phương pháp sắc ký khí lỏng hiệu suất cao (hplc) và những vấn đề cần nghiên cứu ứng dụng

Phương pháp sắc ký khí lỏng
hiệu suất cao (HPLC) và những vấn
đề cần nghiên cứu ứng dụng
Mở đầu
Nước là tài nguyên phổ biến nhất trên trái đất che phủ khoảng 71% bề
mặt trái đất (khoảng 361 triệu m
3
) trữ lượng nước được ước tính khoảng 1,5
tỷ m
3
. Trong đó nước ngọt chỉ chiểm 28,25 triệu km
2
(1,88% thủy quyển).
Nước đồng nghĩa với sự sống,nó là thành phần chính của các vật thể sống. ở
người nước chiếm từ 60 đến 70% trọng lượng cơ thể,ở trong một số loại sinh
vật biển có khi lượng nước lên tới 90%. Nước tham gia vào thành phần sing
quyển và điều hoá các yếu tố khí hậu, đất đai, sinh vật Thông qua chương
trình vận động của nó.
Cùng với sự phát triển của văn minh nhân loại, nhu cầu nước ngày càng
lớn. Hiện tại toàn bộ lượng nước sử dụng trong sinh hoạt, công nghiệp và
nông nghiệp, lượng nước sử dụng cho nhu cầu này thải ra ngày càng lớn,
gây ô nhiễm đáng kể đến nguồn nước và môi trường. Nước thải đưa vào nước
các loại hoá chất khác nhau, từ trạng thái tan hoặc huyền phù, nhò tương đến
các loại vi khuẩn. Mặt khác khi thải vào nước do tương tác hoá học của các
chất mà tạo nên các chất mới ngăn cản quá trình làm sạch nước và ảnh hưởng
đến sự sống của các sinh vật trong nước.
Quá trình đô thị hoá, công nghiệp và nông nghiệp hoá thâm canh càng
phát triển thì tình trạng ô nhiễm nguồn nước mặt, nước ngầm đã xuất hiện ở
nhiều nước, nhiều nơi và ngày càng trở nên nghiêm trọng. Sự ô nhiễm nước
không chỉ đơn thuần là do vi sinh vật và các chất hưu cơ dễ phân huỷ, mà còn
do nhiều chất hưu cơ khác, các sản phẩm dầu, các chất tẩy rửa các chất phóng

xạ Đó là các chất độc hại gây nguy hiểm cho sức khoẻ con người và mọi
sinh vật sống. Trên góc độ môi trường phenol và các dẫn xuất của phenol
được xếp vào loại chất gây ô nhiễm. đây là nhóm tương đối bền , có khả năng
tích luỹ trong cơ thể sinh vật và có khả năng gây nhiễm độc cấp tính, mãn tính
cho con người. Khi xâm nhập vào cơ thể các phenol nói chung và Clophenol
nói riêng gây ra nhiều tổn thương cho các cơ quan và hệ thống khác nhau
nhưng chủ yếu là tác động lên hệ thần kinh, hệ thống tim mạch và máu. Do
vậy việc nghiên cứu, xác định sự có mặt của phenol, clophenol và các dẫn
xuất khác của nó để tìm cách loại bỏ nó là điều quan trọng và đặc biệt cần
thiết. Việc phân tích xác định mức độ ô nhiễm môi trường do phenol và các
clophenol gây ra đã được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới quan tâm và
nghiên cứu. Cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ (US - EPA) và cộng đồng Châu
Âu đã có những quy định chung cho quy trình chuẩn phân tích đối tượng này.
các phương pháp phân tích xác định phenol và các clophenol thông thường
gồm 2 giai đoạn.
1.Sử dụng kỹ thuật tách chiết và làm giàu. Sö dông kü thuËt t¸ch chiÕt vµ
lµm giµu.
- Chiết láng lỏng trực tiếp từ nước bằng dietylete hoặc
diclometal.
- Cất lôi cuốn hơi nước.
- Kỹ thuật sục khí và bẫy chất phân tích lại.
- Kỹ thuật sục khí tuần hoàn.
- Chiết pha rắn với các chất hấp thụ, XAD-2, XAD-4, C
6
,
C
8
, C
18
,

2.Sử dụng các phương pháp định lượng Sö dông c¸c ph¬ng ph¸p
®Þnh lîng nh:
- Sắc khí lỏng hiệu năng cao với detector quang (uv) và
huỳnh quang (RF).
- Sắc kí khí với detector ion hoá ngọn lửa (FID), Bắt giữ
điện tử (ECD) và khối phổ (MS).
- Phân tích dòng chảy (FIA).
- Trắc quang.
Các quy trình phân tích này đều có thể áp dụng vào điều kiện ở nước ta.
Trong khuôn khổ luận văn này chúng tôi muốn nghiên cứu xây dựng
một quy trình để xác định các clophenol trong nước bao gồm các bước sau:
- Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn để tách và làm giầu
các clophenol trong nước.
- Sử dụng kỹ thuật tách sắc kí lỏng hiệu năng cao với detector
(UV-VIS) để định lượng chúng đồng thời áp dụng để phân tích
một số mẫu thực tế tại một số khu vực thuộc địa bàn Hà Nội.
Tuy nhiên, do điều kiện hạn chế của phòng thí nghiệm nên chúng
tôi chỉ nghiên cứu với 5 clophenol bao gồm (dẫn xuất từ mono
cho đến penta): 2. Clophenol; 2.4 Di clophenol; 2.4.6 Tri
clophenol; 2.3.4.6 Tetra clophenol; Penta clophenol.
Chương I
Tổng quan
1.1 Giới thiệu về các dẫn xuất có clo của phenol
1.1.1Khái niệm Kh¸i niÖm
Các clophenol gồm một dẫy các hợp chất hoá học, chất đại diện đầu
tiên là Hidroxybenzen được Runge tìm thấy năm 1943 khi chưng cất phân
đoạn nhựa than đá. Do mang tính axit nên hợp chất này còn được gọi là
axitcacbolic hoặc axit phelic. Và về sau để thể hiện nó với ancol người ta gọi
nó là "phenol" [4 ]
Các clophenol là hợp chất hữu cơ được tạo thành bằng cách thay thế

