Nghiên cứu một số tính chất sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn chuyển hóa nitơ có khả năng tạo màng sinh học (biofilm) để ứng dụng trong công nghệ xử lý nước nhiễm amoni

Số hóa bởi trung tâm học liệu
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
oOo



HOÀNG THỊ HOA DIỄM


NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT SINH LÝ, SINH HÓA CỦA
VI KHUẨN CHUYỂN HÓA NITƠ CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG
SINH HỌC (BIOFILM) ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ
XỬ LÝ NƢỚC NHIỄM AMONI



LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC






Thái Nguyên – 2013


Số hóa bởi trung tâm học liệu
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
oOo


HOÀNG THỊ HOA DIỄM


NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT SINH LÝ, SINH HÓA CỦA
VI KHUẨN CHUYỂN HÓA NITƠ CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG
SINH HỌC (BIOFILM) ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ
XỬ LÝ NƢỚC NHIỄM AMONI

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. HOÀNG PHƢƠNG HÀ



Thái Nguyên – 2013
i

Số hóa bởi trung tâm học liệu
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu và kết quả nêu trong luận văn là một phần kết quả trong đề tài nghiên cứu
của phòng Công nghệ sinh học môi trƣờng, Viện Công nghệ sinh học. Các kết

quả này đảm bảo trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất cứ công
trình nào khác.


Thái Nguyên, tháng 08 năm 2013
Tác giả luận văn


Hoàng Thị Hoa Diễm











ii

Số hóa bởi trung tâm học liệu
LỜI CẢM ƠN
Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn trân thành, tôi xin gửi lời cảm
ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Phương Hà, PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh, phòng
Công nghệ Sinh học Môi trường, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là những người thầy mẫu mực đã dành
cho tôi những ý tưởng quý báu cũng như tận tụy hướng dẫn, tạo mọi điều kiện
thuận lợi và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị trong phòng Công nghệ Sinh
học Môi trường đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong việc nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến ban lãnh đạo Viện Công nghệ
Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên cứu tại Viện trong suốt thời
gian qua.
Đồng thời tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới các thầy cô trong Khoa
Khoa học sự sống, Trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên đã
truyền đạt những kiến thức bổ ích và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt
quá trình học tập tại trường.
Cuối cùng tôi muốn gửi lời cám ơn chân thành đến những người thân
trong gia đình và bạn bè thân thiết đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ tôi
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.




iii

Số hóa bởi trung tâm học liệu

DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
amoA
Gene encoding the subunit A of AMO
Amp
Ampiciline
AOB
Ammonia oxidyzing Bacteria
ATP
Adenosine triphosphate

ĐC
Đối chứng
Đtg
Đồng tác giả
DNA
Deoxyribonucleic acid
PCR
Polymerase chain reaction
RNA
Ribonucleic acid
16S rRNA
16S ribosomal Ribonucleic acid













iv

Số hóa bởi trung tâm học liệu

DANH MỤC CÁC BẢNG

TRANG
Bảng 2.1. Tỉ lệ pha loãng dung dịch chuẩn ch a NH
4
+
với nƣớc cất 23
Bảng 2.2. Tỷ lệ pha loãng dung dịch chuẩn + nƣớc cất và hàm lƣợng N-NO
2
-
25
Bảng 2.3. Tỉ lệ pha loãng dung dịch chuẩn + nƣớc cất và hàm lƣợng N-NO
3
-
26
Bảng 3.1. Khả năng oxy hóa amoni của nhóm vi khuẩn phân lập 32
Bảng 3.2. Khả năng tạo màng sinh học của của vi khuẩn oxy hóa amoni 33
Bảng 3.3. Khả năng oxy hóa nitrite của nhóm vi khuẩn đƣợc phân lập 35
Bảng 3.4. Khả năng tạo màng sinh học của các vi khuẩn oxy hóa nitrite 35
Bảng 3.5. Ảnh h
PD60 và PD58 50
Bảng 3.6. Ảnh h
5NM 51

v

Số hóa bởi trung tâm học liệu
DANH MỤC CÁC HÌNH
TRANG
Hình 1.1. Tế bào của một số loài thuộc nhóm vi khuẩn oxy hóa amoni 9
Hình 3.1. Các chủng vi khuẩn phân lập trên môi trƣờng Winogradsky. 31
Hình 3.2. Khả năng tạo màng sinh học của vi khuẩn oxy hóa amoni 34
Hình 3.3. Khả năng tạo màng sinh học của các chủng oxy hóa nitrite 36
Hình 3.4. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vi
khuẩn nghiên cứu 38
Hình 3.5. Cây phát sinh chủng loại của vi khuẩn nitrate hóa PD60, PD58, 5NM
và 2NM 40
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt tính nitrate hóa của vi khuẩn nghiên
cứu 42
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng tạo biofilm ng của
vi khuẩn nghiên cứu 43
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của pH tới hoạt tính nitrate hóa của vi khuẩn nghiên
cứu 45
Hình 3.9. Ảnh hƣ ng của
vi khuẩn nghiên cứu 46
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của NaCl tới hoạt tính nitrate hóa của vi khuẩn nghiên
cứu 48
Hình 3.11. Ảnh hƣ ng
của các chủng vi khuẩn nghiên cứu 49
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nồng độ nitơ ng
của vi khuẩn nghiên c u 52

