nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật sử dụng trong phòng trừ bệnh héo xanh lạc và vừng

ViÖn Thæ nh−ìng N«ng hãa






BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI:

Nghiªn cøu s¶n xuÊt chÕ phÈm vi sinh vËt
sö dông trong phßng trõ bÖnh hÐo xanh
l¹c vµ võng


CNĐT: Lª Nh− KiÓu











8862

HÀ NỘI - 2010

1
BÁO CÁO TỔNG KẾT
I. MỞ ĐẦU
Cây vừng có tên khoa học là Sesaum indicum L, được trồng chủ yếu vào
mùa Hè (trồng tháng 6 thu hoạch tháng 9) là cây lấy dầu với bộ phận thu hoạch
chủ yếu là hạt. Nguồn gốc tự nhiên chính xác của cây vừng vẫn chưa được xác
định, dù nhiều loài cây trong hoang dã có liên quan đã hiện diện ở châu Phi và một
số nhỏ hơn ở Ấn Độ. Đây là một cây được thuần hóa ở các vùng nhiệt đới kh
ắp
Thế giới và được trồng để lấy hạt ăn do hạt có hàm lượng chất béo và chất đạm
cao. Hạt vừng có hàm lượng dầu rất cao (từ 38 – 50 % tuỳ thuộc vào từng giống
vừng), giá trị sử dụng chủ yếu là làm thực phẩm, kể cả ở dạng dầu tinh khiết
cũng như ở dạng hạt thô. Bên cạnh giá trị dinh dưỡng, cây vừng còn là loại cây
ch
ịu hạn, có thể trồng ở các vùng đất nghèo dinh dưỡng như đất pha cát, đất
cát. Bên cạnh đó vừng là loại cây nhiệt đới có thể chịu được nhiệt độ từ 25-
32
0
C, vì vậy chúng được trồng khá rộng rãi ở các tỉnh miền Trung và nam
Trung Bộ. Vòng đời sinh trưởng của vừng khá ngắn chỉ vào khoảng từ 60 đến
90 ngày nên lợi ích do phát triển trồng vừng đem lại là rất cao. Hiện nay, diện
tích trồng vừng trên Thế giới tương đối lớn, sản lượng hàng năm 2 triệu tấn,
chủ yếu ở Châu Á (55 – 60 %), Châu Mỹ (18 – 20 %), Châu Phi (18 – 20 %),
ngoài ra châu Âu, châu Đại Dương trồng không nhiều và rải rác. Các qu
ốc gia
trồng vừng trên Thế giới là Ấn Độ 400.000 tấn/năm, Trung Quốc 320.000
tấn/năm, Su Đăng 200.000 tấn/năm, Mêxicô 180.000 tấn/năm. Tại Việt Nam
vừng được trồng nhiều tại các tỉnh Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Nam,

Quảng Bình và một số ít tại vùng Bắc Bộ.
Vừng thường bị một số sâu bệnh hại như: Sâu khoang: Sâu ăn trụi lá,
cắn đứt ngang cây. Th
ời kỳ ra hoa làm quả thì làm rụng hoa, đục khoét quả làm
ảnh hưởng tới năng suất. Sâu cuốn lá: Sâu thường tập trung ở trên lá ngọn và
nhả tơ cuốn hai mép lá vừng vào nhau để sinh sống, sâu ăn biểu bì làm hỏng lá,

2
ảnh hưởng đến quang hợp của cây, làm giảm năng suất. Rệp hại vừng: Rệp
sống tập trung từng đàn trên thân, lá ở phần ngọn, quả non. Rệp chích hút nhựa
cây làm cho cây kém phát triển, lá ngọn xoắn lại, hoa ít, quả nhỏ ảnh hưởng tới
năng suất. Bệnh chết thối do nấm (bệnh thán thư): Bệnh gây héo lá nhưng
không đột ngột, khi bị nặng làm cho cây vừ
ng bị khô, các bó mạch và phần
trong thân không chuyển màu nâu, bóp cây không có dịch nhầy. Bệnh phát triển
mạnh ở những ruộng bón phân không cân đối, độ ẩm đất cao. Bệnh héo xanh
vi khuẩn do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra làm cho vừng bị héo xanh
đột ngột, lá vẫn giữ màu xanh, cắt ngang cây thấy bó mạch có màu nâu sẫm, rễ
bị đen và thối, bóp nhẹ chỗ bị thối có dịch nhầy trắng tiết ra. Bệnh gây hại từ
lúc cây con đến khi thu hoạ
ch, vi khuẩn thường ký chủ trên nhiều loại cây nhất
là cây họ đậu, họ cà.
Cây lạc (Arachis hypogaea) cũng là cây lấy dầu và cho hiệu quả kinh tế
cao, đem lại kinh tế cho nhiều vùng sản xuất. Lạc không yêu cầu khắt khe về độ
phì của đất. Do đặc điểm sinh lý của lạc, đất trồng lạc phải đảm bảo cao ráo,
thoát nước nhanh khi có mưa to. Thành phần cơ giới của đấ
t trồng lạc tốt nhất
là loại đất thịt nhẹ, cát pha, để đất luôn tơi, xốp và có độ pH từ 5,5-7; Nhiệt độ
là yếu tố ngoại cảnh chủ yếu có ảnh hưởng đến thời gian sinh trưởng của lạc.
Nhiệt độ trung bình thích hợp cho suốt đời sống cây lạc là khoảng 25-30

0
C và
thay đổi theo giai đoạn sinh trưởng của cây; Nước là yếu tố ngoại cảnh có ảnh
hưởng lớn nhất đến năng suất lạc. Tuy lạc được coi là cây trồng chịu hạn, song
thực ra lạc chỉ chịu hạn ở một giai đoạn nhất định. Độ ẩm đất trong suốt thời
gian sinh trưởng của lạc yêu cầu khoảng 70-80 % độ ẩm giới hạn
đồng ruộng.
Yêu cầu này có cao hơn một chút ở thời kỳ ra hoa, kết quả (80 – 85 %) và giảm
ở thời kỳ chín của hạt. Lạc được trồng chủ yếu vào các thời vụ sau:
Vụ Xuân: Thời gian gieo từ 20/1-25/2 hàng năm, tập trung chủ yếu từ
01-15/2. Riêng khu vực trung du và miền núi gieo sớm hơn 7-10 ngày.

