ăn có bổ sung Schizochytrium với hàm lượng tương đương 165mg
DHA/con/ ngày, hàm lượng DHA trong trứng tăng lên 135mg/trứng, tăng gấp 5 lần
so với trứng thường (28mg DHA/trứng). Ngoài ra, hàm lượng DHA trong trứng có
thể tăng lên đến 220mg/ trứng đối với gà cho ăn Schizochytrium tương đương với
825mg DHA/con/ngày [14].
1.2. Vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium
1.2.1. Vị trí phân loại
Thraustochytrids là một nhóm sinh vật biển nguyên sinh, khơng có khả năng
quang hợp bao gồm bảy chi: Althornia, Diplophrys, Elina, Japonochytrium,
Thraustochytrium, Schizochytrium, Ulkenia, và khoảng 35 loài [6]. Chúng sử dụng
nitơ cho sự tăng trưởng và sử dụng carbon để tích lũy acid béo.
Trước kia, Thraustochytrids được xếp vào họ nấm bởi vì nó có khả năng sống dị
dưỡng và cũng có hình thái tương đối giống so với họ nấm, tuy nhiên trong vài năm
trở lại đây, dựa trên các kết quả nghiên cứu về gene và hệ protein, người ta đã thống

Lê Đình Tương

5


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học

nhất, cho rằng Thraustochytrids được xếp vào các loại tảo có khả năng dị dưỡng,
đặc trưng bởi sự hiện diện của cơ quan seaenogenetosome, mạng lưới ectoplasmic,
thành tế bào với lớp màng cellulose. Vòng đời của nó có thể bao gồm các dạng tế
bào như: tế bào sinh dưỡng, túi động bào tử và các động bào tử [10]. Việc xác định
Thraustochytrids chủ yếu dựa vào hình thái học ở giai đoạn Thallic và sự khác nhau
trong quá trình phát sinh và giải phóng bào tử.
Gần đây, Thraustochytrids đã được chú ý do có khả năng sản xuất một lượng
lớn acid béo ω - 3, bao gồm: docosanhexaenoic acid (DHA) và eicosapentaenoic
acid (EPA), cả hai acid này đều quan trọng đối với sức khỏe con người cũng như
trong nuôi trồng thủy sản. Tổng lượng dầu của Thraustochytrids chiếm từ 10 - 50%
sinh khối, trong số đó DHA chiếm 30 - 70% . Thraustochytrids cũng sản xuất trên
90% acid béo không no một nối đôi (Mono Unsaturated Fatty Acid - MUFA) như
palmitoleic acid (C16:1), oleic acid (C18:1), eicosenoic acid (C20:1), và erucic acid
(C22:1).
Vi tảo biển Schizochytrium là một chi của họ Thraustochytrids. Trong hệ thống
phân loại học, Schizochytrium được sắp xếp như sau [15]:
Giới:

Chromista (Stramenopilia)

Ngành:

Heterokontophyta

Lớp:

Labyrinthulea

Bộ:

Thraustochytriales
Họ:

Thraustochytriaceae
Chi:

Schizochytrium

1.2.2. Đặc điểm sinh học của vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium
Schizochytrium được tìm thấy nhiều nơi trên thế giới, từ vùng cửa sông ra tới
biển, là loài hoại dưỡng (hấp thụ các chất hữu cơ hòa tan) và được phân lập chủ yếu
trên các mảnh vụn hữu cơ như lá cây, thân cây mục vùng biển ngập mặn. Sinh khối
của chúng có thể lên tới khoảng 2.5×108 tế bào/g trọng lượng khô (TLK) và hoàn
toàn không liên quan đến các nhóm tảo có khả năng sinh độc tố.
Schizochytrium có dạng hình trịn, tập trung thành từng cụm, có mạng lưới
ngoại chất xuất phát từ bề mặt tế bào, kích thước 2,5 đến 17 µm. Schizochytrium
đặc trưng bởi sự phân đơi liên tục của các tế bào từ tetrads và octads đến việc sản

Lê Đình Tương

6


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học

xuất các động bào tử, các tế bào amip với hình dạng bất thường [5].