Số hóa bởi trung tâm học liệu
MỤC LỤC
TRANG
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT iii
DANH MỤC CÁC BẢNG iv
DANH MỤC CÁC HÌNH v
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Hiện trạng ô nhiễm và nguồn gốc phát sinh các hợp chất nitơ trong nƣớc 3
1.1.1. Hiện trạng ô nhiễm các hợp chất nitơ trong nƣớc 3
1.1.2. Tác hại của các hợp chất chứa nitơ đối với cơ thể con ngƣời 4
1.1.3. Nguồn gốc phát sinh các hợp chất chứa nitơ trong môi trƣờng sống 5
1.2. Cơ sở của phƣơng pháp khử nitơ sinh học 6
1.2.1. Cố định nitơ 6
1.2.2. Quá trình khoáng hóa 7
1.2.3. Quá trình nitrate hóa 7
1.2.4. Quá trình khử nitrate 7
1.3. Vi khuẩn nitrate hóa tự dƣỡng 7
1.3.1. Vi khuẩn oxy hóa amoni nitroso) 8
1.3.2. Vi khuẩn oxy hóa nitrite (vi ) 11
1.4. Màng sinh học (Biofilm) 13
1.4.1. Khái niệm về biofilm 13
1.4.2. Thành phần của biofilm 13
1.4.3. Ảnh hƣởng của một số điều kiện hóa lý đến sự hình thành và phát triển
của biofilm 16
1.4.4. Màng sinh học của vi khuẩn nitrate hóa tự dƣỡng 17

1.5. Phân loại vi khuẩn bằng xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA 18

Số hóa bởi trung tâm học liệu
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1.Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc 20
2.1.1. Vật liệu 20
2.1.2. Hóa chất và enzyme 20
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm 20
2.2. Các môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn. 21
2.2.1. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn nitrate hóa 21
2.2.2. Môi trƣờng LB 21
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 21
2.3.1. Phân lập vi khuẩn nitrate hóa 21
2.3.2. Xác định hàm lƣợng amoni trong nƣớc ngọt theo phƣơng pháp Nessler 22
2.3.3. Xác định hàm lƣợng NO
2
-
bằng phƣơng pháp Griss 24
2.3.4. Xác định hàm lƣợng NO
3
-
bằng phƣơng pháp Salicylate 25
2.3.5. Phƣơng pháp đánh giá khả năng tạo màng sinh của các chủng vi
26
2.3.6. Ảnh hƣởng của một số điều kiện lên khả năng tạo màng sinh học và hoạt
tính nitrate hóa 27
2.3.7. Các phƣơng pháp sinh học phân tử 29
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 31
3.1. Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các
chủng vi khuẩn nitrate hóa 31

3.1.1. Phân lập 31
3.1.2.Khả năng nitrate hóa và tạo màng sinh học (Biofilm) 32
36
, sinh tr
sinh học 41

Số hóa bởi trung tâm học liệu
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO 55











1
Số hóa bởi trung tâm học liệu
MỞ ĐẦU
Nƣớc là dạng vật chất rất cần cho tất cả các sinh vật sống trên Trái Đất.
Khoảng 71% với 361 triệu km
2
bề mặt trái đất đƣợc bao phủ bởi nƣớc. Nƣớc
có nhiệt hoá hơi, đóng băng và ngƣng kết tƣơng đối gần nhau, vì vậy nƣớc tồn
tại trên Trái Đất ở cả ba dạng: rắn, lỏng và hơi. Ngƣời ta đã phát hiện thấy
khoảng 80% loại bệnh tật của con ngƣời có liên quan đến chất lƣợng của

nguồn nƣớc dùng cho sinh hoạt [48].Vì vậy chất lƣợng nƣớc có vai trò hết sức
quan trọng trong sự nghiệp bảo vệ và chăm sóc sức khoẻ cộng đồng. Các
nguồn nƣớc đƣợc sử dụng chủ yếu là nƣớc mặt và nƣớc ngầm đã qua xử lý
hoặc sử dụng trực tiếp. Phần lớn chúng đều bị ô nhiễm bởi các tạp chất với
thành phần và mức độ khác nhau tuỳ thuộc vào điều kiện địa lý, đặc thù sản
xuất, sinh hoạt của từng vùng và phụ thuộc vào địa hình mà nó chảy qua hay
vị trí tích tụ. Ngày nay, với sự phát triển của nền công nghiệp, quá trình đô thị
hoá và bùng nổ dân số đã làm cho nguồn nƣớc tự nhiên ngày càng cạn kiệt và
ngày càng ô nhiễm. Hoạt động nông nghiệp gắn liền với sử dụng các loại
phân bón trên diện rộng. Các loại nƣớc th công nghiệp, sinh hoạt giàu hợp
chất nitơ thải vào môi trƣờng làm cho nƣớc ngầm ngày càng bị ô
nhiễm.
Amoni
do làm tăng sự hình thành
glutamate và glutamine chuyển hoá nitrit và nitrate là
yếu tố gây độc. Các hợp chất nitrit và nitrate hình thành do quá trình oxi
hoá vi sinh vật trong quá trình xử lý, tàng trữ và chuyển tải nƣớc đến
ngƣời tiêu dùng. Vì vậy việc xử lý amoni trong nƣớc là đối tƣợng rất đáng
quan tâm.
Để giải quyết tình trạng này, các nƣớc tiên tiến trên thế giới đã nghiên
cứu và đề xuất áp dụng các kỹ thuật loại nitơ bằng biện pháp hóa lý và sinh
học. Trong đó biện pháp sinh học đƣợc quan tâm hơn cả. Một trong các
2
Số hóa bởi trung tâm học liệu
phƣơng pháp xử lý sinh học đem lại hiệu quả cao, đó là sử dụng màng sinh
học (Biofilm) do các vi sinh vật tạo ra.
Tại Việt Nam, trong những năm gần đây các công nghệ loại bỏ các hợp
chất chứa nitơ bằng biện pháp sinh học đã và đang đƣợc quan tâm. Một trong
số đó là công nghệ ứng dụng sự hình thành màng sinh học của nhóm các vi
khuẩn nitrate hóa. Ở nƣớc ta những nghiên cứu về màng sinh học của nhóm vi

khuẩn này còn rất mới mẻ. Vì vậy: chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu một
số tính chất sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn chuyển hoá nitơ có khả năng
tạo màng sinh học (biofilm) để ứng dụng trong công nghệ sử lý nƣớc ô
nhiễm amoni”.
Mục tiêu: Lựa chọn một số chủng vi khuẩn có hoạt tính nitrate hóa cao
và tạo màng sinh học.
Nội dung nghiên cứu:
* Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu một số vi khuẩn nitrate hóa tiêu
biểu.
* Phân loại vi khuẩn tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
* Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính nitrate hóa, sinh
trƣởng và tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.