3
Vụ Hè - Thu: Gieo tốt nhất từ 1/6-15/6 và gieo ngay sau khi thu hoạch
cây trồng vụ Xuân càng sớm càng tốt.
Vụ Thu - đông: Thời gian gieo từ 25/8-25/9.
So với cây lương thực và nhiều loại cây khác, cây lạc và cây vừng là
những cây có giá trị kinh tế cao trên một đơn vị diện tích gieo trồng. Do vậy,
phát triển trồng lạc và vừng không chỉ thúc đẩy chuyển dịch cơ cấu cây trồng
trong nông nghiệp mà còn nâng cao thu nhập cho người sản xuất.
Th
ực tế trồng lạc ở các nước trên Thế giới nói chung và ở Việt Nam nói
riêng gặp rất nhiều khó khăn, do xuất hiện nhiều loại sâu bệnh gây hại chủ yếu
như: Sâu hại cây con: Sâu xám, phá hại khi cây mới mọc đến 2 - 3 lá, sâu cắn
ngang thân cây. Sâu làm giảm mật độ cây trên đồng ruộng. Sâu hại lá: Có rất
nhiều (sâu xanh, sâu khoang, sâu cuốn lá, sâu đo, sâu róm, rệp ). Sâu đục
quả: Quả lạc ở d
ưới đất, nên sâu đục quả ít, thường gặp là “sùng trắng” (sâu
non của bọ cánh cứng - bọ hung, xén tóc, cánh cam). Bệnh lở cổ rễ: Bệnh do
nấm phá hại cây non (từ khi mọc đến 3 lá). Nấm bệnh (nấm trắng và nấm đen)

phá huỷ mạch dẫn vùng cổ rễ khiến cho cây lạc bị chết do không hút được nước
và dinh dưỡng. Bệnh hại nặng khi đất bị quá ẩm, dí đất. Vì vậy, cầ
n tạo điều
kiện cho đất thông thoáng, độ ầm đất khoảng 70 – 75 % là thích hợp. Bệnh
đốm lá gồm 2 loại nấm gây bệnh đốm đen và đốm nâu. Bệnh thường xuất hiện
sau khi lạc ra hoa và phá hại vào cuối thời kì sinh trưởng (từ ra hoa đến chín).
Bệnh thường không làm chết cây, nhưng làm giảm năng suất do làm giảm số
quả và trọng lượng quả. Bệnh héo xanh vi khuẩn là b
ệnh phổ biến và gây hại
nghiêm trọng cho lạc xuân ở các tỉnh miền Trung. Bệnh thường xuất hiện từ khi
cây có 5 lá thật đến thời kì quả phát triển. Bệnh gây chết cây, có khi chết từng
vạt, ảnh hưởng xấu đến năng suất do làm giảm số cây thu hoạch, bệnh nặng có
thể làm giảm tới 80 % năng suất. Bệnh đặc biệt phát triển nhanh trong mùa gió
Lào. Hiện chưa có thuốc đặc tr
ị bệnh này. Bệnh héo xanh vi khuẩn đã phát sinh
ở hầu hết các tỉnh, thành phố: Hà Nội, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh, Thái Nguyên,

4
Thanh Hoá, Nghệ An đã gây thiệt hại nặng nề về kinh tế cho người nông dân,
có nơi có lúc bệnh đã gây thiệt hại nặng tới mức gây chết 80-100 % cây trồng.
Bệnh gây nghiêm trọng không chỉ ở những vùng chuyên trồng lạc mà còn ở cả
những vùng mới trồng. Bệnh tăng rất nhanh ở những vùng trồng lạc truyền
thống và trồng liên tục từ năm này sang năm khác. Tình hình gây hại là như v
ậy
nhưng cho tới nay những nghiên cứu về bệnh héo xanh vi khuẩn ở lạc và vừng
chủ yếu chỉ giới hạn trong phạm vi xác định mức độ thiệt hại, sự phân bố của
bệnh và bước đầu xác định nguồn gen kháng trong tập đoàn các giống lạc và
vừng hiện có. Trong thời gian gần đây đã có phân hữu cơ vi sinh đa chức năng
có khả năng hạn ch
ế bệnh héo xanh trên lạc từ 15-20 %.

Tuy nhiên do bản chất kháng bệnh và sự biến đổi đặc tính độc của các
chủng vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên toàn Thế giới, cho nên các biện pháp
phòng trừ bệnh này càng trở nên phức tạp và khó khăn. Đặc biệt sử dụng thuốc
bảo vệ thực vật hóa học đã không mang lại hiệu quả như mong muốn mà còn
gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới môi trường. Ngày nay, các biện pháp phòng
chố
ng thay thế bằng phòng trừ sinh học đang thu hút được sự quan tâm của
nhiều phòng thí nghiệm trên Thế giới và trong nước, kết quả cho thấy nhiều
hứa hẹn và đây cũng sẽ là biện pháp rất cần thiết để thay thế các loại thuốc bảo
vệ thực vật hoá học trong tương lai. Trên cơ sở đó, được sự đồng ý của Bộ NN
& PTNT, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên c
ứu sản xuất chế phẩm vi sinh
vật sử dụng trong phòng trừ bệnh héo xanh lạc và vừng” thuộc Chương trình
CNSH Nông nghiệp, bắt đầu từ tháng 01 năm 2007 đến tháng 12 năm 2009.
1.1. MỤC TIÊU
Mục tiêu chung: Tạo được chế phẩm sinh học có hiệu lực và an toàn sinh học
phục vụ phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn trên lạc và vừng
Mục tiêu cụ thể:
- Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả
năng đối kháng cao với các chủng

5
vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên lạc và vừng.
- Sản xuất được chế phẩm sinh học phục vụ phòng chống bệnh héo xanh lạc và
vừng.
1.2. Đối tượng nghiên cứu:
- Bệnh héo xanh vi khuẩn do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra,
- Vi khuẩn Ralstonia solanacearum,
- Vi khuẩn đối kháng vi khuẩn Ralstonia solanacearum,
- Cây lạc và vừng.

