Khảo sát sự tạo huyền phù tế bào bắp cải tím (Brassica oleracea var. capitata f. rubra)

i
LỜI CẢM ƠN

Luận văn tốt nghiệp là một bước tiến quan trọng đánh dấu sự trưởng thành
của bản thân.
Lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn Bộ môn Công nghệ Sinh học -
Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lơi cho
tôi tiến hành luận văn.
Tiếp đến tôi xin gửi lời tri ân đến tất cả quý Thầy, Cô trong bộ môn, đặc biệt
là Tiến sĩ Lê Thị Thủy Tiên đã luôn tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành
tốt luận văn này.
Và cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các bạn sinh viên, các anh chị
Cao học phòng thí nghiệm 102B2; xin cảm ơn gia đình tôi đã luôn bên tôi, luôn ủng
hộ và chia sẻ những khó khăn với tôi trong suốt thời gian vừa qua.

Sinh viên
Trương Thúy Vi







ii
TÓM TẮT LUẬN VĂN

― Khảo sát sự tạo huyền phù tế bào bắp cải tím (Brassica oleracea var.
capitata f. rubra)‖
Đề tài được tiến hành nhằm khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự hình

thành, tăng trưởng của mô sẹo, và sự hình thành, tăng trưởng của huyền phù tế bào
bắp cải tím.
Kết quả thực nghiệm cho thấy 2,4-D nồng độ 1 mg/l và kinetin nồng độ 1
mg/l thích hợp cho sự tạo sẹo, tăng trưởng sẹo và sự tăng trưởng huyền phù tế bào.
Mô sẹo 3 tuần tuổi, tỉ lệ giữa khối lượng mô sẹo và thể tích môi trường: 0.5 g / 15
ml, sucrose nồng độ 30 g/l và dịch chiết tảo Spirulina nồng độ 75 mg/l thích hợp
cho sự tạo và tăng trưởng của huyền phù tế bào.











iii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
TÓM TẮT LUẬN VĂN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC BẢNG vi
DANH MỤC HÌNH vii
DANH MỤC ẢNH viii
LỜI MỞ ĐẦU ix
Chương 1: Tổng quan tài liệu 10
1.1. Bắp cải tím Brassica oleracea var. capitata f. rubra 11
1.1.1. Nguồn gốc 11

1.1.2. Hình thái 11
1.1.3. Sinh trưởng 12
1.1.4. Thành phần dinh dưỡng bắp cải tím 13
1.1.5. Công dụng của bắp cải tím 13
1.1.6. Một số nghiên cứu về anthocyanin trong bắp cải tím 14
1.2. Anthocyanin 15
1.2.1. Giới thiệu 15
1.2.2. Cấu trúc hóa học 16
1.2.3. Sự sinh tổng hợp anthocyanin trong tế bào 17
1.2.4. Vai trò đối với thực vật 18
1.2.5. Vai trò đối với con người 19
1.2.6. Một số nghiên cứu về huyền phù tế bào trong mục đích thu nhận
anthocyanin 20
Chương 2: Vật liệu – Phương pháp 23
2.1. Sơ đồ nghiên cứu chung 24
2.2. Vật liệu 25
2.3. Phương pháp 25
2.3.1. Tạo cây mầm in vitro 25
2.3.2. Khảo sát sự tạo mô sẹo bắp cải tím 26

iv
2.3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và kinetin lên sự hình thành
và tăng trưởng của mô sẹo 26
2.3.3. Khảo sát sự tạo huyền phù tế bào bắp cải tím 26
2.3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của độ tuổi mô sẹo lên sự tạo
huyền phù tế bào 26
2.3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy
lên sự tạo huyền phù tế bào 27
2.3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sucrose lên sự tăng trưởng
của huyền phù tế bào 27

2.3.3.4. Khảo sát đường cong tăng trưởng của huyền phù tế bào 28
2.3.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và kinetin lên sự tăng trưởng
của huyền phù tế bào 28
2.3.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết tảo Spirulina lên
sự tăng trưởng của huyền phù tế bào 29
2.3.3.7. Phương pháp xác định thể tích tế bào lắng 30
Chương 3: Kết quả - Bàn luận 31
3.1. Tạo cây mầm in vitro 32
3.2. Khảo sát sự tạo mô sẹo bắp cải tím 32
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và kinetin lên sự hình thành và
tăng trưởng của mô sẹo từ lá mầm cây mầm bắp cải tím 32
3.3. Khảo sát sự tạo huyền phù tế bào 37
3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của độ tuổi mô sẹo lên sự tạo huyền phù tế bào 37
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của thể tích môi trường lỏng lên sự tạo
huyền phù tế bào 41
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sucrose lên sự tăng trưởng
của huyền phù tế bào 42
3.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và kinetin lên sự tăng trưởng
của huyền phù tế bào 44
3.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết tảo Spirulina lên sự tăng
trưởng của huyền phù tế bào 46
Chương 4: Kết luận - Đề nghị 48

v
4.1. Kết luận 49
4.2. Đề nghị 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO 50
PHỤ LỤC 54