3
Số hóa bởi trung tâm học liệu
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Hiện trạng ô nhiễm và nguồn gốc phát sinh các hợp chất nitơ trong nƣớc
1.1.1. Hiện trạng ô nhiễm các hợp chất nitơ trong nƣớc
Có thể đánh giá mức độ ô nhiễm bằng cách so sánh nồng độ các hợp
chất nitơ trong nƣớc thải hoặc nƣớc ngầm với qui chuẩn [1].
Theo kết quả quan trắc tài nguyên nƣớc dƣới đất năm 2011 của Trung
tâm Quy hoạch và điều tra tài nguyên nƣớc – Bộ tài nguyên và môi trƣờng,
phần lớn nƣớc ngầm ở vùng đồng bằng bắc bộ nhƣ Hà Nội, Hải Phòng, Thái
Bình, Hải Dƣơng… đều bị nhiễm bẩn amoni (NH
4
+
) rất nặng vƣợt tiêu chuẩn

nhiều lần. Hàm lƣợng amoni tính theo nitơ trên toàn bộ số mẫu lấy từ tầng
nƣớc ngầm trên (cách mặt đất khoảng 25 – 40m) vào mùa khô năm 2011 gấp
92,4 lần tiêu chuẩn cho phép [8].
Xác suất các nguồn nƣớc ngầm nhiễm amoni ở vùng đồng bằng Bắc bộ
có nồng độ cao hơn tiêu chuẩn là 100%. Ngoài amoni, không ít nguồn còn
chứa khá nhiều chất hữu cơ. Nhƣ vậy, tình trạng nhiễm bẩn Amoni và hợp
chất hữu cơ trong nƣớc ngầm ở Đồng bằng Bắc Bộ đã đến mức báo động [8].
Theo kết quả khảo sát chất lƣợng nƣớc của bộ Xây dựng cho thấy, hàm
lƣợng amoni trong nguồn nƣớc ngầm tại một số địa bàn Hà Nội dao động
trong khoảng 30 mg/l. Hầu hết, các khu vực đều nhiễm amoni, trong đó có
các khu vực nhiễm nặng nhƣ: Pháp Vân, Định Công, Hạ Đình, Kim Giang,
Tƣơng Mai, Bạch Mai, Bách Khoa, Kim Liên, Quỳnh Mai. Một số khu vực
nhiễm nhẹ nhƣ Lƣơng Yên, Yên Phụ, Ngô Sĩ Liên, Đồn Thủy. Ngoài ra, một
số khu vực cũng đã có dấu hiệu nhiễm nhƣ Ngọc Hà, Mai Dịch. Nhìn chung,
các khu vực bị nhiễm nặng amoni tập trung nhiều hơn ở khu vực phía Nam
thành phố và khu Trung tâm. Cao nhất là khu vực Pháp Vân, Định Công (~ 20
mg/l), sau đó là khu vực Hạ Đình (~12 mg/l), Tƣơng Mai (~10 mg/l) [3].
4
Số hóa bởi trung tâm học liệu
Tầng nƣớc ngầm dƣới (cách mặt đất từ 45m đến 60m) là nguồn cung
cấp cho các nhà máy cũng bị nhiễm bẩn. Đề tài “ nghiên cứu xử lí nƣớc
ngầm nhiễm bẩn amoni” do sở giao thông công chính Hà Nội vừa nghiệm thu
cho thấy: do cấu trúc địa chất , nƣớc ngầm nhà máy nƣớc Pháp Vân, Hạ Đình,
Tƣơng Mai có hàm lƣợng sắt và amoni (NH
4
) vƣợt quá tiêu chuẩn cho phép
khá nhiều. Tại nhà máy Tƣơng Mai: Hàm lƣợng NH
4
là 6 – 12, có khi 18
mg/l; Hạ Đình: 12 -20, có khi 25 mg/l; Pháp Vân: 15 – 30, có khi 40 mg/l [3].

Nhƣ vậy tình trạng nƣớc ngầm bị ô nhiễm amoni đã đến mức báo động.
Sử dụng nƣớc ngầm bị nhiễm amoni cho mục đích ăn uống sẽ làm ảnh hƣởng
rất lớn đến đến sức khỏe cộng đồng. Chính vì vậy trên thế giới cũng nhƣ Việt
Nam đã và đang nghiên cứu và tạo ra các công nghệ loại bỏ các hợp chất chứa
nitơ có trong các nguồn nƣớc, đặc biệt là nƣớc ngầm.
1.1.2. Tác hại của các hợp chất chứa nitơ đối với cơ thể con ngƣời
Trong những thập niên gần đây, nồng độ các hợp chất chứa nitơ trong
nƣớc uống tăng lên đáng kể. Chúng có thể tồn tại dƣới dạng các hợp chất hữu
cơ, amoni, nitrite và nitrate. Amoni thực ra không quá độc đối với cơ thể con
ngƣời. Ở trong nƣớc ngầm amoni không thể chuyển hóa đƣợc do thiếu oxi.
Nhƣng khi khai thác lên, vi sinh vật trong nƣớc nhờ oxi trong không khí
chuyển amoni thành các nitrit (NO
2
-
), nitrat (NO
3
-
) tích tụ trong nƣớc. Bản
thân NO
3
-
không gây rủi ro cho sức khỏe, tuy nhiên NO
3
-
chuyển thành NO
2
-

do men khử nitrate và gây độc [50]. NO
2

-
ảnh hƣởng đến sức khỏe với hai khả
năng sau: chứng máu Methaemoglobin và ung thƣ tiềm tàng.
 Chứng máu Methaemo-globinaemia (hội chứng xanh xao trẻ em)
Khi có mặt NO
2
-
thì haemoglobin của máu bị chuyển hóa thành
methaemoglobin. Đối với ngƣời trƣởng thành, methaemoglobin nhanh chóng
đƣợc chuyển thành oxyhaemoglobin nhờ hệ thống khử nhƣ NADH-
methaemoglobin reductase, nhƣng đối với trẻ sơ sinh từ 3 tháng tuổi trở
xuống thì hệ enzyme này chƣa phát triển hoàn chỉnh. Sự hình thành
5
Số hóa bởi trung tâm học liệu
methaemoglobin làm giảm khả năng vận chuyển oxy trong máu tới các tế bào
và cơ quan trong cơ thể, làm xuất hiện bệnh da xanh [6].
 Ung thƣ tiềm tàng
Ở Việt Nam khác với nhiều nƣớc trên thế giới, nƣớc ngầm bị nhiễm
NH
4
+
rất nặng. Tuy NH
4
+
không độc nhƣng dƣới tác động của vi khuẩn hiếu
khí, nó dễ dàng chuyển hóa thành NO
2
-
. NO
2