1.3. Phạm vi nghiên cứu
- Trong phòng thí nghiệm, nhà lưới và các thí nghiệm ngoài đồng ruộng tại Hà
Nội, Nghệ An.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực ti
ễn của đề tài
- Kết quả của đề tài đã làm sáng tỏ hơn nữa khả năng ứng dụng các chủng vi
sinh vật đối kháng trong công tác bảo vệ thực vật, đây là vấn đề có ý nghĩa khoa
học cao, từ những kết quả này sẽ mở ra hướng ứng dụng rỗng rãi hơn nữa các vi
sinh vật đối kháng trong nông nghiệp trên các đối tượng cây trồng khác nhau.
- Về thực tiễ
n: các kết quả đã minh chứng rõ nét hiệu quả của sản phẩm đề
tài, cụ thể sản phẩm đã được ứng dụng để phòng chống bệnh héo trong sản xuất
lạc và vừng hiện nay, đã mang lại hiệu quả kinh tế và môi trường.
1.5. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
Trong bối cảnh vấn đề dịch bệnh đối với cây trồng và vật nuôi đang diễn
biến rất phức tạp, đây là hiện tượng báo hiệu một sự kháng thuốc của nhiều chủng
vi sinh vật gây bệnh, nhiều loại kháng sinh đã không còn tác dụng trong việc
phòng chống một số bệnh nguy hiểm. Đối với cây trồng đã xuất hiện hàng loạt các
loại sâu bệnh như: đạo ôn, khô vằn, đốm nâu, rầy nâu, héo xanh, thối thân, thối
quả…v….v… rất khó phòng trừ bằng thuốc hóa học. Do
đó, việc tìm giải pháp để

6
giải quyết vấn đề trên là cần thiết và cấp bách, trong đó Công nghệ sinh học Nông
nghiệp đóng vai trò quan trọng.
* Bệnh héo xanh vi khuẩn

Bệnh héo xanh cây trồng do Ralstonia solanacearum gây ra, là một loại
bệnh có nguồn gốc từ đất rất phổ biến trên Thế giới.
Từ năm 1965, Kelman và Sequeira đã tìm ra được một số cơ chế phát sinh

của bệnh. Nhờ khả năng thiết lập một quần thể động trong quản bào và mạch gỗ
của cây, nó khác biệt với phần lớn vi khuẩn gây thối lá, thối rữa và gây khối u.
Ngày nay, nhi
ều công trình nghiên cứu về bệnh héo xanh cây trồng đã đưa ra
những bằng chứng khoa học và kết luận có giá trị làm cơ sở cho các nghiên cứu
tiếp theo.
Bệnh héo xanh vừng:
Cây vừng (Sesaum indicum L) là cây lấy hạt. Hạt vừng có hàm lượng dầu
rất cao, giá trị sử dụng chủ yếu là làm thực phẩm, kể cả ở dạng dầu tinh khiết cũng
như hạt thô. Sản lượng vừ
ng trên Thế giới là rất lớn khoảng 2 triệu tấn/năm, chủ
yếu ở Châu Á (55 - 60%), Châu Mỹ (18 - 20%), Châu Phi (18 - 20%), ngoài ra
còn có ở Châu Âu, Châu Đại Dương nhưng không nhiều. Các quốc gia trồng nhiều
vừng trên Thế giới là Ấn Độ (400.000 tấn/năm), Trung Quốc (320.000 tấn/năm),
Su Đăng (200.000 tấn/năm), Mêxicô (180.000 tấn/năm).
Cây vừng thường gặp bệnh héo do vi khuẩn R. solanacearum gây nên, nhiều
lúc, nhiều nơi đã trở thành những d
ịch bệnh làm chết cây hàng loạt. Bệnh đã làm tăng
tỉ lệ cây chết có khi đến 70-80%, làm thất thoát đáng kể năng suất cây vừng.
Bệnh héo xanh lạc
Cây lạc (Arachis hypogaea) được trồng chủ yếu vào mùa Xuân (từ tháng 2
tới tháng 6). Mặc dù điều kiện và môi trường thuận lợi cho trồng lạc nhưng năng
suất vẫn ở mức thấp (1.09 tấn/ha). Bệnh héo xanh ở lạc gây nên bởi
Ralstonia
solanacearum là loại bệnh chính phổ biến rộng rãi và gây nên nhiều thiệt hại cho

7
người trồng trọt, thậm chí có những vùng thiệt hại tới 70-80%. Bệnh gây nghiêm
trọng không chỉ ở những vùng chuyên trồng lạc mà còn ở cả những vùng mới
trồng. Bệnh tăng rất nhanh ở những vùng trồng lạc truyền thống và trồng liên tục

từ năm này sang năm khác.
* Vi sinh vật đối kháng

Vi sinh vật (VSV) trong tự nhiên như vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, vi-rút có
mặt ở khắp mọi nơi nhưng đất là môi trường thích hợp nhất. Do đặc điểm sinh
sống của chúng có thể chia thành ba nhóm: có ích, gây bệnh và đối kháng. VSV
đối kháng có khả năng khống chế sinh học, tác động đối kháng lên nhóm VSV gây
bệnh, tiêu diệt hoặc hạn chế quá trình sống của chúng. Vì vậy, VSV đối kháng rất
có lợi cho việc bảo vệ cây trồ
ng khỏi bị sâu bệnh tấn công [17].
Trong quần thể vi sinh vật, mỗi loài đều phải đấu tranh sinh tồn suốt cả quá
trình tiến hóa dưới các hình thức khác nhau và rất linh hoạt. Vi sinh vật có thể
thay thế các tác nhân cạnh tranh của chúng bằng cách nhân lên với số lượng lớn,
hoặc có thể hình thành các chất đặc hiệu hay không đặc hiệu trong quá trình
chuyển hoá vật chất, nhằm ức chế sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật khác.
Các chất không
đặc hiệu có thể là các axít hữu cơ, rượu, hoặc các hợp chất khác.
Đặc biệt ở một số loài vi khuẩn và nấm đã sử dụng cơ chế siderophores.
Sử dụng vi sinh vật đối kháng đã được sự quan tâm và đầu tư rất lớn của
nhiều phòng thí nghiệm trên Thế giới trong nhiều thập kỷ qua.
Chae Gun Phae đã cho rằng, chủng Bacillus subtilis NB22 có thể tiết vào
đất chất iturin, ch
ất này có khả năng ức chế sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn
gây bệnh héo xanh. Trigalet, Frey và Demery đã đưa ra một bức tranh toàn cảnh
gồm các công trình nghiên cứu của nhiều tác giả về biện pháp phòng trừ sinh học
bệnh héo xanh do vi khuẩn R. solanacearum như sau:
Khi sử dụng các biện pháp phòng trừ sinh học đều cho thấy mức độ giảm
quần thể R. solanacearum một cách hiệu quả, mặc dù hầu hết các kết qu
ả đều ở

8
phạm vi phòng thí nghiệm, nhà kính và quy mô nhỏ ngoài đồng ruộng [18]. Các
chất giống như kháng sinh sinh ra bởi Pseudomonas cepacia và Pseudomonas
glumae, cần được nghiên cứu kỹ hơn để đánh giá vai trò tiềm tàng của chúng
trong việc phòng chống R. solanacearum ở trên đồng ruộng [16], [26].
Trong hầu hết các trường hợp thì các thực nghiệm trên đồng ruộng vẫn còn
nhiều hạn chế, có thể do sự xâm nhiễm của các nhân tố phòng trừ sinh học vào
trong rễ cây còn quá y
ếu, hoặc do sự phụ thuộc quá nhiều vào các điều kiện tự
nhiên [12], [23].
* Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng ở ngoài nước:

