Nghiên cứu tính an toàn và công hiệu Văcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt từ não chuột chủng Beijing-1 do việt nam sản xuất

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
WX


ĐỖ THỊ DIỆP LAN


NGHIÊN CỨU TÍNH AN TOÀN VÀ CÔNG HIỆU
VĂCXIN VIÊM NÃO NHẬT BẢN BẤT HOẠT TỪ NÃO
CHUỘT CHỦNG BEIJING-1 DO VIỆT NAM SẢN XUẤT

Chuyên ngành: Vi sinh Vật
Mã số: 60.72. 68

LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
GS.TS. HUỲNH PHƯƠNG LIÊN






Hà Nội – 2010



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

WX


ĐỖ THỊ DIỆP LAN


NGHIÊN CỨU TÍNH AN TOÀN VÀ CÔNG HIỆU
VĂCXIN VIÊM NÃO NHẬT BẢN BẤT HOẠT TỪ NÃO
CHUỘT CHỦNG BEIJING-1 DO VIỆT NAM SẢN XUẤT



LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC








Hà Nội – 2010

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc của mình, em xin dành trang đầu tiên của luận văn
để bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:
Ban giám hiệu trường Đại học Y Hà Nội, Phòng đào tạo sau Đại học, cùng
toàn thể quý thầy cô trong Bộ môn Vi sinh đã giảng dạy tận tình và giúp đỡ em
trong quá trình học tập ở trường.

PGS.TS. Lê Văn Phủng- Viện trưởng Viện kiểm định Quốc gia Văcxin và
Sinh phẩm Y tế, đồng thời là Trưởng Bộ môn Vi sinh trường Đại học Y Hà Nội
người thầy luôn quan tâm, động viên em trong quá trình học tập tại trường và làm
việc tại Viện.
GS. TS. Huỳnh Phương Liên- Công ty văcxin và sinh phẩm số 1, người thầy
đã luôn quan tâm hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình làm
luận văn.
Phòng kiểm định chất lượng, Công ty văcxin và sinh phẩm số 1.
Khoa Kiểm định Văcxin virut, Viện Kiểm định Quốc gia Văcxin và Sinh
Phẩm Y Tế, đã tạo điều kiện cho tôi học tập và làm việc.
Xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình , tất cả bạn bè, anh chị em đã quan tâm,
giúp đỡ, chia sẻ, động viên em trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, tháng 8 năm 2010
Người viết luận văn



Đỗ Thị Diệp Lan
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………… 1
Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………….….…3
1.1. Virut VNNB…………………………………………………………………3
1.1.1. Thành phần hoá học của virut……………………………………… 3
1.1.2. Tính chất hoá lý……………………………………………… …… 4
1.1.3. Cấu trúc hạt virut……………………………………………… ….…4
1.1.4. Hình thái học ………………………………………………… …… 4
1.1.5. Sự nhân lên của virut………………………………………………… 5
1.2. Dịch tễ học………………………………………………………………… 6
1.3. Đặc điểm lâm sàng………………………………………………… … 10

1.4. Chẩn đoán…………………………………………………………… …. 11
1.4.1. Chẩn đoán lâm sàng……………………………………………… 11
1.4.2. Chẩn đoán phòng thí nghiệm………………………………… … 11
1.5. Bệnh lý học và sinh bệnh học………………………………………… …15
1.6. Văcxin VNNB…………………………………………………………… 16
1.6.1. Những khía cạnh chung của phương pháp tiêm phòng bằng văcxin 16
1.6.2. Kháng nguyên bảo vệ và văcxin……………… ……………………18
1.6.3. Ý nghĩa và lịch sử phát triển của văcxin VNNB…………………… 19
1.6.4. Hiệu lực của văcxin……………………………………………… …21
1.6.5. Thời gian miễn dịch………………………………………………….22
1.7. Các loại văcxin sử dụng trên thế giới………………………………… 23
1.8. Văcxin VNNB bất hoạt sản xuất từ não chuột …………………………….23
1.8.1. Định nghĩa……………………………………………………….… 23
1.8.2. Chủng virut………………………………………………………… 23
1.8.3. Chuột dùng cho sản xuất văcxin……………………………… … 23
1.8.4. Sản xuất văcxin……………………………… …………………… 23
1.8.5. Kiểm định văcxin…………………………………………… …… 23
Chương II. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu………………………………26
2.2. Vật liệu nghiên cứu…………………………………………………… … 26
2.3. Phương pháp và kỹ thuật nghiên cứu………………………………… 29
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu………………………………………….…29
2.3.2. Kiểm tra tính an toàn của văcxin VNNB……………………… … 29
2.3.2.1. Kiểm tra an toàn chung ……………………………………… … 29
2.3.2.2. Kiểm tra chất gây sốt………………………………………… … 32
2.3.2.3. Kiểm tra an toàn đặc hiệu……………………………………… 34
2.3.2.4. Kiểm tra vô trùng………………………………………………… 36
2.3.2.5. Kiểm tra các thành phần hoá học………………………………… 37
2.3.3. Kiểm tra tính công hiệu của văcxin VNNB……………………… 42
2.3.4. Phương pháp xử lý sô liệu……………………………………….… 47