-
có thể chuyển hóa thành axit
nitric (HNO
2
) trong điều kiện pH axít. Axit nitric là một tác nhân nitro hóa
mạnh, khi với các thành phần thực phẩm, kể cả các axit amin dễ tạo
thành nitrosamine là một tác nhân gây ung thƣ [41]. Rất nhiều nghiên cứu trên
động vật nhƣ chuột, chó, thỏ… cho thấy các hợp chất N-nitroso đƣợc đƣa vào
theo đƣờng ăn uống trực tiếp sẽ gây tổn thƣơng hoại tử ở ruột, gan và tạo nên
xung huyết của phổi. Phức hợp N-nitroso-methylurea cũng gây xung huyết và
tổn thƣơng dạ dày, ruột, tụy và làm ảnh hƣởng đến tủy sống. Các nghiên cứu
tác động của nitrosamin tới các động vật có vú, chim, cá và một số loài động
vật lƣỡng cƣ khác cho thấy sự phát triển của tế bào ung thƣ và chúng thƣờng
xuất hiện ở gan, thực quản, hệ hô hấp, thận…[41].
Ngoài ra, amoni có mặt trong nƣớc ngầm làm giảm hiệu quả của khâu
khử trùng bằng clo, do nó phản ứng với clo để tạo thành các cloramin, có tác
dụng sát khuẩn yếu hơn nhiều so với clo (khoảng 1000 lần). Mặt khác, nó còn
giảm khả năng xử lý sắt, mangan bằng công nghệ truyền thống. Amoni là
nguồn dinh dƣỡng, tạo điều kiện cho các vi sinh vật nƣớc, kể cả tảo, phát triển
nhanh, làm ảnh hƣởng đến chất lƣợng nƣớc thƣơng phẩm, đặc biệt là độ
trong, mùi, vị, nhiễm khuẩn [7].
1.1.3. Nguồn gốc phát sinh các hợp chất chứa nitơ trong môi trƣờng sống
Nitơ luôn tồn tại ở dạng các hợp chất vô cơ hoặc hữu cơ trong cơ thể
sống của động thực vật hay trong các sản phẩm công nghiệp và tự nhiên. Các
dạng hợp chất này bao gồm amoni/ammoniac (NH
4
+
/NH
3
); khí nitơ (N

2
);
dinitơ oxit (N
2
O); nitơ oxit (NO); nitrite (N-NO
2
); nitơ dioxit (NO
2
); nitrate
6
Số hóa bởi trung tâm học liệu
(N-NO
3
) [5]. Sự tích lũy các hợp chất này ngày một tăng do sự bùng nổ dân
số đã gây ô nhiễm ngày càng nặng nề đối với các thành phố lớn. Chất thải từ
các nhà máy công nghiệp và các trang trại chăn nuôi gia súc, các lò giết mổ…
[2] đã tăng đáng kể các chất gây ô nhiễm có nguồn gốc từ nitơ. Ngoài ra, sự
lạm dụng phân bón hóa học cho sản xuất nông nghiệp cũng là nguyên nhân
chính dẫn đến ô nhiễm các hợp chất nitơ trên các diện tích canh tác và nƣớc
ngầm. Theo ƣớc tính, ngƣời dân sử dụng lƣợng phân bón hóa học cho nuôi
trồng rất lớn. Trong điều kiện bình thƣờng chỉ có 50 – 70% lƣợng NO
3
-
có
trong lƣợng phân bón hóa học nhƣ NaNO
3
, KNO
3
, Ca(NO
3

)
2
, NH
4
NO
3
đƣợc
cây sử dụng, 15 – 20% bị giữ lại trong đất và 20 – 10% bị rửa trôi xâm nhập
vào nƣớc ngầm, nƣớc mặt [7]. Quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ ngay
trong tầng chứa nƣớc cũng làm ô nhiễm nƣớc ngầm. Đây là các nguyên nhân
chính làm tăng các hợp chất chứa nitơ trong nƣớc ngầm [2].
1.2. Cơ sở của phƣơng pháp khử nitơ sinh học
Phƣơng pháp khử nitơ sinh học dựa vào chu trình chuyển hóa nitơ của
vi sinh vật trong tự nhiên. Vòng tuần hoàn của nitơ bao gồm cố định nitơ, quá trình
khoáng hóa của vi khuẩn, quá trình nitrate hóa và quá trình khử nirate.
1.2.1. Cố định nitơ
Sự sống của vạn vật trên trái đất đều có nhu cầu đối với các hợp chất
nitơ để tạo ra các hợp chất cơ bản nhƣ protein và các acid nucleic. Trong
không khí, nitơ chiếm 79%, nhƣng chỉ rất ít sinh vật sử dụng nitơ ở dạng này.
Quá trình cố định nitơ dƣới các hình thức: cố định trong khí quyển, cố định
nitơ hóa học dƣới điều kiện nhiệt độ và áp xuất không khí cao (T
0
C khoảng
500
0
C, áp xuất khí quyển khoảng 200at) và cố định nitơ sinh học. Quá trình
cố định nitơ sinh học đƣợc thực hiện chủ yếu nhờ một số loài vi khuẩn. Ngoài
các vi khuẩn hay sinh vật cố định nitơ tự do trong đất, có một vài nhóm sinh
vật sống cộng sinh với thực vật nhƣ cây họ đậu, trong khi đó một số nhóm
khác sống cộng sinh với động vật nhƣ mối, hà. Một số đại diện của vi khuẩn