Vi sinh vật đối kháng với một số bệnh cây trồng đã được các nhà khoa học
trên Thế giới nghiên cứu và ứng dụng từ những năm đầu của thế kỷ XX [28], [30],
[31], [32].
- Năm 1924, Porter đã xử lý hạt lúa mì với những thể vi khuẩn đối kháng, rồi
nhiễm với nấm Helminthosporium. Kết quả những hạt đã nảy mầm bình thường
hoặc không bị nhiễm b
ệnh, hoặc bị nhiễm rất nhẹ.
- Năm 1939, Cholonyi quan sát thấy độc tính của dịch chiết khoai tây có khả
năng giết chết vi khuẩn và tính độc của dịch chiết tăng khi củ đã nẩy mầm.
- Năm 1940, 1948, Weindling đã sử dụng nấm Trichoderma lignorum để bảo
vệ những cây cam con khỏi bệnh do Rhizoctonia gây ra. Theo nhiều tác giả loài
nấm này cũng bảo vệ cả dưa chuột và quả
lê.
- Năm 1952, Gregory nuôi cấy Bacillus sp. B-6, Actinomycetes No 67, nấm
Pecillium patulum và quan sát sự hình thành những chất kháng khuẩn trong đất.
- Năm 1953, Petrusheva sử dụng dịch nuôi cấy của Actinomycetes như là một
chất đối kháng với bệnh thối hạt thuốc lá gây nên bởi nấm Thielaviopsis basicola.
Khi đất được xử lý với dịch vi khuẩn đối kháng thì cây phát triển bình thường, khi

không có dịch đối kháng trong đất thì tỉ lệ cây chết là 70%.

9
- Năm 1953, Gurinovich đã sử dụng dịch nuôi cấy của Actinomycetes và
những thể đối kháng vi khuẩn để chống lại bệnh thối của bắp cải, gây nên bởi vi
khuẩn không hình thành bào tử Pseudomonas campestris khi những thể đối kháng
được đưa vào đất thì cây vẫn phát triển bình thường.
- Năm 1955, Kuzina sử dụng vi khuẩn đối kháng bệnh héo của bông gây nên
bởi Verticillum. Tác giả đã xử lý hạt bông với vi khu
ẩn trước khi gieo. Kết quả tỉ
lệ cây chết ở phần đối chứng là 54%, sau khi được xử lý với vi khuẩn đối kháng tỉ
lệ này là 8% - 9%.
- Năm 1978, Cuppels và cs đã kết luận rằng, nhiều chủng vi khuẩn có khả
năng sản sinh bacteriocin và một số chủng sinh bacteriocin không độc có khả
năng giảm bệnh héo xanh của cà chua.
- Năm 1986, Aspiras R.B và Cruz A. R cho rằng Bacillus polymyxa và P.
fluorescens có khả năng giảm b
ệnh héo xanh cà chua ở điều kiện nhà kính.
- Năm 1990, Tanaka và cs đã phát hiện được các thực khuẩn thể không độc có
vai trò tiềm tàng trong phòng trừ sinh học đối với R. solanacearum.
- Năm 1993, Hsu đã cho rằng cải tạo đất bằng một hỗn hợp theo công thức
ammonium sulphat, bột xương, bột hải ly, cua, glixerin, sỉ silic và valin đã làm
tăng tần xuất tạo khuẩn lạc của các chủng P. fluorescens ở đầu rễ, chính vì v
ậy đã
làm tăng khả năng phòng chống bệnh héo xanh cho cây trồng ở các thực nghiệm
trong chậu.
- Năm 1993, Elphinstone và Aley đã chỉ ra một loài khác là P. cepacia được
phân lập từ rễ ngô có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh héo xanh trong
phòng thí nghiệm và trong chậu.
- Jaime R. Montealegre đã sử dụng chủng vi khuẩn đối kháng trong kiểm soát

bệnh do Rhizoctonia solani gây ở cà chua [24], [21].
- Karden Mulya đã công bố kết quả việc sử dụ
ng phương pháp nhúng rễ cây
cà chua non trong dung dịch nuôi cấy P. fluorescens PfG32 trước khi trồng, P.
fluorescens PfG32 được phân lập từ vùng rễ cây hành.

10
- A. Muslim đã công bố khả năng kiểm soát bệnh do nấm Fusarium
oxysporum f. spp. spinaciae (FOS) của 4 chủng Rhizoctonia (G1, L2, W1 và W7)
đạt 77% - 97%.
- Nobutaka đã công bố chủng Serratia marcescens B2 được phân lập từ vùng
rễ cây cà chua, có khả năng ức chế sự phát triển của một vài loại nấm gây bệnh và
mốc xám ở cây hoa anh thảo gây nên bởi Botrytis cinerea và Fusarium oxysporum
f.spp. cyclaminis. S. marcescens B2 có tạo ra enzym phân giải như chitinaza.
- Nhiều tác giả đ
ã đưa ra cơ chế siderophores và kháng sinh như là những
nhân tố đối kháng nấm và vi khuẩn rất hiệu quả [19], [20, [25].
- B.F. Hu đã phân lập được 2 chủng vi khuẩn đối kháng Pseudomonas spp.
(P751) và Bacillus cereus (B752) từ lá thông. Chúng có khả năng ức chế sinh
trưởng và phát triển của 9 loài nấm và côn trùng, 2 chủng này an toàn đối với
người, thực vật và động vật, ức chế bệnh và tăng năng suất cây trồng như lúa, lúa
mì, thuốc lá, vải, trà, rau và c
ỏ
- Ciampi-Panno đã tách được chủng P. fluorescens BC8 có thể ức chế mạnh vi
khuẩn gây bệnh héo xanh ở khoai tây, đặc biệt khi hạt được bao bọc một lớp vỏ vi
khuẩn P. fluorescens BC8. Dường như vi khuẩn này có thể xâm nhập được vào
cây chủ qua hệ thống rễ, song hiệu quả kháng bệnh chưa cao, thực tế sự nhiễm
bệnh ở củ vẫn xảy ra.
- Hiện nay, nhiều loạ
i chế phẩm phòng trừ sinh học có nguồn gốc sinh học

khác nhau đã được lưu hành trên Thế giới như: Xentari 35 WDG là sản phẩm của
hãng Abbott, thành phần chính gồm Bacillus thuringensis var. aizawai 3500
BIU/mg. Delfin WG 32 BIU là sản phẩm của hãng Sandoz Agro, Thụy Sĩ, thành
phần chính gồm Bacillus thuringensis var. kurstaki 32 BIU/kg.
- MVP 10 FS là sản phẩm của Mỹ. MVP 10 FS được đặc chế bằng công
nghệ biến nạp gen cao cấp của Mỹ, chứa độc tố Bacillus thuringensis var.
kurstaki, đượ
c bảo quản bằng màng tế bào cứng của vi khuẩn Pseudomonas
fluorescens, thành phần gồm độc tố delta-endotoxin của Bacillus thuringensis var.