2.3.5. Đạo đức trong nghiên cứu…………………………………….…… 47
Chương III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………… …………………48
3.1. Kết quả kiểm tra thành phần hoá học của 6 loạt văcxin VNNB từ chủng
Beijing-1………………………………………………………………………… 48
3.2. Kết quả kiểm tra tính công hiệu của 6 loạt văcxin VNNB từ chủng Beijing1 57
Chương IV. BÀN LUẬN………………………………………….…………… 58
4.1.Tính an toàn của văcxin VNNB từ chủng Beijing-1 do Việt Nam
sản xuất 58
4.1.1. Hàm lượng TCA-Protein 58
4.1.2. Hàm lượng Thimerosal 59
4.1.3. Hàm lượng Formaldehyd 61
4.1.4. Độ pH 62
4.1.6. Thử nghiệm an toàn chung 62
4.1.7. Thử nghiệm an toàn đặc hiệu 63
4.1.8. Thử nghiệm yếu tố gây sốt 64
4.2. Tính công hiệu của văcxin VNNB từ chủng Beijing-1 do Việt Nam
sản xuất 65
Chương V: KẾT LUẬN 66
1. Tính an toàn của văcxin VNNB từ chủng Beijing-1 do Việt Nam sản xuất.
2. Tính công hiệu của văcxin VNNB từ chủng Beijing-1 do Việt Nam sản xuất.
KIẾN NGHỊ 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO 68


NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

BA Albumin bò ( Bovin albumin)
BHK-21 Tế bào thận chuột đất vàng (Baby hamster kidney)
CF Kết hợp bổ thể (Complement Fixation)
CPE Cytopathic effect

CTTCMR Chương trình tiêm chủng mở rộng
CV Virut thử thách (Challenge virus)
DTaP Bạch hầu, Uốn ván, Ho gà vô bào
( Diphteria, Tetanus, acellular Pertussis)
ELISA Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết gắn enzym (Enzyme
Link Immuno-sorbent Assay)
FBS Huyết thanh bào thai bê (Fetal Bovin Serum)
FTM Fluid Thioglycollate Medium
GMP Thực hành sản xuất tốt (Good Manufacturing Practice)
GSK Glaxo Smith Kline
HA Phản ứng ngưng kết hồng cầu (Hemaglutination Assay)
HI Ngăn ngưng kết hồng cầu (Hemaglutination Inhibition)
IF Miễn dịch huỳnh quang (Immunofluorscent)
IP Tiêm phúc mạc (intra peritorial))
JE Viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis)
LAL
L
L
i
i
m
m
u
u
l
l
u
u
s
s

A
A
m
m
e
e
b
b
o
o
c
c
y
y
t
t
e
e
s
s


L
L
y
y
s
s

a
a
t
t
e
e


LE Môi trường Lactalbumin trong đệm Earle
LH Môi trường Lactalbumin hydrolysat
NICVB Viện Kiểm định Quốc gia Văcxin và Sinh phẩm Y tế
(National Institute for control of Vaccines and Biologicals)
OD Mật độ quang học (Optic density)
PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)
PFU Tạo đám hoại tử (Plaque Forming Unit)
PRNT Trung hoà giảm đám hoại tử (Plaque Reduction Neutralization
Test)
TSB Tryptic Soy Broth
TCA Axit tricloraxetic
ƯCNKHC Ức chế ngưng kết hồng cầu
VABIOTECH Công ty văcxin và sinh phẩm số 1
VVSDTTƯ Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương
VNNB Viêm não Nhật Bản
WHO Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization)
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) hiện đang là mối quan tâm lớn của
ngành y tế các nước châu Á vì mức độ nguy hiểm của nó. Bệnh lưu hành ở châu
Á bao gồm Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Philipin, Triều Tiên, Ấn Độ, vùng
viễn đông Nga và tất cả các nước Đông Nam Á, với khoảng 50.000 trường hợp
mỗi năm, trong đó 10.000 ca tử vong, 15.000 ca mang di chứng thần kinh suốt

đời [52]. Từ thập kỷ 90 của thế kỷ 20 virut VNNB đã lan đến các vùng khác
ngoài châu Á như vùng Torres của Australia [34, 44] .
Ở Việt Nam dịch xảy ra hàng năm, rải rác khắp các tỉnh thành từ đồng
bằng đến miền núi, miền Bắc có tỷ lệ mắc cao nhất. Hiện nay khi việc tiêu diệt
vectơ truyền bệnh là muỗi Culex hoặc tiêm phòng cho lợn là ổ chứa virut còn rất
khó khăn thì gây miễn dịch cho người là biện pháp duy nhất để ngăn ngừa bệnh
VNNB.Tuy nhiên với sự thay đổi của các chủng virut như VNNB genotyp 1
được phát hiện ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Việt Nam báo động cho chúng ta
cần dự phòng bệnh tích cực hơn bằng các chủng loại vắc xin VNNB có diện đáp
ứng kháng thể rộng với nhiều chủng, lưu hành ở nhiều vùng khác nhau.
Theo
nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy chủng Beijing-1 được coi là chủng đại
diện nhất, có thể bảo vệ chéo với nhiều chủng VNNB lưu hành ở nhiều địa
phương và khả năng miễn dịch cao hơn chủng Nakayama.
Sau khi chuyển giao công nghệ của Nhật Bản, Việt Nam đã sản xuất
thành công văcxin VNNB từ chủng Nakayama. Hiện nay, Công ty văcxin và
sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) đã sản xuất văcxin VNNB ở cả 2 chủng
Nakayama và Beijing-1 để đáp ứng nhu cầu thị trường trong và ngoài nước.
Kiểm tra chất lượng văcxin là một vấn đề hết sức quan trọng, có tính chất khẳng
định chất lượng của văcxin về tính an toàn và công hiệu của nó. Do đó chúng tôi
tiến hành nghiên cứu đề tài:
"Nghiên cứu tính an toàn và công hiệu văcxin viêm não Nhật Bản bất
hoạt từ não chuột chủng Beijing-1 do Việt Nam sản xuất”

1

Trong phạm vi của đề tài này nhằm 2 mục tiêu:
1. Đánh giá tính an toàn của vắc xin viêm não Nhật Bản từ não chuột
chủng Beijing-1 trong ph
òng th í nghiệm do Việt Nam sản xuất.

