Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate

Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

i

NHẬN XÉT CỦA GVHD























Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

ii

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này em xin gửi lời cảm ơn đến
- Cô Huỳnh Ngọc Oanh, Bộ môn Công nghệ Sinh học trƣờng đại học Bách
Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong
suốt thời gian thực hiện luận văn.
- Gia đình và bạn bè đã động viên em hoàn thành luận văn.
- Các bạn cùng lớp, đặc biệt là các bạn, các anh chị cùng thực tập tại phòng
thí nghiệm bộ môn công nghệ sinh học.
Em xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô đã dạy dỗ em trong suốt thời gian học tập
tại trƣờng.
Do thời gian thực hiện luận văn và kiến thức của em hạn chế, nên không tránh khỏi
sai sót. Rất mong nhận đƣợc ý kiến của thầy cô và các bạn.













Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

iii

TÓM TẮT LUẬN VĂN
Enzyme α-Amylase là enzyme quan trọng dùng để thủy phân tinh bột đƣợc ứng
dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp. Vấn đề cố định để tái sử dụng enzyme cũng
đã đƣợc đề cập trong rất nhiều nghiên cứu. Luận văn này khảo sát khả năng cố định
enzyme α-Amylase trên chất mang vô cơ kết hợp với chất mang hữu cơ. Enzyme α-
amylase đƣợc khảo sát cố định trên celite, silica gel, celite kết hợp với alginate, silica
gel kết hợp với alginate. Kết quả hiệu suất hoạt tính thu đƣợc cao nhất ở celite kết hợp
với alginate (60%) và silica gel kết hợp với alginate (44%). Enzyme cố định trên celite
kết hợp với alginate bị mất hoạt tính nhanh chóng. Tuy nhiên kết quả rất khả quan đối
với enzyme cố định trên silica gel kết hợp với alginate. Sau 40 lần sử dụng enzyme vẫn
giữ đƣợc 60 % hoạt tính. Khoảng pH hoạt động tối ƣu của enzyme cố định khoảng 5,5.
Khoảng nhiệt độ hoạt động tối ƣu là 80 – 90
o
C. Trong số các nguồn cơ chất tinh bột
đƣợc khảo sát lƣợng đƣờng khử tạo ra cao nhất đối với tinh bột khoai tây.
SUMMARY
Alpha-amylase is one of the most important commercial enzyme used to hydrolysis
starch to products with low molecular weight in many kinds of industry. From that,
there were so many studies about immobilization of alpha-amylase. To continue, this
dissertation researched immobilization Termamyl on unorganic carriers (celite, silica
gel) combine with alginate. The enzyme immobilized on celite – alginate exhibited the
highest activities (60% compared with the free enzyme) but lost its activities
immediately. However the result is quite respective with the enzyme immobilized on
silica gel – alginate, retained 44% of the initial activity of free enzyme. These si – alg
enzyme capsules carrying α-amylase retained 60% of their initial efficiency after 40
starch hydrolysis batches. When performing the hydrolysis of starch, the shifts of
optimum temperature from 80 to 90 ◦C and pH around 5.5. Among the various starchy

substrates tested, higher amounts of reducing sugars were released from potato starch
hydrolysis.

Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

iv

MỤC LỤC
NHẬN XÉT CỦA GVHD I
LỜI CẢM ƠN II
TÓM TẮT LUẬN VĂN III
MỤC LỤC IV
CÁC TỪ VIẾT TẮT SỬ DỤNG VI
DANH MỤC BẢNG VII
DANH MỤC HÌNH VIII
CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5
2.1 Enzyme cố định 5
2.2 Các phƣơng pháp cố định enzyme 5
2.2.1 Phƣơng pháp tạo liên kết giữa enzyme và chất mang 5
2.2.2 Phƣơng pháp nhốt enzyme 7
2.3 Chất mang 8
Chia làm hai loại: hữu cơ và vô cơ 8
2.3.1 Chất mang hữu cơ – alginate 8
2.3.2 Chất mang vô cơ 12
2.4 Enzyme amylase 13
2.4.1 Chế phẩm Termamyl 14
2.4.2 Một số công trình nghiên cứu cố định enzyme 14
CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU & PHƢƠNG PHÁP 20

3.1 Vật liệu – hóa chất 20
3.2 Phƣơng pháp 20
3.2.1 Phƣơng pháp chung 20
3.2.2 Khảo sát quá trình cố định enzyme 22
3.2.3 Phƣơng pháp khảo sát khả năng sử dụng của enzyme cố định 24
3.2.4 Phƣơng pháp tính toán 25
3.2.5 Anova - Phân tích phƣơng sai một nhân tố 26
Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

v

CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27
4.1. Khảo sát chế phẩm enzyme Termamyl 27
4.1.1. Khảo sát hàm lƣợng protein của chế phẩm enzyme Termamyl 27
4.1.2. Khảo sát hoạt tính của chế phẩm enzyme Termamyl 27
4.2 Cố định enzyme trên celite 28
4.3 Cố định enzyme trên celite kết hợp với alginate 29
4.3.1 Khảo sát tỉ lệ Celite 29
4.3.2 Khảo sát nồng độ dung dịch sodium alginate 30
4.4 Cố định enzyme trên silica gel 32
4.5 Cố định enzyme trên silica gel kết hợp với alginate 33
4.5.1 Khảo sát tỉ lệ silica gel 33
4.5.2 Khảo sát nồng độ alginate 34
4.6 Khảo sát độ ổn định của enzyme cố định 35
4.7 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của enzyme cố định si – alg 37
4.8 Khảo sát ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của enzyme cố định si – alg 38
4.9 Khảo sát khả năng ứng dụng của enzyme cố định si – alg 39
4.9.1 Khảo sát ảnh hƣởng của nguồn cơ chất 39
4.9.2 Khảo sát phản ứng liên tục 41

CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO 45
PHỤ LỤC 47




Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

vi

CÁC TỪ VIẾT TẮT SỬ DỤNG
bđ: Ban đầu
cđ: Cố định
pƣ: Phản ứng
cel: celite
si: silica gel
alg: alginate.
OD
540
: Độ hấp thu ở bƣớc sóng 540 nm
OD
595
: Độ hấp thu ở bƣớc sóng 595 nm
ODtb: Độ hấp thu trung bình của mẫu
∑protein cđ: Tổng lƣợng protein đƣợc cố định
HS: Hiệu suất

Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.2: Một số đặc điểm của chế phẩm Termamyl 14
Bảng 2.2: Kết quả nghiên cứu cố định lipase trên celite 19
Bảng 4.1: Kết quả khảo sát trên chế phẩm Termamyl 29
Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của tỉ lệ enzyme:celite đến hiệu suất cđ protein và tổng hoạt độ
của enzyme cđ trên celite 29
Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của tỉ lệ celite đến tổng hoạt độ của enzyme cđ cel – alg 31
Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của nồng độ sodium alginate đến tổng hoạt độ enzyme cđ cel –
alg 33
Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của tỉ lệ enzyme:silica gel đến tổng protein cđ và tổng hoạt độ
enzyme cđ trên silica gel 34
Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của tỉ lệ silica gel đến tổng hoạt độ enzyme cđ si – alg 35
Bảng 4.7: Ảnh hƣởng của nồng độ sodium alginate đến tổng hoạt độ enzyme cđ si – alg
36
Bảng 4.8: Kết quả khảo sát khả năng tái sử dụng enzyme 36
Bảng 4.9: So sánh enzyme cđ celite – alg với enzyme cđ si – alg 38

Bảng 4.10: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ enzyme cđ si – alg 39
Bảng 4.11: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của enzyme cđ si – alg 40










Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

viii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu tạo phân tử tinh bột 1
Hình 1.2: Sơ đồ quá trình sản xuất sirup 2
Hình 1.3: Mô hình cố định enzyme 3
Hình 2.1: Enzyme hấp phụ lên chất mang 6
Hình 2.2: Phƣơng pháp nhốt enzyme trong hệ gel và trong hệ sợi 8
Hình 2.3: Phƣơng pháp bao gói enzyme 8
Hình 2.4: Cấu tạo phân tử alginate 10
Hình 2.5: Ảnh hƣởng của nồng độ alginate đến hiệu suất cố định protein 15
Hình 2.6 : Sơ đồ xử lý enzyme và chất mang đối với chất mang ƣa nƣớc và kỵ nƣớc 16
Hình 2.7: So sánh nồng độ đƣờng khử theo thời gian ở 50
o

C và hiệu suất tái sử dụng
của α-amylase tự do và α-amylase cố định 17
Hình 2.8: Nồng độ đƣờng khử theo thời gian phản ứng sử dụng α-amylase cố định tại
các nồng độ alginate khác nhau 18
Hình 2.9: Thuỷ phân tinh bột bằng enzyme cố định trong alginate bổ sung các nồng độ
silíc gel khác nhau 18
Hình 2.10: Khả năng tái sử dụng enzyme cố định trên alginate và alginate/silica gel với
các hàm lƣợng enzyme khác nhau 19
Hình 3.1: Sơ đồ tiến hành cố định enzyme trên chất mang vô cơ 23
Hình 3.2: Sơ đồ tiến hành cố định enzyme trên chất mang vô cơ kết hợp alginate 24
Hình 3.3: Hệ thống cột phản ứng 25
Hình 4.1: Đồ thị tƣơng quan giữa OD và nồng độ albumin 28
Hình 4.2: Đồ thị tƣơng quan giữa OD và nồng độ đƣờng khử 29
Hình 4.3: Ảnh hƣởng của tỉ lệ enzyme:celite lên tổng protein cđ và tổng hoạt độ
enzyme cđ cel – alg 30
Hình 4.4: Ảnh hƣởng của tỉ lệ celite đến tổng hoạt độ của enzyme cố cđ cel – alg 32
Hình 4.5: Ảnh hƣởng của nồng độ alginate đến tổng hoạt độ của enzyme cđ cel – alg 33
Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

ix

Hình 4.6: Ảnh hƣởng của tỉ lệ enzyme:silica gel đến tổng protein cđ và tổng hoạt độ
của e cđ si – alg 34
Hình 4.7: Ảnh hƣởng của tỉ lệ silica gel đến tổng hoạt độ của enzyme cđ si – alg 36
Hình 4.8: Khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme cđ si – alg 38
Hình 4.9: Ảnh hƣởng của nhiệt độ pƣ lên nồng độ đƣờng khử tạo thành 39
Hình 4.10: Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên nồng độ đƣờng khử tạo thành 40
Hình 4.11: Khả năng thuỷ phân các loại tinh bột khác nhau của enzyme cđ si – alg 41
Hình 4.12: Khảo sát ảnh hƣởng của vận tốc dòng cơ chất lên khả năng xúc tác của

enzyme cđ si – alg 42
Hình 4.13: Khảo sát khả năng phản ứng theo thời gian sử dụng enzyme cđ si – alg 43

Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

1

CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU
Tinh bột (C
6
H
10
O
5
)
n
, một carbonhydrate dự trữ của thực vật, là các polisacharide có
khối lƣợng phân tử rất lớn đƣợc tạo thành từ các đơn phân phân tử glucose thông qua
các cầu nối 1 – 4 và 1 – 6. Quá trình thủy phân các liên kết 1 – 4 của tinh bột để tạo
thành các phân tử nhỏ hơn đƣợc xúc tác bởi enzyme α-amylase.
Tinh bột là một nguồn cung cấp năng lƣợng quan trọng của con ngƣời. Qúa trình
thủy phân tinh bột xúc tác bởi enzyme α-amylase là một trong những quá trình quan
trọng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, công nghiệp giấy và dệt may, đặc biệt là
trong ngành công nghệ thực phẩm sản xuất sirup [9]. Trong quá trình sản xuất sirup,
α-amylase cắt ngắn phân tử tinh bột giúp giảm nhanh độ nhớt tạo thuận lợi cho quá
trình thủy phân tiếp theo [2].
Cố định enzyme α-amylase cho phép dễ dàng tách enzyme ra khỏi sản phẩm thủy
phân, tiết kiệm lƣợng enzyme nhờ có thể tái sử dụng và giảm các chi phí có liên quan.

Hình 1.1: Cấu tạo phân tử tinh bột




Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

2

















Hình 1.2: Sơ đồ quá trình sản xuất sirup

Đã có rất nhiều phƣơng pháp nghiên cứu sử dụng chất mang vô cơ cố định α-
amylase nhƣ hấp phụ lên than hoạt tính, bentonite hay đất sét và sử dụng chất mang

hữu cơ nhƣ gắn vào gel polyacrylamide, hấp phụ lên hạt gel sepharose hoạt hoá bởi
cyanogen bromide (CNBr) [5], và nhốt trong hạt gel calcium alginate. Tuy nhiên các
phƣơng pháp hấp phụ trên chất mang vô vơ nhƣ celite hoặc silica gel vẫn chƣa đƣợc
quan tâm do hiệu suất chƣa cao và đặc biệt là độ ổn định thấp vì các liên kết có độ bền
không cao, enzyme dể dàng thoát ra ngoài. Ngƣời ta đã phát triển các phƣơng pháp sử
dụng chất hoạt hoá cho hiệu suất cố định cao nhƣng lại có nhƣợc điểm là các hoá chất
này đều độc hại có thể ảnh hƣởng đến hoạt tính enzyme. Một nhƣợc điểm nửa của chất
mang vô cơ là khả năng ứng dụng trong môi trƣờng sản xuất kém. Do chất mang vô cơ
Hạt tinh bột
Huyền phù tinh
bột
Tinh bột hồ hoá
Tinh bột Dịch hoá
Sirup glucose &maltose
Quá trình hồ hoá
Quá trình dịch hoá
Quá trình đƣờng hoá
α-amylase
Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

3

thƣờng ở dạng bột, dễ gây nghẽn mạch, quá trình tách enzyme cố định ra khỏi sản
phẩm khó khăn. Hơn nữa chất mang vô cơ thƣờng lắng xuống đáy nên hạn chế khả
năng xúc tác phản ứng. Sử dụng chất mang vô cơ đòi hỏi phải có hệ thống khuấy trộn
rất phức tạp, trong quá trình sản xuất có thể dẩn đến nghẽn mạch.
Chất mang hữu cơ đƣợc sử dụng nổi bật hiện nay là sodium alginate với phƣơng
pháp bao gói. Ƣu điểm là giá thành rẻ, quá trình đƣợc thực hiện dể dàng trong điều
kiện ôn hoà [10]. Tuy nhiên để enzyme cố định có hiệu quả cao, lổ gel phải đủ lớn để

cơ chất có thể khuếch tán qua màng và đủ nhỏ để giữ lại enzyme. Ở nhiệt độ cao, gel
trƣơng nở enzyme có thể thoát ra ngoài làm giảm khả năng tái sử dụng (theo
Sadhukhan et al và cộng sự). Enzyme cố định giữ đƣợc khoảng 70 % hoạt tính sau
khoảng 20 lần tái sử dụng [10]. Một phƣơng pháp khác rất triển vọng để khắc phục
nhƣợc điểm của các phƣơng pháp trên là cố định enzyme vào các vật liệu có kích thƣớc
hạt lớn đồng thời sử dụng phƣơng pháp bao gói hạn chế enzyme thoát ra ngoài. Bắt
nguồn từ ý tƣởng trên, chúng tôi thực hiện đề tài này nghiên cứu sử dụng kết hợp vật
liệu vô cơ (silica gel, celite) và hữu cơ (alginate) để cố định enzyme Termamyl (α-
amylase). Ban đầu enzyme đƣợc gắn lên chất mang vô cơ sau đó đem đi bao gói bằng
gel alginate. Với mục đích tránh dùng các chất hoạt hoá tránh gây biến tính enzyme
đồng thời vẫn giữ đƣợc sự ổn định nhờ lớp bao gói alginate.

a b
Hình 1.3: Mô hình cố định enzyme
a) Bao gói bằng gel alginate b)Kết hợp cố định trên chất mang với bao gói


Enzyme
Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

4


Mục tiêu
 Khảo sát quá trình cố định enzyme lên chất mang vô cơ và kết hợp với bao gói
bằng calcium alginate.
 Khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme cố định.
 Khảo sát các điều kiện pH, nhiệt độ lên hoạt tính và độ ổn định của enzyme cố
định.

 Khảo sát khả năng ứng dụng của enzyme cố định.



















Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

5

CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Enzyme cố định
Enzyme có bản chất là protein đƣợc sinh vật tổng hợp và tham gia vào các phản
ứng sinh học. Enzyme không chỉ xúc tác cho các phản ứng nhất định trong cơ thể mà
còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào.

Theo Trevan, thuật ngữ enzyme cố định (immobilized enzyme, insoluble enzyme)
đƣợc hiểu là đƣa enzyme vào những pha riêng rẽ. Pha này đƣợc tách riêng với pha
dung dịch tự do.
Enzyme cố định hay còn gọi là enzyme không hoà tan đƣợc hiểu theo cả nghĩa hẹp
và nghĩa rộng.[2]
Theo nghĩa hẹp: Enzyme không hoà tan là những enzyme đƣợc đƣa vào những pha
riêng rẽ, pha này đƣợc tách riêng với pha dung dịch tự do.[2]
Theo nghĩa rộng: Các chất xúc tác cố định là các enzyme, tế bào, cơ thể sống ở
trạng thái cho phép sử dụng lại (Kláu Mosbach). Nhƣ vậy, theo nghĩa rộng, enzyme
không hoà tan bao gồm cả enzyme đƣợc cố định vào chất mang, bao gồm cả enzyme
có trong các tế bào sống đƣợc cố định trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết
vào một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần.[2]
2.2 Các phƣơng pháp cố định enzyme
2.2.1 Phƣơng pháp tạo liên kết giữa enzyme và chất mang
Tùy theo tính chất của chất mang, ngƣời ta thực hiện gắn enzyme vào chất mang
theo những cơ chế sau:
- Phƣơng pháp hấp phụ
- Phƣơng pháp tạo liên kết đồng hóa trị.
- Phƣơng pháp tạo liên kết ion
- Phƣơng pháp liên kết với kim loại
a) Phƣơng pháp hấp phụ là một trong những phƣơng pháp đầu tiên đƣợc dùng để
cố định enzyme. Nhờ khả năng hấp phụ của các nguyên liệu làm chất mang, enzyme sẽ
đƣợc gắn vào bề mặt của chất mang. Khả năng hấp phụ của chất mang càng cao,
Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

6

enzyme càng đƣợc gắn nhiều vào chất mang. Do đó khả năng tái sử dụng enzyme cố
định càng cao. Nói chung phƣơng pháp hấp phụ có những ƣu điểm sau:

- Tính thuận nghịch: Không những có thể tinh sạch đƣợc protein mà còn có thể tái
sử dụng chất mang [5].
- Quá trình cố định đơn giản có thể thực hiện trong những điều kiện ôn hoà [5].
- Giữ đƣợc hoạt tính enzyme cao vì không có sự biến đổi hoá học trong quá trình
cố định [5].
Tuy nhiên enzyme cố định bằng phƣơng pháp hấp phụ có nhƣợc điểm là enzyme dễ
bị thoát ra khỏi bề mặt chất mang do các liên kết giữa enzyme và chất mang là những
liên kết yếu dễ dàng bị phá vỡ trong các điều kiện phản ứng nhƣ lực ion cao, pH, nhiệt
độ…Trong một vài trƣờng hợp enzyme có thể đƣợc hấp phụ mạnh trên các chất mang
thích hợp hoặc sự hấp phụ này đủ ổn định trong điều kiện phản ứng nhất định.[1]

Hình 2.1: Enzyme hấp phụ lên chất mang

b) Phƣơng pháp cố định bằng liên kết cộng hoá trị
Cố định bằng liên kết cộng hoá trị là phƣơng pháp đƣợc tìm ra thứ hai từ khoảng
những năm 1950 và hiện nay là một trong những phƣơng pháp quan trọng nhất để cố
định enzyme [5]. Do lực liên kết giữa enzyme và chất mang mạnh nên có thể hạn chế
sự rò rỉ enzyme ra khỏi bề mặt chất mang.
Nói chung liên kết giữa chất mang và enzyme đƣợc tạo ra bằng liên kết hoá học
giữa nhóm amino acid hoạt động trên bề mặt phân tử enzyme và nhóm chức hoá học
gắn trên bề mặt chất mang. Để có thể tạo ra các liên kết có hiệu quả nhóm chức của
chất mang hoặc enzyme phải đƣợc hoạt hoá trƣớc khi cố định. Thông thƣờng ngƣời ta
thƣờng hoạt hoá chất mang. Tuy nhiên trong một số trƣờng hợp ngƣời ta hoạt hoá
Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

7

enzyme. Khác với phƣơng pháp hấp phụ đơn thuần phƣơng pháp sử dụng liên kết cộng
hoá trị là phƣơng pháp không thuận nghịch, enzyme bị đông cứng vào chất mang do

cấu trúc đa liên kết gắn vào chất mang do đó làm thay đổi cấu trúc và ảnh hƣởng đến
hoạt tính của enzyme.[5]
c) Phƣơng pháp tạo liên kết ion
Dựa trên khả năng tạo liên kết ion giữa chất mang và enzyme, ngƣời ta gắn enzyme
vào chất mang. Liên kết ion thƣờng không bền bằng sự hấp phụ của enzyme đối với
chất mang [1].
Chất mang thƣờng đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp này là CMC, cellulose
phosphate…
d) Phƣơng pháp tạo liên kết với kim loại
Ngƣời ta làm tăng hoạt tính bề mặt của chất mang bằng những hợp chất kim loại.
Từ đó, các enzyme sẽ gắn chặt hơn vào chất mang [1].
Những chất mang đƣợc hoạt hóa bề mặt bằng kim loại đã đƣợc ứng dụng là
cellulose, gelatin, nhôm…

