Phương pháp phát hiện và phòng chống HIV

Tiểu luận kỹ thuật gen
Đề tài : Phương pháp phát hiện và phòng chống HIV
GVHD: PGS.TS Khuất Hữu Thanh
SVTH : Phạm Anh Toàn
Nguyễn Xuân Kính
HIV

H i ch ng suy gi m mi n ộ ứ ả ễ
d ch ng iị ở ườ

Ngu n g c 1900 ,1 th ồ ố ợ
săn nhi m AIDS virus t ễ ừ
Pan troglodytes
chimpanzee

1981-2006 ,25 tr ng iườ

0,4% nhi m HIV ,2009ễ
hiv

H ọ Ritrovirus

Chi Lentivirus

DitruyềnngượcchiềutừRNA
sangDNA

HIV-1 , HIV-2
Tải lượng virut


Đo số lượng bản sao
của virut trong máu

Copies/ml

Giá trị nền

Chu kỳ ngưỡng (CT)

Đường nền (base
line)
Các k thu t phân t đo t i l ng virutỹ ậ ử ả ượ

K thu t real time PCR ỹ ậ

K thu t bDNAỹ ậ

K thu t NASBAỹ ậ
Kỹ thuật real – time PCR

Xử lý huyết tương thu RNA tinh sạch

RNA virut phiên mã ngược thành cDNA

Mẫu dò Taq man bắt căp với cDNA

Taq polymerase cắt bỏ mẫu dò , ánh sáng huỳnh quang
phát ra
Xử lý huyết tương thu dna rna tinh sạch


Sát trùng nơi lấy máu bằng cồn 70 độ

Sử dụng chất chống đông máu EDTA

Ly tâm ống chứa máu 2000v/ phút thu huyết tương
Tách chiết rna tổng số từ mẫu máu bằng kit hãng invitrogen

Đ đ m b o thu đc Rna tinh s ch ,c n lo i b Rnase bá m trên d ng c ể ả ả ạ ầ ạ ỏ ụ ụ
thi t b b ng cách ngâm d ng c trong dung d ch DEPC 1% trong 8-12 h ế ị ằ ụ ụ ị
,h p kh trùng v i nhi t đ áp su t cao .l y 200 ul m u cho vào ng ấ ử ớ ệ ộ ấ ấ ẫ ố
eppendorf ,b sung proteinase K .l c nh 30s , 20 phút 37 đ .li tâm 6 ổ ắ ẹ ủ ở ộ
phút t c đ 12000 vòng /phút thu d ch ,thêm 400 ul iso propan và tr n ố ộ ị ộ
đ u .chuy n d ch sang c t S N A P .Li tâm 1 phút t c đ 12000v/phút ,b ề ể ị ộ ố ộ ỏ
d ch li tâm và r a c t b d ch li tâ m và r a c t 2 l n b ng dung d ch r a ị ử ộ ỏ ị ử ộ ầ ằ ị ử
1X ,trong 2 phút

S d ng 120 ul n c kh ion đ thu axit nucleic t ng s .Lo i DNA b ng ử ụ ướ ử ể ổ ố ạ ằ
cách cho thêm 15ul đ m 10X cho Dnase , 37 c trong 8 -10 phút ,thêm ệ ủ
300ul Iso propan và đ o ng 4 -5 l n ả ố ầ

Chuy n d ch vào 1 c t S N A P m i .Li tâm trong 1 -2 phút t c đ ể ị ộ ớ ở ố ộ
12000v/phút ,b d ch ly tâm và r a c t 2 l n b ng dung d ch r a 1x .s ỏ ị ử ộ ầ ằ ị ử ử
d ng 120 ul n c kh ion đ ụ ướ ử ể thu RNA t ng s tinh s chổ ố ạ
K thu t gen và nguyên lý ng d ng – PGS.TS KHU T H U THANH –page 106ỹ ậ ứ ụ Ấ Ữ
Ki m tra đ tinh s ch RNA ể ộ ạ

Ki m tra đ tinh s ch RNA b ng đi n di trên gel ể ộ ạ ằ ệ
agarose

Ki m tra đ tinh s ch c a RNA b ng quang ph kể ộ ạ ủ ằ ổ ế

Mẫu dò Taq man bắt căp với cDNA
Kit th HIVử
K thu t nasba ỹ ậ
(Nucleic acid sequence based amplification)

K thu t NASBA dùng cho các tác nhân có b gene là ỹ ậ ộ
RNA m ch đ nạ ơ

Huy t t ng c a b nh nhân s qua b c x lý và thu ế ươ ủ ệ ẽ ướ ử
RNA tinh s chạ

Trình t RNA c a HIV s đ c phiên mã ng c thành ự ủ ẽ ượ ượ
cDNA

M ch RNA trong phân t RNA-DNA lai s b h y b b i ạ ử ẽ ị ủ ỏ ở
enzyme RNAse H

Cu i cùng m i xuôi ,enzyme T7 RNA polymerase m ch ố ồ ạ
RNA m i s đ c t ng h p trên khuôn m u c a m ch ớ ẽ ượ ổ ợ ẫ ủ ạ
cDNA