11
kurstaki, nước và các phụ gia [27]. VBt là sản phẩm của Viện Công nghệ Sinh học
Hải Nam- Trung Quốc. Aztron 7000DBMU là sản phẩm của hãng Abbott, Mỹ.
Tập kỳ 1.8EC là sản phẩm của xạ khuẩn Streptomyces avermitilis v v
- Một số tác giả đã phát hiện được một số chủng vi sinh vật có khả năng đối
kháng với R. solanacearum như: Pseudomonas fluorescens; Pseudomonas
glumae; Pseudomonas cepacia; Bacillus sp.; Erwinia sp. và các thể đột biến của
R. solanacearum không độc.
Theo nhà nghiên cứu bệnh học thực vật David Schisler thuộc sở Nông
nghiệp Hoa Kỳ (ARS), vi khuẩn phát sinh tự nhiên có thể cạnh tranh với vi nấm F.
graminearum về chất dinh dưỡng tiết ra từ các bao phấn của cây lúa mì. Trong các
cuộc thử nghiệm, các công thức phun xịt vi khuẩn có lợi trên các miếng đất trồng
hai loại cây lúa thương mại đã làm giảm đi tính khắc nghiệt của bệnh vảy nấm
được 63%. Kết quả là các dòng trao
đổi chất choline (CM) có thể tham gia vào các
vi khuẩn đối kháng chống bệnh vảy nấm khác mà nhóm của Schisler đã nghiên
cứu được, trong đó có men và vi khuẩn tiết chất kháng sinh. Schisler hình dung sẽ
kết hợp các vi khuẩn đối kháng này lại trong một công thức trừ sâu sinh học để
các nông dân có thể xịt lên lúa mì, bổ sung vào phương pháp bảo đảm chống lại
bệnh vảy nấm.

Tóm lại, vi sinh vật đối kháng đã được nhiều nhà khoa học trên Thế giớ
i
nghiên cứu và đã đưa vào sản xuất nhiều loại chế phẩm. Tuy nhiên, hiệu quả trong
lĩnh vực phòng chống bệnh héo xanh cây trồng nói chung, lạc và vừng nói riêng
còn nhiều hạn chế, vì phải phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: kỹ thuật thâm canh,
tiểu vùng khí hậu, giống cây trồng, nhiệt độ, thời vụ canh tác và chính bản thân
của chế phẩm. .v v
* Tình hình nghiên cứu vi sinh vật đối kháng trong nước

Xuất phát từ thực tế về bệnh héo xanh cây trồng ở Việt Nam, các biện pháp
phòng trừ sinh học bệnh này đã và đang được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học
cũng như nhiều phòng thí nghiệm ở nước ta trong nhiều thập kỷ qua.

12
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã nghiên cứu khả năng sinh kháng
sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh của Streptomyces arabicuss 112 và chế
phẩm sinh học Fluorecent từ Pseudomonas fluorescens. Sản phẩm có khả năng
phòng trừ bệnh thối thân, thối rễ và vàng lá ở một số loài cây nhất định [15].
Trường Đại học Sư phạm I - Hà Nội đã nghiên cứu chủng xạ khuẩn
Streptomyces V6 có khả năng sinh kháng sinh ch
ống nấm và vi khuẩn R.
solanacearum [1].
Viện Công nghệ Sinh học cũng đã sản xuất các chế phẩm Bt và một số chế
phẩm sinh học khác có nguồn gốc từ vi khuẩn, xạ khuẩn và vi nấm v v… Các
chế phẩm này đã có tác dụng trong phòng chống một số sâu và bệnh hại cây trồng.
Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam (cũ) đã nghiên cứu tạo chế
phẩm phân bón vi sinh trên cơ
sở một tập hợp đa chủng vi sinh vật, trong đó có vi
khuẩn đối kháng, sản phẩm được sử dụng trong trồng trọt vừa có tác dụng kích
thích sinh trưởng của cây, vừa có khả năng ức chế một số bệnh thực vật gây ra bởi

vi khuẩn hoặc nấm [14].
Viện Bảo vệ thực vật cũng đã sử dụng một số chế phẩm sinh h
ọc có nguồn
gốc từ nấm Metarhizium ansopliae có độc tính cao đối với bọ dừa, Bt (Bacillus
thuringensis) và NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus) có tác dụng trong phòng trừ
một số sâu hại rau. Nấm Trichoderma có khả năng đối kháng với nấm gây bệnh
cây trồng.
Bacterin BT là chế phẩm của Liên hiệp Khoa học sản xuất hoá chất, Tổng
công ty Hoá chất công nghiệp và tiêu dùng, Bộ Công nghiệp nặng, thành phần
chính gồm Bacillus thuringensis var. kurstaki .
Các kế
t quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần thơ, Viện Lúa Đồng Bằng
Sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã
cho thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng
Bằng Sông Cửu Long và Đông Nam Bộ. Các nghiên cứu cho thấy nấm

13
Trichoderma có khả năng tiêu diệt nấm Furasium solani (gây bệnh thối rễ trên
cam quýt, bệnh vàng lá chết chậm trên tiêu) hay một số loại nấm gây bệnh khác
như Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani.
Bộ môn Vi sinh vật – Viện Thổ nhưỡng Nông hoá và phòng Di truyền và
Công nghệ Vi sinh - Viện Di truyền Nông nghiệp đã phân lập được một số chủng
vi khuẩn đối kháng có khả năng ức chế sinh trưởng và phát triển của R.
solanacearum [10], [11].
Các nghiên cứu
đã đưa ra được các chế phẩm vi sinh đối kháng để phòng
trừ một số bệnh cây trồng, nhưng đối với bệnh héo xanh thì cho đến nay các sản
phẩm có giá trị cao (khả năng hạn chế bệnh cao – khoảng hơn 60%) thì hầu như
chưa có. Do đó, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng có khả năng
phòng bệnh héo xanh cây trồng nói chung và cây lạc, vừng nói riêng (đạt trên