Hình 1.2. Schizochytrium quan sát dưới kính hiển vi (×40)
Q trình phát triển của tảo được bắt đầu bằn việc, các tế bào sẽ giải phóng các
động bào tử. Trong suốt 8 giờ sau khi nuôi cấy, các động bào tử nhanh chóng mất
roi, đồng thời tăng kích thước. Cùng với quá trình tăng kích thước là sự phân chia
của nhân tế bào và tế bào tạo ra những tế bào mới. Các tế bào đó tiếp tục sinh
trưởng và phát triển thành động bào tử hoặc các nhóm tế bào sinh dưỡng [7]. Hình
1.3 mô tả quá trình sinh sản của họ Schizochytrium

Hình 1.3. Vòng đời của Schizochytrium [21]

Lê Đình Tương

7


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học

Vịng đời của Schizochytrium bao gồm 3 chu kỳ phát triển [21]:
Chu kỳ 1: các tế bào trong giai đoạn sinh trưởng khi đạt được đến một kích
thước nhất định, chúng có thể hình thành nên các động bào tử, và giải phóng động
bào tử. Mặt khác, chúng có thể hình thành nên các tế bào dạng amip, hoặc tiếp tục
sinh trưởng đến giai đoạn trưởng thành rồi thực hiện quá trình phân chia tiếp theo.
Chu kỳ 2: tế bào tiếp tục phân chia đến 8, tế bào sau đó các tế bào được giải
phóng tạo thành các tế bào đơn, tiếp tục sinh trưởng tạo tế bào trưởng thành
Chu kỳ 3: nội chất bên trong của tế bào trưởng thành được hoàn thiện, bắt đầu
tạo thành các động bào tử. Sau một thời gian các động bào tử được giải phóng và
phát triển thành tế bào đơn theo chu kì khép kín.

A)

C)

B)

D)

E)

Hình 1.4. Hình dạng tế bào trong từng chu kỳ phát triển của Schizochytrium
A) Sự giải phóng các động bào tử, B) Tế bào trưởng thành
C) Sự phân chia liên tiếp của tế bào, D) Hình thành các túi động bào tử,
E) Hình thành tế bào dạng amip
1.2.3. Đặc điểm hạt lipid
Nghiên cứu về hình thái học đã chứng minh rằng, Thraustochytrids chứa các hạt
lipid dễ dàng quan sát được trên mặt tế bào, có chứa hàm lượng DHA cao. Các hạt

Lê Đình Tương

8


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học

lipid của Schizochytrium là tập hợp proteolipid, đa dạng về kích thước, thành phần,
nguồn gốc phát sinh, và trạng thái tế bào. Các hạt này đóng vai trị quan trọng trong

việc lưu trữ, vận chuyển chất béo trong cả tế bào động thực vật. Mặc dù các hạt
lipid trong một số loài Thrausrochytrids dễ dàng nhận thấy được nhưng chúng ta
biết rất ít về sự hình thành và đặc tính của chúng [7].
Lượng lipid tích lũy trong vi sinh vật có thể được nâng cao bằng việc cung cấp
dư thừa carbon trong khi hạn chế nitơ.
1.2.4. Thành phần dinh dưỡng của VTBDD Schizochytrium
VTBDD Schizochytrium có hàm lượng lipid chiếm 70% trọng lượng chất khơ,
DHA chiếm đến 35% tổng số acid béo [1]. Tương tự, trong báo cáo của Leaño [1],
DHA (24 - 35% tổng acid béo) và acid palmitic (39 - 42% tổng acid béo) là hai acid
béo nhiều nhất trong các chủng Thraustochytrium phân lập từ đảo Panay,
Philippines. Schizochytrium sp. (ATCC 20888) cũng sản xuất một lượng lớn DHA
(32.9% tổng acid béo) và palmitic acid (25.1% tổng acid béo). Trong nghiên cứu
khác của Leaño, DHA chiếm 31.53% và palmitic acid chiếm 34.9% trong tổng số
acid béo của chủng S. Mangrovei IAO-1.
Schizochytrium có khả năng tổng hợp một lượng lớn PUFAs như:
eicosapenteanoic acid (C20:5n-3, EPA), arachidonic acid (C20:4n-6, AA),
docosahexanenoic acid (C22:6n-3 DHA) và docopentaenoic acid (C22: 5n-6, DPA).
Trong đó, EPA và DHA là hai acid béo ω-3 quan trọng [3]. EPA có lợi cho hệ tim
mạch và đã được sử dụng trong điều trị xơ vữa động mạch, tâm thần phân liệt và
ung thư. DHA là một acid béo thiết yếu cho người cũng như động vật có xương
sống khác, là acid béo chính trong các nơron thần kinh của vỏ não và võng mạc
mắt. Vì vậy, DHA có vai trị quan trọng trong sự phát triển của vỏ não, võng mạc,
sự hình thành bào thai, giai đoạn con non và duy trì chức năng não trong suốt quá
trình trưởng thành. Ngoài ra, DHA cũng có ảnh hưởng tích cực trong điều trị các
bệnh về tim mạch như: bệnh tim mạch vành, đột quỵ, tăng huyết áp và có thể đối
với cả các bệnh rối loạn thần kinh như mất trí, Alzheimer's và trầm cảm.
Các eicosanoid như prostaglandins, prostacyclins, và leukotrienes nguồn gốc từ
PUFA n-3 cũng rất quan trọng trong sự phát triển của trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ, chống
lại sự điều biến mạch máu, và chữa lành vết thương. PUFAs là những chất rất quan