Quá trình này đ c l p l i nhi u l n, k t qu là 1 l ng ượ ặ ạ ề ầ ế ả ượ
l n RNA s đ c t o raớ ẽ ượ ạ
1.Khu ch đ i chu i ế ạ ỗ
acid nucleic c a h n 109 b n cóth đ c ủ ơ ả ể ượ
th c hi n ch trong 90 phút hành đ ng ba enzyme.ự ệ ỉ ộ
2. Thi t b đ t ti n thermocycling là không c n ế ị ắ ề ầ

thi t nh là các ph n ng x y ra isothermally 41 ° Cế ư ả ứ ả ở
3. Nó giúp trong ph n ng RT-PCR t t h n vì nó cung ả ứ ố ơ
c p đ ng h c khu ch đ i nhanh h n.ấ ộ ọ ế ạ ơ
4. Retrovirus đ c đ c phát hi n và đ nh l ng b ng cách ượ ượ ệ ị ượ ằ
khu ch đ i ch có b gen RNA và không ph i b n ế ạ ỉ ộ ả ả
sao DNA proviral.
5. Nó có th đo sao chép c a virus DNA b ng cách phát ể ủ ằ
hi n các bi u hi n mRNA cu i.ệ ể ệ ố
6. Nó h tr vi c phát hi n các trình t mRNA con ỗ ợ ệ ệ ự
ng i mà khôngcó các nguy c ô nhi m DNA ườ ơ ễ
II.LIỆU PHÁP GEN TRONG PHÒNG
CHỐNG HIV/AIDS
1. Gây ức chế hoạt động gen của HIV, hoặc biến đổi gen của
HIV
a. Vecto liệu pháp
-Vect có bán ch t virus th ng ng d ng là vect thi t ơ ấ ườ ứ ụ ơ ế
k t adenovirus AAV và HIV-1. ế ừ
-Vect không có b n ch t virus th ng s d ng các ơ ả ấ ườ ử ụ
oligon cleotid, polycalion. liposom ư
-AAV viral vecto được thiết kế mang một gen liệu pháp 4,7 kb
nhằm hạn chế tái bản HIV trong tể bào, tuy nhiên khả năng gắn
gen liệu pháp vào nhiễm sắc thể số 19 của người rất thấp. và
hầu như không có tác dụng (Chaterjee và cộng sự, 1992).
Adenoviral trong li u pháp phòng ch ng hivệ ố
-Vectơ li u pháp thi t k t ệ ế ế ừ adenovirus là m t vect ộ ơ
lai ch a ba lo i gen: gen c a ứ ạ ủ adenovirus là (đo n ạ CCD
Ad5; gen c a HIV là ủ gen gag và tpa đã bi n đ i c a ế ổ ủ
HIV ; gen c a ng i làủ ườ promoter CMV (hCMV - gen
human cytomegavirus). t o nên hai vect li u pháp gạ ơ ệ en

phòng ch ng HIV là vect Ad5FLgagố ơ (Ad5 HIV-I gag)
và Ad5tpagag (Ad CMVI- ipaHIVgag). Các vect li u ơ ệ
pháp gen Ad5FLgag vi Ad5tpagag dã đ c th ươ ử
nghiêm trên khí và trên chuôi cho k t quá r t kh ế ấ ả
quan, t l t bào nhi m HIV c a kh d c đi u tr ỷ ệ ế ễ ủ ỉ ượ ề ị
gi m nhi u so v i kh không đ c đi u tr . Các ả ề ớ ở ỉ ượ ề ị
vect này là nh ng vect tri n v ng có th s d ng ơ ữ ơ ể ọ ế ử ụ
phòng và ch ngố HIV/AIDS cho ng i trong th i gian ườ ờ
s p t i.ắ ớ
-Vectơ liệu pháp thiết kế từ virus HIV-1 được thiết kế và
thử nghiệm từ năm 1991 (Poznansky và cộng sự, 1991;
Shimada và cộng sự 1991). Cơ sở thiết kế vectơ liệu
pháp phòng chống HIV -1 từ bộ gen HIV - 1 đã biến
dổi, và được cài gắn thêm môi số gen khác có chức
năng ức chế tái bản hoặc hoạt động của HIV. Đến nay,
có nhiêù loại vecto phòng chống HIV được sử dụng.
Trong đó có một sô vectơ thử nghiệm có hiệu quả.
-Ví d :ụ
Vectơ pCMVAR9 bao gồm bộ gen virus HIV-1 dã cắt bớt một số
gen, và cài thêm promoter hCMV của bộ gen người (hCMV - gen
human cytomegavirus) và tín hiệu đóng gói SD (packaging
signal); Vectơ mã hoa protein vỏ của virus (env-coding plasmid),
plasmid này dược thiết kế gồm các gen mã hóa vỏ của virus
MLV (Moloney murine leukemia virus); Vecto HIV chuyển dịch
(transfer vector), vectơ này mang các gen GA, RRE và promoter
CMV của bộ gen người có chức năng ngăn cản tái bản gen của
HIV trong tế bào đồng thời hạn chế khả năng gắn bộ gen HIV với
bộ gen tế bào
-Các vectơ HIV-1 phòng chống nhiễm HIV/AIDS đã

được thử nghiệm trên chuột, có hiệu quả hạn chế phát
triển của virus HIV trong tế bào. Tuy nhiên khi sử dụng
viral vectơ HIV-1 có hiện tượng tái tổ hợp gen giữa
vectơ liệu pháp với virus HIV, dẫn đến các đột biến gen
và các hậu quả không mong muốn. Do vây vectơ liệu
pháp 111V-1 cho đến nay còn là vấn đề cần tiếp tục
nghiên cứu, thử nghiệm trên động vật và trên các tế bào
người in vitro.