vi
DANH MỤC BẢNG


Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng trong 100 g bắp cải tím
Bảng 1.2: Các anthocyanidin thường gặp ở thực vật bậc cao
Bảng 3.1: Tỉ lệ tạo sẹo từ lá mầm bắp cải tím trên môi trường bổ sung 2,4-D
nồng độ thay đổi sau 3 tuần nuôi cấy
Bảng 3.2: Sự tăng trưởng của mô sẹo ở môi trường bổ sung 2,4-D nồng độ thay
đổi sau 3 tuần nuôi cấy
Bảng 3.3: Sự tăng trưởng của mô sẹo ở môi trường bổ sung kinetin nồng độ thay
đổi sau 3 tuần nuôi cấy
Bảng 3.4: Sự tăng trưởng của huyền phù tế bào ở môi trường bổ sung 2,4-D nồng
độ thay đổi sau 3 tuần nuôi cấy
Bảng 3.5: Sự tăng trưởng của huyền phù tế bào ở môi trường bổ sung kinetin

nồng độ thay đổi sau 3 tuần nuôi cấy
Bảng 3.6: Sự tăng trưởng của huyền phù tế bào ở môi trường bổ sung dịch chiết
tảo Spirulina sau 3 tuần nuôi cấy














vii
DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Flavylium cation
Hình 1.2: Sự acyl hóa anthocyanin: peonidin 3-6-p-coumarylglucoside
Hình 1.3: Sự tạo thành malonyl-CoA từ acetate
Hình 1.4: Sinh tổng hợp anthocyanin trong tế bào
Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu chung
Hình 2.2: Quy trình tạo cây mầm
Hình 2.3: Phương pháp thu dịch chiết tảo Spirulina
Hình 2.4: Bình đo thể tích tế bào lắng
Hình 3.1: Đường cong tăng trưởng của huyền phù tế bào ở các nồng độ sucrose
khác nhau

viii
DANH MỤC ẢNH


Ảnh 1.1 : Bắp cải tím
Ảnh 1.2 : Cây mầm (a) và hoa bắp cải tím (b, c)
Ảnh 3.1: Cây mầm in vitro bắp cải tím 7 ngày tuổi
Ảnh 3.2: Mô sẹo trên môi trường bổ sung 2,4-D 1 mg/l và kinetin 1 mg/l sau 3
tuần nuôi cấy
Ảnh 3.3: Mô sẹo trên môi trường bổ sung 2,4-D 2 mg/l và kinetin 1mg/l sau 3
tuần nuôi cấy
Ảnh 3.4: Mô sẹo trên môi trường bổ sung 2,4-D 3 mg/l và kinetin 1 mg/l sau 3
tuần nuôi cấy
Ảnh 3.5: Mô sẹo trên môi trường bổ sung 2,4-D 1 mg/l và kinetin 0.5 mg/l sau 3
tuần nuôi cấy

Ảnh 3.6: Mô sẹo trên môi trường bổ sung 2,4-D 1 mg/l và kinetin 1 mg/l sau 3
tuần nuôi cấy
Ảnh 3.7: Mô sẹo trên môi trường bổ sung 2,4-D 1 mg/l và kinetin 1.5 mg/l sau 3
tuần nuôi cấy
Ảnh 3.8: Huyền phù tế bào từ mô sẹo 1 tuần tuổi sau 21 ngày nuôi cấy
Ảnh 3.9: Huyền phù tế bào từ mô sẹo 2 tuần tuổi sau 21 ngày nuôi cấy
Ảnh 3.10: Huyền phù tế bào từ mô sẹo 3 tuần tuổi sau 21 ngày nuôi cấy
Ảnh 3.11: Huyền phù tế bào từ mô sẹo 4 tuần tuổi sau 21 ngày nuôi cấy
Ảnh 3.12: Huyền phù tế bào từ mô sẹo 5 tuần tuổi sau 21 ngày nuôi cấy
Ảnh 3.13: Huyền phù tế bào trong 15 ml môi trường sau 5 ngày (a) và 21 ngày
(b) nuôi cấy















ix
LỜI MỞ ĐẦU

Anthocyanin, một hợp chất tự nhiên có nhiều trong hoa, lá và quả của nhiều
loài thực vật, có nhiều hoạt tính sinh học quan trọng đối với con người.
Tuy nhiên, quá trình trích ly anthocyanin trực tiếp từ thực vật thường tốn
kém và không hiệu quả. Ngày nay, với sự phát triển của lãnh vực công nghệ tế bào
thực vật, anthocyanin được trích ly trực tiếp từ mô sẹo và huyền phù tế bào. Phương
pháp này được cho rằng hiệu quả hơn việc thu nhận anthocyanin trực tiếp từ cây
trồng ngoài tự nhiên.
Nhiều nghiên cứu về hệ thống nuôi cấy mô sẹo cũng như huyền phù tế bào
nhằm thu nhận anthocyanin đã được tiến hành trên nhiều đối tượng thực vật như
dâu tây (Fragaria sp.), nho (Vitis vinifera), cà rốt (Daucus carota), tía tô (Perilla
frutescens) và Aralia cordata, … .
Đề tài được tiến hành nhằm khảo sát khả năng tạo huyền phù tế bào từ mô
sẹo bắp cải tím (Brassica oleracea var. capitata f. rubra), bước đầu tạo huyền phù
tế bào sinh trưởng mạnh để tiến tới việc thu nhận anthocyanin.
Nội dung đề tài bao gồm:
- Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và kinetin lên sự hình thành và tăng
trưởng của mô sẹo bắp cải tím.
- Khảo sát ảnh hưởng của độ tuổi mô sẹo lên sự tạo huyền phù tế bào.
- Khảo sát ảnh hưởng của thể tích môi trường nuôi cấy lên sự tạo huyền
phù tế bào.
- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sucrose lên sự tăng trưởng của huyền
phù tế bào.
- Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và kinetin lên sự tăng trưởng của huyền
phù tế bào.
- Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết tảo Spirulina lên sự tăng trưởng của
huyền phù tế bào.
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Trang 10

