nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chẽm mõm nhọn psammoperca waigiensis (cuvier, 1828) trong nitơ lỏng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
*&*



NGUYỄN THỊ THANH THỦY

NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN TINH TRÙNG CÁ
CHẼM MÕM NHỌN Psammoperca waigiensis
(Cuvier, 1828) TRONG NITƠ LỎNG


LUẬN VĂN THẠC SĨ









Nha Trang, năm 2014



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
*&*


NGUYỄN THỊ THANH THỦY

NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN TINH TRÙNG CÁ
CHẼM MÕM NHỌN Psammoperca waigiensis
(Cuvier, 1828) TRONG NITƠ LỎNG

CHUYÊN NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
MÃ SỐ: 60 62 03 01

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. LÊ MINH HOÀNG









Nha Trang, năm 2014
i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan kết quả của luận văn “Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá

chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis (Cuvier, 1828) trong nitơ lỏng” thuộc đề
tài “Nghiên cứu mt s đặc tính và bảo quản tinh trùng cá chẽm mõm nhọn
Psammoperca waigiensis (Cuvier, 1828)” do Quỹ khoa học và công nghệ Quốc gia
(NAFOSTED) tài trợ - trường Đại Học Nha Trang chủ trì - TS. Lê Minh Hoàng chủ
nhiệm, được thực hiện từ tháng 12 năm 2011 đến tháng 12 năm 2013 là chính xác. Các số
liệu, kết quả trình bày trong luận văn hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong
bất cứ công trình khoa học nào khác tới thời điểm này.
Tác giả luận văn


Nguyễn Thị Thanh Thủy
ii

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các quý
phòng ban trường Đại học Nha Trang nói chung và Viện Nuôi trồng thuỷ sản nói riêng;
đặc biệt là sự hướng dẫn trực tiếp và tận tình của TS. Lê Minh Hoàng đã giúp tôi hoàn
thành tốt đề tài. Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến sự giúp đỡ này.
Tôi xin cảm ơn các cán bộ, công nhân tại lồng bè nuôi cá Vũng Ngán – Nha Trang –
Khánh Hòa đã giúp chúng tôi nuôi vỗ thành thục cá.
Tôi xin ơn Quỹ phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) hỗ trợ
kinh phí thuộc đề tài giúp tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến tất cả quý thầy, cô giáo trong Viện
Nuôi trồng thuỷ sản – Trường Đại học Nha Trang đã truyền đạt cho tôi những kiến thức
cơ bản nhất làm cơ sở và nền tảng cho tôi thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và tất cả bạn bè đã giúp đỡ và động
viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, ngày 25 tháng 6 năm 2014

Người thực hiện


Nguyễn Thị Thanh Thủy
iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CÁC BẢNG vi
DANH MỤC CÁC HÌNH vii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TNG QUAN 3
1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá chm mm nhọn 3
1.1.1 Hệ thống phân loại 3
1.1.2 Phân bố: 4
1.1.3 Đặc điểm hình thái: 4
1.1.4 Đặc điểm sinh trưởng 5
1.1.5 Đặc điểm sinh sản 5
1.1.5.1 Tui và kch thước thành thục 5
1.1.5.2 Hệ số thành thục 5
1.1.5.2 Mùa vụ sinh sản: 6
1.1.5.3 Sức sinh sản: 6
1.1.5.4 Sự thay đi giới tính 6
1.2 Đặc điểm tinh trùng cá 6
1.2.1 Quá trình tạo tinh 6
1.2.2 Cấu tạo tinh trùng 7

1.2.3 Đặc điểm sinh l học của tinh trùng 8
1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tinh trùng cá: 9
1.2.4.1 Yếu tố lý học 9
1.2.4.2 Các yếu tố hóa học 11
1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình bảo quản tinh trng cá trong nitơ lỏng 14
iv

1.2.5.1 Kỹ thuật chọn cá thu mẫu: 14
1.2.5.2 Thao tác thu tinh: 14
1.2.5.3 Tỷ lệ pha loãng: 15
1.2.5.4 Chất bảo quản: 15
1.2.5.5 Chất chống đông và nồng độ chất chống đông: 16
1.2.5.6 Thời gian cân bằng: 18
1.2.5.7 Tốc độ hạ nhiệt: 18
1.2.5.8 Phương pháp rã đông: 19
1.3 Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trng trong nitơ lỏng: 20
1.3.1 Trên thế giới: 20
1.3.2 Ở Việt Nam: 23
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1 Địa điểm nghiên cứu: 24
2.2 Thời gian nghiên cứu: 24
2.3 Đối tượng nghiên cứu: 24
2.4 Phương pháp nghiên cứu 24
2.4.1 Chọn cá đực và thu tinh 24
2.4.1.1 Chọn cá đực 24
2.4.1.2 Vuốt và thu tinh: 24
2.4.2 Một số đặc điểm của tinh dịch cá chm mõm nhọn đưa vào nghiên cứu: 24
2.4.2.1 Màu sắc tinh dịch 24
2.4.2.2 Dung lượng tinh dịch 25
2.4.2.3Mật độ tinh trùng 25

2.4.2.4 Hoạt lực của tinh trùng 25
2.4.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 26
2.5 Phương pháp xử lý số liệu 29
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30
3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng lên hoạt lực và vận tốc của tinh trùng cá chm mõm
nhọn bảo quản trong nitơ lỏng 30
v