2. Đánh giá tính công hiệu của vắc xin viêm não Nhật Bản từ não chuột
chủng Beijing-1 trong ph
òng th í nghiệm do Việt Nam sản xuất.

























2
Chương I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Virut viêm não Nhật Bản
Virut VNNB là một thành viên của nhóm B các arbovirut, thuộc họ
Togaviridae, dòng Flavivirut; là một virut chứa ARN có vỏ bọc. Các hạt virut
hình cầu có đường kính trung bình 40 – 50nm [41].












Hình 1.1: Sơ đồ cấu trúc hạt virut VNNB (Flaviviruse)
1.1.1. Thành phần hoá học của virut
- ARN sợi đơn, có hằng số lắng là 44S, có trọng lượng phân tử 4 ×10
6

dalton. ARN chiếm 6% trọng lượng của virion và có thành phần bazơ là G:26;
A:30; C:22; U:22. ARN là vật liệu gây nhiễm và đóng vai trò của ARN thông tin
với một mũ "cap" ở đầu 5’ và không có dải poly A ở đầu 3’ [56].

3
- Protein: có 3 protein cấu trúc [49]:
+ Protein vỏ (protein E) là một glycoprotein có chức năng là
mộtkháng nguyên ngưng kết hồng cầu và có trọng lượng phân tử 53 ×10

3
dalton.
+ Protein lõi (protein C) có trọng lượng phân tử 13,5 ×10
3
dalton.
+ Protein giống màng (hay protein M) có trọng lượng phân tử
8,7 ×10
3
dalton.
Các protein chiếm 66% trọng lượng của virion.
- Lipit: chiếm 17% trọng lượng của virion.
- Đường (carbohydrate): 9% trọng lượng của virion, protein E gắn với
đường mannoza và các glycan.
1.1.2. Tính chất hoá lý
- Virut có tỷ trọng 1,19 - 1,20 g/cm
3
trong đường sucroza và 1,22 - 1,24
g/cm
3
trong cesium clorit.
- Hệ số lắng 200S.
- Trọng lượng (60 - 70) × 10
6
dalton.
- Độ bền vững: virut bền vững ở pH 7 - 9, bị mất 50% hoạt tính ở 50
0
C
trong 10 phút, bị bất hoạt ở 56
0
C trong 30 phút, ở dưới - 60

0
C virut tồn tại lâu
[29]. Nhậy với các dung môi hoà tan mỡ, các thuốc tẩy và trypsin.
1.1.3. Cấu trúc hạt virut
- Nucleocapsit: có đường kính 25 - 30 nm và hệ số lắng 120 - 140S. Gồm
ARN và protein C.
- Vỏ bọc gồm 1 màng lipit kép gắn với protein E và protein M [41].
1.1.4. Hình thái học
Hạt virut hình cầu đường kính trung bình 45-50 nm với các chỗ lồi rất nhỏ
trên bề mặt tạo thành quầng sáng quanh hạt virut. Chỗ lồi trên bề mặt hạt virut là
các gai dài 5 - 10nm với đường kính 2nm. Những gai này chính là các
glycoprotein mang hoạt tính ngưng kết hồng cầu và hoạt tính trung hoà [48].

4
1.1.5. Sự nhân lên của virut
Virut VNNB có thể nhân lên được ở một số loại tế bào có nguồn gốc khác
nhau như: Tế bào có nguồn gốc từ người, khỉ, một số loài gậm nhấm, lợn, chim và
tế bào muỗi. Hiệu giá của virut khi nhân lên tuỳ thuộc vào từng loại tế bào chủ.
Quá trình nhân lên của virut VNNB có thể chia thành 4 giai đoạn:
* Giai đoạn 1: Virut bám dính và xâm nhập vào tế bào chủ
* Giai đoạn 2: Giai đoạn tổng hợp các thành phần của virut bên trong tế
bào. Khi xâm nhập vào tế bào virut truyền thông tin di truyền của nó từ ARN,
kích ứng sinh tổng hợp ARN-Polymeraza. ARN sợi (+) sẽ được phiên mã nhờ
ARN-polymeraza thành ARN (-) bổ sung thành sợi kép để làm khuôn sinh tổng
hợp ARN mới theo cách bán bảo tồn, ARN được tổng hợp ở quanh nhân tế bào.
Các ARN của virut và ARN thông tin được tạo thành để tổng hợp các protein
của virut.
* Giai đoạn 3: Giai đoạn lắp ráp các thành phần của virut khi axit nucleic
và protein của virut được tổng hợp, chúng tiến dần đến màng tế bào để lắp ráp
vỏ capsit và ARN để tạo thành virut mới.

* Giai đoạn 4: Virut thoát khỏi tế bào. Sau khi lắp ráp thành virut hoàn
chỉnh chúng tiến dần đến màng tế bào, phá vỡ tế bào, giải phóng khỏi tế bào để
xâm nhập vào tế bào khác.