60%) là rất cần thiết và c
ấp bách, sản phẩm không những chỉ hạn chế bệnh héo
xanh mà còn mang lại lợi ích kinh tế, xã hội và bảo vệ môi trường sâu sắc.
II. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2. 1. Vật liệu nghiên cứu
2. 1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Cây lạc, vừng, vi khuẩn R. solanacearum và vi sinh vật đối kháng.
- Mẫu đất, cây được thu từ đất trồng lạc, vừng và các cây lạc, vừng có biểu
hiện triệu chứ
ng nhiễm bệnh héo xanh điển hình ở một số tỉnh như: Hà Nội,
Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tây, để phân lập vi khuẩn R. solanacearum.
- Mẫu đất, cây được thu từ đất trồng lạc, vừng và các cây lạc, vừng, cỏ, ớt,
hành và cà chua khỏe để phân lập vi sinh vật đối kháng.
- Các môi trường phân lập vi khuẩn:
+ Môi trường TTC: Để nghiên cứu hình thái khuẩn lạc R. solanacearum
(Kelman, 1954): pepton 10g; cazein hydrolyzat 1g; glucoza 5 g; thạch 20 g; nước

14
cất 1 lần 1000ml; pH = 7,0. Khử trùng ở 0,5 at, 121
0
C, 20 phút, làm lạnh đến 60
0
C
và thêm 5 ml 2-3-5 Triphenyl Tetrazolium Chloride 1 %.
+ Môi trường 523: Để nuôi cấy R.solanacearum: MgSO
4
.7H
2
O (6,25%) 5
ml; K

2
HPO
4
12,5 %) 16,3 ml; yeast extract 4 g; casein hydrolyzat 8 g; sacaroza 10
g; agar 18 g; nước cất 1000 ml; pH = 7,0.
+ Môi trường King B (KB): Để phân lập và thu sinh khối vi khuẩn đối
kháng: Yeast extract 5 g; pepton 20 g; glyxerin 5 ml; K
2
HPO
4
(12,5 %) 12 ml;
MgS0
4
.7H
2
0 (6,25 %) 25 ml; nước cất 1000 ml; pH = 7,0.
+ Môi trường LB: Để nuôi cấy vi khuẩn đối kháng (Luria Broth: Difco
Bacto): tryptone 10 g; yeast extract 5 g; NaCl 5 g; nước cất 1000 ml; pH = 7,0.
- Các môi trường phân lập nấm:
+ Môi trường PDA: Glucoza 20 g; Khoai tây 200 g; Thạch 15 g; nước cất
1000 ml; pH = 7,0.
+ Môi trường Czapek- Dox: Sacarose 30 g; NaNO
3
3,0 g; MgSO
4
.7 H
2
O 0,5
g; KCl 0,5 g; FeSO
4

x 7 H
2
O 0,01 g; K
2
HPO
4
1 g; thạch 15 g; nước cất 1.000 ml
pH = 7,0.
+ Môi trường mước chiết Malt: Glucoza 20 g; Malt extract 20 g Pepton 1 g;
Thạch 20 g; Nước cất 1.000 ml ; pH=5.6
- Các dung dịch đệm chủ yếu để tách ADN vi sinh vật.
+ Đệm CTAB: 100 mM Tris HCl, pH = 9,0; 20 mM NaEDTA, pH =
8,0; 1,4M NaCl; 2 % Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB); 0,2% β-
mercapto ethanol.
+ Đệm gây tan tế bào “Lysis”: 50 mM Tris - HCl; 50 mM EDTA; 3
% SDS; 1% 2 - mercapto ethanol; chloroform; TE : saturated phenol (1/1 phenol
bão hoà trong TE); TE: 10 mM Tris - HCl (pH = 8,0); 1 mM EDTA; 3M NaOAc
(pH = 8,0); isopropanol, ethanol 70 %.
+ Dung dịch mẹ:

15
* Dung dịch phenol bão hoà TE.
* Dung dịch chloroform: isomylacohol (24/1).
* Dung dịch TE (10 mM Tris - HCl pH = 8,0; 1 mM EDTA).
+ Dung dịch đệm điện di 10xTBE: Tris Base: 108 g; boric acid 55 g; 0,5M
EDTA (pH = 8,0) 40 ml; nước 1000 ml.
- Các vật tư khác để sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng: Than bùn, gỉ
đường, N,P,K, khoáng chất vi lượng khác, phụ gia, v v
- Các thiết bị, hoá chất của Bộ môn Vi sinh vật – Viện Thổ nhưỡng Nông
hóa.

2. 1.2. Địa điểm nghiên cứu
Các nội dung cần giải quyết để thực hiện mục tiêu củ
a đề tài sẽ được tiến
hành tại các cơ sở nghiên cứu có uy tín như: Viện Thổ nhưỡng Nông hóa, Viện
Bảo vệ thực vật, Viện Vi sinh vật học và Công nghệ sinh học (Đại học Quốc gia
Hà Nội), Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Sinh học và Môi trường.
Thực nghiệm tại: Vĩnh Phúc, Hà Nội và Nghệ An.
2. 1.3. Thời gian nghiên cứu
3 năm (từ tháng 01 năm 2007 đến tháng 12 năm 2009)

2.2. Nội dung nghiên c
ứu
Nội dung I:
Khảo sát, điều tra tình hình bệnh héo xanh cây lạc, vừng và
phân lập vi khuẩn Ralstonia solanacearum
1.1. Khảo sát, điều tra tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn R. solanacearum trên
cây lạc và vừng ở miền Trung và miền Bắc Việt Nam; (Điều tra tình hình gieo
trồng, bệnh héo xanh lạc vừng ở vùng nghiên cứu, biện pháp phòng trừ bệnh héo
xanh).

16
1.2. Phân lập và tuyển chọn một bộ sưu tập đa dạng các chủng vi khuẩn R.
solanacearum có tính độc cao gây bệnh héo xanh trên cây lạc và vừng; (tuyển
chọn được các chủng vi khuẩn R. solanacearum có tính độc cao, có thể gây chết
cây từ 60 - 85 %, để làm vật liệu nghiên cứu).
Nội dung II.
Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng vi
khuẩn Ralstonia solanacearum
2.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng với R.
solanacearum từ những mẫu đất và những cây lạc và vừng ở nhiều vùng sinh thái

khác nhau;
2.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học các chủng vi sinh vật đối kháng;
2.3. Đánh giá độc tính của các chủng vi sinh vật đối kháng;
2.4. Đánh giá hoạt tính sinh học và phân loại các chủng vi sinh vật đố
i kháng
đến loài;
2.5. Lựa chọn các chủng vi sinh vật đối kháng điển hình để sử dụng sản xuất
chế phẩm vi sinh;
Nội dung III.
Nghiên cứu quy trình sản xuất, ứng dụng chế phẩm vi sinh
vật phòng chống bệnh héo xanh cây lạc và vừng
3.1. Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng bệnh héo
xanh cây lạc và vừng trong phòng thí nghiệm;
3.2. Thử nghiệm chế phẩm vi sinh vật đối kháng bệnh héo xanh cây lạc và
vừng trong phòng thí nghiệm và nhà kính;
3.3. Sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng để sử dụng thử nghiệm trên diện
hẹp ngoài cánh đồ
ng;
3.4. Đánh giá mức độ sống sót của các chủng vi sinh vật trong chế phẩm;
3.5. Nghiên cứu sự tương tác giữa các chủng vi sinh vật trong chế phẩm;
3.6. Đánh giá hiệu quả kinh tế và môi trường của chế phẩm;