một hay nhiều nguyên từ Hidro trong vòng thơm của phân tử phenol bằng các
nguyên tử clo
Công thức tổng quát: C
6
H
5-n
Cl
n
OH với n = 1-> 5 víi n = 1-> 5
Công thức cấu tạo của các clophenol nh sau:
X
Với X = 1 -> 5 nguyên tử clo.
Các phân tử clophenol lập thành dãy 19 chất gồm các mono, di ,tri,
tetra và một pentaclophenol.
1.1.2 Tính chất vật lý hoá học của các clophenol
Ở nhiệt độ phòng , hầu hết các clophenol ở trạng thái rắn có cấu trúc
tinh thể ngoại trừ o-clophenol (2.clophênol). Các chất này có mùi khá mạnh .
Ýt tan trong nước, thay đổi từ 2,1.10
-2
mol/lít với o-clophenol cho tới 7.10
-9
mol/lít với 2.3.4.6 tetraclophenol, nhưng chúng dễ dàng tan trong một số dung
môi hưu cơ như: metanol, ête, diclometan, axetonitril, [13]
Các clophenol trong dung dịch nước có tính axit. Tính chất này tăng lên
khi số lượng clo thế trong vòng benzen tăng lên. Do có tính axit nên trong
môi trường kiềm các clophenol tạo thành các muối tương ứng tan tốt hơn các
clophenol ban đầu.
Bảng 1: Tính chất vật lý của các Clophenol
T
T

Tên hợp chất Ký hiệu Khối lượng
Phân tử
Nhiệt độ
sôi
C
o
(760
mHg)
Nhiệt độ
nóng
chảy C
o
(760
mHg)
1 2-Clophenol 2.CP 128.56 174.9 9
2 2.4 Diclophenol 2.4 DCP 163.00 210.0 45
3 2.4.6 Triclophenol 2.4.6
T
3
CP
197.45 246.0 69.5
4 2.3.4.6 Tetraclophenol 2.3.4.6
T
4
CP

231.89 150
15
70
5 Pentaclophenol PCP 266.34 309->310 190->191

1.1.3. ứng dụng của các clophenol
Ngay từ đầu thập kỷ 30, các clophenol đã được tổng hợp trong công
nghiệp để sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau. Trong công nghiệp sản
xuất thuốc bảo vệ thực vật, diclophenol và triclophenol được sử dụng để sản
xuất các chất diệt cỏ nhóm phenolxy như: 2.4-D; 2.3.5-T. Các tetraclophenol
và triclophenol được dùng làm thuốc diệt khuẩn, diệt nấm mốc và tẩy uế,
khử trùng, pentaclophenol và các tetraclophenol được sử dụng để tẩm tre, gỗ
nhằm chống mối mọt và chống mốc, ngoài ra các clophenol còn được sử
dụng trong công nghiệp da, dày, vải, sợi và làm chất trung gian trong quá
trình sản xuất thuốc nhuộm, thuốc chữa bệnh.
1.1.4Độc hại của clophenol đối với người và động vật §éc
h¹i cña clophenol ®èi víi ngêi vµ ®éng vËt
1.1.4.1.Độc hại của clophenol với động thực vật §éc h¹i cña clophenol víi
®éng thùc vËt
Các clophenol với số nguyên tử clo khác nhau có mức độ độc hại khác
nhau đối với các loại động thực vật. Nhiều thí nghiệm đã chỉ ra rằng độ độc
hại của clophenol đối với các loài sinh vật tăng theo mức độ clo hoá vòng
thơm và độ độc tính của chúng cũng thay đổi rõ rệt theo pH của môi trường.
Ở pH thấp, các clophenol duy trì ở dạng phân tử và dễ dàng đi qua màng tế
bào. Khi pH tăng độc tính của các clophenol giảm rõ rệt, ảnh hưởng này đặc
biệt quan trọng khi số lượng các nguyên tử clo có mặt trong vòng khác nhau.
c tớnh ca clophenol thay i ph thuc vo s lng nguyờn t clo
cú mt trong vũng thm. Cỏc clophenol cú ít nguyờn t clo gõy ra nhng ri
lon, cũn cỏc clophenol cú nhiu nguyờn t clo s nh hng ti quỏ trỡnh
pht phỏt hoỏ trong c th sinh vt.
Hỡnh 1: Biu hin tỏc ng ca clophenol núi riờng v ca phenol núi
chung i vi qun th sinh hc
-Farquahanrsen v cng s ó nghiờn cu nhng nh hng ca phenol
lờn chut cho thy khi tiờm 2,6 - DCP v 2, 4, 6 - T
3