Hình 1. 2: Hình ảnh hạt virut VNNB quan sát dưới kính hiển vi điện tử JEM -
T8 độ phóng đại 120 000 lần

5
1.2. Dịch tễ học
Virut VNNB được lưu hành rộng rãi ở châu Á bao gồm Nhật Bản, Trung
Quốc, Đài Loan, Triều Tiên, Philippin, vùng Viễn Đông Liên Xô, hầu hết các
nước Đông Nam Á và Ấn Độ [25]. Từ thập kỷ 90 của thế kỷ 20 virut VNNB đã
lan đến vùng khác ngoài châu Á như vùng Torres của Australia [34, 44] . Năm
1924 một vụ dịch viêm não lớn xẩy ra ở Nhật Bản với hơn 6000 trường hợp mắc
và tỷ lệ tử vong là hơn 60%. Sau đó các vụ dịch xẩy ra hàng năm vào mùa hè
với tổng số khoảng 27000 trường hợp mắc trong thời gian từ năm 1924 - 1940.
Vụ dịch VNNB năm 1949 ở Triều Tiên có 5500 trường hợp mắc với tỷ lệ tử
vong là 50%. Ở Trung Quốc hàng năm có trên 1000 trường hợp mắc. Từ cuối
những năm 60 của thế kỷ trước, tỷ lệ mắc bệnh giảm đi ở Nhật Bản và Trung
Quốc: hàng năm ở Nhật Bản có dưới 20 trường hợp mắc; ở Bắc Kinh - Trung
Quốc tỷ lệ mắc bệnh giảm từ 15 - 30 trường hợp/100000 dân xuống còn 2,5
trường hợp/ 100000 dân (theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới năm 1980).
Ngược lại, các vụ dịch lớn xuất hiện ở Ấn Độ, Nepal và Đông Nam Á.
Các nghiên cứu cho thấy ở miền Bắc Thái Lan dịch xảy ra hàng năm với số
lượng mắc trung bình là 1600 trường hợp (3 - 5 trường hợp/100000 dân). Năm
1969 một vụ dịch lớn bùng nổ ở đây, đặc biệt là ở tỉnh Chiang Mai với tỷ lệ mắc
là 20,3 trường hợp/100000dân [32, 33]. Ở Ấn Độ dịch xảy ra hàng năm ở nhiều
vùng khác nhau, các vụ dịch từ năm 1973 đến 1983 đã có trên 10.000 trường
hợp mắc (theo báo cáo của Viện Virut học Quốc Gia Ấn Độ). Ở Triều Tiên và
các tỉnh ven biển Trung Quốc đến nay dịch vẫn xảy ra hàng năm. Tỷ lệ tử vong

trong các vụ dịch là 20 đến 70% phụ thuộc vào sự chăm sóc y tế và điều kiện
sống từng nơi.
Virut VNNB được phân lập đầu tiên vào năm 1935 ở Nhật Bản và đã
được tìm thấy ở hầu hết các nước Đông Nam Á. Genotyp I phân lập bao gồm
các nước miền bắc Thái Lan, Campuchia và Hàn Quốc. Việt Nam chỉ phân lập
được 1 chủng Genotyp I từ người vào năm 1990 còn hầu hết Genotyp I được
phát hiện ở muỗi và lợn. Genotyp II được phân lập ở các nước miền nam Thái

6
Lan, Malaysia, Indonesia và phía Bắc Australia. Genotype III bao gồm các nước
Nhật Bản, Trung Quốc, Hồng Kông, Philippines, Việt Nam [40]. Ở Việt Nam,
bệnh VNNB đã được ghi nhận từ năm 1960 và đã được chẩn đoán xác định bằng
huyết thanh học và phân lập virut từ người bệnh, súc vật, muỗi vectơ. Bệnh
VNNB lưu hành ở hầu hết các tỉnh phía Bắc trên địa bàn 107 quận, huyện, thị
xã. Các ổ dịch lưu hành phần lớn tập trung tại các vùng bán sơn địa và vùng
đồng bằng trồng lúa nước thuộc các tỉnh Hà Giang, Thái Nguyên, Bắc Kạn, Hoà
Bình, Hải Dương, Hưng Yên, Hà Nam, Ninh Bình, ngoại thành Hà Nội và Hải
Phòng. Ở miền Nam, miền Trung và Tây Nguyên có tỷ lệ mắc thấp hơn so với
các tỉnh miền Bắc [10].
Trong 5 năm từ 1989-1992 có 4.130 trường hợp viêm não cấp tính được
thông báo từ 23 tỉnh, thành phố trong đó 237 trường hợp tử vong chiếm 5,7%.
1296 trường hợp được lấy máu xét nghiệm xác định được 733 trường hợp là
bệnh VNNB chiếm 56,55%, 860 mẫu huyết thanh lợn được xét nghiệm xác định
được 370 mẫu có kháng thể VNNB chiếm 43,5%[11]. Chỉ số mật độ muỗi ở nơi
lưu hành bệnh VNNB thường tăng cao từ tháng 4 đến tháng 9. Hai năm có dịch
xảy ra lớn là 1988 và 1992, 119 số quận huyện thị đã được xác định có lưu hành
bệnh, tập trung cao ở vùng đồng bằng và vùng bán sơn địa có trồng lúa nước ở
miền Bắc Việt Nam. Bệnh xảy ra quanh năm đỉnh cao là tháng 6 thường chậm
hơn đỉnh cao của sự nhiễm virut trong quần thể lợn và chỉ số mật độ muỗi từ 1-2
tháng. Trẻ em dưới 15 tuổi là đối tượng mắc bệnh chủ yếu trong đó trẻ từ 3

tháng tuổi đến 9 tuổi chiếm 86,1% [11].
Cho đến nay virut VNNB vẫn là nguyên nhân hàng đầu gây hội chứng
não cấp (HCNC) ở Việt Nam, với trên 80% số mắc ở trẻ em dưới 15 tuổi. Để
khống chế bệnh VNNB cần tăng cường sử dụng vắc xin VNNB cho trẻ dưới 15
tuổi [6]. 976 mẫu kháng huyết thanh và dịch não tủy của bệnh nhân có HCNC
đã chẩn đoán xác định IgM kháng virut VNNB là 46,1 % trường hợp bị HCNC
là do virut VNNB [8].


