bài giảng về PCR (polymerase chain reaction)

PCR (polymerase chain reaction)

Chương II
Taq polymerase
Các bước PCR
1 phản ứng PCR
Nguyên tắc máy
PCR
Làm thế nào để
phân lập được
gen

I. Giới thiệu
Kary Mullis 1985
Nobel 1993

Giới thiệu

PCR: phản ứng chuỗi trùng hợp

Là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn DNA
với tốc độ nhanh, có độ chính xác cao, khơng
cần sự hiện diện của tế bào

Phản ứng PCR cho phép khuyếch đại
một đoạn DNA nằm giữa 2 mồi chuyên
biệt, nhờ men DNA polymerase

Nguyên tắc
•

Dựa trên sự hoạt động của emzyme
•
Sự hiện diện của mồi chuyên biệt
•
Khả năng nối dài mồi của taq polymerase
•
Các nu tự do trong môi trường

Máy PCR

Thực nghiệm

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ mỗi chu
kỳ gồm 3 bước

Bước 1: Biến tính (denaturation)

94-98
o
C

2-5 phút

Bước 2: Gắn mồi (anneealing)

30-65
o
C

20s-2’


Bước 3: kéo dài (extending)

68-72
o
C

20s-5’

Thực nghiệm
/>
III. THỰC NGHIỆM
/>
III. THỰC NGHIỆM
/>
Mồi (primers)
Mồi (primers)
= oligonucleotide đơn mạch (18-24 b) bổ sung với 2 vùng trên trình tự DNA
Mồi xuôi (sense primer hoặc Forward) bắt cặp với mạch khuôn của DNA
và sẽ kéo dài theo chiều phiên mã
Mồi ngược (anti sense primer hoặc Reverse) bắt cặp với mạch mã của
DNA và sẽ kéo dài ngược theo chiều phiên mã
5’
3’
3’
5’
3’ 5’ 5’
3’

THIẾT KẾ MỒI


Nguyên tắc

Trình tự của mồi được thiết kế sao cho không có sự bắt
cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược, kể cả cấu trúc kẹp tóc

Nhiệt độ gắn mồi của mồi xuôi và mồi ngược không được
chênh lệch quá xa (Không nên quá nhiều G hoặc C nối
tiếp nhau thường tỷ lệ G, C nằm trong khoảng 30%<
G+C<70%))

Không nên nhiều bắt cặp sai với DNA khuôn

Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần
khuyếch đại không trùng với các trình tự lặp lại trên
DNA

Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn
(<3000 tốt nhất là dưới 1000)

THIẾT KẾ MỒI
Cách thiết kế mồi:

Mồi xuôi: cùng trình tự với mạch mã

Mồi ngược: là trình tự ngược và bổ sung
với mạch mã

Cách tính Tm (nhiệt độ gắn mồi)
Tm = 4(G+C) + 2(A+T)

Polymerase chòu nhiệt
Polymerase chòu nhiệt
Taq-polymerase : từ Thermus aquaticus
Nhiệt độ tối ưu : 72°C
Có hoạt tính 5'->3' polymerase
Có hoạt tính terminal transferase : thêm 1 Adenosine ở đầu 3’
của mạch DNA mới.
Không có khả năng sửa sai (2x10
-5
, 0.25% sai sau 30 chu kỳ)
Sao chép ~ 2000b/min. Không sao chép được trên 3kb
Pfu-polymerase : từ Pyrococcus furiosus
Nhiệt độ tối ưu : 72°C
Có hoạt tính 5'->3' polymerase và 3’-> 5’ exonuclease
Tỷ lệ chép sai thấp (1.5x10
-6
)
Sao chép ~ 500b/min

Buffers

Có nhiều loại buffer sử dụng riêng cho
từng loại enzyme.

Một số buffer chứa chất hoạt động bề
mặt có thể ảnh hưởng đến các phản
ứng

Nhiều loại buffer đã có sẵn ion Mg2+

Nồng độ Mg2+ và dNTP

Nồng độ ion Mg2+ cao: xuất hiện thêm các sản phẩm
không đặc hiệu.

Nồng độ ion Mg2+ thấp: lượng sản phẩm PCR thấp.

Nồng độ ion Mg2+ phụ thuộc vào loại DNA polymerase,
DNA mẫu và thành phần buffer

gradien nồng độ từ 0.5 đến 2 mM với các khoảng cách
mỗi bước là 0.2 mM.

dNTPs là loại hóa chất kém bền

Lượng dNTP tối ưu là 200 µM of mỗi loại dNTP. Việc
tăng dNTP không làm tăng đáng kể lượng sản phẩm
PCR so với việc hiệu chỉnh các yếu tố khác

Chất khác

Đối với các DNA template lớn, giàu GC
thì có thể sử dụng các chất biến tính
như DMSO, formamide, glycerol, and
betaine trong thành phần PCR.

Tăng lượng DMSO trong PCR sẽ cần
giảm nhiệt bắt mồi xuống.


Dầu khoáng

CÁC CHỈ TIÊU ẢNH HƯỞNG ĐẾN PHẢN ỨNG PCR

1. DNA mẫu: (100ng-1µg)

2. Enzyme

3. Mồi và nhiệt độ gắn mồi (nhiệt độ lai)

4. dNTP: 20-200µM/ mỗi lọai nu

5. Nồng độ Mg++

6. Số lượng chu kỳ phản ứng

7. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng

Một số vấn đề thường gặp

Không có sản phẩm hoặc lượng sản
phẩm quá thấp

Kiểm tra lại DNA mẫu, thao tác

Tăng thời gian kéo dài, số chu kỳ, nhiệt độ
biến tính

Hạ nhiêt độ gắn mồi


Primer, buffer

Một số vấn đề thường gặp

Vệt smear kích thước lớn hơn sản phẩm
mong muốn

Giảm DNA, thời gian kéo dài, số chu kỳ

Tăng nhiệt độ gắn mồi

Thay đổi nồng độ Mg2+

Tăng thời gian kéo dài nếu sp mear có kt
nhỏ


Băng sản phẩm phụ rõ nét với kích thước thấp
hơn sản phẩm mong muốn

Tăng nhiệt độ bắt mồi 2°C và/hoặc tăng thời gian bắt
mồi

Tăng thời gian kéo dài thêm 30s.

Giảm nồng độ DNA polymerase.

Tối ưu hóa nồng độ Mg2+.

Tinh sạch DNA template


Giảm nồng độ primer.

Thiết kế cặp primer mới.
Một số vấn đề thường gặp


Real-time PCR
Real-time PCR

Một máy luân nhiệt

Một hệ thống phát và đọc tín hiệu huỳnh quang

Chương trình vi tính để theo dõi và phân tích kết quả

Quá trình nhân bản sao ADN
Quá trình nhân bản sao ADN
trong một phản ứng PCR
trong một phản ứng PCR
Thềm phát
hiện
Pha log
Pha bình nguyên
Pha chậm
Số lượng ADN
Trong pha Log : Q
n
= Q
0

(E)
n
Q
n
= Số bản sao sau n chu kỳ
Q
0
= Số bản sao khởi đầu
E = Hiệu suất PCR
n = số chu kỳ