3.2 Ảnh hưởng của chất bảo quản lên hoạt lực và vận tốc tinh trùng cá chm mõm nhọn
bảo quản trong nitơ lỏng 31
3.3 Ảnh hưởng của chất chống đông trong quá trình bảo quản tinh trùng cá chm mõm
nhọn trong nitơ lỏng 33
3.4 Ảnh hưởng của quy trình làm lạnh đến hoạt lực và vận tốc tinh trùng cá chm mõm
nhọn bảo quản trong nitơ lỏng 36
3.5 Tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở của tinh trng cá chm mm nhọn sau khi rã đông 38
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 41
4.1 Kết luận 41
4.2 Đề xuất ý kiến: 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các chất bảo quản dng cho bảo quản lạnh tinh trng một vài loài cá 16
Bảng 1.2 Các chất chống đông dng trong nghiên cứu bảo quản lạnh tinh trng 17
Bảng 1.3 Các loại chất chống đông dng cho bảo quản lạnh tinh trng một vài loài cá 18
Bảng 2.1 Một số đặc điểm l học của tinh dịch cá chm mm nhọn 26
Bảng 2.2 Thành phần 4 chất bảo quản trong 100ml nước cất 28

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình dạng ngoài của cá chm mm nhọn 4
Hình 1.2 Vng phân bố cá chm mm nhọn trên thế giới 5
Hình 1.3 Cấu tạo tinh trng cá 7
Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu bảo quản tinh trng cá chm mm nhọn trong nitơ lỏng 26
Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng đến hoạt lực và vận tốc tinh trng cá chm mm
nhọn bảo quản trong nitơ lỏng 30
Hình 3.2 Ảnh hưởng của chất bảo quản đến hoạt lực và vận tốc tinh trng cá chm mm
nhọn bảo quản trong nitơ lỏng 32
Hình 3.3 Ảnh hưởng của chất chống đông đến hoạt lực và vận tốc tinh trng cá chm
mm nhọn bảo quản trong nitơ lỏng 35
Hình 3.4 Ảnh hưởng của quy trình làm lạnh đến hoạt lực và vận tốc tinh trng cá chm
mm nhọn bảo quản trong nitơ lỏng 37
Hình 3.5 Tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở của tinh trng cá chm mm nhọn sau 1 tuần, 1 tháng
và 1 năm bảo quản trong nitơ lỏng 39

viii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CCSE
: Common carp sperm extender
ASP
: Artificial seminal plasma
RFS:
: Ringer solution for seawater fish species

RFW
: Ringer solution for freshwater fish species
M-Her
: Modified of Her
DMSO
: Dimethyl sulfoxide
µm/s
: Micromet/giây
µl
: Microlit
%
: Phần trăm
MPRS
: Marine Ringer Solution
ctv
: Cộng tác viên

1

MỞ ĐẦU
Cá chm mm nhọn Psammoperca waigiensis là loài phân bố ở vng biển nhiệt đới
và c giá trị kinh tế cao. Hiện nay, trên thế giới ni chung và Việt Nam ni riêng không
c nhiều nghiên cứu về loài này. Năm 2003, Nguyn Trọng Nho và ctv đã tiến hành
nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh sản và cho thử nghiệm sản xuất giống nhân tạo loài cá
này, tuy nhiên số lượng con giống vẫn còn hạn chế [7]. Để c thể sản xuất một lượng con
giống lớn nhằm cung cấp cho nuôi thương phm thì những nghiên cứu về sinh sản nhân
tạo và ương nuôi cá chm mm nhọn là rất cần thiết. Do đ, thành công của quá trình bảo
quản lạnh tinh trng cá chm mm nhọn s giúp c được nguồn tinh trng trong bất cứ
thời gian nào và giảm chi ph nuôi giữ cá đực.
Bảo quản tinh trng đng vai trò quan trọng trong các chương trình chọn giống và

bảo tồn nguồn gen của vật nuôi, góp phần cung cấp nguồn nguyên liệu cho công nghệ di
truyền phân tử áp dụng trong các chương trình chọn giống. Nhờ bảo quản tinh ta có thể
chủ động trong quá trình sản xuất giống nhân tạo, nhất là trong trường hợp có hiện tượng
lệch pha trong sự thành thục giữa giới đực và cái. Việc bảo quản tinh góp phần làm đơn
giản hóa quá trình vận chuyển cá bố từ nơi này đến nơi khác. Ngoài ra, phương pháp này
còn hạn chế tối đa việc lưu giữ cá đực bảo tồn dòng thuần ngăn cản suy giảm chất lượng
di truyền do lai cận huyết [98].
Những năm gần đây, cá chm mm nhọn là loài được nuôi rất ph biến, đặc biệt là
ở Việt Nam [94, 95, 107]. Tuy nhiên, vẫn chưa c các nghiên cứu về việc xác định các
điều kiện tối ưu cho quá trình bảo quản lạnh tinh trng. Mặc d trên thế giới đã c nhiều
nghiên cứu về lnh vực này trên nhiều đối tượng như: cá tuyết Đại Tây dương Gadus
morhua, cá tuyết chấm đen Melanogrammus aeglefinus [100], cá bơn Pseudopleronectes
americanus [101], cá rô biển Lateolabrax japonicus [43], cá chm châu Âu
Dicentrarchus labrax [50], cá mú đen Epinephelus malabaricus [56], …nhưng vẫn chưa
tiến hành nghiên cứu bảo quản tinh trng cá chm mm nhọn trong nitơ lỏng. Chnh vì
thế, nhằm gp phần cung cấp thông tin về các điều kiện tối ưu trong bảo quản lạnh tinh
trng cá chm mm nhọn cũng như chủ động trong sinh sản nhân tạo đối tượng này, đề
2

tài “Nghiên cứu bảo quản tinh trng c chẽm mm nhọn Psammoperca waigiensis
trong nitơ lỏng” được thực hiện.
Đề tài này được thực hiện với các nội dung chnh sau:
- Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng đến hoạt lực tinh trng cá chm mm nhọn bảo
quản trong nitơ lỏng.
- Ảnh hưởng của chất bảo quản đến hoạt lực tinh trng cá chm mm nhọn bảo
quản trong nitơ lỏng.
- Ảnh hưởng của chất chống đông khác nhau đến hoạt lực tinh trng cá chm mm
nhọn bảo quản trong nitơ lỏng.
- Ảnh hưởng của quy trình làm lạnh đến hoạt lực tinh trng cá chm mm nhọn bảo
quản trong nitơ lỏng.