Lê Đình Tương

9


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học

trọng trong các lĩnh vực dược phẩm, y tế, và chất dinh dưỡng [9].
Hiện nay, dầu cá là nguồn cung cấp PUFAs chính. Tuy nhiên, nguồn cung cấp
này là có giới hạn. Ngoài ra, vấn đề về an toàn dầu cá đã được đề xuất bởi vì nó có
thể bị ơ nhiễm đáng kể bởi các chất độc như kim loại nặng, polychlorinated
bipheyls và dioxins - là những chất đặc biệt nguy hiểm với phụ nữ mang thai và trẻ
em. Ứng dụng của dầu cá như một chất phụ gia thực phẩm bị hạn chế do các vấn đề
liên quan tới đặc điểm mùi, vị khó chịu, và tính ổn định oxy hóa kém [8]. Do đó,
việc nghiên cứu nguồn cung cấp PUFAs thay thế PUFAs từ dầu cá đã và đang được
đặc biệt quan tâm.
Các VTBDD có thể chứa một lượng lớn DHA và chúng được xem là nguồn sản
xuất DHA đầy tiềm năng. Schizochytrium được xem là loài có khả năng sản xuất
DHA lớn, bởi hàm lượng lipid chiếm đến 70% trọng lượng khô và trong tổng số
acid béo: DHA chiếm đến 35%, palmitic acid chiếm 24%, DPA chiếm 13.6% và
myristic acid chiếm 10.1% . Sinh khối vi tảo này cũng đặc biệt thích hợp cho quá
trình tách chiết và tinh sạch acid béo không no đa nối đôi mạch dài (LCPUFA), do
chúng có thành phần rất ổn định. LCPUFA từ vi tảo ni cấy khơng có cholesterol,
khơng bị nhiễm kim loại nặng hay polychlorobiphenyl (PCB)... và có mùi dễ chịu
[1].
Ngoài ra, một số carotenoid nhất định mà đặc biệt là astaxanthin cũng được tìm
thấy trong Schizochytrium.
Astaxanthin là một loại carotenoid, một dạng sắc tố hịa tan trong chất béo có

màu vàng, cam hay đỏ, cơng thức hóa học là 3,3'-dihydroxy-β,β-carotene-4,4’dione,
có mặt trong thực vật và các loài sinh vật quang hợp khác như cây cối, tảo, nấm hay
vi khuẩn. Nó được bổ sung vào thực phẩm và sử dụng như thuốc nhuộm cho cá
ni, gia cầm và tơm [14].
Schizochytrium có khả năng tích lũy 6.1 mg/l astaxanthin trong 4 ngày ni cấy
ở mơi trường có chứa 10% glucose và nguồn nitơ ít hơn 0.3%, cịn trong mơi trường
có chứa 2% glucose, schizochytrium có khả năng sản sinh ra 8mg/l β-caroteniod.
Một nhà máy sản xuất rượu Shochu ở Nhật Bản đã sử dụng nước thải của nhà máy
để nuôi Schizochytrium và nhận thấy chúng có thể tạo ra 7.7 mg/l astaxanthin [13].