Chương 1
Tổng quan tài liệu








Chương 1: Tổng quan tài liệu
Trang 11

1.1. Bắp cải tím Brassica oleracea var. capitata f. rubra
Phân loại khoa học:
Giới : Plantae
Ngành : Magnoliophyta
Lớp : Magnoliopsida
Bộ : Brassicales
Họ : Brassicaceae
Chi : Brassica
Loài : Brassica oleracea var.
capitata f. rubra Ảnh 1.1 : Bắp cải tím [30]
1.1.1. Nguồn gốc
Bắp cải tím có nguồn gốc từ Địa Trung Hải, và hiện nay đã được nhân rộng
khắp thế giới. Bắp cải tím được trồng phổ biến ở Nhật Bản với sản lượng hàng năm
khoảng 150 triệu tấn; ở Việt Nam, bắp cải tím được trồng phổ biến ở Đà Lạt.

Bắp cải tím trồng tại Đà Lạt có nguồn gốc từ Nhật Bản (Takii seed, Tokita,
Tohoku ), Pháp (Paris), Mỹ (Peto seed). Trong đó, giống của Nhật Bản được trồng
nhiều nhất vì thích hợp với điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng của Đà Lạt, cũng như có
khả năng kháng được một số loại nấm bệnh phổ biến, năng suất cao và ổn định
[28].
1.1.2. Hình thái
Bắp cải tím thuộc loài Brassica oleracea, là loại cây rau ăn lá, thân thảo, họ
Cải (Brassicaceae), cây sống hai năm hoặc hơn.
Bắp cải tím có lá dày, mép uốn lượn, phía trên không ôm thân. Hoa chùm,
đơn hay phân nhánh; lá đài dựng đứng; nhị gần bằng nhau. Quả hẹp, dài, có một mỏ
hình nón. Hạt nâu, nhẵn, xếp thành một dãy. Lá mầm thuôn, hai thùy, gập đôi.
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Trang 12


(a)

(b) (c)
Ảnh 1.2 : Cây mầm (a) và hoa bắp cải tím (b, c) [30]
Bắp cải là cây trồng có năng suất cao, được gieo trồng khắp nơi trên thế giới.
Hiện nay, người ta đã lai tạo và chọn được nhiều giống bắp cải, phổ biến là loại bắp
cải cuốn (B. oleracea var. capitata) ; và nhiều giống khác nhau như bắp cải trắng,
bắp cải đỏ, bắp cải chịu nhiệt, súp lơ (Brassica oleracea botrytis) [28].
1.1.3. Sinh trưởng
Bắp cải tím sinh trưởng tốt trong những vùng đất màu mỡ và đủ ẩm. Mùa vụ
thích hợp cho gieo trồng là mùa xuân và thu hoạch vào cuối mùa thu. So với các
loại bắp cải trắng cùng họ, bắp cải tím có thể được bảo quản lâu hơn cho đến cuối
mùa đông [29].
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Trang 13

Bắp cải trồng tại Đà Lạt có phẩm chất cao hơn ở những nơi khác trong nước.
Thời gian gieo trồng phụ thuộc vào đặc tính giống ngắn ngày hay dài ngày. Cây bắp
cải được trồng quanh năm tại Đà Lạt, không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết. Năng
suất bình quân trong vụ đông xuân có thể đạt đến 900-1100 tạ/ha, vụ hè thu đạt
600-750 tạ/ha [31].
1.1.4. Thành phần dinh dưỡng bắp cải tím
Trong bắp cải tím có chứa nhiều chất xơ, khoáng, nhiều loại amino acid và
vitamin:
Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng trong 100 g bắp cải tím [32]
Thành phần
Đơn vị
Giá trị
Thành phần
Đơn vị
Giá trị



Khoáng
Nước
g
90.39
Calcium,
Ca
mg
45
Protein
g
1.43

Sắt,
Fe
mg
0.80
Lipid tổng
g
0.16
Magnesium,
Mg
mg
16
Tro
g
0.64
Phosphorus,
P
mg
30
Carbohydrate
g
7.37
Potassium,
K
mg
243
Chất xơ
g
2.1
Sodium,
Na

mg
27
Đường tổng
g
3.83
Kẽm,
Zn
mg
0.22
Sucrose
g
0.60
Đồng,
Cu
mg
0.017
Glucose
g
1.74
Manganese,
Mn
mg
0.243
Fructose
g
1.48
Selenium,
Se
g
0.6