CP lm chut b ri lon
nh run ry, mt phn x t nhiờn, thm chớ b ri lon trm trng vi 2,3,6 -
T
3
CP kốm theo thay i nhit c th. Khi tiờm T
4
CP v PCP thỡ dn n
tỡnh trng ngt th hoc cht sau thi gian ngn do thiu oxi. Khi tiờm
pentaclophenol vi hm lng 10 n 20 ppm cho thy 90% cht c c
thi ra khi c th chut, cũn li ch yu c tớch lu trong thn, gan v
mỏu. Thn b tn thng sau khong thi gian t 20 n 40 giờ, gan b tn
thng sau 3 dn 5 ngy.
Nghiờn cu ó ch ra rng hu nh cỏc mono - , di - , triclophenol cú c
tớnh va phi khong 23-400àg/kg trng lng. Cỏc clophenol cú ít nguyờn
t clo cú c tớnh gn ging phenol. Cũnvi T
4
CP v PCP thỡ c tớnh mnh
hn khong 10-40mg/kg trng lng.
Biểu hiện tác động của các clophenol
nói riêng và phenol nói chung đến
quần thể sinh học
Mất ph!ơng h!ớng
trong chuyển động
Mất phản xạ trong
điều chỉnh cân bằng
cơ thể
Mất tính năng bơi lội
trong n!ớc, ngừng hô
hấp và chết
1.1.4.2. Sự độc hại của clophenol đối với người

Các clophenol có mùi rất đặc trưng và có độc tính mạnh. Chúng có khả
năng làm ngưng tụ protein và làm bỏng nặng trên da. Biểu hiện của triệu
chứng nhiễm độc có clophenol là: chóng mặt, nôn mửa, rối loạn tim mạch, tê
liệt cử động, hôn mê, nước tiểu trở nên xanh nhợt hoặc có màu tro, nhiệt độ
cơ thể thay đổi, đặc biệt T
4
CP và PCP làm da xanh xám lại, co thắt một thời
gian ngắn trước khi chết.
Hỡnh2: Biu hin tỏc ng ca cỏc clophenol v phenol i vi c th con
ngi

1.2. Ngun thi cỏc clophenol vo mụi trng
1.2.1. Ngun t nhiờn
Mt số clophenol c phỏt hin trong mụi trng cú ngun gc t
cỏc nha cõy, nha than ỏ v trong mt s loi sinh vt. Trong nha cõy, cỏc
sn phm phenol l kt qu ca quỏ trỡnh phõn hu cỏc hp cht thiờn nhiờn
cú cu trỳc khỏc nhau bng con ng vi sinh vt. Trong than ỏ loi antraxit,
hm lng cỏc phenol cú th lờn ti 0,001%. Trong mt s loi sinh vt 2, 4 -
diclophenol c phỏt hin trong nm penicilium, 2,6 - iclophenol úng vai
Bỏng
nặng
trên
da
Qua
đờng
tiêu
hoá
Biểu hiện tác động của các clophenol và
phenol đối với cơ thể con ng!ời
Nhiễm độc Hậu quả khác

Chóng
mặt
Nôn
mửa
Tê liệt
tim
mạch
N!ớc
tiểu có
màu
Tử
vong
Ng!ng
tụ
protein
Ngộ
độc
Qua
đ!ờng
hô hấp
Qua
da
trò nh mét phenomon của một số loài phát ra. Lượng lớn các hợp chất
clophenol được phát hiện trong môi trường có nguồn gốc tự nhiên .
1.2.2. Nguồn nhân tạo
Vào thập kỷ 70, sản lượng hàng năm của clophenol trên toàn thế giới
ước tính khoảng 200 nghìn tấn, và chủ yếu là 2,4 - diclophenol và 2, 3,4, 6 -
tetraclophenol. Các nước sản xuất clophenol chủ yếu là Mỹ, Nhật, Anh, Thuỵ
Điển. Đến cuối thập kỷ 70, khi các nghiên cứu về độc tính của clophenol khá
đầy đủ thì một số nước phát triển đã đề ra quy định về việc hạn chế sử dụng

loại hợp chất này và do đó sản lượng có giảm rõ rệt.
Trong công nghiệp clophenol được tổng hợp theo hai con đường:
(1) Clo hoá trực tiếp phenol để tạo ra các clophenol hoặc polyclophenol
với sự có mặt của xúc tác và ở nhiệt độ cao.
(2) Thuỷ phân các clobenzen trong dung môi metanol, etylenglycol hoặc
một số dung môi khác.
Các chất được sản xuất theo con đường thứ nhất là: 2 - MCP; 4 -
MCP; 2,4 - DCP; 2,6 - DCP; 2,4,6 - T
3
CP; 2,3,4,6 - T
4
CP; PCP. Quá trình clo
hóa không định lượng thu được một nhóm các clophenol khác nhau. Theo con
đường thứ hai, người ta sản xuất được 2,5 - PCP; 3,4 - DCP; 2,4,5 - T
3
CP;
2,3,4,5 - T
4
CP và PCP. Cả hai con đường này đều sinh ra những chất gây ô
nhiễm khác nhau có hại cho sức khoẻ con người. ở nước ta do việc sử dụng
các loại thuốc trừ sâu, diệt cỏ một cách bừa bãi , không được kiểm soát chặt
chẽ của các cơ quan chức năng. Mặt khác các clophenol còn được thải ra ở
nhiều nhà máy xí nghiệp, chưa xử lý nguồn nước thải một cách đúng
đắn.Những nguồn này gây ra sự ô nhiễm rất lớn cho môi trường nước của
chúng ta.
1.3. Một số phương pháp chiết, tách làm giàu clophenol
1.3.1. Kỹ thuật sục khí và bẫy lạnh (Purge and trap) [15]
Hình 3: Thiết bị sục khí và bẫy lạnh
Với kỹ thuật này, các chất hữu cơ được chuyển từ pha lỏng lên pha
hơi do khí sục qua mẫu dưới áp suất khí quyển. Hơi chất hữu cơ được cuốn