Lê Đình Tương

10


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học

1.2.5. Một số nghiên cứu về vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium
Ở Việt Nam, năm 2005, Viện Công nghệ sinh học đã phân lập thành công loại
vi tảo biển dị dưỡng Labyrinthula sp., và Schizochytrium sp., tại một số vùng biển ở
Việt Nam, có hàm lượng DHA (Docosahexaenoic, C22:6 n-3) và DPA
(decosapentaenoic, C22:5 n-3) cao gấp 5-10 lần so với các loại vi tảo biển khác.
Một quy trình công nghệ nuôi trồng Schizochytrum do công ty Martek
Biocience (Mỹ) thiết lập với hiệu xuất 20g sinh khối tảo khơ/lít sau 48h ni cấy và
hàm lượng PUFAs n-3 chiếm 10% sinh khối tế bào.
Ở Nhật Bản, hiệu xuất lên men của chủng Schizochytrium sp., SR1 đạt 48,1g
trọng lượng khơ/lít và 13,3g DHA/lít sau 4 ngày ni cấy.

Lê Đình Tương

11


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học

Chương II - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium XT41 được nhận từ Phòng Sinh học
Tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội
2.1.2. Máy móc và dụng cụ
Sử dụng máy móc và dụng cụ có tại phịng Sinh học Tảo và các phịng thí
nghiệm thuộc Viện Vi sinh vật và Cơng nghệ Sinh học - Đại học Quốc Gia Hà Nội.
2.1.3. Hóa chất
Các hóa chất được sử dụng có xuất sứ từ Merck (Đức), Sigma(Mỹ), Trung
Quốc
2.2. Môi trường nuôi cấy
Trong nghiên cứu việc lựa chon mơi trường ni cấy GPY, có bổ sung thêm 2
loại kháng sinh Ampicillin và Streptomycin. Nước biển dùng để pha môi trường lấy
từ RNM Xuân Thủy - Nam Định, chất lượng nước không thay đổi trong thời gian
tiến hành thí nghiệm. Mơi trường ni cấy được vô trùng ở 110°C trong 20 phút
hoặc 115°C trong 15 phút.
Môi trường GPY (g/l)
Bảng 2.1. Thành phần môi trường nuôi cấy
Thành phần môi trường
Glucose

Peptone
Cao nấm men
Nước biển
2.3. Phương pháp nghiên cứu

Hàm lưọng (g/l)
2
1
0.5
1

2.3.1. Các phương pháp xác định sự sinh trưởng của vi tảo
2.3.1.1. Phương pháp xác định số lượng tế bào tế bào bằng buồng đếm
Neubauer
Phương pháp đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer [22]. Cấu tạo buồng đếm
Neubauer:
Buồng đếm Neubauer là một tấm thủy tinh dày khoảng 3 mm, được chia làm 2

Lê Đình Tương

12


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học

phần. Các phần bên ngăn cách với phần giữa bởi 2 rãnh dọc. Phần giữa được chia đôi
do một rãnh ngang và thấp hơn hai phần bên 0.1 mm tạo ra hai ngăn đếm giống nhau.
Mỗi ngăn đếm hình vuông, được chia thành 16 ô lớn và mỗi ô lớn lại được chia thành