17
3.7. Xây dựng quy trình sản xuất và sử dụng chế phẩm vi sinh vật đối kháng
tại hai cơ sở sản xuất (mỗi cơ sở có 10.000m
2
/một loại cây trồng); huyện Mê Linh-
Vĩnh Phúc và Sóc Sơn-Hà Nội.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp điều tra, phân lập vi khuẩn R. solanacearum
- Phương pháp điều tra: điều tra diện tích trồng lạc và vừng ở các địa
phương thuộc miền Trung và miền Bắc Việt Nam. Điều tra tình hình bệnh héo
xanh do vi khuẩn R. solanacearum và F. oxysporum ở các tỉnh [2, 9, 16].
Xác định tỷ lệ % cây bị bệnh héo xanh tại một s
ố ruộng đại diện để có số liệu
về mức độ thiệt hại do bệnh héo xanh gây ra được tính theo công thức [3]:
Tỷ lệ cây nhiễm bệnh =
Số cây bị bệnh
Tổng số cây điều tra
x 100%
- Phương pháp thu mẫu cây bệnh héo xanh: chỉ thu mẫu ở những cây mới bị
bệnh. Mỗi thửa ruộng (khoảng 200 m
2
) thu 2 ÷ 5 đoạn thân sát gốc có kích thước
3cm, giữ trong túi polyetilen. Ghi thời gian thu mẫu (ngày, tháng, năm), địa điểm,
giống cây, Sau mỗi lần cắt, dụng cụ cắt phải được tẩy trùng bằng cồn 70 % để
tránh làm lây lan mầm bệnh giữa các mẫu với nhau.
- Phương pháp xử lý mẫu: Sau khi được rửa sạch bằng nước máy và sát
trùng bề mặt bằng cồn 70 %, các mẫu bệnh được bổ dọ
c và cắt những phần bị
nhiễm bệnh (có màu nâu nhạt), ngâm trong ống eppendorf chứa 1 ml nước cất vô
trùng, để ở nhiệt độ phòng. Sau 5 ÷ 10 phút có thể quan sát thấy một dòng dịch vi
khuẩn màu trắng sữa thôi ra từ mẫu bệnh. Sau 20 phút loại bỏ đoạn thân nhiễm
bệnh ra khỏi ống dịch thôi vi khuẩn. Những ống dịch này được bảo quản ở nhiệt
độ 20
0
C.
- Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn R.solanacearum: pha
loãng dịch thôi vi khuẩn sao cho có thể thu được các khuẩn lạc riêng biệt sau khi

18
cấy gạt trên môi trường TTC, ủ ở nhiệt độ 28
0
C ± 2
0
C. Theo dõi và ghi kết quả sau
24, 48 và 72 giờ. Từ mỗi nhóm hình thái khuẩn lạc tiến hành chọn 3 đến 5 khuẩn
lạc để cấy vạch trên môi trường 523. Sau 24 ÷ 48 giờ ủ ở nhiệt độ 28
0
C ± 2
0
C, tiến
hành chọn những khuẩn lạc có kiểu hình thái điển hình của loài vi khuẩn và giữ
trong nước cất vô trùng để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo [6, 7, 8].
- Phương pháp đánh giá tính độc của R. solanacearum: sử dụng phương
pháp cắm tăm để gây độc nhân tạo, kiểm tra số cây chết và sống sót theo thời gian,
dựa vào kết quả để đánh giá tính độc của vi khuẩn R. solanacearum theo 5 mức độ
khác nhau theo Winstead và Kelman .
Mức độ độc Triệu chứng của cây
0 Không có triệu chứng
1 Một lá héo hoặc héo từng phần
2 Hai tới ba lá héo hoặc héo từng phần
3 2/3 số lá héo
4 Tất cả lá bị héo xanh
5 Cây chết (lá bị khô)
- Xác định R. solanacearum bằng phương pháp PCR: sử dụng cặp mồi
AU.P759/760 đặc hiệu cho loài vi khuẩn R. solanacearum [29].
AU P.759: GTCGCCGTCA
GCAATCCGGAATCG

AU P.760: GTCGCCGTCA
GCAATGGAATCG
2.3.2. Phương pháp thu mẫu và phân lập nấm F. oxysporum
Mẫu bệnh nấm F. oxysporum được thu từ các thân cây và mẫu đất đã bị nhiễm
bệnh. Phân lập từ thân cây: cắt một phần nhỏ thân cây đã bị nhiễm, sát trùng bề
mặt bằng dung dịch chất tẩy 10 % trong 5 phút, để khô trên giấy thấm, cắt từng
mảnh nhỏ dày khoảng 2-4 mm, đặt 5-6 mảnh trên đĩa môi trường PDA, ủ dưới ánh
sáng huỳnh quang. Các sợi n
ấm sẽ phát triển từ những mảnh thân cây, chuyển

19
những isolates sang đĩa môi trường PDA mới, ủ những đĩa này trong 10-14 ngày,
những khuẩn lạc của F. oxysporum có mầu tím đỏ và được bao phủ bởi một hệ sợi
trắng hồng [4, 5].
Phân lập từ đất theo phương pháp của Komada: hòa loãng mẫu đất thành
các nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ được cấy trên môi trường chọn lọc. Các bước
tiếp theo được tiến hành như trên.
2.3.3. Phương pháp phân lập và tuy
ển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng R.
solanacearum và F. oxysporum.
- Thu mẫu: mẫu là các đoạn thân sát cổ rễ và bộ rễ của những cây lạc và
vừng khoẻ, đang thời kỳ ra hoa kết quả. Mẫu đất được thu ở độ sâu 15 cm ÷ 20
cm, mỗi điểm thu 100g đất, mẫu được đựng trong từng túi polyetilen riêng biệt,
ghi ngày tháng năm và địa điểm thu mẫu.
- Phân lập và tuyển chọn:
(theo Geels và Schippers -1983) [22].
10g đất được khuấy đều trong 90 ml nước cất khử trùng, lắc 30 phút, để
lắng tự nhiên, lấy phần dịch trong để phân lập vi khuẩn đối kháng. Mẫu thu từ các
cây được nghiền trong cối sứ có chứa 1 ml nước cất khử trùng, bỏ cặn, sử dụng
phần dịch để phân lập vi khuẩn đối kháng.

