tiểu luận sinh học vai trò của enzyme restriction và plasmid trong ứng dụng của sinh học phân tử

- 1 -
1/ Đặt vấn đề :
Di truyền học phân phân tử nghiên cứu cấu trúc các gen và sự vận
hành các sản phẩm của chúng trong một tế bào. Lãnh vực này không ngừng
được phát triển là nhờ kỹ thuật liên quan đến sự thao tác ADN, ARN và
protein thay đổi mau lẹ và mạnh mẽ mà các kỹ thuật đó ngày nay được gọi là
công nghệ gen hay công nghệ tái tổ hợp ADN.
Công nghệ tái tổ hợp ADN là những kỹ thuật tách và tái tổ hợp lại các
gen invitro. ADN tái tổ hợp là phân tử ADN lai từ ADN của hai lồi khác
nhau. Ví dụ một gen cần nghiên cứu được gắn vào ADN của virus tạo ADN
tái tổ hợp. Quá trình tách gen cần nghiên cứu, sử dụng rồi gắn vào ADN khác
(như ADN virus, ADN plasmid…) tạo ra ADN tái tổ hợp rồi chuyển ADN tái
tổ hợp vào tế bào cần thiết là các kỹ thuật cơ bản củ công nghệ tái tổ hợp
ADN.
Các enzym cắt hạn chế RE và các vector là các công cụ sử dụng trong
công nghệ tái tổ hợp ADN. Đề tài: “ Vai trò của enzyme restriction và
plasmid trong ứng dụng của sinh học phân tử” giúp người viết hiểu
hơn về vai trò của sinh học phân tử trong nhiều lĩnh vực khoa học.
2/ Đối tượng và phạm vi nghiên cứu :
Đối tượng nghiên cứu: là vi khuẩn, nấm, thực vật, động vật và các
enzym.
Phạm vi nghiên cứu: chỉ tập trung nghiên cứu vai trò của enzyme
restriction và plasmid thông qua kỹ thuật tái tổ hợp ADN.
3/ Phương pháp nghiên cứu:
Phương pháp nghiên cứu đề tài là phương pháp tổng hợp các tài liệu
được lấy từ các nguồn thông tin như thư viện, báo đài, internet. Dựa vào sự
phân tích, tổng hợp, so sánh, đối chiếu các tài liệu để thực hiện đề tài.
Mặc dù đề tài được chuẩn bị khá công phu, nhưng chắc chắn vẫn còn sơ
suất, rất mong được sự góp ý của quí thầy hướng dẫn và các bạn đồng
nghiệp. Tác giả chân thành biết ơn.
4/ Cấu trúc tiểu luận:

Phần 1: Kỹ thuật tái tổ hợp ADN.
Phần 2: Một số ứng dụng của kỹ thuật di truyền.
MỤC LỤC
Trang
Phần mở đầu 1
Phần nội dung 3
Phần I- Kỹ thuật tái tổ hợp ADN
PHẦN MỞ ĐẦU
DUNG
- 2 -
I/ Các enzyme hạn chế 3
II/ Thu nhận gen 5
1/Tạo các đoạn ADN có chứa gen từ bộ gen 5
2/Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học 6
3/Sinh tổng hợp gen từ mARN của gen tương ứng 6
III/ Các vector chuyển gen 6
1/ Các vector chuyển gen plasmid 7
2/ Các vector chuyển gen là phage lamdaˆ
3/ Các vector chuyển gen dự trên cosmid 9
4/ Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men 10
IV/ Tạo ADN tái tổ hợp 11
V/ Tạo dòng phân tử 13
Phần II- Một số ứng dụng của kỹ thuật di truyền…………………….16
KẾT LUẬN 19
TÀI LIỆU THAM KHẢO 20
Phần 1: KỸ THUẬT TÁI TỔ HỢP ADN.
Kỹ thuật tái tổ hợp ADN được thực hiện qua nhiều giai đoạn nhờ các
công cụ enzyme cắt, nối và sao chép nucleic acid.
I.CÁC ENZYME HẠN CHẾ:
Kỹ thuật tái tổ hợp ADN sử dụng hàng loạt các công cụ phân tử, đó là