7
Hình 1.3: Sự phân bố theo nhóm tuổi các trường hợp VNNB
năm 2002 ở miền Bắc

Scherer và cộng tác đã chứng minh rằng lợn và chim - chủ yếu là cò, diệc,
có thể cả vịt - là những ổ chứa virut và muỗi Culex là vectơ truyền virut giữa
các ổ chứa này và từ chúng truyền sang người. Trong trường hợp thể bệnh cảnh
lâm sàng rõ rệt cũng như trong trường hợp nhiễm không có triệu chứng ở lợn và
chim [46]. Muỗi Culex tritaeniorhynchus là vectơ truyền bệnh quan trọng nhất,
chúng đẻ trứng trên các đồng lúa nước, rãnh nước và ao hồ. Mật độ muỗi cao
nhất trong các tháng hè nóng, các loài muỗi khác cũng truyền virut VNNB như
Culex vishnui (Ấn Độ), Culex gelidus, Culex fuscocephalus (Malaysia, Thái
Lan), Culex annuilus (Đài Loan) và Culex annulirostris (Guam)[47, 59].
Ở vùng ôn đới, virut xuất hiện ở muỗi vào tháng 7 thì 1 đến 3 tuần sau ở
lợn và chim, người nhiễm virut vào vài tuần sau đó [27]. Ở vùng nhiệt đới chu
trình tuần hoàn virut VNNB giữa muỗi, chim và lợn có thể xảy ra quanh năm.
Ở Việt Nam, theo thống kê của viện VSDTTƯ từ năm 1980 đến nay cho
thấy virut VNNB được truyền ở quần thể lợn trong suốt năm như một chu kỳ
khép kín tạo thành ổ chứa virut gần người. Nhưng chỉ số mật độ muỗi Culex
tritaeniorhynchus tăng cao từ tháng 4 đến tháng 9 và tần số mắc bệnh VNNB
tăng cao từ tháng 5 đến tháng 7 [7]

8


Hình 1. 4: Chu trình tuần hoàn virut VNNB trong tự nhiên
Muỗi và lợn được xác định là vật truyền và ổ chứa virut VNNB quan
trọng đã gây ra các vụ dịch viêm não. Lợn còn được xác định là động vật khuếch
đại virut. Ở những vùng cận nhiệt đới như miền Bắc Việt Nam, dịch VNNB
thường xảy ra vào mùa hè, ngược lại ở những vùng nhiệt đới như miền Nam
Việt nam, các trường hợp VNNB xảy ra rải rác quanh năm. Trong mùa dịch, tỷ
lệ nhiễm virut VNNB trong quần thể lợn rất cao chiếm 82% trong tháng 6.
Ngược lại trong các tháng khác ngoài mùa dịch tần suất nhiễm virut VNNB
trong quần thể lợn rất thấp với tỉ lệ xác định dương tính trong quần thể lợn dao
động trong khoảng 1,96-14% [9].
Khả năng tồn tại qua mùa đông của virut VNNB ở các vùng ôn đới còn
chưa được sáng tỏ. Việc truyền virut VNNB do muỗi Culex và Aedes đã được
chứng minh trong phòng thí nghiệm và bằng các nghiên cứu thực địa [47]. Các
giả thiết khác cho rằng virut sống sót trong muỗi cái Culex tritaeniorhynchus
ngủ đông, tồn tại ở ve hoặc các vectơ khác, nhiễm virut dai dẳng ở động vật có
xương sống, hoặc chu trình được bắt đầu lại bởi các loài chim di cư. Ở Nhật Bản
người ta đã tìm thấy virut VNNB và kháng thể ở dơi [43,55]. Những con dơi
được gây nhiễm thực nghiệm rồi ngủ đông sẽ nhiễm virut dai dẳng và khi trời
ấm lên sẽ có đủ virut trong máu để muỗi có thể hút máu dơi và truyền virut sang

9
cho người [41]. Virut VNNB và kháng thể cũng được tìm thấy ở loài bò sát
nhưng vai trò của chúng trong sinh thái học bệnh VNNB còn chưa rõ [39].
1.3. Đặc điểm lâm sàng
VNNB là bệnh nhiễm trùng cấp tính hệ thần kinh trung ương bởi vậy các