7
Số hóa bởi trung tâm học liệu
lam cũng có thể cố định nitơ. Sự cố định nitơ sinh học đòi hỏi một phức hệ
enzyme và nhu cầu sử dụng ATP tƣơng đối lớn [42].
1.2.2. Quá trình khoáng hóa
Là tạo ra nitơ vô cơ, nhƣ amoni bằng cách phân hủy các chất còn lại của cây
trồng, các chất hữu cơ có trong đất bởi vi sinh vật. Tốc độ tạo ra nitơ vô cơ phụ thuộc
vào lƣợng các chất phân hủy, phụ thuộc vào nhiệt độ và độ ẩm của đất. Quá trình
khoáng hóa có thể diễn ra hàng tuần, hàng tháng và hàng năm. Theo thời gian nitơ
đƣợc tạo ra từ các hữu cơ trong đất, nhƣng sẽ nhanh hơn từ một số chất thải của mùa
màng, xác động vật, chất thải sinh học, các sản phẩm của quá trình nông nghiệp.
1.2.3. Quá trình nitrate hóa
Là quá trình chuyển amoni thành nitrate. Amoni tồn tại trong thiên nhiên một
phần thẩm thấu trực tiếp vào rễ cây, còn phần lớn đƣợc vi sinh vật oxy hóa để tạo
thành nitrate thông qua hai bƣớc: vi khuẩn (chủ yếu thuộc chi Nitrosomonas) oxy hóa
amoni để tạo thành nitrite và nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrite thành nitrate (chủ yếu
thuộc chi Nitrobacter). Đây là hai nhóm vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong chu
trình nitơ.
1.2.4. Quá trình khử nitrate
Trong điều kiện thiếu hụt oxy sẽ diễn ra quá trình khử nitrate. Trong đó nitrate

đƣợc

các vi khuẩn sử dụng làm chất nhận điện tử và chuyển thành N
2
, trả lại nitơ cho
khí quyển. Quá trình này xảy ra do các vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas,
Achromobacter…
1.3. Vi khuẩn nitrate hóa tự dƣỡng
Trƣớc đây, phƣơng pháp phân loại truyền thống đã xếp các chủng vi

khuẩn nitrate hóa chung vào cùng một nhóm thuộc họ Nitrobacteriaceae [51],
[52]. Sau đó dựa vào khả năng oxy hóa các cơ chất vô cơ của vi khuẩn nitrate
hóa mà ngƣời ta đã chia thành hai nhóm, đó là nhóm vi khuẩn oxy hóa amoni
và nhóm vi khuẩn oxy hóa nitrite. Trong phân loại truyền thống, các nghiên
8
Số hóa bởi trung tâm học liệu
cứu về đặc điểm tế bào cũng nhƣ các tính chất sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn
thuộc hai nhóm này đã cho thấy sự khác biệt về hình dạng, kích thƣớc, sự sắp
xếp màng trong tế bào, hình thức trao đổi chất… [52] Những nghiên cứu về
phát sinh chủng loại bằng kỹ thuật sinh học phân tử lại càng khẳng định thêm
sự đa dạng của vi khuẩn nitrate hóa.
1.3.1. Vi khuẩn oxy hóa amoni nitroso)
1.3.1.1. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn oxy hóa amoni
Vi khuẩn oxy hóa amoni là nhóm vi khuẩn gram âm, hóa tự dƣỡng và hiếu khí
bắt buộc. Vi khuẩn này lấy năng lƣợng từ quá trình oxy hóa amoni thành nitrite. Quá
trình oxy hóa amoni xảy ra theo phƣơng trình sau:
2NH
4
+
+ 3O
2
→ 2NO
2
-
+ 2H
2
O + 4H
+
+ năng lƣợng cho tế bào sinh trƣởng
Vi khuẩn oxy hóa amoni tự dƣỡng lấy năng lƣợng và lực khử từ quá trình oxy

hóa amoni để sinh trƣởng và duy trì tế bào. Nguồn cacbon chính mà các tế bào vi
khuẩn sử dụng là CO
2
trong khí quyển thông qua chu trình Calvin-Benson. Các tế
bào vi khuẩn sinh trƣởng rất chậm, thời gian nhân đôi tế bào của vi khuẩn ít nhất là 7
- 8 giờ [16], [36] thậm chí kéo dài tới vài ngày [52].
Tế bào vi khuẩn oxy hóa amoni nói chung hình gậy, hình cầu, hình xoắn hay
hình chia thùy (hình 1.1) [30] uyển động nhờ roi hoặc vành lông
rung. Hầu hết các chủng vi khuẩn sinh trƣởng trong điều kiện hiếu khí, nhƣng một số
chủng có thể sinh trƣởng trong điều kiện thiếu oxy [53]. Những nghiên cứu về đặc
điểm sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn oxy hóa amoni cho thấy, vi khuẩn oxy hóa
amoni có thể tồn tại trong khoảng nhiệt độ từ 5 đến 35
o
C, pH từ 5,8 đến 8,5 [52].
Nhiệt độ tối ƣu cho sinh trƣởng của chúng từ 25 đến 30
o
C [35], pH tối ƣu cho
của vi khuẩn nitrate hóa từ 7,5 đến 8,0 [35]. Nồng độ amoni tối ƣu trong
khoảng 2-10 mM [13]. Độ ẩm và pH là những yếu tố có vai trò quan trọng ảnh
hƣởng tới sinh trƣởng và hoạt tính chuyển hóa nitơ của vi khuẩn nitrate.
9
Số hóa bởi trung tâm học liệu


