NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
GVHD : PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh
SV thực hiện : Nhóm 7
Chủ đề:
NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO
1. Nguyễn Thị Duyên 570960
2. Nguyễn Thị Anh Đào 560785
3. Phạm Thị Huệ 560808
4. Lê Ngọc Mai 560827
5. Phùng Tiến Quang 560853
6. Phạm Thị Thảo 560866
7. Đào Trần Trung 550413
8. An Thị Yến 560895
A.ĐẶT VẤN ĐỀ
.
1
2
3
4
5
6
Giới thiệu chung
Kĩ thuật sử dụng trong nuôi cấy huyền phù tế bào
ƯD của NC huyền phù TB trong nhân giống vô tính
ƯD của NC huyền phù TB trong sản suất sinh khối
tế bào và các hợp chất có giá trị cao
Nuôi cấy Nhân sâm Panaxginseng bằng Bioreacter
KẾT LUẬN
Khái niệm, Đặc trưng
Khái niệm, Đặc trưng


Nuôi cấy huyền phù tế bào (cell suspension cultures) là phương thức
nuôi tế bào đơn (single cell) hay cụm nhiều tế bào (cell aggregate) ở
trạng thái lơ lửng trong môi trường lỏng

Các tế bào tách ra khỏi mô sẹo và phân tán trong môi trường lỏng
Sinh trưởng, phân chia và có thể hình thành những cụm tế bào kết
tập. Dung dịch nuôi cấy tế bào chuyển thành huyền phù tế bào
I. GIỚI THIỆU CHUNG
•
Nuôi cấy huyền phù tế bào cần một lượng mô sẹo khá lớn.
•
Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp tế bào
đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế
bào chết.Mức độ tách rời của các tế bào phụ thuộc vào đặc
tính của các khối tế bào xốp và có thể được đều chỉnh bởi
thành phần môi trường.
•
Để duy trì quá trình nuôi cấy, các tế bào cần được cấy
truyền vào giai đoạn đầu của pha ổn định và ở thời điểm khi
sự kết tập của tế bào là lớn
•
Nuôi cấy huyền phù tế bào cần một lượng mô sẹo khá lớn.
•
Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp tế bào
đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế
bào chết.Mức độ tách rời của các tế bào phụ thuộc vào đặc
tính của các khối tế bào xốp và có thể được đều chỉnh bởi
thành phần môi trường.
•

Để duy trì quá trình nuôi cấy, các tế bào cần được cấy
truyền vào giai đoạn đầu của pha ổn định và ở thời điểm khi
sự kết tập của tế bào là lớn
.
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
tb huyền phù có bản chất là tb callus
mt nuôi cấy calus có thể sử dụng để
khởi đầu việc nuôi cấy huyền phù tế bào
cải tiến hàm lượng và tỉ lệ auxin/cytokinin
cho phù hợp để có được các tế bào phân tán
tốt trong môi trường lỏng lắc.
Các chỉ tiêu sinh trưởng
Các chỉ tiêu sinh trưởng
•
Số lượng tế bào:
Trước khi đếm, xử lý những cụm tế bào qua acid chromic, đun nóng
700C trong 5 – 10 phút, sau đó làm nguội và lắc mạnh trong vài
phút.
Pha loãng dịch, nhuộm và đếm trên buồng đếm hồng cầu.
Kết quả: số lượng tế bào/ml dung dịch nuôi cấy.
•
Thể tích tế bào:
Lấy ngẫu nhiên một thể tích dịch nuôi cấy, đem ly tâm ở tốc độ 2000
vòng/phút trong thời gian 5 phút.
Thu tế bào và đem xác định thể tích.
Kết quả: Số ml tế bào/thể tích môi trường nuôi cấy.
•
Khối lượng tươi:
Thu thập tế bào trong một thể tích dịch xác định.