16 ơ nhỏ, mỗi một ơ nhỏ có diện tích là 1/400 m2, và chiều cao là 1/10mm.
Số lượng tế bào được tính theo cơng thức:
D = ( a /64)× 106
Trong đó:
D: là số lượng tế bào (số tế bào /ml)
a: là số tế bào trung bình trong một buồng đếm
Cách tiến hành:
Buồng đếm và lamen được lau sạch bằng bông cồn, thấm khô trước khi cho
mẫu vi tảo vào. Lamen được đặt trên buồng đếm, sao cho khi nhìn nghiêng thấy có
sự giao thoa ánh sáng ở vị trí tiếp xúc giữa buồng đếm và lamen. Sau đó, dùng
pipete Pasteur hút một ít dịch chứa mẫu đã được lắc đều trước chấm vào cạnh của
lamen dịch tảo sẽ tràn láng vào buồng đếm .
Buồng đếm có chứa Schizochytrium được đưa lên kính hiển vi và quan sát ở
vật kính 40 thị kính 10. Đối với những mẫu đếm quá đặc khơng thể chính xác được
thì ta đem pha lỗng trước khi đếm và nhân hệ số pha lỗng khi tính kết quả.
2.3.1.2. Xác định trọng lượng khô
Trọng lượng khô của tế bào VTBDD được xác định bằng bộ lọc có gắn với máy
lọc chân không và sinh khối vi tảo đã biết mật độ tế bào.
Cách tiến hành:
Lấy 5ml sinh khối VTBDD cho vào giấy lọc sợi thủy tinh (kích thươc lỗ lọc
1μm) đã được xác định trọng lượng và được kết nối với một máy bơm chân không .
Sau đó sấy khơ bộ lọc ở 100°C trong 4 giờ. Sau 4 giờ sấy, cân sinh khối 3 lần liên
tiếp cho đến khi trọng lượng không đổi.
2.3.2. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của VTBDD Schizochytrium
Sự phát triển của các chủng Schizochytrium được xác định theo bốn thông số:
độ pH, nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ glucose và nồng độ muối. Mỗi thông số được
kiểm tra ở các mức độ khác nhau.
2.3.2.1. Ảnh hưởng của pH

Lê Đình Tương

13


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học

VTBDD Schizochytrium được ni lắc trong bình tam giác 250ml với tốc độ
lắc 200 vịng/phút trong mơi trường GPY ở nhiệt độ 28°C, nồng độ muối 17‰,
glucose là 2%. Sau khi nuôi cấy giống vi tảo gốc có số lượng 10 5 tb/ml được sử
dụng trong thí nghiệm để xác định khoảng pH thích hợp cho ni thu sinh khối vi
tảo. Thí nghiệm được thực hiện với dải pH: 4, 5, 6, 7, 8, 9. Sau 36 giờ nuôi cấy, lấy
mẫu xác định số lượng tế bào và TLK theo phương pháp 2.3.1.1, 2.3.1.2
2.3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Sau khi xác định được điều kiện pH thích hợp, tiến hành xác định nhiệt độ thích
hợp cho sự phát triển của Schizochytrium.
Nhiệt độ có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của VTBDD. Để xác
định mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh trưởng, tạo sinh khối của
Schizochytrium tiến hành nuôi lắc trong bình tam giác 250ml với số lượng tế bào
gốc là 105 tb/ml tốc độ 200 vòng/phút trong mơi trường GPY ở pH thích hợp đã xác
định ở mục 2.3.2.1, nồng độ muối 17‰, glucose là 2%, sử dụng các dải nhiệt độ:
25, 28, 30, 32 và 37°C. Sau 36 giờ nuôi cấy, lấy mẫu để xác định số lượng tế bào và
TLK theo phương pháp 2.3.1.1, 2.3.1.2
2.3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối
Mỗi loại vi tảo có biên độ chịu mặn khác nhau: có loài có khả năng thích nghi
với độ mặn cao có loài khả năng thích nghi độ mặn thấp. Để xác định khoảng độ
mặn tối ưu cho ni sinh khối vi tảo, thí nghiệm được thực hiện với dải độ mặn: 0,
5, 10, 15, 20, 25‰. Môi trường GPY với pH và nhiệt độ đã được xác định ở mục
2.3.2.1và 2.3.2.2, nuôi lắc trong bình tam giác 250 ml, tốc độ 200 vòng/phút,

glucose là 2%. Sau 36 giờ nuôi cấy, lấy mẫu để xác định số lượng tế bào và TLK
theo phương pháp 2.3.1.1, 2.3.1.2
2.3.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ glucose
Hàm lượng glucose có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và kích thước của
tế bào VTBDD Schizochytrium. Để xác định nồng độ glucose thích hợp cho sự phát
triển thu sinh khối của Schizochytrium, thí nghiệm được tiến hành ni lắc trong
mơi trường GPY với pH, nhiệt độ, pH và nồng độ muối được xác định ở các mục
2.3.2.1, 2.3.2..2,.2.3.2.3, với dải nồng độ glucose: 1, 3, 6, 9, 12%. Sau 36 giờ nuôi
cấy, lấy mẫu để xác định số lượng tế bào và TLK theo phương pháp 2.3.1.1, 2.3.1.2
Từ các thí nghiệm xác định ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, nồng độ muối, nồng độ
glucose, xác định được các điều kiện nuôi cấy thích hợp sử dụng để tiến hành lên
men thu sinh khối phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.