Nitrosomonas
Nitrosococcus

Nitrosospira
Nitrosolobus
Nitrosovibrio
Hình 1.1. Tế bào của một số loài thuộc nhóm vi khuẩn oxy hóa amoni [30]
Một số chủng vi khuẩn oxy hóa amoni có thể thích nghi trong điều kiện môi
trƣờng bị thiếu hụt oxy [11], [34]. Trong điều kiện không có oxy, Nitrosomonas
eutropha và Nitrosomonas europaea có thể oxy hóa amoni sử dụng nitrite làm chất
nhận điện tử với sự có mặt của piruvat để tạo ra các sản phẩm nhƣ NO, N
2
O, N
2
[9].
Hoạt tính oxy hóa amoni của tế bào Nitrosomonas europaea nhanh chóng đƣợc phục
hồi sau một thời gian dài thiếu lƣợng amoni khác biệt với tế bào Nitrosospira [46].
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh, có một vài chủng vi khuẩn oxy hóa amoni
sinh trƣởng theo hình thức tạp dƣỡng, chúng có thể sinh trƣởng trong môi trƣờng
muối khoáng vô cơ có bổ sung hợp chất cacbon hữu cơ nhƣ acetat, pyruvat,
saccarose So với hình thức sinh trƣởng tự dƣỡng, các chủng vi khuẩn sinh trƣởng
theo hình thức tạp dƣỡng này có thể làm tăng tỷ lệ oxy hóa amoni đến 130 % và số
lƣợng tế bào có thể tăng từ 10-15 lần [36]. Các chủng vi khuẩn oxy hóa amoni không
thể sinh trƣởng dị dƣỡng [36], [35].
10
Số hóa bởi trung tâm học liệu
Vi khuẩn oxy hóa amoni phân bố rộng trong tự nhiên và đƣợc phân lập từ rất nhiều
nguồn khác nhau nhƣ đất, đá, nƣớc ngọt, môi trƣờng biển, nƣớc lợ và các hệ thống
xử lý nƣớc thải [15]. Các nghiên cứu của Watson et al., (1989) cho thấy, các chủng vi
khuẩn này có thể tồn tại trong những điều kiện khắc nghiệt nhƣ độ muối cao
(halophilic = ƣa mặn), pH cao (acidophilic = ƣa acid), độ dinh dƣỡng cao
(eutrophilic) hoặc thấp, khả năng chịu nhiệt cao hoặc thấp. Một nghiên cứu khác cho

thấy, loài Nitrosomonas cryotolerans đƣợc phân lập từ bờ biển Alaska có khả năng
sinh trƣởng đƣợc ở -5
o
C [33], một vài chủng vi khuẩn oxy hóa amoni khác lại đƣợc
phát hiện thấy ở các hồ của vùng Nam cực, nơi mà mặt hồ luôn đóng băng [49].
1.3.1.2. Phân loại vi khuẩn oxy hóa amoni
Các chủng vi khuẩn oxy hóa amoni đƣợc phân lập từ cuối thế kỷ XIX đã cho
thấy sự đa dạng của vi khuẩn oxy hóa amoni [24] .
Để phân loại các chủng vi khuẩn theo phƣơng pháp truyền thống, ngƣời ta
thƣờng dựa vào một số đặc điểm hình thái, khả năng dinh dƣỡng, môi trƣờng sinh
sống, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn. Để phân loại chính xác các chủng
vi khuẩn đến loài, ngƣời ta thƣờng dựa vào các đặc tính di truyền chứ không phải dựa
vào kiểu hình [18]. Các phƣơng pháp sinh học phân tử giúp cho việc khẳng định vị
trí và sự khác biệt về kiểu gen của các chủng vi khuẩn trong khóa phân loại.
Năm 1972, theo khóa phân loại của Bergey, các chủng vi khuẩn oxy hóa amoni
đƣợc chia thành 4 chi: Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosococcus và
Nitrosolobus.[52]
Năm 1989, theo khóa phân loại của Bergey, các chủng oxy hóa amoni đƣợc
chia thành 5 chi, ngoài 4 chi nhƣ đã công bố năm 1972 còn có thêm 1 chi là
Nitrosovibrio với loài Nv. Tenuis [52].
Theo một số tác giả, các chi Nitrosolobus, Nitrosovibrio có quan hệ gần gũi với
chi Nitrosospira [47], nên ngƣời ta coi chúng thuộc chi Nitrosospira . Các chủng vi
khuẩn thuộc 3 chi này có đặc điểm hình thái khác nhau, chi Nitrosospira có hình
11
Số hóa bởi trung tâm học liệu
dạng tế bào hình xoắn ốc, chi Nitrosolobus tế bào phân thùy còn chi Nitrovibrio có
hình dạng tế bào hình que, cong, mảnh. Nhƣng 3 chi này lại không thể phân loại dựa
vào phân tích trình tự gen 16S rRNA [45].
Từ năm 2001 cho đến nay, trong hệ thống phân loại ngƣời ta chia nhóm vi
khuẩn oxy hóa amoni thành 3 chi, dựa vào sự khác biệt về hình dạng tế bào, kiểu

hình và tổ chức nội bào. Đó là Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira. Sử dụng
Kỹ thuật xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA để phân loại cho thấy phần lớn các
chi đều thuộc phân lớp β-proteobacteria [49], chỉ có loài Nitrosococcus oceani,
Nitrosococcus mobolis. Nitrosococcus halophilus thuộc dƣới lớp γ-proteobacteria.
Các kỹ thuật mới để xác định trình tự gen sau này nhƣ sử dụng gen chức năng amoA
(gen mã hóa tiểu đơn vị A của Amonia monooxygenase) đã bổ sung thêm các chủng
vi khuẩn oxy hóa amoni [18].
1.3.2. Vi khuẩn oxy hóa nitrite )
Nhóm vi khuẩn tham gia vào quá trình oxy hóa nitrite thành nitrate đƣợc
gọi là vi khuẩn oxy hóa nitrite. Đây là bƣớc thứ 2 của quá trình nitrate hóa. Nhóm vi
khuẩn này đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển đổi nitrite thành nitrate cần thiết
cho ngành nông nghiệp khi sử dụng chúng làm phân bón nitơ. Bên cạnh đó, nó còn
có vai trò chìa khóa để loại bỏ các hợp chất nitơ trong xử lý nƣớc thải. Do vậy, nhóm
vi khuẩn này đã và đang đƣợc các nhà khoa học tập trung nghiên cứu để ứng dụng.
1.3.2.1. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn oxy hóa nitrite
Nhóm các vi khuẩn oxy hóa nitrite tự dƣỡng đƣợc biết đến nhƣ là vi khuẩn tự
dƣỡng hóa năng (chemoautotroph) hay tự dƣỡng vô cơ (lithautotroph) [13], Gram
âm và hiếu khí. Chúng có khả năng sử dụng nitrite nhƣ là chất cho điện tử, lấy năng
lƣợng từ quá trình oxy hóa nitrite thành nitrate [13]. Giống nhƣ vi khuẩn oxy hóa
amoni, g sử dụng nguồn cacbon là CO
2
từ không khí thông qua chu trình
Calvin-Benson [16]. nitrite hóa nhƣ sau:
2NO
2
-
+ 2O
2
→ 2NO
3