Rửa bằng nước cất vô trùng
Làm khô trong chân không.
Cân để xác định khối lượng.
•
Khối lượng khô:
Lấy một thể tích mẫu xác định.
Loại bỏ phần nổi, rửa phần tế bào trên giấy lọc Whatman.
Sấy khô trong 12h ở 800C đến khối lượng không đổi.
•
Xác định chỉ số nguyên phân (chỉ số phân bào):
Huyền phù tế bào được cố định trong hỗn hợp Aceto-orcein :
Acid Acetic (3:1) sau đó chuyển sang lam kính. Nhỏ 1 giọt
Aceto-orcein lên mẫu, hơ trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội
trong 5 phút. Đậy mẫu bằng Lamel, làm khô mẫu, quan sát
dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 100. Xác định các kỳ
trong khoảng 1000 tế bào.
Tổng số tế bào phân bào x 100
Chỉ số phân bào(%) =
Tổng số tế bào kiểm tra
•
Khả năng sống của tế bào:
nhuộm bằng flurescein diacetate (0,01%) và quan sát
màu xanh dưới sự chiếu sáng tử ngoại (ultraviolet).
II. Kĩ thuật sử dụng trong nuôi cấy huyền
phù tế bào
Nuôi cấy dịch
thể động
Nuôi cấy bằng
Bioreactor
Nuôi cấy

chìm liên
tục
Nuôi cấy
chìm tuần
hoàn
Bioreacter
không có
cánh
khuấy
Hệ thống
nuôi cấy
ngập chìm
tạm thời
(TIS)
Nuôi cấy chìm liên tục
Nuôi cấy chìm liên tục
Nuôi cấy chìm tuần hoàn
NUÔI CẤY DỊCH THỂ ĐỘNG
•
Ngâm hẳn tế bào vào dd môi
trường
•
Khí đưa vào vô trùng
•
250 vòng/phút
•
10 – 15 ngày
•
Nhúng chìm vào môi trường
dịch thể, xen kẽ với những

khoảng thời gian được đưa ra
ngoài môi trường.
•
Khối tế bào ở đầu này được
đưa vào môi trường. Khối tế
bào ở đầu kia tiếp xúc với
không khí

Bioreacter không
có cánh khuấy:
thiết kế với một bộ
phận sủi bọt khí ở
phía dưới đáy bình

khuấy trộn
môi trường và cung
cấp oxy
Nuôi cấy bằng Bioreactor

Khả năng nhân sinh khối rất
nhanh, chồi phát triển tương
đối đồng đều

phù hợp cho những quá trình
nhân sinh khối tế bào và rễ do
khả năng chịu được sự ngập
chìm trong môi trường

Hiện tượng thủy tinh thể do
ngập chìm hoàn toàn và liên

tục

Khó áp dụng một cách đồng
loạt cho nhiều giống khác
nhau

Nuôi cấy trong môi trường
lỏng dễ bị nhiễm vi sinh vật
như nấm, vi khuẩn, côn
trùng
Ưu điểm
Nhược điểm

Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời
(TIS).
•
Pha 1: mô không ngập
trong môi trường
•
Pha 2: hiện tượng ngập
được hoạt hóa, các van
mở ra cho khí đi qua các
màng lọc đẩy môi trường
lỏng lên ngập mô cấy
•
Pha 3: sự trao đổi khí
trong hệ thống RITA
•
Pha 4: chu kỳ kết thúc,
các van đóng lại và môi

trường lỏng rút xuống
ngăn bên dưới.
Hệ thống RITA

Ảnh hưởng của hệ thống ngập chìm tạm
thời lên chất lượng nuôi cấy
•
Lá nhỏ hơn lá trong môi trường nuôi cấy lỏng
•
Các cụm chồi phát triển thường có hình cầu
•
Chồi có xu hướng phát triển tỏa tròn xung quanh tâm
một số chồi con có kích thước không lớn. Chồi cây có thân
dài hơn và ra nhiều lá hơn so với nuôi cấy trên môi trường
thạch
Những ảnh hưởng có lợi từ hệ thống ngập chìm tạm
thời lên sự phát triển chồi có thể là kết quả của việc sử dụng
những bình chứa dung tích lớn
•
Ứng dụng trên nhiều đối tượng
cây trồng, không bị biến dị với tần
số cao
•
sinh trưởng và hệ số nhân cao
•
Cây tái sinh và phôi soma thu
được có chất lượng tốt
•
Hạn chế hiện tượng thủy tinh thể
•