Vitamin
Amino acid
Vitamin C
mg
57.0
Tryptophan
g
0.012
Thiamin
mg
0.064
Threonine
g
0.039
Niacin
mg
0.418
Isoleucine
g
0.034
Vitamin B-6
mg
0.209
Leucine
g
0.046
Folate tổng
g
18
Lysine

g
0.049
Carotene, beta
g
670
Methionine
g
0.014
Vitamin A
IU
1116
Cystine
g
0.012
Lycopene
g
20
Phenylalanine
g
0.036
Vitamin E
mg
0.11
Tyrosine
g
0.022

1.1.5. Công dụng của bắp cải
Lượng vitamin trong bắp cải nhiều gấp 4.5 lần so với cà rốt, 3.6 lần so với
khoai tây, hành tây. Đặc biệt là vitamin A và P trong bắp cải kết hợp với nhau làm

cho thành mạch máu bền vững hơn. Trong bắp cải còn chứa các chất chống ung thư
như sulforaphane, phenethyl isothiocyanate và indole-33 carbinol. Bắp cải tím chứa
nhiều chất xơ, canxi, sắt và kali hơn bắp cải xanh. Trong bắp cải có chứa nhiều
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Trang 14

vitamin C. Dùng bắp cải trong các món salad là cách chế biến giúp giữ lại được
nhiều dưỡng chất của bắp cải nhất.
Theo Đông y, bắp cải vị ngọt, tính hàn, không độc, có tác dụng hòa huyết,
thanh nhiệt, thanh phế, trừ đàm thấp, sinh tân, chỉ khát, mát dạ dày, giải độc, lợi
tiểu. Bắp cải cũng giúp chống suy nhược thần kinh, giảm đau nhức, phòng chống
các bệnh ung thư, tim mạch và nhiều loại bệnh khác.
Còn theo Tây y, bắp cải đã được dùng để chữa nhiều bệnh thông thường như
mụn nhọt, sâu bọ đốt, giun, đau dạ dày. Các nghiên cứu cho thấy rằng những loại
rau trong gia đình nhà bắp cải có khả năng hạn chế sự phát triển của ung thư ruột vì
trong thành phần của nó có chứa indole có tác dụng giúp các tế bào ruột tránh được
những thay đổi dẫn đến ung thư.
Ngoài ra, một số tác dụng chữa bệnh chính của bắp cải được biết đến như
bắp cải giúp phòng bệnh ung thư vú ở phụ nữ, ung thư dạ dày, giúp chữa bệnh loét
dạ dày tá tràng và giúp phòng chống bệnh ung thư phổi, … .
1.1.6. Một số các nghiên cứu về anthocyanin trong cây bắp cải tím
Hrazdina (1976) xác định thành phần anthocyanin trong bắp cải tím gồm 8
hợp chất: cyanidin-3-sophoroside-5-glucoside, cyanidin-3-malonyl-sophoroside-5-
glucoside, cyanidin-3-p-coumaryl-sophoroside-5-glucoside, cyanidin-3-(di-p-
coumaryl)sophoroside-5-glucoside, cyanidin-3-ferulyl-sophoroside-5-glucoside,
cyanidin-3-(diferulyl)sophoroside-5-glucoside, cyanidin-3-sinapylsophoroside-5-
glucoside, and cyanidin-3-(disinapyl)-sophoroside-5-glucoside [6].
Dyrby (2001) khảo sát sự nhạy cảm của dịch trích bắp cải tím với ánh sáng
và nhiệt độ. Hàm lượng anthocyanin được tìm thấy là phụ thuộc vào cả pH và bước
sóng ánh sáng. Ở nhiệt độ khảo sát 25 – 80 C, mức độ ổn định của dịch trích

anthocyanin theo thứ tự bắp cải tím > vỏ nho > quả cơm cháy [15].
Igarashi (2000) báo cáo rằng ở chuột, các anthocyanin đã acyl hóa từ bắp cải
tím có thể bảo vệ hiệu quả chống lại các tổn hại do phản ứng oxi hóa gây ra bởi
thuốc diệt cỏ [14].
Arapitsas (2008) nghiên cứu một phương pháp nhanh để trích ly và phân tích
anthocyanin trong bắp cải tím. Dung môi trích ly là hơi nước chứa 5 % ethanol.
HPLC/DAD được dùng để phân tích nhanh – 24 đỉnh anthocyanin trong vòng 18
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Trang 15