-
+ Năng lƣợng
12
Số hóa bởi trung tâm học liệu
Vi khuẩn oxy hóa nitrite sinh trƣởng chậm , thời gian nhân đôi tế bào có thể từ
8 cho tới 59 giờ hoặc thậm chí kéo dài tới 140 giờ. Ở một số loài, tế bào vi khuẩn có
thể sử dụng nitric oxide (NO) thay cho NO
2
-
nhƣ là

một nguồn cho điện tử [13].
Tốc độ sinh trƣởng của vi khuẩn oxy hóa nitrite phụ thuộc vào nồng độ cơ
chất, nhiệt độ, pH, ánh sáng và nồng độ oxy hòa tan. Các chủng vi khuẩn oxy hóa
nitrite tự dƣỡng sinh trƣởng tốt nhất ở nồng độ nitrite từ 2-30 mM, nồng độ quá cao
có thể ức chế sinh trƣởng của tế bào [52]. Vi khuẩn oxy hóa nitrite có thể sinh trƣởng
trung bình trong môi trƣờng tự nhiên ở dải pH từ 6,5 đến 8,5 điều kiện tối ƣu cho sinh
trƣởng là pH 7,5 – 8 [52], [13]. Nhiệt độ lý tƣởng cho sinh trƣởng của chúng là 25 –
30
o
C trong môi trƣờng thông khí. Nitrobacter có thể sinh trƣởng đƣợc trong môi
trƣờng giới hạn oxy [14], nhƣng trong điều kiện không có oxy tốc độ sinh trƣởng của
vi khuẩn sẽ bị ức chế.
Đặc điểm hình thái: Tế bào vi khuẩn thƣờng có hình que, hình quả lê,
hình cầu hay hình sợi xoắn. Không có nội bào tử. Màng trong tế bào có cấu
trúc hình phiến mỏng hoặc dạng ống. Một số tế bào vi khuẩn có thể chuyển
động nhờ roi, một số khác không có khả năng chuyển động
Môi trƣờng sống: có thể tồn tại trong những môi trƣờng khác
nhau nhƣ đất, đá, nƣớc thải, biển và chủ yếu là nƣớc lợ [53].
Một số loài thuộc chi Nitrobacter và Nitrospira có khả năng sinh

trƣởng dị dƣỡng hay tạp dƣỡng [52], [15], các chủng sinh trƣởng dị dƣỡng
thƣờng sử dụng năng lƣợng và nguồn cacbon từ các hợp chất hữu cơ. Sinh
trƣởng tạp dƣỡng sử dụng nguồn cacbon hữu cơ nhƣ acetate, pyruvat và
glycerol [29]. Các chủng vi khuẩn sinh trƣởng tạp dƣỡng có thể sinh trƣởng
nhanh hơn gấp 10 lần so với vi khuẩn sinh trƣởng tự dƣỡng [23].
1.3.2.2. Phân loại vi khuẩn oxy hóa nitrite
Ngày nay, vi khuẩn oxy hóa nitite đƣợc phân loại thành 4 chi: Nitrobacter,
Nitrospira, Nitrococcus và Nitrospina [52], [13], [27]. Tế bào vi khuẩn thuộc chi
13
Số hóa bởi trung tâm học liệu
Nitrobacter có hình gậy ngắn, màng trong tế bào chứa mũ phân cực. Tế bào vi khuẩn
thuộc chi Nitococcus có hình tròn, màng trong tế bào hình ống. Tế bào các vi khuẩn
thuộc chi Nitrospina có hình gậy dài, màng trong tế bào dạng túi. Tế bào các chủng vi
khuẩn thuộc chi Nitrospira có hình xoắn và không xuất hiện màng trong tế bào.
Các nghiên cứu về trình tự gen 16S rRNA cho thấy chi Nitrobacter thuộc lớp
α Proteobacteria [54], [15], chi Nitrococcus thuộc lớp γ Proteobacteria [22], chi
Nitrospina thuộc lớp δ Proteobacteria [47], còn chi Nitrospira lại thuộc lớp
Nitrospira [53], [23].
Các số liệu phân tích trình tự gen 16S rRNA cho thấy, các chủng thuộc chi
Nitrobacter có quan hệ rất gần gũi với một số vi khuẩn quang dƣỡng nhƣ
Rhodopeudomonas palustris và vi khuẩn cố định N
2
Bradyrhizobium japonicum [27].
1.4. Màng sinh học (Biofilm)
1.4.1. Khái niệm về biofilm
Cùng với những tiến bộ trong quá trình nghiên cứu, khái niệm về màng
sinh h đƣợc đƣa ra càng ngày càng hoàn thiện và đầy đủ hơn. Hiện nay,
khái niệm màng sinh đƣợc hiểu là tập hợp các quần xã vi sinh bám dính
và phát triển trên bề mặt môi trƣờng khác nhau thông qua mạng lƣới ngoại
bào do chính chúng tạo ra [20]. Màng sinh có thể hình thành trên bề mặt