Tiết kiệm công lao động và không
gian nuôi cấy, giảm chi phí sản
suất
•
Giảm hoạt tính của các chất độc
•
Chưa khảo sát được mật độ nuôi
cấy
•
rất đắt, chưa được tự chế tạo
trong nước
•
Các thông số kĩ thuật cần được
khảo sát kỹ lưỡng và tối ưu hóa
đối với từng giai đoạn nuôi cấy
của từng loại cây
Ưu điểm
Nhược điểm
Các bước cơ bản
Các bước cơ bản
III. Ứng dụng của nuôi cấy huyền phù tế bào
trong nhân giống vô tính.

Nuôi cấy callus: tiến hành cấy chuyển nhiều lần trong môi
trường thạch mềm

Nuôi cấy dịch huyền phù:
•
Callus được cấy chuyển sang môi trường lỏng chuyển động
•

Các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những chuyển động
xoáy của môi trường
các tế bào đơn, các cụm tế bào với kích thước khác nhau, các
mẫu nuôi cấy còn thừa chưa phát triển và các tế bào chết
Sự phát sinh soma
Sự phát sinh soma

sử dụng môi trường kích thích có chứa auxin, nước dừa,
dùng nhiều xytokinin, myo-inosiol giảm lượng nitrogen

phôi soma có kích thước tương đối nhỏ và đồng đều kích
cỡ nên chúng không phải cắt thành những mảnh nhỏ và
tách rời khi nuôi cấy trong môi trường tăng sinh

sau đó cất trữ hoặc tạo ra cây con trực tiếp
.
Sự nhân chồi
Sự nhân chồi
Hệ thống ngập chìm có tác dụng thúc đẩy việc nhân chồi:

chồi sinh trưởng tốt hơn, chất lượng tốt hơn và dài hơn
so với chồi trên môi trường rắn

chồi có thể tăng trưởng liên tục cho phép thu
hoạch chồi sau mỗi tháng mà không cần cấy chuyền

Sau khi thu hoạch, cây con được chuyển ra nuôi ở môi
trường tự nhiên bình thường như trên môi trường thạch
IV. Ứng dụng trong sản suất sinh khối tế bào thực vật
và các hợp chất có giá trị cao

NHÂN SINH
KHỐI CALLUS
NHÂN SINH
KHỐI CALLUS
NHÂN SINH
KHỐI RỄ
NHÂN SINH
KHỐI RỄ

Hiệu suất mang
lại rất cao

Một số sản phẩm:
•
Alkaloid:morphina
•
Các hợp chất kháng ung
thư: taxol, saponin

Tốc độ tăng trưởng rất cao

Nđ:
•
Nguồn cung cấp Oxy ko đến đc
với sinh khối ở giữa Bioreactor
mô bị lão hóa
•
Khả năng nuôi cấy rễ thành công
phụ thuộc vào việc thiết kế hệ
thống Bioreactor phù hợp

1 SỐ HỢP CHẤP THỨ CẤP
Diosgenin: chống viêm;
chữa sốt, thấp khớp, đau
lưng
Cây củ nâu
Cây Anh túc
Codein : giảm đau và
giảm ho
.
Cây thông đỏ
hóa trị liệu ung thư
Cây nhân sâm
Saponin và sapogenin:
chữa rối loạn tiêu hóa,
chống suy nhược cơ thể,
tăng cường sinh lực
Taxol
V. Ứng dụng trong nuôi cấy thông đỏ đê
thu nhận Taxol.
Thông Đỏ
Thông Đỏ
•
Nguồn dược liệu rất quý trong y học:
•
Năm 1994 công bố: “từ cây thông đỏ
có thể tìm thấy các hoạt chất để chữa
trị bệnh ung thư cụ thể là Taxol chiết
suất từ vỏ các loài: T. brevifolia, T.
cuspidata, T.yunnanensis, T. baccata
và T. wallichiana,…

•
Chữa ung thư buồng trứng và ung
thư vú, chống các khối u ác tính, ung
thư phổi và một số dạng khối u rắn
khác.