Mục tiêu của đề tài này nhằm tìm ra được: (1) tỷ lệ pha loãng thch hợp nhất, (2)
chất bảo quản tốt nhất, (3) chất chống đông và (4) phương pháp làm lạnh tối ưu nhất cho
bảo quản tinh trng cá chm mm nhọn trong nitơ lỏng. Thành công của nghiên cứu này
s gp phần cung cấp thông tin về các điều kiện tối ưu cho bảo quản lạnh tinh trng cá
chm mm nhọn trong nitơ lỏng giúp cho việc sinh sản nhân tạo đạt hiệu quả hơn; gp
phần lưu giữ nguồn gen và bảo tồn giống thuần phục vụ sinh sản nhân tạo.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:
Ý nghĩa khoa học: Là tài liệu tham khảo, cơ sở bước đầu cho các nghiên cứu tương
tự sau này trên các đối tượng khác.
Ý nghĩa thực tiễn: Lưu giữ tinh trùng cá chm mõm nhọn trong thời gian dài, cung
cấp nguồn tinh trùng luôn có sẵn cho sinh sản nhân tạo.

Nha Trang, ngày 25 tháng 6 năm 2014
Học viên thực hiện


Nguyễn Thị Thanh Thủy

3

CHƯƠNG 1. TNG QUAN
1.1 Mt s đặc đim sinh học của c chẽm mm nhọn
1.1.1 H thng phân loi
Giới (Kingdom): Animalia
Ngành (Phylum): Chordata
Lớp (Class): Actinopterygii
Bộ (Order): Perciformes
Họ (Family): Centropomidae
Giống (Genus): Psammoperca
Loài (Species): Psammoperca waigiensis

Tên tiếng Anh
Tên tiếng Việt
Sand bass
Glass eyed perch
Sand perch
Waigieu sea perch
Cá chm mm nhọn
Cá vược mm nhọn
Cá thầy bi
Cá vược cát

Hnh 1.1 Hnh dng ngoi của c chẽm mm nhọn – Psammoperca waigiensis
Cuvier, 1828[123]

4

1.1.2 Phân b:
Trên th gii: Phân bố ở các vng biển ven bờ các nước nhiệt đới từ đông Ấn Độ
Dương đến tây Thái Bình Dương, giới hạn ở Bắc bán cầu là vng đảo Ryukyu [28].

Hnh 1.2 Vng phân b c chẽm mm nhọn trên thế gii (Ngun:www.aquamaps.org,
version of Aug. 2010. Web. Accessed 9 Mar. 2013).
*Màu đ: Vng phân b ca cá chm mm nhọn
 Vit Nam: Cá phân bố từ vịnh Bắc Bộ đến vịnh Thái Lan nhưng không nhiều.
Chúng thường sống ở vng đáy, ven biển, cửa sông và ở các thủy vực nước lợ. Thường
gặp ở các hang, hốc đá, thch nghi với đáy là các rạn san hô c nhiều thực vật lớn như
rong, cỏ biển [9].
1.1.3 Đc đim hnh thi:
Thân dài, dt bên, đầu nhỏ nhọn, bắp đuôi ngắn, nền bụng hơi tròn. Chiều dài thân
bằng 2,7-3,6 lần chiều cao. Mp sau xương nắp mang hình răng cưa, gc dưới c một gai

khỏe ko dài. Xương nắp mang c một gai dp rất khỏe ở gần gc trên. Miệng rộng, hàm
dưới hơi ngắn hơn hàm trên. Xương hàm trên ko dài đến dưới nền trước đồng tử, phần sau
phình rộng. Màng nắp mang liền với ức, c 7 tia nắp mang, lược mang dài và cứng [12].
Thân phủ vảy lược lớn, dày, phần lược yếu. Má và nắp mang c vảy, đnh đầu phủ
vảy đến giữa hai mắt. Hai vây lưng liền nhau, lm ở giữa. Vây lưng thứ hai và vây lưng
5

hậu môn đều c vảy. Vây đuôi tròn, lồi. Thân màu nâu xám, bụng trắng bạc. Chiều dài
lớn nhất 47 cm, thông thường 19-25 cm [12].
1.1.4 Đc đim sinh trưng
Cá chm mõm nhọn là loài cá dữ ăn thịt, có hình thái khá giống với cá chm châu Á
(Lates calcarifer), nhưng kch thước nhỏ hơn. Ngoài tự nhiên, cá hoạt động và bắt mồi
nhiều về đêm, thức ăn chủ yếu là cá và giáp xác nhỏ. Trong điều kiện nhân tạo, thức ăn
thay đi ty theo giai đoạn phát triển. Giai đoạn cá bột, thức ăn của chúng là các loại
động vật phù du và giáp xác nhỏ như luân trng, Nauplius của Artermia và Copepoda. Từ
giai đoạn cá giống trở đi, thức ăn được sử dụng là các loại cá tạp hoặc giáp xác nhỏ. Sự
sinh trưởng của cá Chm Mõm Nhọn tương đối chậm. Trong cùng thời gian và điều kiện
môi trường, con đựcthường c kch thước nhỏ hơn con cái. Ở tui 2
+
chiều dài trung bình
là 243 mm ở con cái và 223 mm ở con đực. Ở tui 4
+
chiều dài con cái là 269 mm và con
đực là 247 mm [107]. Ở vùng biển Khánh Hòa, cá chm mõm nhọn có tui thọ ph biến
trong khoảng 1- 6
+
, trong đ, nhm tui chiếm tỷ lệ cao từ 2
+
đến 4
+