2.2.2 Phƣơng pháp nhốt enzyme
Có hai phƣơng pháp nhốt enzyme.
a) Phƣơng pháp nhốt enzyme trong gel: là phƣơng pháp dựa trên cơ sở tạo ra một
màng bọc hay một polimer. Các chất tham gia phản ứng và sản phẩm của phản
ứng có thể thẩm thấu vào trong hoặc thông ra ngoài thông qua màng bọc này và
enzyme đƣợc giữ lại trong khuôn gel đó. Phƣơng pháp đƣợc thực hiện bằng
cách trộn enzyme vào một polymer sau đó tiến hành các quá trình trùng hợp với
sự có mặt của một hay nhiều tác nhân khâu mạch, tạo ra phức chelate. Khi đó,
enzyme sẽ đƣợc bao bọc trong khoảng không của gel mới tạo thành [1].
b) Phƣơng pháp nhốt enzyme trong hệ sợi: có khả năng xúc tác phản ứng tốt hơn
phƣơng pháp nhốt trong hệ gel. Các sợi thƣờng đƣợc sử dụng là các sợi nhân tạo
trong đó phổ biến nhất là cellulose acetate.[1]
Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

8

Hình 2.2: Phƣơng pháp nhốt enzyme trong hệ gel và trong hệ sợi
c. Phƣơng pháp tạo vi nang nhốt enzyme
Phƣơng pháp vi bao hay còn gọi là phƣơng pháp bao gói enzyme là phƣơng pháp
tạo một lớp màng bao chế phẩm enzyme tách khỏi pha dung dịch phản ứng.[1]

Hình 2.3: Phƣơng pháp bao gói enzyme
2.3 Chất mang
Chia làm hai loại: hữu cơ và vô cơ
2.3.1 Chất mang hữu cơ – alginate
Alginate đƣợc tìm ra vào khoảng cuối thế kỷ 19 và trở thành một sản phẩm công
nghiệp quan trọng đƣợc thu nhận từ tảo nâu ở biển. Ở tảo nâu alginate là loại
polysaccharide chiếm tỉ lệ cao nhất (lên tới 40% trọng lƣợng khô) nằm trong tế bào
chất dƣới dạng gel của sodium, cancium, mangnium strontium và barium có chức
năng nhƣ bộ khung nâng đở tế bào, mang lại sự cứng chắc và mềm dẻo cho mô.
Alginate thu nhận từ tảo nâu có các đặc tính thay đổi theo mùa và sự thay đổi của điều
kiện sinh thái nên ngƣời ta đang hƣớng đến nguồn alginate mới từ vi khuẩn. Cho đến
hiện nay ngƣời ta chỉ mới tìm ra hai loại vi khuẩn sản xuất alginate là Pseudomonas và
Azotobacter. Cả hai loài vi khuẩn này đều sản xuất alginate nhƣ một dạng
polissacharide ngoại bào trong giai đoạn tăng trƣởng sinh dƣởng của chúng nhƣng
chức năng sinh học của chúng là khác nhau và khác với alginate ở tảo nâu. Trong khi ở
Dung dịch bên trong
Màng bao
Enzyme
Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

9

tảo nâu alginate đóng vai trò nhƣ một chất tạo cấu trúc nội bào (tƣơng tự nhƣ pectin ở
tế bào thực vật) thì ở vi khuẩn nó đóng vai trò hoàn toàn khác biệt. Vi khuẩn đất gram
âm Azotobacter vinelandii Alginates trải qua một quá trình phân hoá chống lại sự mất
nƣớc bằng cách tạo bào tử trong các điều kiện bất lợi. Bào nang trƣởng thành đƣợc bao
quanh bởi hai lớp vỏ. Mỗi lớp vỏ này đều chứa thành phần rất cao alginate để có thể
giữ đƣợc tính toàn ven trong cấu trúc (Moreno et al. 1998). Ở Pseudomonas
aeruginosa, một trong những vi khuẩn gây bệnh ở ngƣời, alginate đƣợc coi là một yếu
tố gây độc trong quá trình xâm nhiểm của vi khuẩn vào biểu mô (Gacesa and Russell
1990). Từ các đặc điểm có liên quan alginate đƣợc quan tâm nhiều trong các lĩnh vực
màng sinh học (biofilm) và vật liệu sinh học. Ở vi khuẩn alginate đƣợc tổng hợp ở
dạng polymannuronic acid, trải qua quá trình biến đổi hoá học bao gồm quá tình acetyl
hoá và sự epimer hoá diển ra trong quá trình vận chuyển periplasmmic trƣớc khi đƣợc
đƣa ra ngoài qua màng. Alginate với các đặc tính đặc biệt của nó đã đƣợc tăng cƣờng
cho những ứng dụng trong hoá sinh và y học. Các chủng vi sinh vật biến đổi gen có thể
tạo ra các loại alginate có các đặc tính mới phù hợp hơn cho các ứng dụng trongy học
và công nghiệp.
Alginate là một polysaccharide thuộc nhóm copolymers mạch thẳng (không phân
nhánh) và không lặp lại bao gồm một lƣợng b-D-mannuronic acid và đồng phân C5
của nó a- L-guluronic acid thông qua cầu nối b-1,4-glycosidic giống nhƣ phân tử
ADN. Là một polimer mang điện tích âm có dạng dung dịch nhớt đến dạng gel khi có
sự hiện diện của các liên kết với các cation hoá trị cao.
Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