các enzym nuclease, ADN-polymerase, ligase, reverse transcriptase, terminal
transferase, trong đó vai trò hàng đầu là các enzyme restriction.
Vào năm 1962, V.Arber lần đầu tiên chứng minh rằng có những enzyme
đặc biệt hoạt động trong tế bào vi khuẩn, chúng có khả năng phân biệt ADN
PHẦN NỘI DUNG
- 3 -
của mình với ADN lạ của phage. Các enzym này hạn chế khả năng sinh sản
của phage trong tế bào vi khuẩn bằng cách phân hủy chúng một cách đặc hiệu
do đó gọi theo tiếng Anh là Restriction enzyme. Chữ restriction có nghĩa là
hạn chế có nguồn gốc lịch sử từ đó và được dùng đến nay.
Các enzyme phân cắt ADN được gọi là nuclease gồm 2 loại là
exonuclease và endonuclease. Exonuclease cắt ADN từ 2 đầu mút, còn
endonuclease cắt ADN ở giữa phân tử. Các restriction enzyme cắt phân tử
AND ở giữa một cách đặc hiệu nên được gọi là restriction endonuclease.
Năm 1970, H.Smith và các cộng tác viên đã tách được restriction
endonuclease đầu tiên từ vi khuẩn Haemophilus influenzae Rd được gọi là
HindII. Các enzyme restriction endonuclease nằm trong hệ thống chuyên biệt
hạn chế- biến đổi ( restrictio-modification system) để bảo vệ tế bào khỏi sự
xâm nhập của ADN lạ.
Các restriction enzyme nhận biết ADN mạch kép ở những trình tự nhất
định thường được gọi là điểm nhận biết (recognition sites) và cắt ADN ở
ngay điểm này hay kế cận. Các điểm nhận biết này thường có trình tự 4-8 cặp
nucleotide đối xứng đảo ngược nhau, được gọi là các palyndrom. Sự cắt
ADN như vậy có thể tạo đầu tù hay đầu bằng (HpaI) hoặc đầu dính (BamHI)
phụ thuộc vào cơ chế cắt của enzyme. Đầu dính đặc biệt được sử dụng trong
cấu trúc phân tử ADN lai hay khảm.
Ngày nay hơn 500 loại restriction endonuclease đã được phát hiện,
chúng có khả năng cắt ADN tổng cộng với hơn 120 trình tự nhận biết khác
nhau. Hàng trăm loại restriction endonuclease được bán ở thị trường. Mỗi
restriction endonuclease có trình tự nhận biết đặc trưng.

Ví dụ:
*Restriction endonuclease EcoRI (từ E.coli) có trình tự
Eco RI cắt
G-A-A-T-T-C G A-A-T-T-C
C-T-T-A-A-G G-T-T-A-A G
*Enzyme Bam HI (từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens)
Bam HI
G-G-A-T-C-C G G-A-T-C-C
C-C-T-A-G-G C-C-T-A-G G
*Enzyme Hae III (từ vi khuẩn Haemophilus aegyptium)
Hae III
G-G-C-C G-G C-C
C-C-G-G C-C G-G
Các enzym Eco RI và Bam HI khi cắt ADN mạch kép tạo ra các đầu
lệch dính (cohesive ends) vì các base bổ sung dễ bắt cặp để gắn lại với nhau
- 4 -
như lúc chưa bị cắt rời. Nếu có một đoạn ADN lạ khác cùng bị cắt bởi một
loại enzym hạn chế, ví dụ Eco RI thì nhờ các đầu dính đoạn ADN lạ có thể
xen vào giữa như sau :
Đoạn ADN1 Đoạn ADN lạ 2
G-A-A-T-T-C ~G-A-A-T-T-C~~~~~~G-G-A-T-C-C~
C-T-T-A-A-G ~C-T-T-A-A-G~~~~~~C-T-T-A-A-G~
Eco RI
« Đầu dính » « Đầu dính »
G A-A-T-T-C A-A-T-T-C~~~~~~G
C-T-T-A-A G G~~~~~~C-T-T-A-A
« Đầu dính » « Đầu dính »
G-A-A-T-T-C~~~~~~G-G-A-T-C-C
C-T-T-A-A-G~~~~~~G-T-T-A-A-G
Đoạn ADN lạ xen giữa

Tính chất quan trọng này được sử dụng để cắt và ghép các gen.
Các enzyme endonucleaza hạn chế và những đoạn cắt của chúng
Enzyme hạn chế Các đoạn cắt Có nguồn gốc từ vi khuẩn
Bam III G G A T C C
C C T A G G
Bacillus amylolique faciens H
Bgl II A G A T C T
T C T A G A
Bacillus globigi
Hind III A A G C T T
T T C G A A
Haemophilus influenzeae R
d
Eco RII C C T G G
G G A C C
Escherichia coli R245
Hpa I G T T A A C
C A A T T G
Haemophilus parainfluenzea
Hha I G C G C Haemophilus haemolyticus
- 5 -
C G C G
Taq I T C G A
A G C T
Thermus aquaticus YTI
II.THU NHẬN GEN :
Có thể thu nhậân gen cho việc thực hiện kỹ thuật di truyền bằng ba
phương pháp : tách trực tiếp từ ADN bộ gen, tổng hợp hóa học và sinh tổng
hợp gen từ mARN tương ứng.
1.Tạo các đoạn ADN có chứa gen từ bộ gen :

Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong buổi đầu của sự phát
triển kỹ thuật di truyền. Tồn bộ ADN của một sinh vật được cắt đoạn nhỏ
khoảng 15-20.000 cặp base bằng lắc cơ học hay bởi các restriction
endonuclease rồi gắn vào các vật mang gen tạo plasmid tái tổ hợp. Các
plasmid tái tổ hợp được đưa vào tế bào để tạo dòng đoạn ADN hoặc theo dõi
sự biểu hiện của gen.
Phương pháp này mang nhiều tính chất mò mẫm vì nguyên bộ gen tức
tồn bộ ADN của các sinh vật khác nhau chứa rất nhiều gen. Phương pháp này
được gọi bằng tiếng Anh là Shotgun ( bắn đạn chài). Tuy nhiên hiện nay nó
vẫn được sử dụng có hiệu quả trong việc lập ngân hàng gen hay thư viện gen
của các sinh vật, được gọi là ngân hàng gen nhiễm sắc thể (Bank of genomic
ADN) hay thư viện gen (genomic ADN libraries).
2.Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học :
Lần đầu tiên vào năm 1977, KaItakura và Boyer đã thành công trong
việc cho gen tổng hợp nhân tạo mã hóa hormone somatostatin của động vật
có vú biểu hiện trong tế bào E.coli. Gen somatostatin đã nhận được nhờ biết
cấu trúc peptid của hormone chỉ gồm có 14 amino acid. Sau đó, các nòi
E.coli mang gen tổng hợp được tạo ra, chúng sản sinh hormone tăng trưởng ở
người Somatotripin) và các hormone peptid khác. Gen hormone tăng trưởng
ở người dài 584 cặp nucleotide là gen dài nhất được tổng hợp nhân tạo vào
cuối những năm 70.
3.Sinh tổng hợp gen từ mARN của gen tương ứng :
Trong thực tiễn của kỹ thuật di truyền người ta sử dụng rộng rãi
phương pháp thứ ba tạo gen từ các ARN thông tin của chúng. Phương pháp
này được vào quá trình phiên mã ngược nhờ sử dụng enzyme phiên mã
ngược reverse transcriptase. Enzyme gọi đúng nghĩa là ADN-polymerase phụ
thuuộc ARN (ARN- dependent ADN-polymerase). Enzym có khả năng tổng
hợp nên ADN một mạch là c-ADN (complementary ADN) từ khuôn mARN
hoặc từ một đoạn polyribonucleotide tổng hợp hóa học. Nhờ enzyme này có
thể tổng hợp hầu như bất cứ gen riêng biệt nào miễn có mặt mARN của gen

đó.
- 6 -
III.CÁC VECTOR CHUYỂN GEN:
Vật chuyển gen là phân tử ADN có khả năng tự tái sinh, tồn tại độc lập
trong tế bào và mang được đoạn gen cần thiết . Các vật chuyển gen phải thỏa
mãn các yêu cấu tối thiểu :
*Có các trình tự xuất phát sao chép (ori) để có thể tồn tại độc lập.
*Có các trình tự nhận biết (ricognition site) mà các restriction
endonuclease nhận biết để cắt.
*Các trình tự điều hòa tạo thuận lợi cho sự phiên mã gen lạ.
*Đảm bảo sự di truyền bền vững của ADN tái tổ hợp ở dạng độc lập
hay gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ.
*Có các gen đánh dấu để dễ phát hiện vector hoặc các gen gắn vào.
1.Các vector chuyển gen plasmid :
a.Vector pBR322.
Các vector thông dụng được sử dụng với E.coli trước tiên phải kể đến
là pBR322 (chữ p là chữ viết tắt của cụm từ plasmid ; BR là tên viết tắt của
hai nhà khoa học ở phòng thí nghiệm đầu tiên tìm ra vector này là : F.Bolivar
và R.Rodrigues ; 322 là danh số của plasmid này để phân biệt với các
plasmid khác trong khi nghiên cứu cũng do phòng thí nghiệm này tìm ra như
pBR325, pBR327 ).
Plasmid có kích thước nhỏ hơn 10kb nên dễ loại trừ vấn đề ADN bị
gãy khi làm sạch : pBR322 có 4361 cặp base. Kích thước đó nói lên rằng,
không chỉ vector có thể làm sạch một cách dễ dàng mà còn có thể cả phân tử
ADN được cấu trúc với nó. Thậm chí thêm vào 6 kb ADN, phân tử pBR322
tái tổ hợp vẫn còn là kích thước có thể điều khiển được.
Plasmid này có hai bộ gen kháng kháng sinh là gen kháng ampicilin
hoặc gen kháng tetracyclin được dùng làm marker chọn lựa đối với tế bào
chứa plasmid này. Mỗi gen marker gồm những vị trí cắt gen hạn chế duy
nhất, mà chúng được dùng trong các thí nghiệm chọn dòng.

Việc gài ADN mới vào pBR322 đã được cắt với PstI, PvuI hoặc ScaI
sẽ làm ức chế gen amp
R
và khi dùng gài một trong 8 emzyme cắt hạn chế làm
ức chế tetracyclin. Sự thay các vị trí cắt hạn chế –mà chỗ đó có thể dùng để
ức chế gài- pBR322 có thể được dùng để chọn dòng các đoạn ADN có đầu
dính.
- 7 -
Một sự tiến bộ thứ ba của pBR322 là cơ số bản sao cao. Có khoảng 15
phân tử có mặt trong E.coli bị biến nạp nhưng số lượng này có thể tăng từ
1.000 tới 3.000 phân tử bởi sự phóng đại plasmid với sự có mặt của chất ứu
chế tổng hợp như chloramphenicol. Do đó sự nuôi cấy E.coli đã cung cấp
một sự sản sinh lớn phân tử pBR322 tái tổ hợp.
b. Vector pBR325 chứa ba marker chọn lựa.
pBR325 là plasmid pBR222 có thêm đoạn ADN. Đoạn này mang gen
acetylcholintransferaza của chloramphenicol (CAT) một enzyme ức chế hoạt
động của chloramphenicol và như vậy kháng kháng sinh này. Gen CAT chỉ
chứa vị trí enzyme cắt hạn chế E.coRI trên plasmid. Như vậy vị trí này có thể
được dùng để chọn dòng những tái tổ hợp được phát hiện bởi ức chế gài của
kháng chloramphenicol, pBR325 có tiến bộ hơn pBR222 là thêm một vị trí
chọn dòng và thêm một marker chọn lựa.
c.Vector pATI 53-plasmid có số bản sao cao.
Vector pATI 53 là một dẫn suất khác của pBR322 nhưng trong trường
hợp này sự thay đổi không bao gồm sự cộng thêm marker chọn dòng mới hay
những vị trí chọn dòng bên ngồi. Ngược lại, vector pATI 53 đã được cấu trúc
bởi sự tách ra một đoạn 700 đôi base của pBR322, trong đó có cả gen amp
R
và tet
R
nhưng làm thay đổi sự tái bản và tiếp tục tạo ra plasmid. pATI 53 khác