triệu trứng chủ yếu là phản ánh tổn thương hệ thần kinh trung ương. Bệnh có thể
chia thành 4 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Thời kỳ ủ bệnh thường 6- 16 ngày, giai đoạn này không có
biểu hiện triệu trứng lâm sàng.
Giai đoạn 2: Thời kỳ khởi phát từ 2-4 ngày, với sốt cao đột ngột, đau đầu
buồn nôn và nôn sau đó có các biểu hiện tổn thương thần kinh.
Giai đoạn 3: Thời kỳ toàn phát: Bệnh nhân tiếp tục sốt cao co giật, giai
đoạn này có tổn thương thực thể ở não biểu hiện cứng gáy, Babinski (+), co giật
và đi vào hôn mê thường ngày thứ 5 đến ngày thứ 9.
Giai đoạn 4: Thời kỳ bình phục:
Nhẹ: Bệnh nhân qua khỏi, hồi phục chức năng vận động
Nặng: Bệnh nhân tiếp tục co giật, hôn mê sâu dẫn đến tử vong.
Bệnh VNNB có tỷ lệ tử vong cao, di chứng nặng nề. Có thể là liệt chi, liệt nửa
người, kém trí nhớ, động kinh thường xảy ra muộn hơn.
1.4. Chẩn đoán
1.4.1. Chẩn đoán lâm sàng: Chủ yếu dựa vào các triệu chứng lâm sàng như sốt
cao đột ngột, đau đầu, buồn nôn, nôn dấu hiệu Babinski (+) hay còn gọi là các
triệu chứng của viêm não do virut.
Chỉ dựa vào các triệu chứng lâm sàng thì rất dễ nhầm với các bệnh khác
như lao màng não, sốt rét ác tính thể não Để chẩn đoán xác định cần phải dựa
vào chẩn đoán phòng thí nghiệm.


10
1.4.2. Chẩn đoán phòng thí nghiệm
Vai trò chẩn đoán phòng thí nghiệm rất quan trọng, quyết định về kết quả
xác định căn nguyên, vì vậy cần có phòng xét nghiệm chuyên ngành về virut
học, hiện nay có rất nhiều kỹ thuật chẩn đoán, tuy nhiên tuỳ từng trường hợp cụ
thể mà ta tiến hành các kỹ thuật xét nghiệm khác nhau.
1.4.2.1. Lấy mẫu bệnh phẩm

* Lấy mẫu bệnh phẩm để chẩn đoán phòng thí nghiệm hết sức quan trọng.
Nó quyết định tác nhân gây bệnh, nếu lấy mẫu bệnh phẩm đúng quy định thì tỷ
lệ chẩn đoán sẽ cao và ngược lại.
- Lấy mẫu bệnh phẩm để phân lập virut:
* Ổ chứa virut (máu lợn, não chim ).
* Máu lợn lấy 2-4 ml.
* Véc tơ (muỗi Culex triaeniorlynchus) 20-50 con/mẫu.
* Người: + Lấy máu bệnh nhân từ khi có triệu chứng đầu tiên đến ngày
thứ 13 thì virut vào hết hệ thần kinh.
+ Nước não tuỷ sau khi mắc 1-3 ngày 2-4 ml.
+ Não tử thi: Lấy não tử thi sau khi chết không quá 6 giờ, bệnh
nhân chết sau khi mắc bệnh dưới 2 tuần, lấy các vị trí khác nhau: đại não, tiểu
não, các nhân xám (trong trường hợp không lấy được não có thể dùng kim chọc
hút qua khe sàng).
- Lấy mẫu bệnh phẩm để chẩn đoán huyết thanh:
+ Máu lợn để xác định sự lưu hành VNNB trong quần thể lợn.
+ Máu và nước não tuỷ của bệnh nhân nghi mắc VNNB.
Thông thường thì lấy máu kép để tìm động lực kháng thể (ELISA-IgG,HI).
Máu 1: Ngày khởi bệnh.
Máu 2: 2 tuần sau khi lấy máu 1.

11
Ngày nay có những kỹ thuật chỉ cần một mẫu máu cũng có thể cho kết
quả chính xác như kỹ thuật phát hiện sớm IgM bằng ELISA có thể chẩn đoán
sau khi mắc bênh từ 3-5 ngày. Kỹ thuật RT-PCR phát hiện ARN của virut
VNNB với cặp mồi đặc hiệu cho ta kết quả chính xác
1.4.2.2. Bảo quản bệnh phẩm:
Thường các mẫu bệnh phẩm sau khi lấy được chuyển về phòng xét
nghiệm càng sớm càng tốt.
Các bệnh phẩm phải được ghi đầy đủ tên, tuổi, địa chỉ, ngày mắc bệnh,

ngày chết (nếu là tử thi).
Bệnh phẩm phải được bảo quản cẩn thận tuỳ theo mẫu bệnh phẩm và mục
đích xét nghiệm. Các mẫu để chẩn đoán huyết thanh bảo quản 2-8 độ C. Các
mẫu lưu phải cất ở -20 đến -80 độ C. Các bệnh phẩm phủ tạng phải được bảo
quản trong dung dịch glyxerin 50% và trong nhịêt độ lạnh, tôt nhất là từ -20 đến
-80 độ C cho các mẫu phân lập.
Các mẫu muỗi phải được giữ trong điều kiện chúng vẫn còn sống.

12

Bệnh phẩm
Ổ chứa Vectơ Người bệnh
Máu lợn C.tritaeniorhynchus Não tử thi
Não chim, cò và những loài Nước não tuỷ
muỗi nghi ngờ Máu bệnh nhân



Xử lý
Theo thường quy phòng thí nghiệm
(Kỹ thuật xét nghiệm VSV- Y học 1991)



Phân lập


(1) (2) (3)
Tiêm truyền chuột ổ Gây nhiễm tế bào Tóm bắt kháng

1-2 ngày tuổi C6/36 nguyên

Chuột Chuột
liệt Tế bào bị huỷ hoại Phát hiện genom
không liệt sau 4 ngày CPE(+) hoặc CPE(-) của virut bằng phản
Sau 3 lần tiêm truyền ứng chuỗi Polymeraza
Tiêm truyền Chuyển tiếp trên tế bào phiên mã ngược