10


Hình 2.4: Cấu tạo phân tử alginate
Alginate hiện nay đƣợc sử dụng cho rất nhiều các mục đích công nghiệp khác nhau
và chủ yếu đƣợc thu nhận từ tảo nâu. Bên cạnh những ứng dụng truyền thống nhƣ làm

phụ gia thực phẩm alginate còn đƣợc ứng dụng nhiều trong y học nhƣ làm băng gạc
trong điều trị vết thƣơng hoặc dùng làm phụ gia, tá dƣợc trong sản xuất thuốc. Ngoài ra
alginate còn là chất mang hữu cơ triển vọng đƣợc ứng dụng trong công nghệ lên men
cố định tế bào cũng nhƣ enzyme.
Cố định enzyme trong alginate là một phƣơng pháp rất hiệu quả, đơn giản trải qua
một bƣớc duy nhất, và thực hiện trong điều kiện ôn hoà. Để cố định enzyme trong gel,
ngƣời ta trộn enzyme vào dung dich sodium alginate sau đó nhỏ hỗn hợp này vào một
dung dịch muối đa hóa trị. Tuy nhiên phƣơng pháp này cũng có nhiều giới hạn nhƣ bản
chất hoá học đa dạng của alginate do nó có nguồn gốc tự nhiên và mạng lƣới tạo liên
kết ion trong gel có tính thuận nghịch. Khi trong môi trƣờng phản ứng có nhiều nhóm
có ái lực cao đối cancium nhƣ nhóm phosphate hay nhóm nitrate, calcium sẽ dần bị
thay thế bởi các ion không tạo gel nhƣ sodium hay magnesium làm phá vỡ cấu trúc gel.
Nhƣợc điểm này có thể đƣợc khắc phục bằng cách bảo quản hạt gel trong dung dịch
trung tính có calcium với nồng độ khoảng vài milimol/l và giữ tỉ lệ Na:Ca nhỏ hơn
Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

11

25:1 đối với alginate giàu G và 3:1 đối với alginate giàu M. Ngoài ra có thể thay thế Ca
bởi các ion tạo liên kết hoá trị khác có ái lực cao đối với alginate bao gồm
Pb>Cu>Cd
2
>Ba
2
>Sr
2
> Ca>Co, Ni, Zn>Mn. Ngoài ra tuy đƣợc tinh chế, alginate có
thể vẫn còn chứa một lƣợng nhỏ polyphenol có thể gây ảnh hƣởng cho enzyme.
Các tính chất hoá lý của alginate nhƣ độ nhớt, cơ tính, độ xốp, độ giản nở chịu ảnh

hƣởng phần lớn do tỉ lệ thành phần G và M trong alginate.
Alginate có độ nhớt rất cao khi nó vẫn còn ở trong tế bào, khi đƣợc tách chiết độ
nhớt giảm đáng kể. Độ nhớt phụ thuộc vào phƣơng pháp tách chiết và thành phần có β-
D-Mannuronic (M) hay không. Các đoạn mạch ngắn chứa những đoạn M sẽ không
tham gia vào quá trình tạo gel, do đó nó dễ dàng thoát ra khỏi hạt gel, ở dạng acid hay
muối kết hợp với kim loại hóa trị 2 trở lên, sẽ tạo alginate không tan trong nƣớc, nhƣng
lại có khả năng hút nƣớc và trƣơng nở tạo thể gel. Khi kết hợp với ion kim loại hóa trị
1 nhƣ Na
+
, K
+
, NH
4
… sẽ làm alginate tan trong nƣớc tạo dung dịch có độ nhớt cao.
Trong đó, những loại có độ nhớt vào khoảng 200 ÷ 400 mPa.s là đƣợc sử dụng
nhiều nhất. Khi nồng độ thay đổi, độ nhớt cũng thay đổi theo, ngoài ra đố nhớt còn phụ
thuộc vào:
- Khối lƣợng phân tử: khối lƣợng phân tử càng cao, độ nhớt càng tăng. Các nhà
sản xuất sẽ kiểm soát khối lƣợng phân tử (DP) tƣơng ứng với độ nhớt. Độ nhớt của
alginate từ 10 ÷ 1000 mPa.s ứng với DP khoảng 100 – 1000 đơn vị.
- Nhiệt độ: khi nhiệt độ tăng 10
o
C thì độ nhớt giảm tƣơng ứng 2,5%
Bằng cách tăng tỉ lệ G sẽ làm tăng cơ tính của gel và sự ổn định của nó trƣớc các
yếu tố làm hỏng gel (Na, Mg). Tăng tỉ lệ G làm tăng độ xốp, giảm sự co trong quá trình
tạo gel, và hạt gel không bị trƣơng nở khi làm khô. Tăng tỉ lệ M làm gel nhẹ hơn đồng
thời tăng khả năng co giản. Gel co lại nhiều hơn và giảm độ xốp. Chúng dể bị trƣơng
nở khi làm khô và dể dàng bị tan khi có sự hiên diện của các nhóm EDTA hay
phosphate hơn là gel tạo bởi alginate giàu G.
Sự khuếch tán có vai trò quan trong trong cố định enzyme bằng gel alginate vì vậy

ta phải biết đƣợc kích thƣớc lỗ xốp trên bề mặt gel và tác dụng của nó. Khả năng
khuếch tán của các phân tử nhỏ nhƣ glucose, etanol hay lactate chịu ảnh hƣởng rất ít
Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