môi trƣờng vô sinh hay hữu sinh và là hiện tƣợng phổ biến xuất hiện trong tự
nhiên, trong đời sống hay trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau.
1.4.2. Thành phần của biofilm
Biofilm trong tự nhiên gồm 2 thành phần chính: Thành phần tế bào (tập
hợp các tế bào của một hay nhiều loài vi sinh vật khác nhau, bám dính trên bề
mặt nhất định) và mạng lƣới các hợp chất ngoại bào (extracellular polymeric
substances – EPS) bao quanh các tế bào, tạo nên cấu trúc đặc trƣng cho
biofilm. Về cơ bản biofilm có thể đƣợc hình thành từ một loài (biofilm đơn
14
Số hóa bởi trung tâm học liệu
chủng) hoặc nhiều loài vi khuẩn (biofilm đa chủng).v.v. Dạng biofilm đa
chủng thƣờng chiếm ƣu thế trong hầu hết các môi trƣờng, còn biofilm đơn
chủng thƣờng xuất hiện trên các bộ phận cấy ghép giả trong cơ thể và là
nguyên nhân gây nên các bệnh về nhiễm trùng. Biofilm đa chủng thƣờng tốt
hơn so với biofilm đơn chủng, sinh khối biofilm của 4 chủng Microbacterium
phyllosphaerae, Shewanella japonica, Dokdonia donghaensis và
Acinetobacter lwoffii cao hơn 167% so với biofilm các chủng đơn tƣơng ứng.
Trong tế bào vi sinh vật 2- 5% tổng khối lƣợng của biofilm, 97% là
nƣớc, 3-6% còn lại là các hợp chất polimer ngoại bào và ion [10]. Một tế bào
riêng lẻ có thể tạo ra vài thành phần ngoại bào khác nhau tùy thuộc vào điều
kiện môi trƣờng, đặc tính của từng loài vi khuẩn cũng nhƣ cách thức khác
nhau hình thành biofilm. Quá trình tạo màng sinh cần có sự tham gia của
nhiều yếu tố để hình thành nên cấu trúc đặc trƣng của màng. Tỷ lệ và mức độ
bám dính của tế bào vi khuẩn vào một bề mặt phụ thuộc vào đặc tính kỵ nƣớc
của bề mặt tế bào, sự hiện diện của lông roi, tiêm mao và chất kết dính, ngoài
ra còn có protein màng tế bào và sự sản xuất mạng lƣới ngoại bào [21].
1.4.2.1. Thành phần mạng lƣới các hợp chất ngoại bào
Mạng lƣới chất ngoại bào có hàm lƣợng cacbon chiếm 50 – 90% tổng
lƣợng hữu cơ trong màng sinh , nó đƣợc xem nhƣ là vật liệu chính của
màng sinh .

Thành phần polymer ngoại bào rất đa dạng tùy loài vi sinh vật, dạng
biofilm và điều kiện hình thành. Nhƣng về cơ bản đều bao gồm các
polysaccharide chiếm khoảng 40 - 95%, 1 - 60% protein, 1 - 10% acid
nucleic, 1 - 40% lipid [19]. Các hợp chất này thay đổi theo không gian và thời
gian tồn tại của biofilm. Về cơ bản biofilm càng dày thì có hàm lƣợng chất
ngoại bào càng nhiều và thời gian tồn tại càng lâu. Mật độ tế bào tập trung
cao nhất ở lớp bề mặt của biofilm và giảm dần theo độ sâu, nhƣng thành phần
chất ngoại bào lại phong phú hơn ở vùng phía trong biofilm. Thành phần chất
15
Số hóa bởi trung tâm học liệu
ngoại bào trong hầu hết các biofilm cũng khác biệt so với các vi khuẩn ở dạng
sống tự do. Những thành phần chính đƣợc xem xét trong một biofilm bao
gồm polysaccharide, protein và DNA.
 Thành phần polysaccharide ngoại bào
Polysaccharide là thành phần quan trọng để tạo nên cấu trúc hoàn chỉnh
của biofilm. Các polysaccharide có thể rất đa dạng về đặc tính sinh lý, sinh
hóa thông qua dạng liên kết glycosilic giữa các phân tử (β-1,4; β-1,3 hay α-
1,6) hay đơn vị monomer cấu tạo nên. Polysaccharide có thể là các đồng phân
tử cấu tạo bởi một đơn phân monosaccharide duy nhất nhƣ cellulose, dextran,
hay dị phân tử cấu tạo bởi 2 đến 4 dạng đơn phân khác nhau nhƣ: alginate,
emulsan, gellen. Các monosaccharide phổ biến trong biofilm là D- glucose,
D- galactose, D-mantose, L-fuctose. Thành phần các đƣờng đơn có ảnh hƣởng
đến đặc tính của cả mạng lƣới biofilm [17].
 Protein ngoại bào
Protein màng tế bào đƣợc ghi nhận là có ảnh hƣởng đáng kể trong sự bám
dính, cũng nhƣ trong giai đoạn phát triển sớm của màng sinh . Nghiên
cứu cho thấy sự gắn kết của E.coli lên bề mặt vô sinh dẫn đến những tƣơng
tác vật lý của tế bào đối với bề mặt đã làm biến đổi các đặc tính bề mặt của
lớp màng ngoại bào [40].
Những phƣơng pháp di truyền và chụp ảnh hiển vi cung cấp thông tin về việc

protein đóng vai trò nhƣ là một yếu tố kết nối tế bào. Protein ngoại bào có
khối lƣợng dao động từ 10 kDa đến 200 kDa .
1.4.2.2. Thành phần tế bào
Biofilm có thể đƣợc hình thành bởi tập hợp các tế bào của một hoặc
nhiều loài vi sinh vật khác nhƣ vi nấm, vi tảo, xạ khuẩn, vi khuẩn. Trong
biofilm các tế bào tập hợp thành các đơn vị cấu trúc là các vi khuẩn lạc.
Thành phần này đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành biofilm
đặc biệt là giai đoạn đầu bởi nó quy định đặc tính hình thành biofilm cho từng