với pBR322 ở hai phương diện:
- pARI 53 có số lượng bản sao cao hơn pBR322, thường có mặt
khoảng 30-45 phân tử trên một E.coli. Với số lượng copy này thì dễ dàng
được phát hiện khi nghiên cứu hiệu quả của gen được chọn dòng trong tế bào
chủ.
- pARI 53 là một plasmid không liên tục, không trực tiếp vận chuyển
được tới tế bào E.coli khác do sự phát đi 700 đôi base đã làm phá hủy khả
năng liên tục của pBR322. Điều này quan trọng đối với sự kiềm chế sinh học
để tránh đi khả năng làm tẩu thốt phân tử pATK- 53 tái tổ hợp từ trong các
ống nghiệm.
d.Vector pUC8-sự chọn dòng gen lacZ.
Vector pUC8 đã được dẫn ra từ pBR322, mặc dù trong trường hợp này
sự tái bản và gen amp
R
vẫn còn nguyên vẹn. Một đoạn nucleotide của gen này
đã bị thay đổi. Tất cả những vị trí chọn dòng bây giờ đã được tụ tập lại trong
một đoạn ngắn của gen lacz
1
. Sự chọn dòng bằng gen lacz
1
không thuận tiện
hơn khi dùng marker kháng sinh song giá trị của nó ở chỗ là tập trung lại
được các vị trí cắt hạn chế và cho phép một đoạn ADN có hai đầu dính khác
nhau được chọn dòng mà không còn chất gắn.
2.Các vector chuyển gen là phage lamda :
- 8 -
Phân tử ADN lamda chứa 52 kb có thể tăng lên khồng 5% tức là
khoảng 3 kb ADN mới thêm vào nữa. Nếu kích thước của phân tử lớn hơn 52
kb, thì nó không bao gói vào cấu trúc đầu lamda được và các tiểu phần phage
gây nhiễm không tiến hành được. Điều đó làm hạn chế kích thước của đoạn

ADN cài vào vector lamda.
Bộ gen lamda thì quá lớn, điều đó phải có nhiều đoạn thứ tự nhận diện
đối với các enzym cắt hạn chế. Song enzym cắt hạn chế không thể được dùng
để làm gãy phân tử lamda bình thường trong cái kiểu- mà kiểu đó sẽ cho
phép gài ADN mới vào đó được. Hình như phân tử này có thể được cắt thành
nhiều mẫu nhỏ mà những mẫu này có thể tạo thành bộ gen lamda mới thay
đổi do kết cấu nối trở lại.
Do những khó khăn đó nên chúng ta ngạc nhiên rằng; có nhiều kiểu
vector chọn dòng lamda được phát triển. Việc sử dụng đầu tiên của chúng là
những mẫu ADN lớn từ 5kb đến 40kb, còn những mẫu quá lớn thì lại được
dùng bởi plasmid hay vector M13.
Dưới đây là những vector gài vào và thay thế dựa vào phage lamda.
* Vector gài vào ít nhất phải có một vị trí cắt hạn chế
Gồm có :
-Lamda NM607 đó là vector gài, nó mang tới 9 kb ADN mới được gài
vào vị trí EcoRI trong gen CI.
-Lamda charon 16, ADN mới được gài vào vị trí EcoRI làm ức chế gen
lacZ’.
* Vector thay thế phải có hai vị trí cắt hạn chế
Gồm có :
-Lamda (ƯE
λ
B’) : đoạn ADN mới có thể thay vào là 15kb.
-Lamda EMBl4 : đoạn ADN mới có thể thay vào là 23 kb.
3.Các vector chuyển gen dựa trên cosmid :
Cosmid là vector lai tạo giữa phân tử ADN phage và plasmid vi khuẩn.
Cosmid về cơ bản là một plasmid mang vị trí cos. Vị trí cos cần cho
chức phận bao gói của phage. Cosmid thiếu các gen lamda nên không sản
xuất plaque.
Thí nghiệm chọn dòng với cosmid thì được giản ra như sau : cosmid

mở ra một vị trí cắt hạn chế và những đoạn ADN mới được gài vào. Những
đoạn này thì được sản xuất bằng enzyme cắt hạn chế và được dẫn vào
cosmid. Sự kết nối được giản ra. Sau đó ADN cosmid tái tổ hợp được bao gói
và làm nhiễm E.coli mặc dù vòng plaque không được hình thành.
Cosmid được dùng để thuần hóa những đoạn ADN lớn có khi tới 40kb.
Khả năng này đã làm dấy lênvấn đề thư viện genom hay còn gọi là thư viện
bộ gen. Thư viện bộ gen là một bộ của dòng tái tổ hợp-mà dòng đó chứa tất
cả các ADN có mặt trong một cơ thể riêng lẻ, chẳng hạn thư viện bộ gen
E.coli chứa tất cả những gen E.coli. Các cơ thể có thư viện bộ gen được giới
thiệu ở bảng sau :
- 9 -
Số lượng các dòng gen có mặt trong thư viện bộ gen của các cá thể.
Các cá thể khác nhau Kích thước bộ
gen (đôi base)
Số đoạn dài
17 kb (1)
Số đoạn dài
35 kb (2)
Escherichia coli 4x10
6
700 340
Bacillus megaterium 3x10
7
5.300 2.600
Aspergillus nidulans 4x10
7
7.000 3.400
Saccharomyces cerevisiae 7x10
7
12.500 6.000