Huỷ sau Tiêm truyền CPE (+) CPE (-) Huỷ
14 ngày tiếp
theo dõi RT-PCR
Đ
ị
nh lo
ạ
i

Kháng thể đơn dòng với ELISA SANDWICH

Hình 1.5: Sơ đồ phân lập và định loại virut



13
1.4.2.3. Chẩn đoán huyết thanh
Trong chẩn đoán huyết thanh học có nhiều phương pháp- các phương
pháp cổ điển như ngăn ngưng kết hồng cầu (HI), kết hợp bổ thể (CF), phản ứng
trung hoà trên chuột Thập kỷ 80 và 90 của thế kỷ trước các kỹ thuật được sử
dụng nhiều là IF, ELISA, PRNT.
MAC-ELISA: WHO đã công nhận kỹ thuật MAC-ELISA là kỹ thuật

chuẩn thức trong chẩn đoán VNNB. Kỹ thuật MAC-ELISA (IgM antibody
capture ELISA) là kỹ thuật ELISA tóm bắt kháng thể IgM. Chỉ trong trường hợp
nhiễm virut vào hệ thần kinh trung ương làm thay đổi tính thấm của hàng rào
máu não, IgM mới vượt qua để làm nhiệm vụ bảo vệ hệ thống thần kinh trung
ương. Vì vậy, việc phát hiện kháng thể IgM kháng virut VNNB trong mẫu dịch
não tủy là bằng chứng cho thấy sự mới nhiễm virut. Đó là lý do khi phát hiện
IgM kháng virut VNNB trong dịch não tủy được coi là tiêu chuẩn vàng trong
chẩn đoán nhiễm virut VNNB [30, 31]. Kỹ thuật ELISA phát hiện IgM trong
chẩn đoán huyết thanh học được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán bệnh VNNB. Kỹ
thuật này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể chẩn đoán phân biệt được với sự
nhiễm các virut trong cùng một họ. Chính vì vậy kĩ thuật này đã được ứng dụng
rộng rãi trong chẩn đoán xác định các virut Arbo [9, 10].
Ngăn ngưng kết hồng cầu: Là kỹ thuật cổ điển để thực hiện đối với những
phòng thí nghiệm không có đủ điều kiện, cần phải lấy máu 2 lần để tìm động lực
kháng thể. Nhược điểm của phương pháp này là miễn dịch chéo với các
Flavivirus khác.
Kết hợp bổ thể: Kỹ thuật này có độ đặc hiệu trung bình, kháng thể kết hợp
bổ thể thường xuất hiện muộn, phản ứng này bổ xung cho HI.
Miễn dịch huỳnh quang: Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
thường dùng kỹ thuật này để phát hiện virut trong mẫu thử có nhiễm virut. Phát
hiện được nhanh, độ đặc hiệu cao nhưng đòi hỏi trang thiết bị và sinh phẩm.

14
Phản ứng trung hoà:
Là phản ứng đặc hiệu nhất dùng để chẩn đoán huyết thanh học Arbo virut.
Thông thường người ta thường dùng kỹ thuật trung hoà giảm đám hoại tử trên tế
bào nuôi một lớp. Tuy nhiên có thể sử dụng kỹ thuật trung hoà trên động vật thí
nghiệm đặc biệt là kỹ thuật trung hoà trên chuột.
Kháng thể trung hoà nói chung được tăng dần lên ngay từ những ngày đầu
của bệnh đỉnh cao sau hai tuần sau đó giảm dần và kéo dài nhiều năm.

Độ nhạy cảm của phản ứng tương đương thử nghiệm HI và IF nhưng tính
đặc hiệu cao.
Tóm lại: Các thử nghiệm để chẩn đoán virut VNNB rất phong phú, trong
thực tế tuỳ từng mục đích, điều kiện mà ta có thể lựa chọn thử nghiệm nào cho
thích hợp.
1.5. Bệnh lý học và sinh bệnh học
Giữa các chủng virut VNNB có sự khác nhau đáng kể ở khả năng gây độc
hại thần kinh và khả năng gây bệnh thực nghiệm cho chuột. Các điểm nhân lên
và lan toả của virut trên chuột đã được Huang và Wong mô tả. Những điểm đặc
trưng cho bệnh lý học của bệnh VNNB đã được Miyake và Shiraki [50] mô tả.
Trong suốt giai đoạn cấp người ta thường thấy có xung huyết, phù và những
xuất huyết nhỏ ở não. Những tổn thương vi mô như thoái hoá tế bào thần kinh
và hoại tử, viêm thực bào thần kinh, các hạch thần kinh đệm và viêm quanh
mạch. Những biến đổi này xảy ra ở chất xám và ảnh hưởng trước tiên lên não
trung gian, não giữa và các cấu trúc não. Có thể có sự phá huỷ các tế bào Purkije
của tiểu não. Hàng loạt những biến đổi bệnh lý ở các mô ngoài thần kinh cũng
được nhận thấy gồm sự tăng sản các trung tâm điểm hệ thống hạch bạch huyết,
viêm cơ tim mô kẽ, sưng và thay đổi albumin ở các tế bào Kupffer ở gan, viêm
phổi và xuất huyết ở thận. Khi nghiên cứu các trường hợp tử vong người ta thấy
lượng virut cao nhất ở trong các tế bào thần kinh vùng đồi thị và thân não.