theo dòng khí mang đi tới bẫy hấp phụ và bị giữ lại tại đây. Sau khi quá trình
sục khí và hấp phụ hoàn thành, bẫy được gia nhiệt nhanh tới khoảng 180
o
C,
sử dụng dòng khí trơ có tốc độ 20-60ml/phút trong thời gian 4 phót để đẩy các
chất hữu cơ hấp phụ trên bẫy vào cột sắc ký (có thể sử dụng thêm bẫy lạnh để
cô đặc mẫu trước khi đưa vào cột sắc ký). Giới hạn phát hiện của phương
pháp phụ thuộc vào hiệu suất của quá trình tách chất bằng kỹ thuật sục khí
bẫy lạnh và độ nhạy của thiết bị phân tích sắc ký.
1.3.2. K thut sc khớ tun hon (Closed - loop stripping tecnique) [15]
K thut sc khớ tun hon c giỏo s Grob gii thiu ln u tiờn vo
nm 1973 xỏc nh cỏc cht hu c d bay hi trong nc. V bn cht,
phng phỏp ny cú nguyờn tc ging nh phng phỏp sc khớ v by gi cht
phõn tớch li.
Hỡnh 4: Thit b sc khớ tun hon CLSA
Vi k thut ny, dũng khớ i qua bm ti bỡnh mu v c phõn tỏn
vo nc di dng bt. Mt phn hi cht hu c c cun theo dũng khớ
ra khi mu di ti by hp th lm bng than hot tớnh v b gi li ti õy.
Dũng khớ sau khi by than li c tun hon qua bm v sc vo mu nc.
Quỏ trỡnh ny c lp i li li t 2 n 4 giờ.
Sau khi quỏ trỡnh sc khớ tun hon v hp ph hon thnh, by than
c ly ra. Cỏc cht hu c hp ph trờn by than c ra gii bng một
1
2
6
4
5
3
Chú thích
1. Bơm tuần hoàn

2. Đầu phân tán khí
3. Bình mẫu
4. Bình điều nhiệt
5. Bẫy than hoạt khí
6. Lò nhiệt
lượng nhá dung môi khoảng 20µl. Dung môi rửa giải thông thường là CS
2
.
Ngoài ra, quá trình giải hấp còn có thể được thực hiện theo phương pháp nhiệt.
Mẫu rửa giải ra sẽ được cho đi qua thiết bị sắc ký để định tính và định lượng.
[16]
Đây là một phương pháp có hiệu quả để phân tích các hợp chất dễ bay
hơi trong nước, đặc biệt là khi phân tích các hợp chất có hàm lượng rất nhỏ
trong nước vì nó có khả năng làm giàu lớn. Nếu hiệu suất thu hồi của cả quá
trình là 10% thì hệ số làm giàu sẽ là 25.000 lần đối với các hợp chất kém bay
hơi(họ phenol), phương pháp này cho hiệu suất thu hồi thấp vì khả năng
chuyển lên pha hơi của chúng là kém hơn và cùng với nó ta phải tăng nhiệt độ
của qúa trình sục khí và hấp phụ nên giảm khả năng hấp phụ của bẫy than.
Giới hạn phát hiện của phương pháp này khoảng 0,1 - 100ng/l khi xác định
các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi, còn với họ phenol độ nhạy phát hiện khoảng
µl/l
1.3.3. Phương pháp chiết láng - lỏng trực tiếp từ nước
Theo quy trình chuẩn của cơ quan bảo vệ Môi trường Mỹ (EPA) sè 604
và 625, phenol và các dẫn xuất của chúng trong nước ngầm hoặc nước thải
được làm giàu bằng phương pháp chiết - láng trực tiếp với dung môi
diclometan. Sau đó, các hợp chất được định tính và định lượng bằng kỹ thuật
sắc ký khí với detector ion hoá ngọn lửa(FID) hoặc detector khối phổ (MS),
hoặc bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC) với detector UV hoặc
huỳnh quang. Phương pháp này sử dụng chất nội chuẩn 2,4,6 - triclophnol -
13

C
6
với GC và 2,4 - dibromphenol với HPLC. Các phenolat đều được dẫn
xuất hoá dưới tác nhân anhidrit axetic thành dạng phenolaxetat. Độ thu hồi
của phương pháp từ 40-89% và giới hạn phá hiện từ 1-10ng/l [14].
Theo ISO - 8165 -1, các phenol có thể được chiết trực tiếp từ pha nước
(không qua lọc) bằng dietylete, cô cạn, làm giàu và làm sạch qua cột
selicagel. Sau đó, chúng được định tính và định lượng bằng sắc ký khí với
detector FID hoặc FPD [20].
1.3.4. Phương pháp chưng cất
Phương pháp chưng cất là phương pháp nhanh, đơn giản, tốn Ýt dung môi
và có thể áp dụng phân tích đối với mẫu nước thải công nghiệp nhiều tạp chất.
Theo phương pháp chưng cất, mẫu nước dược điều chỉnh tới pH = 1,5
thêm 25% NaCl, và tiến hành chưng cất trực tiếp, hứng phần ngưng, tiêm 1
ml vào máy sắc ký lỏng hiệu suất cao HPLC. Khi nghiên cứu phương pháp
này với 5 clophenol cho thấy độ thu hồi từ 91,9 - 97,3% độ lặp lại cao, và
giới hạn phát hiện từ 7-16µg/l [12].
Phương pháp chưng cất kết hợp với kỹ thuật nội chuẩn và dẫn xuất hoá
các phenolic đã được áp dụng để phân tích mẫu nước thải [9]. Với phương
pháp này, mẫu nước đã được axit hoá tới pH ∼ 1, thêm chất nội chuẩn là 2,6 -
dibromphenol, thêm dung môi và dung dịch NaCl bão hoà, rồi đem chưng cất
thu pha hữu cơ giàu chất phân tích. Sau đó chuyển chất phân tích vào pha hữu
cơ khác phù hợp, tiến hành dẫn xuất hoá các phenolic bằng
pentafluorobenzylbromua 1% trong axeton, rồi làm sạch mẫu bằng cách cho
qua cột florisil và làm khô bằng Na
2
SO
4
khan, đuổi dung môi, tiến hành phân
tích sắc ký khí với detector ECD. Độ thu hồi của phương pháp từ 75,94 -