Drosophila melanogaster 8x10
7
1.410 6.850
Cà chua 7x10
8
125.000 60.000
Người 3x10
9
535.000 258.000
Ếch 2,3x10
10
4.280.000 1.997.000
(1) đoạn 17 kb có thể dùng vector lamda EMB L4 nhân dòng.
(1) đoạn 35 kb có thể dùng vector cosmid nhân dòng.
Những thư viện này có thể giữ lại nhiều năm, có thể gửi cho nhau từ
nhóm nghiên cứu này tới nhóm nghiên cứu khác. Điều đó giupù cho sự phát
triển nghiên cứu nhanh chóng trong lĩnh vực sinh học phân tử.
4.Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men :
Nấm men S.cerevisiae là một trong những cơ thể quan trọng nhất trong
kỹ thuật di truyền. Vector có cấu trúc vòng 2 micromet, kích thước 6kb tồn
tại trong tế bào nấâm men và có số luợng bản sao từ 70 đến 200. Dùng gen
leu.2 như là marker chọn lọc. Vector được dẫn ra từ vòng 2 micromet gọi là
plasmid episom nấm men. Sự cải tiến plasmid này qua nhiều bước dẫn đến
tạo thành nhiễm sắc thể nhân tạo ở nấm men gọi tắt YAC (yeast artificial
chromosome).
- 10 -
Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC.
YAC gồm những trình tự nucleotide căn bản : Ori, CEN ( centromer-
tâm động), EcoRI, TEL (telomer là 2 trình tự đầu mút của nhiễm sắc thể) và
ở phía trước 2 TEL có 2 BamHI (restriction endonuclease). Khi cắt bằng

EcoRI và BamHI. YAC bị đứt thành 2 đoạn A và B, mỗi cái có một đầu TEL
và đầu kia là EcoRI. Nếu ADN, ví dụ của người, cũng bị cắt rất nhẹ nhàng
bằng EcoRI thì nhờ các đầu cố kết, chúng sẽ gắn vào trình tự EcoRI và nối A
với B thành nhiễm sắc thể nhân tạo có khả năng sao chép nhờ Ori và phân
chia đều về các cực của tế bào nhờ CEN. YAC có khả năng mang đoạn gen
rất dài, có thể đến 1 triệu cặp nucleotide.
IV.TẠO ADN TÁI TỔ HỢP (recombinant ADN) :
Bước tiếp theo là gắn các đoạn ADN lạ hay các c-ADN vào vector
chuyển gen để tạo plasmid tái tổ hợp có mang ADN lạ. Phương pháp gắn các
đoạn ADN vào vector đơn giản dùng các đầu mút cố kế hay đầu dính.
Phương pháp này dựa trên cơ sở sự gắn các đoạn ADN với nhau, mà
mỗi một trong chúng có đầu dính tương tự nhận được do bị cắt bơiû cùng
một loại restriction endonuclease. Dưới đây là sơ đồ mô tả quá trình gắn
ADN lạ vào vector chuyển gen nhờ có đầu dính hay đầu cố kết :
- 11 -
Vector là ADN vòng tròn được cắt bởi một loại restristion
endonuclease (ví dụ Eco RI) chuyển thành dạng thẳng có hai đầu cố kết. Các
phân tử ADN của bộ gen khác được cắt bởi cùng một loại restriction nuclease
sẽ tạo ra nhiều đoạn ADN thẳng có các đầu dính. Trộn lẫn ADN thẳng của
vector chuyển gen với các đoạn ADN lạ. Các đầu dính của hai loại ADN bổ
sung bắt cặp với nhau. Enzyme ligase hàn dính các loại ADN lại với nhau tạo
ra plasmid tái tổ hợp (còn gọi là ADN tái tổ hợp).
V.TẠO DÒNG PHÂN TỬ :
1.Các loại vector trong tạo dòng
Loại vector Đặc tính
1. Vector plasmid -Thông thường gắn 8-9kb ADN lạ, tế
bào chủ là vi khuẩn.
2. Vector phage -Có thể gắn 15-20kb ADN lạ, xâm
nhiễm tế bào vi khuẩn cao.
3. Vector cosmid (phối hợp giữa