phút. Các yếu tố khảo sát gồm nhiệt độ (80 – 120 C), khối lượng mẫu (1 – 3 g),
thời gian trích ly (6 – 11 phút), nồng độ formic acid trong dung môi trích ly (0 – 5
% thể tích). Kết quả trích ly tốt nhất với nhiều đỉnh anthocyanin nhất là ở 2.5 g
mẫu, 99 C (ở 50 bar), 7 phút trích ly và dung môi trích ly có thành phần nước /
ethanol / formic acid là 94 / 5 /1 theo thể tích [18].
Mc Dougall (2007) khảo sát độ bền của anthocyanin từ bắp cải tím trong sự
tiêu hóa ở dạ dày. Thành phần các anthocyanin trong bắp cải tím được xác định
bằng phương pháp sắc kí lỏng ghi phổ khối lượng (liquid chromatography mass-
spectrometry). Anthocyanin bền trong môi trường acid ở dạ dày, nhưng lượng
anthocyanin tổng phục hồi được sau sự tiêu hóa do dịch tụy là khoảng 25 %. Tất cả
các anthocyanin đều giảm sau sự tiêu hóa do dịch tụy, nhưng các dạng acyl hóa vẫn
bền hơn so với dạng không acyl hoá. Đồng thời, cũng có sự liên hệ giữa dạng
anthocyanin acyl hóa với hydroxycinnamic acid với độ bền của anthocyanin sau sự
tiêu hóa do dịch tụy [7].
Jones (2008) khảo sát sự hấp thu các anthocyanin từ bắp cải tím ở cơ thể
người. Kết quả cho thấy sự hấp thu các anthocyanin là không đều nhau, một số hấp
thu nhanh và dễ dàng hơn vào mạch máu. Gần 80 % các anthocyanin được acyl
hóa, đồng nghĩa với việc làm chúng trở nên bền hơn nhưng cũng khó hấp thu hơn.
Nghiên cứu cho thấy các anthocyanin không bị acyl hóa dễ hấp thu hơn các
anthocyanin bị acyl hóa ít nhất 4 lần [5].

1.2. Anthocyanin
1.2.1. Giới thiệu
Anthocyanin thuộc nhóm flavonoid, nhóm hợp chất màu thực vật quan trọng
nhất bên cạnh nhóm chlorophyll (Kong và cộng sự, 2003) [10] . Hiện nay, hơn
6400 hợp chất flavonoid khác nhau đã được tìm thấy trong thực vật (Martens và
cộng sự, 2003).
Anthocyanin (trong tiếng Hy Lạp, anthos là hoa và kyanos là màu xanh lam)
là nhóm hợp chất màu tan trong nước, thuộc nhóm hợp chất phenol trong nhóm
flavonoid. Anthocyanin chủ yếu tạo nên màu sắc hấp dẫn cho hoa, lá, quả, dịch quả
và các loại rượu trái cây [10].
1.2.2. Cấu trúc hoá học
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Trang 16

Về mặt hóa học, một anthocyanin chứa một anthocyanidin (hay aglycon) kết
hợp với đường, và thông thường còn thêm một yếu tố thứ ba là một acyl acid.
Anthocyanidin là những muối flavylium (2-phenylbenzopyrylium) khác
nhau về số lượng và vị trí của các nhóm methylated hydroxyl (-OCH
3
) với vòng
benzoyl (A) và vòng hydroxycinnamoyl (B).

Hình 1.1: Flavylium cation [9]
Anthocyanidin kém bền và ít được tìm thấy trong thực vật. Sự đường hóa
xảy ra khi có sự kết hợp giữa phân tử đường với nhóm hydroxyl của anthocyanidin,
thường xảy ra ở C3 hay C3 và C5 tạo nên anthocyanin. Sự đường hoá này giúp làm
giảm bước sóng hấp thu cực đại và làm tăng tính ổn định và tính hoà tan của
anthocyanin. Các phân tử đường có khả năng gắn với anthocyanidin là glucose,
rhamnose, galactose, xylose, arabinose và glucuronic acid (Francis, 1999).
Các glycoside có thể bị acyl hóa. Một hay nhiều phân tử acid thơm như p-

coumaric, ferulic, sinapic và caffeic hay các acid béo như malonic và acetic có thể
bị ester hóa với phân tử đường (Francis, 1999). Nhóm acyl luôn gắn vào đường ở vị
trí số 3 (Harborne, 1964). Sự acyl hóa anthocyanin là quan trọng cho sự ổn định của
các hợp chất màu này (Brouillard, 1988).

Hình 1.2: Sự acyl hóa anthocyanin: peonidin 3-6-p-coumarylglucoside [26]
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Trang 17

Hơn 540 hợp chất màu anthocyanin đã được tìm thấy trong tự nhiên
(Anderson và Francis, 2004). Và 18 hợp chất anthocyanidin tự nhiên đã được xác
định cấu trúc.
Bảng 1.2: Các anthocyanidin thường gặp ở thực vật bậc cao [10]
Tên
Viết tắt
Nhóm thế
3
5
6
7
3’
4’
5’
Cyanidin
Cy
OH
OH
H
OH
OH

OH
H
Delphinidin
Dp
OH
OH
H
OH
OH
OH
OH
Malvidin
Mv
OH
OH
H
OH
OCH
3

OH
OCH
3

Pelargonidin
Pg
OH
OH
H
OH

H
OH
H
Peonidin
Pn
OH
OH
H
OH
OCH
3

OH
H
Petunidin
Pt
OH
OH
H
OH
OCH
3

OH
OH
Ở thực vật bậc cao, cyanidin, delphinidin, malvidin, pelargonidin, peonidin
và petunidin chiếm tỉ lệ theo thứ tự là 50, 12, 12, 12, 7 và 7 % (Zhang và cộng sự,
2005).
Anthocyanin có sự thay đổi cấu trúc thuận nghịch khi pH thay đổi, dẫn đến
sự thay đổi về màu sắc.