Lê Đình Tương

14


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học

2.3.3. Phương pháp lên men thu sinh khối tao trong hệ thống bình lên men 10 lít
2.3.3.1. Chuẩn bị cho quá trình lên men
Dầu phá bọt, mơi

Quy trình lên men
Ch̉n bị mơi

trường ni cấy

trường nuôi cấy
Chủng giống
ban đầu từ đĩa

Khử trùng thiết
Khử trùng môi

bị, hệ thống

trường ni cấy

đường ống, hệ

thạch

thống lọc khí

Ni cấy trong

Cung cấp khơng
Lên men

bình tam giác

khí vơ trùng

có lắc

Thu sinh khối

Hình 3.6. Sơ đồ q trình lên men
• Chuẩn bị bình lên men
Bình lên men có dung tích 10 lít bằng thủy tinh có các bộ phận: cánh khuấy,
điện cực đo pH, điện cực đo lượng oxygen hòa tan, điện cực đo nhiệt độ, đường sục
khí, đường thốt khí, van lấy mẫu.
• Chuẩn bị thiết bị
Các thiết bị trực tiếp ni cấy như bình nuôi cấy lắc, bình lên men được chuẩn
bị qua các bước: rửa sạch, sấy khôi thanh trùng ở 200°C trong 60 phút, lắp ráp và
khử trùng bằng autoclave ở 121°C trong 60 phút, cuối cùng lắp đặt hoàn chỉnh vào
hệ thống.
Điện cực pH, oxygen hòa tan, nhiệt độ được chuẩn bị qua các bước: hiệu chỉnh,
rửa sạch, thanh trùng bằng autoclave ở 121°C trong 20 phút, lắp vô trùng vào bình

Lê Đình Tương

15


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học

lên men.
• Chuẩn bị môi trường
Môi trường GPY bao gồm (g/l): Glucose 20, petone 5, cao nấm men 2.5, muối
17, được khử trùng bằng autoclave ở nhiệt độ 110°C trong 20 phút, hoặc 115°C
trong 15 phút. Sau đó làm nguội xuống 28°C sẵn sàng cho nuôi cấy. Phải điều chỉnh
pH 6 bằng NaOH hoặc HCl trước khi cấy vi tảo.
• Chuẩn bị giống

Chuẩn bị chủng giống nhằm cung cấp đầy đủ lượng VTBDD và VTBDD đủ
hoạt tính cho thí nghiệm lên men thu sinh khối. Chủng giống ban đầu có số lượng
106 tb/ml được nuôi lắc trong bình tam giác với tốc độ lắc 200 vịng/phút, nhiệt độ
28°C, pH 6, sau 36 giờ ni cấy,
2.3.3.2. Lên men
Tiến hành bổ sung chủng vào môi trường lên men với tỷ lệ 5% có số lượng tế bào
10.03×106/ml vào bình lên men 10 lít.
Mục đích: xác định thời gian nuôi cấy VTBDD Schizochytrium tại điều kiện tối
ưu cho sinh khối cao nhất, phục vụ cho các mục đích nghiên cứu tiếp theo.
Thực hiện:
 Thiết bị: hệ thống lên men
 Môi trường: môi trường lên men
 Điều kiện lên men: tốc độ khuấy 250vòng/phút, nhiệt độ 28°C, lưu
lượng khí cấp vào 1.5 lít/phút.
Thời gian ni cấy: 40 - 43 giờ, dừng khi xuất hiện sự suy thoái của tế bào vi
tảo
2.3.4. phương pháp xác định lipid và tách acid béo
2.3.4.1. Phương pháp nhuộm Nile red
Nile red (9-dimethylamino-5H-benzo[α]-phenixazine-5-one) là dạng thuốc
nhuộm huỳnh quang tan trong lipid, được sử dụng để phát hiện các giọt lipid nội