plasmid và phage lamda)
-Có thể gắn tới 35-50kb ADN lạ, phát
triển ở vi khuẩn.
4. Vector virus của sinh vật nhân
chuẩn SV40 đối với động vật, CaMV
đối với thực vật.
Adenovirus
Retrovirus
Herpesvirus
-Có thể xâm nhiễm vào tế bào động
vật, thực vật.
- 12 -
Vacciniavirus
5. Vector thể nhiễm sắc nấm men
nhân tạo.
-Có thể xâm nhập vào tế bào nấm
men.
-Đưa gen lạ có kích thước lớn 150-
1000kb.
1.Những đặc điểm cơ bản của vector plasmid.
-Plasmid là phân tử ADN vòng có trong vi khuẩn. Plasmid mang một
hay nhiều gen và thường những gen đó có ích cho vật chủ : chẳng hạn
plasmid mang genkháng kháng sinh làm cho vi khuẩn chống được một số
kháng sinh, đồng thời có lợi cho công nghệ tái tổ hợp ADN vì chúng cung
cấp một phương tiện thuận lợi để lực chọn các tế bào có mang gen lạ.
-Tất cả các plasmid có ít nhất một đoạn ADN có nguồn gốc nhân lên,
do đó chúng có khả năng nhân lên mà hồn tồn không lệ thuộc vào nhiễm sắc
thể của vi khuẩn.
-Một vài plasmid cũng có khả năng nhân lên bởi tự gài vào nhiễm sắc
thể của vi khuẩn, plasmid đó gọi là episom.

-Kích thước của các plasmid khoảng từ 10kb cho tới 250 kb.
-Số lượng bản sao từ 1 đến 50.
-Có năm loại plasmid chính :
*Plasmid F-có khả năng khởi động chuyển plasmid sang một cơ
thể khác.
*Plasmid R kháng lại kháng sinh.
*Plasmid col-mã hóa colicin một phân tử protein giết vi khuẩn
khác.
*Plasmid thối hóa-cho phép vi khuẩn làm thối hóa những phân
tử chuyển hóa không bình thường như toluen, acid salicylic.
*Plasmid độc-gây bệnh lý cho vật chủ như plasmid Ti sinh ra
bệnh ung thư rễ trên cây hai lá mầm.
-Trong nấm men S.cerevisae cũng có plasmid vòng 2 micromet; nó kết
hợp với pBR322 của E.coli tạo ra vector episom gài vào ADN chromosom
của nấm men và nhân lên nhiều lần.
Tóm lại plasmid vi khuẩn là phân tử ADN hai chuỗi vòng nhỏ, có chức
phận tự nhiên là kháng kháng sinh. Plasmid có nhiều đặc tính mà những đặc
tính đó được sử dụng đặc biệt vào cấu trúc vector chọn dòng. Chúng có thể
có một bàn duy nhất hay nhiều bản sao trong phạm vi một vi khuẩn và tái bản
không lệ thuộc vào ADN của vi khuẩn. Thứ tự ADN tồn bộ của nhiều
plasmid đã biết được. Nhờ đó người ta có thể gài đoạn ADN ngoại lai vào
những vị trí chính xác bởi những enzym cắt hạn chế. Plasmid nhỏ hơn nhiễm
sắc thể vật chủ (vi khuẩn), bởi vậy người ta có thể tách nó dễ dàng ra khỏi
ADN vi khuẩn để thao tác gắn ADN ngoại lai.
- 13 -
Từ khi phát hiện được plasmid có các đặc điểm và tính chất nêu trên,
cho đến nay các plasmid không ngừng được cải tiến, ngày càng mang thêm
nhiều đặc tính quí cho việc tạo dòng. Hiện nay đã sinh ra ba thế hệ của
plasmid.
Các đặc tính của các thế hệ plasmid.

Các thế hệ của
plasmid
Ví dụ Các đặc tính quý
Plasmid thế hệ 1 Đó là các plasmid
tự nhiên như :
pSC101, Col E
1

Góp phần tạo dòng các gen eukaryote
Plasmid thế hệ 2 PBR322 -Kích thước 4363 bp
-Có hai gen kháng kháng sinh :
*Ap
R
-kháng ampicillin
*Tc
R
-kháng tetrcillin
-Có 20 vị trí nhận biết enzyme giới hạn RE.
-Có 11 vị trí đưa gen ADN lạ xen vào, trong số đó có
những vị trí nằm trong các gen kháng kháng sinh nên
khi có gen ADN lạ xen vào sẽ kàm mất tính kháng
kháng sinh tương ứng.
Plasmid thế hệ 3 -Đây là plasmid mạnh nhất với hai đặc tính ;
*Kích thước nhỏ nên sao chép nhanh, tạo ra số bản
sao lớn.
*Có mang polylinkơ, đó là một đoạn
polynucleotide tổng hợp tương ứng với một chuỗi các
vị trí nhận biết duy nhất của các enzyme giới hạn
(RE).
-Hiện có ba nhóm ;