Hiện nay, mục tiêu quan trọng là tạo nên các chất màu có chứa anthocyanin
ổn định hơn. Nhiều nghiên cứu cho thấy tính khả thi của một số các hợp chất có sự
kết hợp các anthocyanin với nhau hay kết hợp anthocyanin với các hợp chất khác
như với flavonoid, polysaccharide, protein, tannin, các hợp chất polyphenolic.
1.2.3. Sự sinh tổng hợp anthocyanin trong tế bào
Anthocyanin được tạo thành từ hai hợp chất khác nhau trong tế bào, và cả
hai đều bắt nguồn từ acetyl acetate từ quá trình quang hợp. Một hợp chất, được tổng
hợp từ con đường acid shikimic, là amino acid phenylalanine. Hợp chất còn lại,
được tổng hợp từ con đường acid acetic, là phân tử malonyl-Coenzym A.
Trong cấu trúc của anthocyanidin chứa hai vòng thơm A và B. Tiền chất của
vòng thơm A là malonyl-CoA, được tạo thành từ phản ứng carboxyl hóa acetyl-
CoA dưới tác dụng của enzym acetyl-CoA carboxylase và ATP.
Tiền chất của vòng thơm B là p-coumaryl-CoA, được tổng hợp từ một loạt
các phản ứng gọi là sự chuyển hóa phenylpropanoid.
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Trang 18

Dưới tác dụng của enzym chalcone synthase (CHS), 3 phân tử malonyl-CoA
kết hợp với p-coumaryl-CoA tạo thành một tetrahydrochalcone trung gian màu
vàng thông qua cơ chế tạo vòng polyketide. Chalcone sau đó được đồng phân hóa
bởi enzym chalcone isomerase (CHI) thành naringenin không màu. Naringenin tiếp
tục bị oxi hóa bởi các enzym như flavonoid hydroxylase, và kết hợp với các phân tử
đường dưới tác dụng của các enzym như UDP-O-glucosyl transferase để tạo thành
sản phẩm cuối cùng là anthocyanin.

Hình 1.3: Sự tạo thành malonyl-CoA từ acetate.
acetate-CoA lyase (AL); acetyl-CoA carboxylase (AC) [26]

Hình 1.4: Sinh tổng hợp anthocyanin trong tế bào [8]
Chương 1: Tổng quan tài liệu

Trang 19

1.2.4. Vai trò đối với thực vật
Một trong những chức năng chủ yếu của anthocyanin là khả năng tạo màu
cho cây để thu hút động vật giúp cho sự thụ phấn hay sự phát tán hạt. Do đó,
anthocyanin rất quan trọng cho sự tiến hóa của thực vật.
Các tia bức xạ UV từ mặt trời có khả năng gây tổn thương protein của cây và
làm giảm hiệu suất quang hợp. Anthocyanin có khả năng hấp thu ánh sáng vàng và
lục, bước sóng khoảng 500 – 600 nm (Field và cộng sự, 2001), do đó có thể bảo vệ
thực vật khỏi sự tổn thương do các bức xạ UV này.
Bên cạnh đó, thông qua việc ngăn chặn các lượng tử năng lượng cao,
anthocyanin giúp ngăn chặn các phân tử không bền với ánh sáng không bị phân hủy
bởi ánh sáng xanh (Gould, 2004).
Anthocyanin cũng có khả năng làm việc như một dấu hiệu cảnh báo các loài
côn trùng (Hamilton và Brown, 2001) và tế bào chứa anthocyanin thường ít bị động
vật ăn cỏ tấn công (Costa-Arbulu và cộng sự, 2001).
Anthocyanin cũng được cho là làm tăng khả năng kháng oxy hóa của thực
vật nhằm giúp thực vật duy trì và bảo vệ các hoạt động sinh lý bình thường trong tế
bào khỏi những ảnh hưởng trực tiếp hay gián tiếp từ các nhân tố môi trường ngoài
(Stintzing và Carle, 2004).
1.2.5. Vai trò đối với con người
Những tổn thương do các phản ứng oxi hóa trong cơ thể là một nguyên nhân
quan trọng trong sự khởi đầu cũng như sự tiến triển của nhiều loại bệnh tật (Jacob
và Burri, 1996).
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng nhiều flavonoid và polyphenol hiện diện
trong trái cây và rau củ là những hợp chất kháng oxi hóa tự nhiên. Những chất này
có khả năng chống oxi hóa in vitro hiệu quả hơn nhiều so với vitamin E và C (Rice-
Evan và cộng sự, 1997). Sự kháng oxy hóa giúp ngăn ngừa hay làm trì hoãn các
bệnh về sự thoái hóa như ung thư, các bệnh về tim mạch, bệnh đục nhân mắt và sự
hoạt động bất thường trong nhận thức (Mazza, 2000). Các hợp chất này hoạt động

như một chất chống oxy hóa bằng cách cho hydro cho các gốc tự do, qua đó ngăn
ngừa sự tổng hợp các gốc tự do tiếp theo.
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Trang 20