89,69% ở nồng độ 0,01 - 1 mg/l với DCP và 0,001 - 0,1 mg/l với các
clophenol có số clo nhiều hơn.
1.3.5. Phương pháp cất lôi cuốn hơi nước [1]
Cất láng - lỏng lôi cuốn hơi nước là một trong những phương pháp
nhân lặp và tinh chế các hợp chất hữu cơ đạt hiệu quả cao. Phương pháp này
sử dụng để tinh chế, làm giàu các chất không tan và Ýt tan trong nước.
Hình 5: Cấu tạo máy cất đạm vi lượng Parnas - Wagnerr sử dụng để cất láng - lỏng
lôi cuốn hơi nước.
1. Bình cấp hơi nước 2 lít
2. Phễu rót nước cất
3. Phễu rót mẫu
4. Bình cầu đựng mẫu
250ml
5. Sinh hàn
6. Bình hứng chất
7. Phễu xả
8. Khoá K1
9. Khoá K2
10.Khoá K3
Quy trình cất láng - lỏng lôi cuốn hơi nước được tiến hành như sau:
Lấy chính xác 100ml nước đã được xử lý sơ bộ vào bình đựng nước 250ml,
axit hoá bằng 2ml axti H
2
SO
4
đặc tinh khiết. Đưa mẫu vào bình 4 bộ chiết cất
lôi cuốn hơi nước. Dùng dung môi dietylete tráng bình định mức và đổ vào
bình 4, rồi tiến hành chưng cất. Phần cất được cô đuổi dung môi bằng dòng
khí N
2

cho đến khi khô, rồi thêm chính xác 100µl dung môi dietylete. Tiêm
1µl dung dịch này vào máy sắc ký khí với detector ECD để định tính và định
lượng chúng. Độ thu hồi của phương pháp này lớn hơn 70%, với độ lặp lại
cao và độ nhạy khảng µg/l.
1.3.6. Phương pháp chiết pha rắn (chiết láng - rắn)
1.3.6.1. Nguyên tắc chung
Trong phương pháp chiết pha rắn, các chất hấp phụ rắn, có diện tích bề
mặt riêng lớn được sử dụng để chiết, tách và làm giàu các hợp chất hữu cơ từ
pha nước. Theo phương pháp này, mẫu nước được điều chỉnh tới pH thích
hợp được xử lý sơ bộ rồi được dội qua cột (cột được nhồi chất hấp phụ rắn).
Do ái lực mạnh với pha tĩnh nên các chất hữu cơ bị giữ lại trên cột, và sau đó
dùng dung môi hữu cơ thích hợp để rửa giải thu chất phân tích.
Các chất hấp phụ rắn được sử dụng cho chiết pha rắn bao gồm: các
polyme, polyme đồng trùng hợp styren - divinylbenzen, polyme acrylic, tenax
- GC, các pha liên kết C
18
, C
8
, C
6
- Silica và thường được bán trên thị trường
dưới dạng hạt, cột nhồi rắn, dạng phim, dạng đĩa hay dạng màng.
Phương pháp chiết pha rắn thường được áp dụng đối với các chất khó
bay hơi, các chất không chiết được bằng phương pháp chiết láng - lỏng.
1.3 2. Phương pháp sử dụng nhựa hấp phụ polystyren - divinyl - benzen
Theo phương pháp này, nhựa được Ðp dưới dạng đĩa, và áp dụng cho
phân tích các phenol trong nước. Trước khi sử dụng, đĩa được chuẩn bị kỹ
lưỡng bằng cách ngâm trong axeton, trong metanol và cuối cùng rửa bằng
nước cất có điều chỉnh pH tương đương với pH của mẫu. Mẫu nước được
điều chỉnh tới pH ∼ 2, rồi được lọc qua đĩa, sau đó chất phân tích được rửa

giải bằng metanol. Cùng với kỹ thuật dẫn xuất hoá, nội chuẩn và làm sạch
trên florisil, khan hoá trên Na
2
SO
4
, đã chứng tỏ chiết bằng đĩa styren -
divinybenzen là phương pháp nhanh để phân tích các clophenol trong nước
ngầm và nước bề mặt. Độ thu hồi của phương pháp khá cao, từ 74,14 -
97,92%. Tuy nhiên, trước khi lọc qua đĩa, mẫu cần được lọc để loại các hạt
rắn [23].
Cheung Julic và cộng sự cũng đã nghiên cứu chiết pha rắn (SPE) sử
dụng chất hấp phụ polystyren - divinylbenzen để tiến hành chiết hỗn hợp 8
clophenol trong nước và tiến hành xử lý nước thải ở vùng Sydney. Kết quả
cho thấy nhựa không ion polystyren - divinylbenzen có khả năng hấp phụ
mạnh hơn than hoạt tính. Sau đó, chất phân tích được định lượng trên thiết bị
GC - MS. Độ nhạy của phương pháp cỡ ppb [7].
1.3.6.3. Chiết pha rắn sử dụng đĩa C
18
Đĩa C
18
đã được sử dụng làm chất hấp phụ để xây dựng quy trình chuẩn
xác định các phenol trong nước. Theo quy trình này, mẫu được kiềm hoá và
thêm chất nội chuẩn 2,4,6 - triclophenol -
13
C
6
, được axetat hoá thành
phenolaxetic với tác nhân anhidritaxetat, được đi qua đĩa C
8
. Chất phân tích bị