. Tui thành thục lần
đầu của Cá Chm Mõm Nhọn là 2
+
với chiều dài và khối lượng trung bình là 256 mm và
233 gram. Thời gian phát triển phôi bình quân 16-18 giờ ở nhiệt độ nước 27-30
o
C [5].
Cá chm mm nhọn c t lệ con đực thấp khi tui càng cao, cá đạt 5
+
và 6
+
tui thì
không c con đực [7].Khác với kết quả nghiên cứu của Shimose, T.và ctv cho thấy tỷ lệ
cá đực càng cao khi tui cá càng lớn, trên 4
+
tui [107].
1.1.5 Đc đim sinh sn
1.1.5.1 Tui và kch thưc thành thc
Ở vng biển Khánh Hòa, cá thành thục lần đầu khi đạt 2+ tui, chiều dài toàn thân
trung bình đạt 256,2±6,9 mm [4]. Tui tham gia sinh sản lần đầu của cá đực và cá cái là
như nhau.
1.1.5.2 H s thành thc
Hệ số thành thục (GSI) của cá cái ở vng đảo Okinawa Nhật Bản dao động từ 0,07 -
12,56% và ở con đực là 0,03 - 5,81%. Hệ số này ở con cái tăng từ tháng 3 đến tháng 5,
sau đ giảm đến tháng 10, thấp nhất từ tháng 11 đến tháng 2. Với con đực, hệ số này tăng
từ tháng 3 đến tháng 4, giảm đến tháng 9, thấp nhất từ tháng 11 đến tháng 2 [107]. Tại
6

Khánh Hoà, hệ số thành thục của loài này như sau: con đực: 1- 4,28%; con cái từ 0,62
(giai đoạn II) đến 6,30% (giai đoạn IV) [4].

Hệ số thành thục GSI của cá Chm Lates calcarifer, một loài có quan hệ gần gũi với
cá Chm mõm nhọn, ở đầm Nha Phu, Khánh Hoà tương đối thấp: Giai đoạn I là 1,04 -
1,07 %; giai đoạn II 2,02 - 2,05%; giai đoạn IV 8,98 - 10,46%. Tuyến sinh dục ch phát
triển mạnh khi đến b ãi đẻ và phát triển nhanh trong thời gian ngắn [10].
1.1.5.2 Mùa v sinh sản:
Ở Việt Nam, những nghiên cứu ban đầu về cá chm mõm nhọn cho thấy loài này đẻ
nhiều lần trong năm, rải rác từ tháng 3 đến tháng 10 trong điều kiện tự nhiên [5].
1.1.5.3 Sức sinh sản:
Sức sinh sản tuyệt đối (AF) của cá dao động trong khoảng 140.000 – 327.600
trứng/cá cái, trung bình 234.616±71.598 trứng/cá cái. Sức sinh sản tương đối (RF) dao
động trong khoảng 636 – 819 trứng/cá cái, trung bình là 714±73,7 trứng/cá cái [4].
1.1.5.4 Sự thay đi gii tính
Đối với cá Chm mõm nhọn, hiện nay vẫn còn nhiều ý kiến đối lập nhau vềvấn đề
này. Theo Tamaki Shimose & Katsunori Tachihara (2006), trong quá trình nghiên cứu
đặc điểm sinh học sinh sản của loài này ở đảo Okinawa, Nhật Bản, không tìm thấy cá thể
lưỡng tính. Tác giả cho rằng không có hiện tượng chuyển đigiới tnh như ở cá chm
Lates calcarifer [107]. Đối lập với ý kiến trên, SyamsulAkbar, Tinggal Hermawan dan
Zakimin lại cho rằng, cá chm mõm nhọn là loài cálưỡng tính với yếu tố đực chn trước.
Con đực thành thục khi cơ thể đạt 75 - 100 gtham gia sinh sản và sau đ chuyển thành
con cái khi cơ thể đạt 150 g trở lên [16].
1.2 Đặc đim tinh trùng cá
1.2.1 Quá trình to tinh
Sự phát triển của tinh trng được chia làm ba giai đoạn chnh: giai đoạn tăng sinh
của tinh nguyên bào gốc, sự phân chia phân bào giảm nhim và sự biến đi của tinh tử
thành tinh trùng.
- Giai đoạn 1: Giai đoạn tăng sinh: Trước khi bắt đầu phát triển tuyến sinh dục, tinh
sào còn non chứa tinh nguyên bào gốc (spermatogonia) tăng sinh bằng cách phân chia
7

nguyên phân. Trong giai đoạn này, số lượng của các tế bào gốc trong tinh sào tăng lên

qua một số chu kỳ phân bào từ khoảng 5 đến 15 tùy thuộc vào loài. Trong quá trình phân
chia, tế bào con cần duy trì trực tiếp giữa các tế bào chất với nhau. Trong giai đoạn của
sự gia tăng phân bào, các spermatogonia đầu tiên thông qua một giai đoạn có tốc độ phân
chia chậm được gọi là spermatogonia A và sau đ thông qua một giai đoạn có tốc độ
phân chia nhanh hơn được gọi là spermatogonia B.
- Giai đoạn 2: Giai đoạn phân bào giảm nhim: Việc phân bào cuối cùng của
spermatogonia B tạo ra túi tinh bào (spermatocytes) chính tham gia vào quá trình phân
bào giảm nhim. Trong suốt giai đoạn 2, spermatocytes tiếp tục sự phân chia phân bào
giảm nhim lần đầu, trong đ bao gồm việc sao chép DNA và tái t hợp thông tin di
truyền, dẫn đến sự hình thành của spermatocytes thứ cấp. Chúng nhanh chng đi đến
phân bào giảm nhim thứ cấp nhưng không sao chp DNA, dẫn đến sự hình thành của
các tế bào mầm đơn bội gọi là tiền tinh trùng hay tinh tử (spermatids).
- Giai đoạn 3: Sự biến đi của tinh tử và tinh trùng. Tinh tử bắt đầu quá trình biến
đi trong đ các tế bào đơn bội spermatids biệt hóa thành tinh trùng roi. Quá trình này
làm tế giảm mạnh về kch thước (>80%) [35].
1.2.2 Cấu to tinh trùng

Hình 1.3 Cấu to tinh trùng cá [104]

