Các phương pháp phân tích trong hóa sinh

Đề tài CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN
TÍCH TRONG HÓA SINH
Khoáng
Vitamin
Carbohy
drat
Enzyme
Protein
Lipid
A. Phân tích protein
•
Phương pháp Kjeldahl
•
Phương pháp Biuret
•
Phương pháp Lowry
•
Phương pháp Dumas
B. Phân tích Carbohydrat
-
Định lượng đường khử theo phương pháp vi lượng của
Rodzevich.
-
Định lượng đường saccarose theo phương pháp thủy
phân bằng acid.
-
Định lượng fructose trong dung dịch có lẫn đường khử
khác.
-
Định lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand

-
Định lượng đường khử bằng thuốc thử kaliferycianua
hay thuốc thử DNS.
-
Định lượng tinh bột theo phương pháp thủy phân bằng
acid.
I. Định lượng đường khử theo phương pháp vi
lượng của Rodzevich
1. Nguyên tắc:

Trong môi trường kiềm của đường khử có thể khử Cu+2 →
Cu+1 dưới dạng kết tủa màu đỏ (Cu2O) và qua lượng CuSO4
dư (không tham gia phản ứng) tính được lượng đường khử.
2. Hóa chất:
•.
Dung dịch Fehling I
•.
Dung dịch Fehling II
•.
Dung dịch KI 30%, dung dịch H2SO4 25% , dung dịch
Na2S2O3 0,1N.
B. Phân tích Carbohydrat
B. Phân tích Carbohydrat
CuSO4 + 4KI + H2SO4  I2 + CuI2 + 2K2SO4
I2 + 2Na2S2O3  Na2S4O6 +2NaI
B. Phân tích Carbohydrat

1ml dd đường + 2ml nước cất +
1ml dd Fehling I + 1ml dd Fehling II
Làm nguội

1ml H2SO425% và
1ml KI 30%,
Đun nóng 2’
Chuẩn độ I2 tạo thành bằng
Na2S2O30,1N.
II. Định lượng đường saccarose theo phương pháp thủy phân bằng acid
1. Nguyên tắc
C12H22O11 + H2O  C6H12O6 +
C6H12O6
(saccarose) (glucose) (fructose)
2. Hóa chất
•
Dung dịch HCl 5%
•
Dung dịch NaOH 5% hoặc dung dịch Na2CO3 bão hòa
•
Metyl đỏ 0,02%
B. Phân tích Carbohydrat
3. Cách tiến hành
B. Phân tích Carbohydrat
10ml dd + 5ml HCl 5%
Định phân kiềm đến khi dd
đỏ  vàng
Đun cách thủy 30 – 40’
Trung hòa bằng dd
Na2CO3 bão hòa
Metyl đỏ
( 3 giọt)
C. Phân tích Lipid
-

Lipid là dẫn xuất các acid béo cao phân tử và các alcohol. Lipid
thường gặp là dầu thực vật và mỡ động vật.
-
Các phương pháp phân tích:
+ Định lượng lipid tổng trong mẫu rắn bằng phương pháp Soxhlet.
+ Định lượng lipid tổng trong mẫu lỏng bằng phương pháp ADAM
ROSE – GOTTLIEB.
+ Phương pháp Chloroform- Methanol.
+ Phương pháp Babcook.
+ Phương pháp Lolch

C. Phân tích Lipid
I. Phương pháp Chloroform- Methanol
1. Nguyên tắc.

Sử dụng methanol, chloroform hòa tan chất béo trong mẫu
thực phẩm  Hỗn hợp tách thành hai lớp  Tách lấy lớp chất
béo đem đi sấy khô  cân định lượng.
2. Hóa chất.

Methanol - Chloroform

KCL 0.88 % - Na2SO4
C. Phân tích Lipid
3. Cách tiến hành.(không có protein bao bọc chất béo)
Trộn 1’
1g mẫu + 10ml
Methanol
20ml
Chloroform

Lắc 2’
Lọc hỗn hợp
30ml hh
Chloroform
-Methanol
Lọc
Hàm
lượng
béo
Tách lớp
Lọc
KCL
0.88
Nước
Na
2SO4
Tách nước
C. Phân tích Lipid
1. Nguyên tắc: sử dụng H2SO4 để kết tủa protein  hỗn hợp
tự tách làm hai lớp  đo thể tích lớp trên chứa chất béo  %
chất béo trong hỗn hợp.
II. Phương pháp Babcook.
2. Cách tiến hành
C. Phân tích Lipid
Mẫu
H2SO4
Nước
Ly tâm (lắc nhẹ
trong 5’)
lắc nhẹ trong 4’