*Nhóm PUC, 2600bp, mang gen ApR và một phàn
gen lacZ để dễ phát hiện mẫu xen vào giữa gen lacZ
là polylinkơ có thể cho phép gắn xen vào bất cứ gen
lạ nào.
*Nhóm pSP và Gemini, 3000bp mang gen ApRp
và polylinkơ, có một promotor đặc trưng cho ARN
polymeraza ở hai bên polylinkơ thuận lợi cho phiên
mã ra nhiểu ARN để làm mẫu dò nghiên cứu.
* Nhóm pBluescript kết hợp được tất cả các ưu
điểm nói trên.
ADN tái tổ hợp tiếp theo được đưa vào tế bào bằng nhiều phương pháp
khác nhau như biến nạp hóa học, điện biến nạp, vi tiêm hoặc bắn vào tế bào.
Từ những dòng tế bào nhận được chọn ra đúng dòng có mang gen lạ, kiểm tra
lại. Những dòng tế bào có mang đúng gen lạ được đem nhân lên và như vậy
- 14 -
gen ban đầu được nhân lên vô số bản sao. Nến những dòng này có khả năng
biểu hiện tốt trong sinh tổng hợp prôtêin thì được sử dụng để tạo sản phẩm.
Phần II: MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT DI
TRUYỀN.
Kỹ thuật di truyền đã dẫn đến nhiều ứng dụng có tính chất cách mạng
trong sinh học và thực tiễn sản xuất. Nó không những là công cụ hữu hiệu
phục vụ cho nghiên cứu mà còn mở ra nhiều ứng dụng mới mà con người
hằng mơ ước. Sau đây là một số ứng dụng chính :
1.ADN và cả ARN trở nên dễ nghiên cứu.
Nhờ kỹ thuật tạo dòng các gen có thể được nhân ra nhiều bản sao và
tương ứng thu được số lượng lớn ADN của gen. Phân tử ADN trở nên dễ
nghiên cứu. Phương pháp xác định trình tự nuclêotide các gen (giải mã gen)
nhanh chóng ra đời. Đến nay việc giải mã bộ gen người có những thành tựu
ngoạn mục làm thay đổi chiến lược y học thế kỷ 21. Hàng chục bộ gen của
các vi sinh vật như Haemophilus influenzae, Bacillus subtilis, E.coli,

Sacchromyces cerevisiae, đã giải mã xong, tức biết chi tiết tồn bộ
nucleotide cùng thứ tự sắp xếp chính xác của chúng.
Trước đây việc nghiên cứu ADN và prôtêin thường tách rời rồi đối
chiếu kết quả với nhau. Nay việc nhgiên cứu có thể thực hiện liên tục từ
ADN đến ARN rồi protein. Điều này giúp giải quyết nhiều vấn đề trong sinh
học mà trước đây khó với tới như nghiên cứu chi tiết các gen gây ung thư, đi
sâu vào những bí ẩn của bộ não người.
2.Công nghệ protein.
Từ lâu các nhà khoa học mong muốn sản xuất protein với số lượng lớn.
Kỹ thuật tạo dòng cho phép sản xuất nhiều loại protein khác nhau không
những với số lượng lớn mà còn có thể biến đổi chất lượng protein.
Sau khi kỹ thuật di truyền ra đời, nhiều protein Là các polypeptide
được nhanh chóng sản xuất nhờ các vi sinh vật như E.coli hay nấm men
Saccharomyces cerevisiae. Đến nay có hàng trăm protein được sản xuất nhờ
kỹ thuật đó và hàng chục loại được bán ra thị trường. Việc sản xuất bằng các
vi sinh vật có ưu thế là tạo ra số lượng lớn protein trong một thời gian ngắn.
Kỹ thuật di truyền giúp phát triển công nghiệp sản xuất các acid amin, các
vitamin, các kháng sinh, các sắc tố, các thuốc trừ sâu, các protein đơn bào và
các enzyme.
3.Phương pháp chẩn đốn mới :
Kỹ thuật tạo dòng và đặc biệt kỹ thuật PCR (polymerase chain
reaction) đưa đến kỹ thuật chẩn đốn mới bằng lai ADN va ARN. Phương
pháp này hiện đang được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đốn các bệnh di
truyền, quan hệ dòng họ, tội phạm hình sự,
4.Vượt giới hạn tiến hóa trong tạo giống.
- 15 -
Nhờ kỹ thuật tạo dòng có thể chuyển nhiều gen khác nhau từ vi sinh vật,
từ người vào các thực vật, động vật hay vi sinh vật. Các thực vật và động vật
mang gen lạ được gọi là các động thực vật chuyển gen. Nhiều tác phẩm mới
ra đời như :

-Thực vật mang gen của đom đóm, gen tổng hợp protein máu người hay
kháng thể của người. Trong tương lai, thực vật sẽ thành nhà máy sản xuất hóa
chất.
-Heo mang gen hormone tăng trưởng của bò hoặc gen của người chống
phản ứng loại bỏ cơ quan lạ nhằm có thể lấy tim heo thay cho tim người
bệnh. Nhiều dạng chuột mang các gen bệnh của người để làm mô hình nghiên
cứu chữa trị các bệnh nguy hiểm
5.Liệu pháp gen :
Nhờ kỹ thuật di truyền khả năng chữa các bệnh di truyền ở người mở ra
triển vọng mới. Nhiều thí nghiệm tiến hành nhằm đưa gen lành vào thay thế
gen bệnh ở những người bị bệnh di truyền do sai hỏng một gen. Hiện nay kết
quả chưa cụ thể nhưng hứa hẹn một triển vọng tốt đẹp cho lồi người.
Tuy điều trị gen mới ra đời, nhưng đến nay đã hình thành một số hướng
về liệu pháp gen trong chưã bệnh cho người như sau :
-Liệu pháp antisense, antigene.
-Đưa một gen mới vào bù đắp cho gen hỏng hóc.
-Đưa một gen mới vào sản xuất ra chất cần thiết để tiêu hủy tế bào bệnh.
-Cấy gen vào các vi khuẩn, nấm men để sản xuất các dược phẩm mới
quý, hiếm sử dụng trong điều trị các bệnh.
-Tái tổ hợp gen trong tạo vaccin thế hệ mới, vaccin phân tử-vaccin ADN.
-Sử dụng kỹ thuật di truyền trong cấy ghép các cơ quan để thay thế
những cơ quan bệnh
-Thay phẫu thuật bằng liệu pháp gen.
Phân loại bệnh Trên các bệnh cụ thể
Các bệnh do virus 1. Adeno virus
2. Herpes simplex virus 1 (HSV 1)
3. Herpes simplex virus 1 (HSV 2)
4. Herpes Zoster
5. Cytimegalovirus (CMV)
6. Epstein-Barr virus (EBV)