giữ trên đĩa được rửa giải bằng axeton. Dịch chiết được cô cạn và được định
tính, định lượng trên thiết bị GC-MS. Độ thu hồi của phương pháp đạt 60-
95%, với giới hạn phát hiện 5-20ppb[13].
Nghiên cứu của S.Dupeyron và các cộng sự cho thấy pentaclophenol
trong nước uống hoặc nước thải công nghiệp được điều chỉnh tới pH∼2,6,
bơm qua đĩa C
18
, được rửa giải bằng hỗn hợp axetonitril + nước + axit axetic,
được định lượng bằng HPLC với detector quang (UV) hoặc huỳnh quang
(RF). Độ nhạy của phương pháp ∼ 0,1µg/l. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng khi
thêm NaCl vào mẫu nước làm tăng độ phân cực của nước và do đó sẽ nâng
cao được độ thu hồi của pentaclophenol lên từ 87-90% [12, 2].
Theo Goncharov V.V. và các cộng sự, lượng lớn mẫu nước được bơm
qua đĩa C
18
để làm giàu trước mỗi phép phân tích. Các nhà nghiên cứu đã sử
dụng kỹ thuật sắc ký khí kết hợp với khối phổ (GC-MS) để phân tích. Giới
hạn phát hiện của phương pháp này là 1 -10ng/l [5].
Đĩa C
18
còng đựơc Bao M.L. và các cộng sự sử dụng để chiết và làm
giàu các phenol và dẫn xuất của phenol trong nước. Theo nghiên cứu này,
mẫu được axetyl hoá trực tiếp bằng anhydritaxetic thành phenolaxetat, rồi được
chiết bằng đĩa C
18
và được định lượng bằng phương pháp sắc ký khí sử dụng
detector khối phổ. Phương pháp này có độ chính xác và độ nhạy cao được dùng
để phân tích các hợp chất của phenol bao gồm: phenol, ankyl phenol, phenol đã
halogen hoá, nitrophenol trong nước máy, trong đất và các mẫu nước sông. Độ
thu hồi của phương pháp lớn hơn 80% và độ nhạy từ 2-50ng/l [3].

Jitka Frebortava, Vera Tatarkovieova đã phân tích 7 clopenol trong
nước thuộc danh mục các chất gây ô nhiễm môi trường lâu dài do EPA đưa
ra: 2 - clophenol (2 - CP); 4- clo - 3 metylphenol (4,3 - CMP); 2,6 -
diclophenol (2,6 - DCP) ; 2,4 - diclophenol (2,4 - DCP); 2,4,5 - triclophenol
(2,4,5 - TCP); 2,4,6 - triclophenol (2,4,5,6-TCP); pentaclophenol (PCP). Các
tác giả đã nghiên cứu chiết pha rắn sử dụng pha liên kết C
6
, C
8
, C
18
- Silica để
xem xét sự phụ thuộc của độ thu hồi vào thể tích dung môi rửa giải, pH mẫu
và thể tích mẫu để tìm chất hấp phụ tối ưu. Kết quả cho thấy C
18
- Silica là
chất hấp phụ đạt hiệu quả cao nhất trong số các chất được khảo sát [21].
1.3.6.4. Chiết pha rắn sử dụng chất hấp phụ XAD - 2, XAD - 4
Chất hấp phụ XAD - 2 còn gọilà nhựa XAD - 2, được sử dụng rộng rãi
trong phương pháp chiết lỏng rắn. XAD - 2 có dạng hạt nhỏ, đường kính ∼
0,25 - 0,5mm màu trắng, có dung lượng hấp phụ lớn do diện tích bề mặt lên
tới 300m
2
/g. Theo phương pháp chiết này, mẫu được xử lý sơ bộ, được điều
chỉnh tới pH ∼ 2, rồi được dội qua cột XAD - 2 để tách và làm giàu các
clophenol. Sau đó, chất phân tích được giải hấp bằng các dung môi thích hợp
đến khi thu hết, rồi đem cô cạn và định lượng trên GC - ECD hoặc GC - MS.
Độ thu hồi của phương pháp từ 75-87%, và độ nhạy ∼ ppb [ 1, 24, 11, 22].
Chất hấp phụ XAD - 4 còn được gọi là nhựa XAD - 4. Đó là nhựa
polystyren có kích thước nhỏ, đường kính trong ∼ 50A