Anthocyanin trong rượu đỏ được báo cáo là chặn đứng sự phát triển cuả các
tế bào ung thư ruột kết (HCT-115) và tế bào ung thư dạ dày (AGS) ở người (Kamei
và cộng sự, 1998) Anthocyanin từ quả việt quất (V. myrtillus) gây ra cái chết cho
các tế bào bạch cầu, (bệnh bạch cầu) và các tế bào khối u ác tính ở ruột kết in vitro
(Katsube và cộng sự, 2003).
Sarma và Sharma (1999) tiến hành nghiên cứu sự tương tác giữa
anthocyanin và DNA, và tìm ra rằng ctDNA và cyanidin có thể tạo một đồng phức
chất màu cyanidin-DNA. Nếu để anthocyanin và ctDNA độc lập dưới tác dụng của
các gốc tự do OH, hai chất này sẽ bị oxy hóa. Sự tạo thành phức chất cyanidin-
DNA lại giúp bảo vệ cả cyanidin và ctDNA. Như vậy, sự tạo phức chất cyanidin-
DNA có thể là một phương pháp hóa học khả thi để bảo vệ DNA khỏi các tổn hại
do quá trình oxy hoá gây ra. Mas và cộng sự (2000) cũng đề xuất rằng các
anthocyanins có khả năng làm ổn định cấu trúc DNA [10].
1.2.6. Một số nghiên cứu về huyền phù tế bào trong mục đích thu nhận
anthocyanin
Ozeki (1981) khảo sát sự tổng hợp anthocyanin ở huyền phù tế bào cà rốt.
Huyền phù tế bào được nuôi trong môi trường chứa 2,4-D nồng độ 5 10
-7
M. Việc
tế bào được chuyển qua môi trường không chứa auxin kích thích tổng hợp
anthocyanin. Zeatin tăng cường quá trình tổng hợp anthocyanin trong môi trường
không có auxin, với sản lượng anthocyanin cao nhất ở zeatin nồng độ 10
-7
– 10
-8

M.
Và 2,4-D ở nồng độ cao hơn 10
-7
M ngăn chặn hoàn toàn sự tổng hợp anthocyanin.
Cũng theo Ozeki (1986), khi thêm 2,4-D vào các tế bào cà rốt đang tổng hợp
anthocyanin (đồng nghĩa với tế bào này đã ngừng phân chia), sự tổng hợp
anthocyanin bị ngăn chặn tức thì, anthocyanin được tích lũy trong tế bào biến mất
và quá trình phân bào được tái lập. Nghiên cứu cũng cho thấy cytokinin có khả
năng tăng cường sự tổng hợp anthocyanin khi không có mặt auxin. Cả gibberellic
acid (GA
3
) và abscisic acid kìm hãm sự tổng hợp anthocyanin trong môi trường
thiếu 2,4-D, mặc dù GA
3
cho thấy không có ảnh hưởng lên sự phân chia tế bào [22,
23].
Takeda (1988) khảo sát tác động kích thích của ánh sáng đến sự tổng hợp
anthocyanin ở huyền phù tế bào cà rốt: sau khi chuyển tế bào vào môi trường không
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Trang 21

chứa 2,4-D trong tối vài ngày, tế bào được chuyển ra ánh sáng. Hơn 90 % tế bào
tổng hợp anthocyanin và ngừng sự phân chia tế bào. Bằng việc giảm nồng độ
phosphate hay cả nồng độ phosphate và nitrogen kết hợp trì hoãn thời điểm chuyển
tế bào ra ánh sáng, sự tổng hợp anthocyanin trên mỗi tế bào gia tăng đến mức tối đa
0 – 8 mol anthocyanin / 10
6
tế bào. Nghiên cứu cho thấy sự thay đổi tình trạng
sinh lý của tế bào (từ tình trạng không nhạy cảm sang nhạy cảm với ánh sáng) được
gây ra bởi việc chuyển tế bào vào môi trường không chứa 2,4-D được xem là một

điều kiện tiên quyết cho sự tổng hợp anthocyanin bằng kích thích ánh sáng [11].
Chi Bao Do (1991) khảo sát sự ảnh hưởng của nitrate nồng độ thấp và đường
nồng độ cao đến hàm lượng anthocyanin trong huyền phù tế bào nho (Vitis vinifera
L.). Hàm lượng anthocyanin tốt nhất khi nồng độ nitrate giảm từ 25mM đến 6.25
mM và khi nồng độ đường sucrose tăng từ 88 mM đến 132 mM [3].
Sato (1995) khảo sát điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sự tổng hợp
anthocyanin của huyền phù tế bào dâu tây. Sản lượng anthocyanin tăng khi tăng
cường độ chiếu sáng, và sự tăng trưởng tế bào thì độc lập với cường độ chiếu sáng.
Hàm lượng anthocyanin tăng và sinh khối tế bào giảm khi các chất dinh dưỡng trở
thành chất ức chế sự tăng trưởng, đặc biệt là phosphate. Nồng độ nitrogen tổng ảnh
hưởng đến sự tăng trưởng tế bào và sự tổng hợp anthocyanin: khi nuôi cấy 13 ngày
trong môi trường có nồng độ nitrogen tổng lớn hơn 14.6 mM, sinh khối đạt 400 –
450 g FW/l (g tế bào tươi / l), và hàm lượng anthocyanin là 0.12 mg/g FW; tế bào
không tăng trưởng trong môi trường không chứa nitrogen. Sự gia tăng nồng độ
sucrose cũng làm giảm sinh khối và tăng hàm lượng anthocyanin [13].
Zang Wei (1998) khảo sát sự ảnh hưởng của đường (bao gồm sucrose,
fructose và glucose), khoáng (PO
4
, NO
3
, NH
4
và Ca) đến sự tổng hợp anthocyanin
và sự tăng trưởng của huyền phù tế bào dâu tây [25].
Zang Wei (1999) đưa ra một quy trình hai giai đoạn với sự thay đổi về nhiệt
độ nhằm tăng sản lượng anthocyanin trong huyền phù tế bào dâu tây (Fragaria
ananassa). Trong quy trình này, tế bào dâu tây được nuôi ở 30 C (nhiệt độ thuận
lợi nhất cho sự sinh trưởng tế bào) trong một khoảng thời gian nhất định (giai đoạn
1). Sau đó nhiệt độ được hạ xuống (giai đoạn 2). Sự thay đổi nhiệt độ này kích thích
sự tổng hợp anthocyanin và lượng anthocyanin thu được cao hơn lượng