Lê Đình Tương

16


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học

bào có trong tế bào động vật và vi sinh vật như tế bào động vật có vú, vi khuẩn,
nấm men, sinh vật phù du, và vi tảo [16]. Thuốc nhuộm dùng để phân biệt giữa các
tế bào bình thường và các tế bào có tích lũy lysosome của các phospholipid. Màu
sắc khi quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi huỳnh quang phụ thuộc vào sự ưa nước
của môi trường xung quanh. Việc này cho phép nhuộm Nile red nhuộm cả hai dạng
chất béo trung tính (màu vàng) và phospholipid (màu đỏ cam).
Ly tâm thu sinh khối vi tảo, bổ sung 500 μl dung dịch Nile red và lắc đều. Giữ
mẫu ở 37°C trong tối từ 5phút. Sau đó loại bỏ dịch Nile red, rửa tế bào bằng dung
dịch đệm Na-solition hoặc bằng môi trường nuôi cấy. Quan sát sự thay đổi huỳnh
quang tại bước sóng 450nm sử dụng kính hiển vi huỳnh quang Axio Zeiss Image
với hệ lọc G-2A.
2.3.4.2. Phương pháp tách acid béo
Tách và phân tích acid béo tế bào theo phương pháp của Miller. Cho khoảng
40mg tế bào ướt vào ống thủy tinh nắp vặn (cỡ 13mm×100mm). Alkal hóa bằng
1.0ml chất phản ứng I (chất phản ứng I gồm 15g sodium hydroxide (NaOH), 50ml
methanol (HPLC grade) và 50ml Mili_Q). Tế bào được thủy phân ở 100°C tại nồi
nhiệt khô (Eyela, dry thermo bath MG-2100) trong 5 phút. Sau đó làm huyền phù
bằng vortex trong 5 giây rồi tiếp tục cho thủy phân trong 25 phút. Sau đó dịch thủy
phân được làm lạnh dưới vòi nước máy tại nhiệt độ phòng. Methyl hóa dung dịch
Alkal với 0.2ml chất phản ứng II (65ml 6N hydrochloric acid và 55ml methanol,
HPLC grade). Sau khi methyl hóa, giữ ở 80°C trong nồi cách thủy khoảng 10 phút
và được làm lạnh dưới vòi nước máy ở nhiệt độ phịng. Dung dịch methyl hóa được
bổ sung 1.25ml của chất thử III (gồm 50ml n-hexane-methyl tert butyl ether,
1:1,v/v) và được trộn đều bằng máy lắc 2.000 vòng trong 10 phút. Dịch nhớt phía
trên được loại bỏ. Dung dịch được bổ sung 3ml thuốc thử IV (1.2g sodium
hydroxyde trong 100ml Milli-Q) và được trộn đều bằng tay trong 5 phút. Ly tâm ở
2.500 vòng trong 10 phút. Dịch trên cùng được chuyển sang ống thủy tinh mới có
nút vặn và cho bay hơi bằng nitrogen gas thông thường tới khi khô. Cuối cùng, toàn
bộ dịch mẫu thu được làm tan với 50µl diethyl ether 300 (hoặc aceton-300, nhexane). Toàn bộ mẫu được chấm vào TLC rồi được đặt trong bồn thủy tinh chứa
100ml n-hexane-diethyl ether (4:1,v/v) trong 30-45 phút. Acid béo có cực và khơng

Lê Đình Tương

17


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học

cực xuất hiện những vệt xanh. Những vệt này được cạo và được rửa 2 lần bằng
diethyl ether 300. Trộn đều dung dịch silicagel trên máy lắc 2.000 vòng trong 10
phút và ly tâm 2.500 vòng trong 5 phút hoặc 10 phút. Dung dịch được bay hơi bằng
nitrogen gas thông thường đến khô. Mẫu được hòa tan trở lại với 50 chất phản ứng
III. Dùng pipett nhỏ vào lọ nhỏ GC có nút đậy. Sau đó đem phân tích trên máy sắc
ký khí.