8

Ở các lớp động vật khác nhau, tinh trùng của chúng khác nhau khá nhiều. Tuy nhiên
tất cả đều có nét chung về hình thái và có liên quan mật thiết đến chức năng chủ yếu là khả
năng sống và thụ tinh [1]. Cấu tạo tinh trùng gồm 3 phần: phần đầu, phần c và phần đuôi.
 Phần đầu: Đầu tinh trùng là phần có khả năng kch thch trứng và chuyển vật chất
di truyền vào trong trứng. Hình thái của đầu tinh trùng khác nhau tùy loài, có thể là hình
đa giác, hình xoắn (ở cá sụn) hay hình ovan, ở cá xương đầu tinh trùng có cấu tạo đơn
giản gần như hình tròn [1].
Đầu tinh trng thường rất to so với các phần c và đuôi. Trên cng của đầu, nằm
ngang dưới màng là thể đnh. Thể đnh c hình như chiếc mũ trm xuống pha dưới,

trong đ chứa enzyme Hialuronidaza có tác dụng hòa tan màng tế bào trứng mở đường
cho tinh trùng xâm nhập vào khi thụ tinh. Thể đnh do bộ máy Golgi tạo thành. Nhân tinh
trùng nằm dưới thể đnh, rất to và đông đặc, chứa nguyên liệu di truyền của giao tử đực.
Bao quanh nhân và thể đnh là một lớp tế bào chất mỏng [3].
 Phần c: Phần c tương đối ngắn, cách đầu bằng một màng mỏng. Trong c chứa
trung tử đầu và trung tử đuôi nằm vuông góc với nhau. Từ trung tử đuôi phát ra các sợi
trục của tinh trùng. Trung tử đầu đng vai trò quan trọng trong quá trình phân chia trứng
đã được thụ tinh [1].
 Phần đuôi: Đuôi tinh trng cá là cơ quan vận động dài và mảnh tùy theo loài. Phần
đầu của đuôi tinh trng là vòng xoắn ty thể. Ty thể là bào quan mang các enzyme oxy hóa và
enzyme oxyphosphorine hóa, do vậy n c liên quan đến quá trình hoạt động chuyển hóa
năng lượng của tinh trùng. Phần cuối của đuôi gồm 10 đôi sợi trục: 1 đôi phân bố ở giữa và 9
đôi ở ngoại vi. Đuôi đảm bảo cho tinh trùng hoạt động. Vì để gặp được trứng, tinh trùng phải
chuyển động một khoảng cách nhất định. Sự di chuyển được thực hiện bằng cách chuyển
động co duỗi lượn sóng và chuyển động đập của đuôi [1].
1.2.3 Đc đim sinh l học của tinh trùng
- Kch thước và số lượng: Kch thước của tinh trng thường rất bé so với tế bào trứng
trong cùng 1 loài. Ví dụ: cá rô 20 µm, người từ 50-70 µm, hầu 75 µm, tôm he 10 µm [3], ngược
lại, số lượng tinh trùng của chúng lại rất lớn. Ví dụ: 1ml tinh dịch cá trắm cỏ có 31,1±1,7 triệu
tinh trùng; cá mè trắng có 31,6±2,8 triệu tinh trùng; cá trắm đen c 16,2±0,9 triệu tinh trùng [3].
9

- Đặc điểm vận động: Khi còn ở trong tuyến sinh dục, tinh trùng không vận động
nhưng khi rơi vào nước nó vận động mạnh. Ở cá nước ngọt, tinh trng lao đầu về pha trước
sau 1-2 phút chuyển động chậm dần và sau đ chuyển sang chuyển động dao động. Khoảng
2-3 phút lượng tinh trùng chuyển động còn rất ít và cuối cùng toàn bộ ngừng hoạt động [1].
Hoạt lực của tinh trùng phụ thuộc vào đặc điểm của loài, mức độ thành thục của nó
và điều kiện môi trường mà n đang sống. Sự chuyển động và thời gian vận động của
tinh trùng có thể giúp đánh giá được chất lượng tinh trùng. Persov [93] đã đề nghị một
bảng để đánh giá mức độ (5 mức) chuyển động của tinh trùng sau khi cho vào dung dịch

kích hoạt. Cụ thể là: Mức 5: Tất cả tinh trng đều chuyển động tiến thẳng, mức 4: Đa số
tinh trùng chuyển động tiến trong hiển vi thường thấy ch có một số ít tinh trùng dao
động, mức 3: Số tinh trùng chuyển động t hơn số tinh trng dao động, đã c một số tinh
trùng bất hoạt, mức 2: Rất ít tinh trùng chuyển động tiến, một số ít chuyển động dao
động, ¾ số tinh không chuyển động, mức 1: Tất cả tinh trùng không chuyển động.
Năng lượng cung cấp cho sự vận động của tinh trùng chủ yếu dựa vào sự phân giải
glucid, năng lượng dự trữ của tinh trùng. Sự vận động là tiêu chun quan trọng nhất để
xác định sức sống của tinh trng cá. Cá đực thành thục tốt thì tinh trùng khỏe mạnh và
tui thọ ko dài hơn so với cá đực chưa thành thục.
1.2.4 Các yếu t nh hưng đến tinh trùng cá:
1.2.4.1 Yu t lý học
Tinh dịch là sản phm tiết của tinh sào và ống dẫn tinh trùng, sự xáo trộn thành phần
của nó s dẫn đến thay đi chất lượng tinh trùng [32, 35]. Vai trò chính của các thành phần
trong tinh dịch là tạo ra môi trường tối ưu cho hoạt lực tinh trùng [105]. Các thông số lý
học của tinh dịch được xác định bao gồm: Mật độ tinh trng, độ quánh, pH, áp suất thm
thấu, tng hàm lượng protein [49, 53].
Mật độ tinh trùng là một yếu tố đánh giá chất lượng tinh trùng cá, tuy nhiên mật độ
tinh trùng có sự khác nhau giữa các con đực trong cùng loài, giữa mùa sinh sản, giữa các
ma trong năm và giữa các loài khác nhau [67, 96]. Ví dụ, cá Carassius auratus có sự
thay đi mật độ tinh trùng theo bốn ma trong năm. Mật độ tinh trng (tb/ml/con đực)
vào ma hè (57,30±10,41tb/ml) và ma đông (65,09±80,40 tb/ml) cao hơn ma xuân 9
10