o
thường được sử dụng
làm chất hấp phụ các phenol và dẫn xuất. Nhựa có dung lượng hấp phụ lớn,
do diện tích bề mặt riêng lớn ∼ 750m
2
/g.
Zheng - Liang Zhi và cộng sự đã tiến hành chiết và làm giàu các phenol
trên XAD - 4, sau đó rửa giải chất phân tích trên pha rắn và áp dụng phương
pháp đo mầu sử dụng thuốc thử 4 - amino antipyrin để xác định tổng lượng
các phenol trong nước. Giới hạn phát hiện của phương pháp này tới 0,2ng/ml
và khoảng tuyến tính 0,5-60ng/ml [27].
Trong nghiên cứu của mình. Elina B. Caramao và các cộng sự Brazin
sử dụng XAD - 4 để chiết các phenol từ mẫu nước khí hoá than sau khi đã
được axtyl hoá bằng anhidritaxetic. Chất phân tích được rửa giải và định
lượng trên thiết bị sắc ký khối phổ GC - MS. Qua nghiên cứu này, họ đã phát
hiện ra 20 hợp chất phenol đã được axetyl hoá trong hổn hợp phức tạp của
nước khí hoá than [26].
Một nghiên cứu mới đây đã sử dụng nhựa XAD - 4 để chiết và làm
giàu các clophenol trong nước. Theo quy trình này, mẫu nước được kiềm hoá
tới pH ∼ 13 được lọc sơ bộ loại các tạp chất thô, rồi axit hoá tới pH ∼ 2; tiến
hành chiết các clophenol trên nhựa XAD - 4, sau đó rửa giải bằng dietylete.
Các clophenol sau khi rửa giải sẽ được giải chiết khỏi pha hữu cơ bằng dung
dịch NaOH ∼ 0,2N, rồi axit hoá tới pH ∼ 2 và chiết lại bằng dietylete. Dịch
chiết được làm khô bằng Na
2
SO
4
khan, rồi cô cạn bằng dòng khí nitơ, thêm
dung môi n - hecxan và bơm 1µl vào máy sắc ký khí với detector ECD để
định lượng. Độ thu hồi của phương pháp từ 68-83% với độ nhạy phát hiện

nhỏ hơn 0,01µg/ml [22].
1.3.6.5. Phương pháp vi chiết pha rắn
Để nâng cao hiệu suất thu hồi khi phân tích các phenol và đơn giản hoá
quy trình phân tích, Buchholz và cộng sự đã đề xuất phương pháp vi chiết pha
rắn (Solid - phase micro extration: SPME). Phương pháp này dùa trên cơ chế
lôi cuốn các hợp chất hữu cơ từ pha nước hoặc pha khí lên sợi silica được phủ
các chất hấp phụ thích hợp nh polyacrylate Các hợp chất hữu cơ bám trên
sợi silica sẽ được đưa trực tiếp vào buòng hoá hơi của thiết bị sắc ký bằng
một bơm tiêm cải tiến.
Theo kỹ thuật này, khi pít tông rút ngược lên, sợi hấp phụ sẽ thụt vào
sâu trong kim để tránh bị gẫy khi rót kim ra khỏi nắp đậy bình mẫu hoặc khi
bơm vào buồng hàng hoá hơi của thiết bị sắc ký. Sợi silica dài 1cm được phủ
một líp polyacrylate dày 95µm. Bằng kỹ thuật này, các nhà nghiên cứu đã thử
nghiệm phân tích 11 loại phenol khác nhau với giới hạn dưới là 0,8µg/l đối
với phenol và 0,01µg/l đối với 4 clo - 3 metyl phenol, tương ứng là các giá trị
cao nhất và thấp nhất trong giới hạn phát hiện của 11 loại phenol đem thử
nghiệm. Độ chính xác của phương pháp rất cao, với sai số lớn nhất khi xác
định pentacclophenol là 12%, còn các chất khác chỉ khoảng 4-5% [6].
1.4. Một số phương pháp xác định các clophenol trong nước
1.4.1 xác định phenol và dẫn xuất của nó bằng phương pháp trắc quang
Với thuốc thử 4 - aminoantypirin khi có mặt kaliferoxianua
K
3
[Fe(CN)
6
]

hoặc amonipesunphat (NH
4
)

2
S
2
0
8
trong môi trường pH ∼ 10. Sản
phẩm mầu được đo trực tiếp ở bước sóng 500mm hoặc được chiết lên
clorofom và đo mầu ở bước sóng 460mm. Phương pháp này có ưu điểm là xử
lý mẫu nhanh, không phức tạp nhưng chỉ cho phép phân tích hàm lượng các
phenol và dẫn xuất có nồng độ 0,001 - 0,005% [18].
Cải tiến các phương pháp này và sử dụng chất hấp phụ XAD - 4 để tách
và làm giàu các clophenol từ dung dịch nước tại pH ∼ 2 trong hệ thống dòng
liên tục. Chất phân tích được rửa giải bằng cách bơm liên tục dòng dung dịch
nước có pH ∼ 13 qua nhựa, rồi đưa trực tiếp vào dòng thuốc thử 4 -
aminoantipyrin. Sản phẩm của phản ứng được chiết bằng cloroform và đo
mầu. Phép phân tích có độ nhạy khá cao khoảng 0,2ng/ml với khoảng tuyến
tính 0,5-60ng/ml [27]
Hạn chế của phương pháp này là thuốc thử 4 - aminoantipyrin kém
chọn lọc với các phenol Chỉ xác định được lượng tổng các phenol trong
nước.
1.4.2. Phương pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao (HPLC)
Phương pháp sắc khí lỏng hiệu suất cao và phương pháp sắc ký khí đã
được Cơ quan Bảo vệ Môi trường Mỹ và Châu Âu sử dông nh là phương
pháp chuẩn để xác định phenol và các dẫn xuất của phenol. Phương pháp có
độ nhạy rất cao, khoảng ppb.
S. Dupeyron và các cộng sự đã tiến hành chiết pha rắn và sử dụng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cao để xác định các phenol trong nước [6].
Theo phương pháp này, cột tách được sử dụng là cột pha đảo có kích thước
(12,5cm x 4,0mm), . Mẫu sau khi đi qua cột tách sẽ được đi qua detector
quang (UV) hoặc huỳnh quang (RF) với chương trình bước sóng của UV là :