Lê Đình Tương

18


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học

Chương III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Quan sát hình dạng tế bào cuả chủng Schizochytrium XT41
Chủng sau khi được tiến hành nuôi cấy trên mơi trường GPY trong 36 giờ. Sau
đó quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch và hình dạng tế bào dưới kính hiển vi

ở độ phóng đại (× 40). .
Kết quả được trình bày tại hình 3.1

Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào của VTBDD Schizochytrium XT41
(× 40).
Ở Hình 3.1 cho ta thấy kh̉n lạc có hình trịn, màu trắng sữa bề mặt nhẵn khơng
có viền. Chủng phát triển tốt trên môi trường GPY. Sau khoảng 18-20 giờ, quan sát
khuẩn lạc tăng dần kích thước và màu sắc đậm dần từ màu trắng trong đến trắng
sữa, trắng ngà và màu vàng. Bề mặt khuẩn lạc chủng nhẵn, bóng chứng tỏ chúng
tích lũy rất nhiều các hạt lipid trên bề mặt.
Đồng thời chu kỳ sinh trưởng của chủng cũng biểu hiện khá rõ nét. Hình dạng tế
bào có dạng hình cầu, đang trong giai đoạn phân chia 2, 4, 8, một số tế bào đang ở
giai đoạn hình thành động bào tử, phù hợp với công bố trong các tài liệu tham khảo.
3.2. Xác định trọng lượng khơ và hàm lượng lipid của Schizochytrium XT41
Để có thể ứng dụng vi tảo vào làm thức ăn chăn ni, chất lượng của tảo đóng vai
trị quan trọng đánh giá yêu cầu cho sản phẩm. Do vậy chủng này được tiến hành
ni cấy lắc 200 vịng/phút, nhiệt độ 28 0C trong bình tam giác 250ml, môi trường
GPY. Bên cạnh đó ni một số chủng khác cùng để so sánh trọng lượng khô và
hàm lượng lipid với chủng Schizochytrium XT41.

Lê Đình Tương

19


Khóa luận tốt nghiệp 2014

Khoa Sinh Học

Kết quả trên bảng 3.1

Bảng 3.1. Hàm lượng lipid tổng số và trọng lượng khô của VTBDD Schizochytrium
XT41 phân lập từ RNM Xuân Thủy, Nam Định
Chủng

Trọng lượng khô

Hàm lượng lipid (TLK)

Schizochytrium XT13

9.56

25.70

Schizochytrium XT14

9.77

18.27

Schizochytrium XT41

13.74

34.06

Schizochytrium XT42

11.05

28.63

Schizochytrium XT51

11.96

19.46

Qua bảng 3.1 cho thấy, sau 36 giờ nuôi cấy, trọng lượng khơ thu được của VTBDD
Schizochytrium XT41 có TLK và trọng lượng sinh khối lớn hơn các chủng cịn lại. Do
đó VTBDD Schizochytrium XT41 tiềm năng cho sản xuất sinh khối với lượng lớn.
3.2. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên sự sinh trưởng của chủng
VTBDD Schizochytrium XT41
Khả năng sinh trưởng của vi tảo cũng như thực vật bậc cao đều bị ảnh hưởng
bởi các điều kiện môi trường khác nhau. Nhiệt độ, pH, độ mặn...là các yếu tố cơ bản
ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của tế bào vi tảo.
3.2.1. Ảnh hưởng của pH
pH có ảnh đến sự sinh trưởng của vi tảo. Mỗi loại tảo đều có một phạm vi pH
sinh trưởng nhất định và pH sinh trưởng tốt nhất. pH ngoài thiên nhiên có dải pH từ
2.5 - 9, và phần lớn vi tảo có khoảng pH tốt nhất trong khoảng này. Do vậy , tiến
hành nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của VTBDD Schizochytirum
XT41 với dải pH từ 4 – 9.
Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng tạo sinh khối của VTBDD
Schizochytirum XT41 được thể hiện ở bảng 3.2 và hình 3.2
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của Schizochytrium XT41
số lượng tế bào
pH

TLK (g/l)

4

Lê Đình Tương

(×106/ml)
38.35

8.56

20