(48,0±7,08 tb/ml) và mùa thu ( 40,42±16,54×109 tb/ml) [126]. Độ quánh (spermatocrit)
tinh dịch là một trong yếu tố ảnh hưởng tới mật độ tinh trng loài cá đ. Nhiều nghiên
cứu ch ra rằng có một sự tương quan giữa mật độ tinh trng và độ quánh tinh dịch cá
như trên cá hồi Salmonids, cá chép Cyprinids và cá bơn Đại Tây Dương Hippoglossus
hippoglossus [60, 89]. Độ quánh của tinh dịch loài được xem như thước đo cho mật độ
tinh trng loài cá đ [59]. Độ quánh cũng thay đi ty loài, đặc biệt độ quánh liên quan
đến chất lượng nguồn cá đực. Độ quánh cao chứng tỏ tinh dịch con cá đ cho mật độ cao

hơn với những con cá khi vuốt tinh s loãng hơn [60]. Theo Ciereszko (1996) cho rằng
mối liên hệ giữa đặc tính sinh lý của tinh trùng là do sự tác động qua lại giữa hàm lượng
protein trong tinh dịch và mật độ tinh trng nhưng vai trò đặc biệt của protein trong tinh
dịch vẫn chưa được hiểu rõ [73].
Đối với cá nước mặn, áp suất thm thấu của tế bào chất tinh trùng gần bằng với
dung dịch nước muối NaCl 0,75%, tức là thấp hơn so với áp suất thm thấu của nước
biển. Khi vào nước mặn, tinh trùng cá biển có khả năng điều hòa áp suất thm thấu để
đảm bảo cho tế bào chất không bị mất nước, nhanh chóng thích nghi với môi trường, duy
trì hoạt động và khả năng thụ tinh của tinh trng trong điều kiện môi trường có áp suất
thm thấu cao hơn. Để thực hiện được quá trình điều chnh nói trên tinh trùng phải tiêu
hao một phần năng lượng dự trữ dẫn đến làm giảm tui thọ của tinh trùng. Tinh trùng cá
biển không có khả năng điều hòa áp suất thm thấu khi chúng ở trong môi trường có áp
suất thm thấu thấp hơn so với áp suất thm thấu của tế bào chất. Tức không có khả năng
chống lại sự xâm nhập của nước vào tế bào chất. Do đ, khi tinh trùng cá biển vào nước
ngọt thì tế bào chất của chúng hút nước, phần đuôi co lại biến thành hình tròn tựa viên bi,
những tinh trùng dạng này tuy vẫn sống song không thể vận động được và không có khả
năng thụ tinh. Như tinh trng cá đối khi vào nước ngọt bị biến dạng như trên mà vẫn có
thể sống được khoảng 30 phút. Nếu đưa chúng trở lại vào nước biển bình thường thì nước
từ trong tinh trùng lại có thể thấm ra ngoài, đuôi ko dài ra như cũ, tinh trng lại dần dần
khôi phục sự vận động có hiệu quả [6, 14].
Đối với hầu hết các loài cá pH tinh dịch là một trong những yếu tố chính kích hoạt
tinh trùng vận động như nghiên cứu trên nhóm cá hồi pH tinh dịch thường 7,5 đến 8,5 và
11

đ cũng là pH tốt nhất cho hoạt lực tinh trùng loài cá này [18]. pH bên trong tế bào của
tinh trùng thấp hơn khoảng 1 đơn vị so với pH bên ngoài môi trường [18].
1.2.4.2 Các yu t hóa học
Thành phần dịch tương tinh trng cá đã được nghiên cứu từ nhiều thập kỷ qua và
các tác giả đều đưa ra kết quả năm ion chiếm ưu thế trong tinh dịch: natri (Na
+

), kali
(K
+
), clorua (Cl
-
), canxi (Ca
2+
) và magiê (Mg
2+
). Trong đ ion Na
+
, Cl
-
chiếm chủ yếu sau
đ là K
+
, 2 ion thứ yếu là Ca
2+
và Mg
2+
[20, 23, 47]. Việc xác định nồng độ của chúng s
thay đi từ loài này sang loài khác, nhưng c một khoảng thích hợp cho mỗi ion để cung
cấp những điều kiện tốt nhất cho tinh trùng [15, 31].
Tùy thuộc vào nồng độ của các ion, hầu hết chúng đều tham gia vào việc kích hoạt
tinh trùng cá hoạt động bằng cách góp phần vào ion nội bào hoặc bằng cách tăng giảm
nồng độ để điều hòa áp suất thm thấu [74, 91]. Sự tương quan giữa các thành phần, nồng
độ các cation và hoạt lực tinh trng đã được nghiên cứu trên nhiều loài khác nhau.
Lahnsteiner và ctv cho rằng có sự tương quan giữa khả năng di chuyển của tinh trùng và
thành phần dịch tương trong tinh dịch cá Alburnus alburnus và gợi ý rằng mối tương
quan này có thể cho biết các thành phần ảnh hưởng tới khả năng di chuyển của tinh trùng.