Xử lý nhiệt 60-
63°C (5’)
Xác
định thể
tích béo
D. Phân tích Vitamin
Vitamin, hay sinh tố, là phân tử hữu cơ cần thiết ở lượng rất nhỏ
cho hoạt động chuyển hóa bình thường của cơ thể sinh vật.
D. Phân tích Vitamin

Xác định caroten bằng phương pháp sắc kí cột.
-
Chiết caroten ra khỏi mẫu thử bằng hỗn hợp ete dầu mỏ và
aceton. Loại bỏ aceton, tách caroten từ các carotenoid bằng
sắc ký cột và xác định hàm lượng caroten bằng đo quang
phổ.
E. Phân tích khoáng

Chất khoáng là những thành phần còn lại dưới dạng tro sau
khi đốt các mô thực vật và động vật. Khoáng là thành phần vi
lượng cần thiết cho cơ thể.
E. Phân tích khoáng

Các phương pháp phân tích
-
Chuẩn độ EDTA Complexometric  canxi và magie trong
nước.
-
Chuẩn độ kết tủa  bạc.
-

Phương pháp Mohr hoặc Volhard  nồng độ muối.
-
Phương pháp so màu  sắt
-
…
G. Phân tích enzyme
I. Xác định hoạt độ enzyme
1. Đơn vị
.
Đơn vị quốc tế UI: lượng enzyme có khả năng xúc tác
chuyển hóa 1 micromol cơ chất sau một phút ở đktc
1 UI = 1 micro mol cơ chất
.
Katal (Kat) là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm
chuyển hóa 1 mol chất sau một giây ở đktc
1 Kat = 1 mol cơ chất/ giây
G. Phân tích enzyme
Nhóm Các thông số có định Các thông số thay
đổi
1 - Thời gian
- Nồng độ enzyme
Biến thiên của S hay
P
2 - Lượng S mất đi (hay lượng P tạo
thành)
- Nồng độ [E]
Thời gian
3 - Thời gian
- Lượng S mất đi (hay lượng P tạo
thành)

Nồng độ E
2. Nguyên tắc

3 nguyên tắc xác định hoạt độ enzyme được tóm tắt ở bảng
sau:
G. Phân tích enzyme

Những lưu ý khi xác định hoạt độ enzyme
•
Nồng độ cơ chất
•
Chất hoạt hóa
•
pH
•
Nhiệt độ
•
Thời gian
G. Phân tích enzyme
3. Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme

Phương pháp đo độ nhớt

Phương pháp phân cực kế

Phương pháp đo áp suất hay áp kế

Phương pháp quang phổ kế

Phương pháp chuẩn độ


Phuong phap sắc ký

Phương pháp hóa học

Phương pháp phóng xạ

Phương pháp huỳnh quang
G. Phân tích enzyme
4. Phân tích enzyme peroxidase
4.2. Hóa chất
-
Dung dịch H2O2 1%.
-
Dung dịch pirogalol 1% pha
trước khi dùng.
-
H2SO4 đậm đặc ( d = 1.84 );
H2SO4 80%.
-
KMnO4 0.1 N.
-
Eter etylic.
-
Purpurogalin tinh khiết.
-
Dung dịch đệm
phosphate pH = 8 ÷ 9
4.1. Nguyên tắc
-

Dựa trên sự oxy hóa pirogalol thành purpurogalin khi có
H2O2.
G. Phân tích enzyme
4.3. Cách tiến hành.

Xử lý mẫu.
Cân 2 -3 gram nguyên liệu ( lá, rễ, hạt,…) Nghiền với 20ml
dung dịch đệm phosphate pH = 8 ÷ 9 + 4 giọt toluene hoặc
chloroform + bột thủy tinh Chuyển vào bình định mức
100ml định mức bằng dung dịch đệm lọc lấy nước.
G. Phân tích enzyme

Tiến hành
40 ml dd enzyme +
dd pirogalol 1% +
1ml H2O2 1%
điều nhiệt
( 250C, 15 – 20’)
erlen 250 ml
Lọc kết tủa
Đun nóng  50 -
600C
Rửa kết tủa
hòa tan kết tủa
bằng H2SO4 80%
1 – 2ml
H2SO4
đ
rửa phễu lọc
chuẩn độ bằng dung

dịch KMnO4