15
Nhiễm virut qua nhau thai ở lợn dẫn đến kết quả sẩy thai và đẻ non, thai
bị sẩy có những tổn thương ở não. Virut VNNB cũng làm giảm và vô tinh hoàn
ở lợn đực. Những thay đổi bệnh lý của tổ chức gồm viêm mào tinh hoàn, ngừng
sinh tinh dịch và viêm bao tinh hoàn. Nhiễm virut qua nhau thai ở người cũng
dẫn đến kết quả sẩy thai và phân lập được virut từ thai nhi. Tiêm phúc mạc cho
chuột chửa cũng truyền virut cho chuột bào thai và thường dẫn đến sẩy thai.
Trong bệnh VNNB có nhiều trường hợp nhiễm trùng ẩn, nhiều người bị
nhiễm virut mà không mắc bệnh. Người ta cho rằng các yếu tố sau ảnh hưởng

đến khả năng nhiễm virut và khả năng gây bệnh:
- Đường truyền virut bởi vectơ muỗi, nghĩa là virut được truyền vào máu
rồi tới hệ thần kinh trung ương hay vào các tổ chức dưới da mà ở đó chúng được
nhân lên trước khi vào mạch máu.
- Số lượng virut được truyền do muỗi.
- Sự khác nhau về khả năng đề kháng của mỗi người liên quan đến lứa
tuổi mà ảnh hưởng đến việc sinh interferon hoặc kháng thể.
1.6. Văcxin viêm não Nhật Bản
1.6.1. Những khía cạnh chung của phương pháp tiêm phòng bằng văcxin
Cơ thể sống có nhiều cơ chế bảo vệ chống nhiễm trùng trong đó quan
trọng nhất là miễn dịch dịch thể có được do các kháng thể và miễn dịch qua
trung gian tế bào do các tế bào lympho phụ thuộc tuyến ức được hoạt hoá. Hai
cơ chế bảo vệ chống lại vi sinh vật này tác động bằng hai cách khác nhau.
Cơ thể sống có những quần thể tế bào lympho, một số ở trong máu ngoại
vi, số khác cư trú trong các hạch bạch huyết, lách, tuyến ức, hoặc trong các tổ
chức khác nhau. Chúng được phân loại thành 2 nhóm: lympho bào B và lympho
bào T .
Trước tiên các tế bào nguồn từ tuỷ xương di cư đến tuyến ức, chúng
được "gia công" và trở nên có thẩm quyền miễn dịch, sau đó các tế bào lympho
T chín đi vào máu rồi cũng cư ngụ tại các vùng phụ thuộc tuyến ức của lách và

16
hạch. Các tế bào này được gọi là lympho bào phụ thuộc tuyến ức hay tế bào
lympho T, chúng có vai trò chủ yếu trong đáp ứng qua miễn dịch trung gian tế
bào. Nhóm lympho bào B cũng được biệt hoá từ tế bào nguồn. Trước tiên các tế
bào nguồn được biệt hoá thành tiền lympho bào B. Tiền lympho bào B được biệt
hoá thành lympho B chưa chín, sau đó lympho B chưa chín được biệt hoá thành
lympho B chín, các lympho bào B chín sẽ biến thành các tế bào plasma là nơi
sản xuất và tiết ra các kháng thể. Diễn biến của quá trình này phụ thuộc vào sự
kích thích của kháng nguyên và sự hợp tác của các lympho bào T hỗ trợ. Các

kháng nguyên sau khi vào cơ thể sẽ chọn lọc và gắn với các lympho bào B chín
để có những thụ thể thích hợp. Việc kháng nguyên gắn với lympho bào B là một
trong những điều kiện cơ bản cho sự phát triển một đáp ứng miễn dịch.
Các kháng thể được chia thành nhiều lớp, đó là IgM, IgG, IgA, IgD và
IgE dựa theo cấu trúc phân tử của chúng. IgG và IgM là các kháng thể phổ biến
nhất tuần hoàn trong máu, trong khi đó các phân tử IgA thường được tạo thành ở
ruột, đường hô hấp và chỉ có một lượng rất nhỏ trong máu.
Sau lần tiếp xúc đầu tiên với một kháng nguyên (do nhiễm khuẩn hoặc
tiêm chủng), cơ thể có phản ứng lần thứ nhất để hình thành kháng thể. Đó là một
đáp ứng hạn chế, cường độ yếu và ngắn hạn (hình 1.6). Kháng thể xuất hiện
trong máu hầu hết gồm IgM và IgG. Phân tử IgM được tổng hợp sớm và sau đó
mất đi, trong khi phân tử IgG tồn tại trong máu một thời gian khá dài. Trong đáp
ứng lần thứ nhất này, các tâm điểm mầm phát triển thành các nhóm lympho bào
khu trú trong tổ chức lympho (gọi là các nang lympho), trong khi đó các tế bào
plasma gia tăng ở tiếp điểm vỏ - tuỷ và trong các giây tuỷ. Trong lần tiếp xúc
sau với kháng nguyên, thì cơ thể có đáp ứng lần thứ 2 ; kháng nguyên sẽ khu trú
trong các tâm điểm mầm và trong vùng tuỷ của các hạch lympho, và các tế bào
plasma được gia tăng phát triển mạnh mẽ. Đáp ứng lần thứ 2 này mạnh hơn đáp
ứng lần thứ nhất rất nhiều, và kháng thể có thể được hình thành liên tục trong
nhiều tháng hoặc trong nhiều năm liền. Đáp ứng lần thứ 2 chủ yếu là IgG. Các
IgM cũng được hình thành, nhưng rất ít và trong thời gian rất ngắn. Người ta

17