Các tác giả kết luận rằng hàm lượng ion Na
+
và K
+
có mối quan hệ tích cực đôi khi là tiêu
cực tương ứng với tỷ lệ phần trăm (%) tinh trng vận động [52, 74]. Trong khi đ Hwang
và Idler đã công nhận sự tương quan giữa t lệ Na
+
/K
+
với khả năng sinh sản tinh trùng
trong cá hồi Đại Tây Dương (Salmo salar) mà không đưa ra một kết luận nào về sự liên
quan đến vận động của tinh trùng cá [60]. Tuy nhiên, đa số các nghiên cứu của nhiều tác
giả trên những đối tượng khác nhau về cả cá biển, cá nước ngọt hay các loài cá di cư
nhận xét, không ch có nồng độ các ion nêu trên ảnh hưởng tới sự vận động của tinh trùng
cá mà t lệ giữa các ion cũng c tác động lớn đến hoạt lực tinh trùng cả về mặt tích cực
(tức là làm tăng hoạt lực tinh trùng) lẫn tiêu cực (tức là làm giảm, đôi khi kìm hãm hoạt
lực tinh trùng) [29, 111].
* Ion Kali:
Theo Alavi và Cosson, Ca
2+
và K
+
là 2 ion có nồng độ cao hiện diện trong dịch
tương của cá [97]. Chúng được coi là chìa kha để kích hoạt sự vận động của tinh trùng ở
12

các đối tượng cá biển, nhóm cá hồi Salmonids, cá tầm Acipenseridae. Ở nhóm cá hồi,
nồng độ K
+

trong dịch tương cao (từ 20 đến 60 mM), sự có mặt với nồng độ khá cao có
thể liên quan đến sự bất động của tinh trùng trong tinh dịch [55, 86]. Sự vận động của
tinh trng được kích hoạt do sự suy giảm nồng độ K
+
ngoại bào. Tuy nhiên, không ch có
ion K
+
liên quan đến sự kích hoạt khả năng vận động của tinh trùng mà còn có sự tác
động của đến khả năng này [87]. Một số nghiên cứu ch ra rằng các ion hóa trị 2 như Ca
2+

và Mg
2+
trong môi trường thụ tinh có tác dụng là ion đối kháng hay ức chế ion K
+
[21].
Các yếu tố ức chế nồng độ K
+
có thể phụ thuộc vào sự nhạy cảm của tinh trùng với ion
này thay đi giữa con đực và mùa sinh sản [112].
Cơ chế điều chnh vận động của tinh trùng cá tầm và cá thìa Polyodon spathula cho
đến nay vẫn chưa được nghiên cứu sâu nhưng cũng đã được trình bày khá tương đồng với
tinh trùng nhóm cá hồi Salmonids [79]. Nồng độ ion K
+
trong dịch tương cá tầm
Acipenser persicus là 6,92±0,88 mmol/l, với nồng độ này K
+
là chất ức chế chủ yếu khả
năng vận động của tinh trùng cá tầm [22]. Tinh trùng cá chép ít nhạy cảm với ion K
+

nhưng khả năng vận động của chúng được phục hồi sau khi cho chúng tiếp xúc với môi
trường có ion K
+
với nồng độ cao khi tinh trng đang ở trạng thái bất động [127]. Do đ,
K
+
là ion quan trọng kiểm soát khả năng vận động của tinh trùng cá [116].
* Ion Canxi:
Canxi ngoại bào được xem là điều kiện tiên quyết bắt đầu sự vận động của tinh trùng
ở một số loài cá [68]. Các dòng Ca
2+
từ bên ngoài đi vào tế bào chất của tinh trùng có tác
dụng gây kích thích vận động của tinh trùng và tham gia vào sự kích hoạt của một số
enzym hoặc các protein [116]. Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây đã ch ra ảnh hưởng có
thể có hoặc sự đng gp vào kho canxi nội bào trong ty thể cũng kch thch tinh trng hoat
động. Krasznai lại cho rằng trong tinh trùng cá chép các dòng canxi ngoại bào tạo ra sự giải
phóng các Ca
2+
từ lưu trữ, nhưng trong trường hợp này không có các dòng của canxi từ bên
ngoài vào, sự phóng thích canxi từ lưu trữ gây ra bởi các cơ chế khác mà không phải là
kích hoạt vận động của tinh trùng, cho thấy rằng đường đi của Ca
2+
bên ngoài cũng là một
yếu tố cần thiết cho quá trình kích hoạt tinh trùng vận động khi chúng được phóng ra môi
trường ngoài [17]. Kết quả tương tự được ghi nhận bởi Alavi và Cosson trên tinh trùng cá
13

hồi thay đi nồng độ bên trong tế bào của ion Ca
2+

từ 30 nM đến 180 nM trước và sau khi
vận động [35].
Ở những loài có thể kích hoạt sự vận động trong môi trường ưu trương không chứa
ion, có thể tăng nồng độ ion Ca
2+
nội bào để kích hoạt tinh trùng vận động hoặc để tạo ra
các đợt kích hoạt bằng cách giải phóng từ các kho dự trữ bên trong cùng với lượng Ca
2+

có trong tinh dịch.
Đối với những loài có thể kích hoạt sự vận động ở môi trường ưu trương không
chứa ion, có thể tăng canxi bên trong tế bào là cần thiết để kích hoạt tinh trùng hoạt động
hoặc để tạo ra các đợt kích hoạt bằng cách giải phóng từ các kho dự trữ bên trong cùng
với lượng canxi có trong tinh dịch. Như vậy có thể thấy rằng nồng độ canxi trong tế bào
đã được cho là thành phần quan trọng trong kích hoạt khả năng vận động của tinh trùng.
Một nghiên cứu khác cũng về nội dung này trên cá tầm Acipenser ruthenus hoạt lực tinh
trng đã hoàn toàn bị ức chế tại 0,35 mM Ca
2+
và tác giả cũng cho biết thêm chính ion K
+

đã gây nên tác dụng ức chế đối với ion Ca
2+
[19, 116].
* Ion Natri:
Na
+
có một vai trò thứ yếu trong việc kích hoạt và duy trì vận động của tinh trùng cá.
Thực tế không có nhiều nghiên cứu được tìm thấy để chứng minh về vai trò kích hoạt vận
động tinh trùng cá của ion này và ch gần đây vai trò của Na

+
mới được biết đến qua một
nghiên cứu trên tinh trùng cá trích Sardinella aurit, Vines và đồng nghiệp phát hiện sự trao
đi qua lại hàm lượng Na
+
/Ca
2+
trong tinh trùng của loài này và công nhận rằng bắt đầu
vận động xảy ra bằng cách đảo ngược sự trao đi Na
+
/Ca
2+
[28]. Cơ chế này cho phép tinh
trng thay đi về pha trước để đảo ngược kênh điều hành dưới sự kiểm soát nồng độ ion
bên trong và bên ngoài tế bào. Thời gian vận động của loài này có thể dài hơn 60 phút, c
vẻ như r ràng rằng các tế bào có thể điều chnh tăng canxi bên trong bằng cách hoạt động
trong một chế độ đảo ngược. Điều này s cho phép khả năng vận động trong thời gian dài
cũng như duy trì tinh trng tiếp xúc với nước biển trong một trạng thái t tiêu hao năng
lượng trước khi tiếp xúc với trứng cho đến khi quá trình thụ tinh xảy ra [116].