270nm clophenol và 2 - CP, 285 nm, 289 nm và 303 nm tương ứng cho 2,4 -
DCP; 2,4,6 - TCP và PCP, còn bước sóng hấp thụ của huỳnh quang là 270 nm
và phát xạ là 298 nm. Phương pháp này có độ nhạy khoảng 0,1µg/l.
Riehn O., Jeken M. đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cao
với cột tách là cột pha đảo để xác định phenol và các dẫn xuất của phenol
trong nước thải. Phenol và các dẫn xuất của phenol đều được xác định ở bước
sóng 500nm khi có mặt N - metylbenzothiazo-2hydrazon và Ce(NH
4
)
2
(SO
4
)
3
trong môi trường axit mạnh. Giới hạn phát hiện của phương pháp từ 1-20ng
trong một lần bơm mẫu
Một số nghiên cứu khác cũng đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
suất cao để xác định phenol và các dẫn xuất của phenol trong nước với độ
nhạy khoảng µg/l [21, 8,].
1.4.3. Phương pháp sắc ký khí
Phương pháp sắc ký khí cột mao quản kết hợp với detector khối phổ và kỹ
thuật chọn lọc ion (GC - MS – SIM) được đánh giá là phương pháp có độ nhạy
cao nhất (khoảng ng/l) trong việc phân tích phenol và các dẫn xuất của phenol.
Theo ISO - 8165 - 1, có 31 hợp chất gồm phenol và dẫn xuất của
phenol đã được xác định bằng phương pháp sắc ký khi với detector ion hóa
ngọn lửa (FID) và detector bắt giữ điện tử (ECD). Giới hạn phát hiện của
phương pháp từ 0,1µg/l - 1 mg/l [18].
Cheung Julic và cộng sự đã tiến hành chiết pha rắn để tách và làm giàu
hỗn hợp các phenol trong nước thải vùng Sydney. Các phenol này được định
tính và định lượng bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ với độ nhạy khoảng

ppb [10].
Theo nghiên cứu của Heberer Thomas và cộng sự, khi tiến hành chiết
pha rắn để tách và làm giàu phenol và hơn 50 dẫn xuất của phenol, sau đó sử
dụng phương pháp sắc ký khí khổi phổ với kỹ thuật chọn lọc ion để định tính
và định lượng chúng đã cho độ nhạy khá cao khoảng ng/l. Trong phương
pháp GC - MS - SIM, họ sử dụng hai loại cột mao quản là HP-5 có kích thước
(25m x 0,2mm x 0,33µ) và Rtx - 200 có kích thước (30m x 0,32mm x
0,25µm) [17].
Chương 2
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp sắc ký khí lỏng hiệu suất cao (HPLC) và những vấn
đề cần nghiên cứu ứng dụng
2.2.1.1. Nguyên tắc chung của phương pháp HPLC
Sắc ký lỏng là quá trình tách một,hoặc hỗn hợp các chất ở trong cột
tách sắc ký ở trạng thái lỏng, mà ở đây thực chất là sự vận chuyển và phân bố
lại liên tục của các chất tan (mẫu phân tích) qua từng líp của cột chất nhồi
(pha tĩnh) từ đầu đến cuối cột tách. Trong những điều kiện sắc ký nhất định
thì chất tan luôn được phân bố giữa hai pha động và pha tĩnh tuân theo định
luật phân bố. Mặt khác, mỗi chất có cấu trúc phân tử và tính chất khác nhau,
nên khả năng tương tác tới pha tĩnh và khả năng hoà tan trong các dung môi
rửa giải (pha động) khác nhau, do vậy tốc độ vận chuyển các chất tan qua cột
là khác nhau. Vì thế tạo ra sự tách của các chất khi qua cột sắc ký.
Trong kỹ thuật HPCL, mẫu phân tích được bơm vào cột qua mét van bơm
mẫu, sau đó nhờ một bơm cao áp bơm pha động chảy qua cột sắc ký với một
tốc độ xác định để thực hiện quá trình tách.Quá trình tách trong cột sắc ký là
sự tương tác của các chất phân tích với pha tĩnh đứng yên trong cột tách và
pha động luôn chuyển động qua cột tách với tốc độ nhất định. Đây là quá
trình chính diễn ra trong cột tách của kỹ thuật HPLC. Sự tương tác của chất
tan với pha tĩnh có thể diễn ra theo:
- Tương tác hấp phụ

- Tương tác trao đổi ion
- Tương tác rây phân tử
Vì thế cũng có ba loại sắc ký tương ứng với ba bản chất của kiểu tương tác
này.
- Sức ký hấp phụ (pha thường NP - HPLC, pha ngược RP-HPLC)
- Sắc ký trao đổi ion (EX-HPLC)
- Sắc ký rây phân tử (Gel-HPLC)
Trong HPLC việc phát hiện các chất phân tích nhờ các detectơ và sau đó
được chỉ thị sang bộ phận ghi nhận kết quả. Tuỳ theo đối tượng, yêu cầu, độ
nhạy và đặc biệt là bản chất của chất phân tích mà chọn các loại detectơ
khác nhau, nh phổ hấp thụ phân tử hay huỳnh quang, v.v