12

của gel. Tốc độ khuếch tán các chất này trong alginate rất cao đạt 90% tốc độ khuếch
tán trong nƣớc. Các phân tử lớn nhƣ protein bắt đầu khó khuếch tán và bị giữ lại trong
mạng lƣới gel. Tuy nhiên nghiên cứu cho thấy các phân tử protein có khối lƣợng phân
tử MW>3.10
5
vẫn có thể bị rò rỉ ra khỏi bề gel với tốc độ phụ thuộc vào kích thƣớc
phân tử. Các gel alginate giàu G thƣờng có tốc độ khuếch tán cao. Kích thƣớc lỗ xốp
cũng đƣợc nghiên cứu bằng các phƣơng pháp khác nhau kết quả cho thấy đƣờng kính
lỗ xốp giao động từ 5 – 200 nm trong khi mạng lƣới trên bề mặt hạt gel thì hẹp hơn 5 –
16 nm. Do gel tích điện âm nên các protein trung tính thƣờng không dễ dàng khuếch
tán vào trong gel. Mặt khác sau khi cố định chúng cũng có xu hƣớng thoát ra ngoài. Để
khắc phục nhƣợc điểm này có thể sử dụng các phƣơng pháp tăng cƣờng độ ổn định của
gel đã nói ở trên. Một phƣơng pháp hiệu quả hơn là cho alginate tƣơng tác với các
polycation nhƣ polypeptide hay chitosan tạo thành lớp màng polyanion – polycation.
Đƣờng kính lỗ xốp của gel calcium alginate có thể đƣợc giảm đáng kể bằng cách làm
khô hạt gel, sử dụng alginate giàu guluronic acid [6].
2.3.2 Chất mang vô cơ
a) Celite
Celite hay còn gọi là diatomic là một loại đá trầm tích có chứa silic, dể vở vụn, dễ
nghiền vụn, giống nhƣ đất nhẹ hay có dạng nhƣ đá phấn. Celite thƣờng có màu sáng,
xốp, nhẹ (nổi trên nƣớc cho đến khi đạt đƣợc độ bảo hoà) và điều đặc biệt quan trọng là
trơ với hầu hết các chất lỏng và khí. Nó dẫn nhiệt kém và có điểm nóng chảy rất cao.
Các sản phẩm thƣơng mại thƣờng có thành phần đƣợc phân tích khoảng 80 – 90%

silica, có thể lên đến 95% (SiO
2
), cộng thêm thành phần alumina 2 – 4 % và hematite
(0,5 – 5%). Thành phần phân tích thƣờng mất đi 4 – 6% do bị đốt cháy. Khối lƣợng
riêng nhỏ khoảng 320 – 640 g/l với phần rỗng chiếm tới 80 – 90 %, celite có thể chứa
từ 10% đến hơn 60% nƣớc. Vì vậy đá ở dạng khô có thể hấp phụ một lƣợng nƣớc nặng
hơn gấp nó từ 1.5 đến 3 lần. Đá ở dạng bột tự nhiên có khối lƣợng riêng dao động từ 80
– 250 g/l. Điểm nóng chảy dao động từ 1000 – 1750
o
C.
Các sản phẩm celite thƣơng mại có kích thƣớc hạt tốt, hình dạng không nhất định,
hạt xốm, có bề mặt lớn, khả năng hấp phụ chất lỏng cao và trơ hoá học[14].
Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

13

b) Silica gel
Silica gel hay gel acid silixic là một chất rất sẵn có trong tự nhiên có nhiều tính
năng ƣu việt rất đƣợc quan tâm hiện nay. Silica gel thực chất là dioxit silic, ở dạng hạt
cứng và xốp (có vô số khoang rỗng li ti trong hạt). Công thức hóa học đơn giản của nó
là SiO
2
.nH
2
O (n<2), đƣợc sản xuất từ natri othosilicat (Na
2
SiO
4
) hoặc silic tetraclorua

(SiCl
4
). Hiện nay silica gel có vai trò rất quan trọng trong công nghệ hóa học từ đơn
giản đến phức tạp. Silica gel đƣợc dùng rất nhiều làm xúc tác trong tổng hợp hữu cơ
hóa dầu, lọc nƣớc,
Khi silica gel đã ngậm no nƣớc, ta có thể tái sinh nó bằng cách sấy ở nhiệt độ
khoảng 150 °C trong khoảng nửa giờ.
Silica gel có hiệu quả hút ẩm và tính kinh tế cao so với các loại chất hút ẩm khác.
Nơi sản xuất silica gel nhiều nhất là Thƣợng Hải, Thanh Đảo của Trung Quốc [14].
2.4 Enzyme amylase
Alpha amylase ( - 1,4 glucan – glucanhydrolase. Mã số 3.2.1.1) là enzyme thủy
phân liên kết 1,4 glucozit ở giữa chuổi mạch polysaccharide. Dƣới tác dụng của
enzyme α-amylase, tinh bột sẽ mất khả năng tạo màu với iod và độ nhớt bị giảm rất
nhanh. Enzyme α-amylase thƣờng bền nhiệt hơn các loại amylase khác và độ bền cấu
trúc tăng lên khi có mặt ion canxi.[2]
Sản phẩm thủy phân tinh bột của α-amylase bao gồm maltose, glucose, dextrin
phân tử lƣợng thấp trong đó chủ yếu là dextrin có phân tử lƣợng thấp. Có nhiều nguồn
amylase bao gồm từ nấm mốc và vi khuẩn. Trong đó α-amylase của vi khuẩn có nhiều
ƣu điểm nhƣ hoạt động ở khoảng pH rộng (5 – 9, pH tối ƣu là 6,5 – 7) và khả năng
chịu nhiệt (nhiệt độ đƣờng hoá có thể >75
o
C thậm chí có thể hoạt động ở 90 – 100
o
C)
[2].




Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate

2010

14

2.4.1 Chế phẩm Termamyl
Chế phẩm Termamyl 120L, là chế phẩm của enzyme α-amylase chịu nhiệt đƣợc sản
xuất từ chủng vi sinh vật Bacillus licheniformis. Chế phẩm này có dạng dung dịch lỏng
hoặc hơi sánh, màu nâu nhạt hoặc đậm tuỳ theo mẻ sản xuất. Tuy nhiên độ đậm nhạt
của màu không thể hiện hoạt tính của enzyme. Các chất đƣợc sử dụng để ổn định
enzyme bao gồm methionine, sodium chloride và sucrose. Cụ thể một vài đặc tính của
chế phẩm nhƣ sau
Bảng 2.1: Một số đặc điểm của chế phẩm Termamyl

Giới hạn dƣới
Giới hạn trên
Đơn vị
α- Amylase unit
KNU-T
120
138
/g
pH ở 25
o
C
5.5
7.0

Khối lƣợng riêng
trung bình
1.26

g/ml
Tổng chất rắn thấy
đƣợc

50000
/g
Coliform

30
/g
E.Coli

Không có
/25 g
samonella

Không có
/25 g
Chế phẩm Termamyl hoạt động tối ƣu trong khoảng pH từ 6.0 – 6.4 tuy nhiên vẫn
có thể ứng dụng ở những khoảng pH thấp hơn nhƣ 5.5 – 5.8.

2.4.2 Một số công trình nghiên cứu cố định enzyme
a) Nghiên cứu cố định α-amylase trên silica gel và alginate
Đã có rất nhiều nghiên cứu cố định enzyme α-amylase trong đó phổ biến nhất hiện
nay là cố định trong alginate. Trong nghiên cứu cố định α-amylase chịu nhiệt trong
alginate [12] hiệu suất cố định thu đƣợc lên đến 65 %. Khoảng pH hoạt động tối ƣu của
enzyme cố định dịch chuyển về khoảng pH kiềm so với enzynme tự do (7,5 so với 7),
Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

15

nhiệt độ hoạt động tối ƣu của enzyme lên đến 60 – 70
o
C. Nồng độ cơ chất tối ƣu 2 –
3%. Cụ thể ảnh hƣởng của nồng độ sodium alginate nhƣ sau:


Hình 2.5: Ảnh hƣởng của nồng độ sodium-alginate lên hiệu suất cố định protein
Nghiên cứu cho thấy ở nồng độ alginate tối ƣu 4%, ảnh hƣởng của thời gian phản
ứng lên hoạt tính của enzyme tự do và enzyme cố định khác biệt không đáng kể. Vì thế
có thể cho rằng chất mang hầu nhƣ không ảnh hƣởng đến sự khuếch tán của cơ chất.
Kích thƣớc của lỗ trên hạt gel là thích hợp với kích thƣớc của cơ chất.
Ngoài ra hiện nay có rất nhiều nghiên cứu đi theo hƣớng ứng dụng cố định trong
alginate kết hợp với các chất mang khác để khắc phục các điểm yếu của alginate nhƣ
khả năng chịu nhiệt kém đồng thời tăng các đặc tính mong muốn khác nhƣ tính thấm,
độ bền cơ học của chất mang. Một trong các nghiên cứu đó là cố định enzyme α-
amylase đơn và cố định kết hợp với glucoamylase trên các chất mang [8]. Silica gel và
DEAE-cellulose nhốt trong gel alginate là những chất mang hiệu quả nhất. Các đặc
tính ƣa nƣớc và kỵ nƣớc của chất mang đƣợc tạo ra bằng cách phủ lớp vỏ áo
polyethylimine hoặc silanization. Tất cả các enzyme cố định trên chất mang ƣa nƣớc
đều thể hiện hoạt tính cao nhất trong các thí nghiệm. Kết quả rất có triển vọng khi hệ
số K
m
của enzyme cố định thấp hơn của enzyme tự do đƣợc lý giải do khả năng thu hút
cơ chất của chất mang (0.102 mg/ml đối với hydrophilic silica gel and 0.099 mg/ml for
DEAE-cellulose bao gói trong gel alginate so với enzyme tự do 0.199 mg/ml). Khoảng
nhiệt độ tối ƣu của enzyme cố định khoảng 50 – 60
o
C, pH tối ƣu khoảng 5.0 – 5.5.

Nồng độ sodium alginate (%)

H
pr
(%)
Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate
2010

16

Enzyme đồng cố định trên silica gel và DEAE-cellulose nhốt trong alginate giữ đƣợc
92.3 và 88.9% hoạt tính sau 10 lần tái sử dụng.


Hình 2.6: Sơ đồ xử lý enzyme và chất mang đối với chất mang ƣa nƣớc (A) và chất
mang kỵ nƣớc (B).
Trong một nghiên cứu khác α-amylase chịu nhiệt từ chủng Bacillus subtilis đƣợc cố
địng trong gel alginate. Ngoài ra các đặc tính của hạt gel còn đƣợc gia cố thêm bằng
cách bổ sung thêm silica gel vào trong thành phần tạo gel. Hạt gel tạo bởi sodium
alginate 2% (w/v), CaCl
2
5% (w/v) có thể tái sử dụng 20 lần và chỉ mất đi 30% hoạt
tính ban đầu. Thậm chí ngƣời ta còn thu đƣợc hiệu quả và độ ổn định cao hơn khi cho
Enzyme cố định trên silica gel

Enzyme cố định trên silica gel - polyethyleneimine
Enzyme cố định trên polyethylênimine – DEAE cellulose
Silica gel
Silica gel