Chương 1: Tổng quan tài liệu
Trang 22

anthocyanin thu được ở hai nhiệt độ đầu và cuối của quá trình, nhưng sự tăng
trưởng của tế bào lại bị hạn chế. Khi nhiệt độ cuối quá trình càng thấp, sự tăng
trưởng của tế bào càng giảm, nhưng lượng anthocyanin thu được càng cao. Sự tổng
hợp anthocyanin bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi thời điểm nhiệt độ thay đổi, và sự tăng
trưởng tế bào thì không. Lượng anthocyanin cao nhất từ 2.7 mg tế bào tươi thu
được vào ngày 9 bởi sự thay đổi nhiệt độ từ 30 C đến 15 C (sự thay đổi nhiệt độ
vào ngày 3) [27].
C. Forni (1999) khảo sát sự tăng trưởng của tế bào với kích thước, hình dáng
khác nhau trong huyền phù tế bào dâu tây. Trong huyền phù tế bào chứa 3 loại tế
bào: loại A (tế bào tròn nhỏ, đường kính < 65 m), loại B (tế bào tròn, đường kính
88 – 100 m) và loại C (tế bào dài, chiều dài 100 – 200 m). Mỗi loại tế bào là tế
bào đơn hay nhóm tế bào (20 – 100 tế bào, loại G). Kết quả nghiên cứu cho thấy tế
bào đơn loại A và B không tăng trưởng, trong khi tế bào đơn loại C tăng trưởng
chậm. Tế bào loại C cũng là loại chiếm phần lớn trong huyền phù tế bào. Loại G
tăng trưởng cao hơn loại A và B. Tế bào loại C và G có hàm lượng anthocyanin cao
hơn các loại tế bào còn lại. Ở loại A, các hợp chất phenol không được tìm thấy
trong giai đoạn tăng trưởng tế bào; và nồng độ các hợp chất phenol giữa 4 loại tế
bào còn lại thì khác nhau phụ thuộc hình thái và giai đoạn tăng trưởng của tế bào
[2].
Zang (2001) nghiên cứu quy trình nuôi cấy tế bào dâu tây với môi trường
thay đổi lặp lại (repeated – patch) nhằm tăng hàm lượng anthocyanin. Quy trình
gồm 4 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: nuôi trên môi trường LS
- Giai đoạn 2: nuôi trên môi trường B5
- Giai đoạn 3: chuyển đổi từ môi trường LS sang B5
- Giai đoạn 4: chuyển đổi từ môi trường B5 sang LS.
Sản lượng anthocyanin trung bình tăng 1.7 lần ở môi trường LS và 1.76 lần ở

môi trường B5. Kết quả nghiên cứu cho thấy việc sản xuất và thu nhận anthocyanin
bằng phương pháp nuôi cấy repeated – patch tế bào dâu tây là khả thi [24].
Hennayake (2006) khảo sát các sự biểu hiện khác nhau của gen tổng hợp
anthocyanin trong huyền phù tế bào của Rosa hybrida nhằm giúp hiểu rõ hơn phản
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Trang 23

ứng của con đường tổng hợp anthocyanin trong tế bào với môi trường nuôi cấy
(môi trường MS và ES, chất điều hóa sinh trưởng IBA và kinetin, nồng độ sucrose),
điều kiện nuôi cấy (sáng, tối và UV-B) [4].
Chương 2: Vật liệu – Phương pháp
Trang 24




Chương 2
Vật liệu – Phương
pháp






Chương 2: Vật liệu – Phương pháp
Trang 25

2.1. Sơ đồ nghiên cứu chung

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu chung

Khử trùng
Tạo cây mầm
Lá mầm
Mô sẹo
Huyền phù tế
bào
Hạt bắp cải tím

Chất điều hòa
sinh trưởng thực
vật 2,4-D và
kinetin
Độ tuổi của mô
sẹo

Thể tích môi
trường lỏng
Nồng độ sucrose
Chất điều hòa
sinh trưởng thực
vật 2,4-D và
kinetin
Nồng độ dịch
chiết tảo Spirulina
Huyền phù tế bào
có khả năng sản
xuất anthocyanin