14

* Ion Magie:
Đây cũng là một ion thứ yếu trong dịch tương tinh trng cá mà c liên quan đến
kích hoạt vận động của tinh trùng. Theo các nghiên cứu trên cá nước ngọt, ion Mg
2+
ức
chế sự hoạt động của ion K
+

, song trên cá biển vẫn chưa c chứng minh nào cho điều đ.
Sự ức chế khả năng vận động của tinh trùng trong tinh dịch chủ yếu là do ion K
+
trong cá
hồi và áp suất thm thấu trong cá chp nhưng Mg
2+
cũng c phần ảnh hưởng tới tính bất
hoạt của tinh trùng [34].
1.2.5 Cc yếu t nh hưng đến qu trnh bo qun tinh trng c trong nitơ lng
Ngoài các yếu tố trên thì quá trình bảo quản lạnh tinh trng cũng gp phần vào làm
giảm chất lượng tinh trùng sau khi bảo quản [42, 110].
1.2.5.1 Kỹ thuật chọn cá thu mu:
Đây là khâu đầu tiên rất quan trọng vì chất lượng tinh trùng của cá đực có tốt hay
không phụ thuộc vào mức độ thành thục và điều kiện sống của cá đực. Khả năng vận
động của tinh trng chưa thành thục hay quá thành thục đều rất kém so với tinh trng
thành thục vừa. Ngoài ra, việc sử dụng kích dục tố cũng ảnh hưởng đến chất lượng tinh
trùng.
1.2.5.2 Thao tác thu tinh:
Trước khi thutinh, dụng cụ cần được khử trng và để nơi thoáng mát và kiểm tra lại
cá đực. Trước khi thu mẫu phải lau khô phần dọc theo bụng cá. Khi thu mẫu phải hết sức
cn thận và nh nhàng, tránh không để phân cá, máu hay nước tiểulẫn vào tinh dịch, nếu
không tinh trùng d bị kích hoạt dẫn đến thời gian cất giữ ngắn hay không đạt kết quả
mong muồn. Nên lấy tinh dịch vào bui sáng sớm hoặc chiều mát để tinh dịch không bị
biến đi, không nên lấy tinh dưới ánh sáng mặt trời để tránh tinh trùng bị sát thương.
Những ống đựng tinh dịch (eppendorfs tube) nên được để trên khay đá khô, không
nên nắm trong tay bởi nhiệt độ cơ thể cao làm giảm tui thọ tinh trng. Tinh thu xong được
lưu giữ trên đá lạnh và vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm để kiểm tra và xử lý mẫu.
15

1.2.5.3 T l pha long:

Theo Stein và Bayrle [108] tỷ lệ thích hợp cho cá chép là 1:3; Legendre và Billard
[76] tỷ lệ pha loãng thích hợp cho tinh dịch cá hồi là 1:3; Harvey [61] tỷ lệ pha loãng
thích hợp cho tinh dịch cá rô phi là 1:5.
Việc lựa chọn được tỷ lệ pha loãng thích hợp s nâng cao sức sống của tinh trùng khi
rã đông, vì vậy nghiên cứu để đưa ra các tỷ lệ thích hợp cho từng loài là cần thiết [92].
1.2.5.4 Chất bảo quản:
Chất bảo quản là một dung dịch muối, có tác dụng làm tăng dung tch và duy trì
trạng thái vô hoạt cũng như thời gian sống tiềm sinh của tinh trng. Việc nghiên cứu tìm
ra chất bảo quản thch hợp không những có thể đạt được mục đch pha loãng tăng dung
tích của tinh dịch mà còn có thể nâng cao t lệ thụ tinh của tinh dịch, kéo dài thời gian
sống cũng như tiết kiệm được nhiều tinh dịch. Lựa chọn chất bảo quản cần chú  các điều
kiện sau:
- Có chất dinh dưỡng cần cho việc trao đi chất của tinh trùng.
- Tránh được sự kích thích của nhiệt độ.
- Áp lực thm thấu phải bằng áp suất thm thấu của tinh dich hoặc nguyên sinh chất
trong tinh trùng.
- Có pH thích hợp với pH tinh dịch.
- Giúp tinh trùng sống nhưng không vận động.
Chất bảo quản khác nhau theo loài, và quan trọng nhất là phải giữ được tinh trùng ở
trạng thái bất động. Chất bảo quản có thể được pha chế trước và giữ trong tủ lạnh trước
khi sử dụng. Tỷ lệ pha loãng tối ưu cần được xác định theo từng loài [118].
Công thức của chất bảo quản không nhất thiết phải phức tạp. Một vài dung dịch đơn
giản như dung dịch chứa NaCl, NaHCO3 và Leceithin [84] cũng cho hiệu quả tốt. Ở một
số loài cá biển như cá trích Clupea harengus và cá đối Mugil cephalus [30]; các tác giả
đã sử dụng thành công nước biển pha loãng cho thêm chất chống đông. Những nghiên
cứu gần đây trên cá rô phi cho thấy sử dụng nước pha thêm 5% Methanol và 15% sữa bột
để pha loãng s cũng c kết quả [84].