7. Human paplilloma virus (HPV)
8. Human T cell lymphotropio virus-1 (HTLV-1)
9. Human –imunodeficiency virus-1 (HIV)
- 16 -
10. Influense A
11. Influense B
12. Farain fluense
13. Hepatitis A
14. Hepatitis B
Các bệnh ung thư 15. Lymphoma
16. Leukemia
17. Melanoma
18. Osteosarcoma
19. Carcinomas colon
20. Prostate carcinoma
21. Kidney carcinoma
22. Bladder carcinoma
23. Breast carcinoma
Bên cạnh những thành tựu ngoạn mục, kỹ thuật di truyền có thể gây nên
nhiều mối lo. Cho đến nay, chưa thấy giới hạn trong các ứng dụng của nó
ngồi vấn đề đạo lý.
Tóm lại, restriction enzyme (RE) và plasmid có vai trò đặc biệt quan
trọng trong ứng dụng của sinh học phân tử, cụ thể là trong kỹ thuật tái tổ
hợp ADN.
RE là endonucleaza có khả năng thủy phân ADN mạch đôi một cách
lặp lại ở những vị trí xác định. Mỗi RE nhận biết được một trình tự
nucleotide đặc trưng và trình tự này có cấu trúc palindromic, do đó vị trí
cắt là giống nhau trên hai mạch.
RE dùng cắt nhỏ bộ gen khổng lồ cuả sinh vật, dùng trong phương
pháp tạo dòng để thu được dòng gen mong muốn có số lượng lớn, dùng

trong lập bản đồ giới hạn để so sánh bộ gen giữa các lồi thông qua kỹ
thuật RFLP.
Các plasmid với vai trò làm vector, là công cụ để chọn và tạo dòng
trong công nghệ tái tổ hợp ADN.
KẾT LUẬN
- 17 -
Công nghệ tái tổ hợp ADN ra đời đã dẫn tới những tiến bộ phi thường
trong thực tiễn y khoa và trong nông nghiệp. Công nghệ tái tổ hợp ADN
là sợi chỉ đỏ của công nghệ sinh học. Nhờ công nghệ tái tổ hợp ADN
người ta đã và đang tạo ra các loại cây trồng, vật nuôi biến đổi gen nhằm
cung cấp lương thực phẩm một cách dồi dào và đa dạng; tạo ra các loại
thuốc, các sinh phẩm quý giá đắt tiền để chữa bện; sản xuất ra các bộ kít
chẩn đốn sớm và chính xác các bệnh; tạo ra các vaccine phân tử tái tổ hợp
để phòng các bệnh virus và nhiễm khuẩn.
Công nghệ tái tổ hợp ADN cho phép các nhà sinh học lấy gen từ tế bào
này và ghép vào một tế bào khác. Khi được ghép vào một tế bào mới, gen
có thể biến đổi chức năng của tế bào đó, để có lợi cho con người, vật nuôi
và cây trồng.
Hiện nay công nghệ tái tổ hợp ADN đã mang nhiều hy vọng làm gia
tăng sản lượng nông nghiệp, mùa màng bội thu bằng cách chuyển gen cho
cây trồng và vật nuôi tạo ra giống mới cho năng suất cao, tạo lương thực
phẩm có phẩm chất tốt, tạo giống mới chống chịu với khí hậu khắc nghiệt,
khô hạn, lạnh hay chua mặn và tạo ra giống kháng được nhi62u và chống
được nhiều bệnh tật do vi sinh vật có hại gây ra.
Công nghệ tái tổ hợp ADN cũng đang đuợc nghiên cứu để phát triển
khoa học máy tính : bằng cách sử dụng trình tự ADN để thay thế cho con
bọ bán dẫn, nhằm vượt qua những hạn chế của máy tính điện tử hiện nay.
Công nghệ tái tổ hợp ADN đang giúp cho vấn đề nghiên cứu nguồn
gốc sự sống và đa dạng sinh học, giúp tìm hiểu cơ chế sống, trong đó có
điều hòa hoạt động, biệt hóa, tăng sinh tế bào dẫn đến ung thư ngày

càng sáng rõ hơn.


- 18 -
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đái Duy Ban và Lữ Thị Cẩm Vân, 1994: nghệ gen và Công nghệ sinh học
ứng dụng trong y dược học hiện đại, NXB Y học.
2. Đái Duy Ban, 2006: Công nghệ gen, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
3. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997: Sinh học phân tử, NXB Giáo dục.
4. Lê Đình Lương, 2001: Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB Khoa học và Kỹ
thuật.
5.Sinh học phân tử :
/>