Bước 1: Mỗi mẫu dịch trên được pha loãng đến nồng độ nhấ
t định, sao cho
khi dùng 0,1 ml trải đều trên bề mặt môi trường KB hoặc PDA, ủ ở nhiệt độ
28
0
C÷30
0
C trong 24 ÷ 48 giờ có thể nhìn rõ các khuẩn lạc riêng biệt.
Bước 2: Những khuẩn lạc có sắc tố vàng, nâu hoặc xanh nhạt được hoà
loãng trong các ống eppendorf riêng biệt, dùng 100µl dung dịch trải đều trên bề
mặt đĩa môi trường KB hoặc PDA (mật độ tế bào trong dung dịch sao cho sau khi
ủ ở 28
0
C ÷ 30
0
C trong 24 ÷ 48 giờ có thể nhìn rõ các khuẩn lạc riêng biệt).
Bước 3: Phun dịch vi khuẩn gây bệnh héo xanh phủ lên bề mặt môi trường,
ủ ở nhiệt độ 28
0
C ÷ 30
0
C trong 24 ÷ 48 giờ.

20
Bước 4: Quan sát các đĩa môi trường, nếu xuất hiện những vùng ức chế
(vòng vô khuẩn), nghĩa là có vi khuẩn đối kháng tại điểm đó.
Bước 5: Những tế bào vi khuẩn đối kháng được làm sạch và giữ trong nước
cất khử trùng hoặc glyxerol 30 % ở - 80
0
C để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.

- Đánh giá hoạt lực của vi khuẩn đối kháng
- Chủng vi khuẩn đối kháng cần kiểm tra được cấy bằng tăm vô trùng lên
điểm giữa của bề mặt môi trường KB (môi trường đặc), để vi khuẩn phát triển ở
28
0
C ÷ 30
0
C trong 24 ÷ 48 giờ, các tế bào phát triển thành cụm khuẩn lạc hình
tròn.
- Dùng bông vô trùng loại bỏ các tế bào trong cụm khuẩn lạc.
- Xử lý những tế bào còn sống sót bằng cách xông hơi chloroform từ 45 đến
60 phút.
- Phun dung dịch vi khuẩn gây bệnh héo xanh đạt mật độ 10
7
÷10
8

tế bào/ml
kín bề mặt môi trường.
- Ủ ở nhiệt độ 28
0
C ÷ 30
0
C, sau 48 giờ quan sát khả năng đối kháng của vi
khuẩn được thể hiện qua hiện tượng có hay không có vòng ức chế.
- Dựa vào kích thước vòng ức chế (D-d, mm) để đánh giá hiệu lực đối kháng
của chúng. Trong đó D là đường kính vòng ức chế, d là đường kính cụm khuẩn lạc.
2.3.4. Phân loại vi sinh vật đối kháng bằng phương pháp Sequence
- Phương pháp nhân bản gen - PCR
Hỗn hợp phản ứng gồm: H

2
O cất khử trùng 22,3 µl, đệm 10xPCR 2 µl,
dNTPs 1,6 µl, MgCl
2
0,6 µl, primer fD1 (fD1 có trình tự: 5’- agagtttgatcctggctcag
-3’) 1µl, primer rP2 (rP2 có trình tự: 5’- cggctaccttgttacgactt- 3’) 1µl, Taq-DNA
polymeraza 0,5 µl và ADN khuôn 1 µl (10ng). Phản ứng nhân bản gen được thực
hiện trên máy Temp Control System PC- 800 và sử dụng chương trình chu kỳ
nhiệt như sau: bước 1: 94
0
C 2 phút; bước 2 gồm 30 chu kỳ: 94
0
C 1 phút; 50
0
C 1

21
phút và 72
0
C 1,5 phút; bước 3: 72
0
C 5 phút. Sản phẩm PCR được làm sạch theo
protocol QIA quick PCR Purification và phân tích trên gel agaroza 1%.
- Phương pháp Sequence
Sản phẩm PCR gen 16S rARN của vi khuẩn được nhân bản bằng kỹ thuật
PCR với cặp primer có ký hiệu: fD1 và rP2 được tinh sạch bằng kít QIAquick
PCR Purification (QIAGEN Inc.) và gắn vào vector pGEM
®
-T (Promega Corp.,
Madison, Wis.), theo quy trình của nhà cung cấp kít. Vector tái tổ hợp được biến

nạp vào chủng vi khuẩn E. coli DH5α và nuôi cấy trên môi trường LB, mỗi đĩa
môi trường được bổ sung 20 µl IPTG 100 mM, 20 µl XGal 40 ng/ml và 40 µl
ampicillin 25 ng/ml), ủ ở nhiệt độ 37
0
C trong 18 ÷ 24 giờ. Những khuẩn lạc có
màu trắng (đã gắn gen tái tổ hợp) được sử dụng để tách plasmid tái tổ hợp, những
plasmid này sau khi nhân bản và tinh sạch bằng kit QIAquick PCR Purification
(QIAGEN Inc.) được dùng để sequence. Quá trình sequence được tiến hành với bộ
hoá chất FS - DNA sequencing kit, theo qui trình của nhà sản xuất và giải trình tự
bằng máy tự động ABI 377 PRISM (Perkin Elmer).
Sử dụng chương trình BLASTN để phát hiện những trình tự tương đồng
với các trình tự nghiên cứ
u đã được công bố trong ngân hàng gen, nhằm xác nhận
trình tự đích và chọn một số trình tự có độ tương đồng cao để so sánh và phân
tích. Sử dụng chương trình phần mềm máy tính MEGA2 để đối chiếu. Phân tích
và xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phương pháp tối thiểu (Maximum
Parsimony (MP) method) và phương pháp tiến hoá tối thiểu (Minimum Evolution
(ME) method) trên cơ sở khoảng cách di truyền theo mô hình Kimura. Giá trị
bootstrap của cây phát sinh chủng loại ME và MP được tính với 1000 lần lấy mẫu
thử (resampling), dựa vào cây phả hệ người ta xác định được mối quan hệ của các
chủng vi khuẩn cần kiểm tra.


22
2.3.5. Phương pháp đánh giá độc tính của chủng vi khuẩn đối kháng trên cây
trồng
Phương pháp đánh giá tính độc của các chủng vi khuẩn sử dụng theo
10TCN: 216-1995 (216-2003). Thí nghiệm chia thành 6 công thức: CT1: công
thức đối chứng là đất không nhiễm sinh khối vi khuẩn; CT2: đất nhiễm R.
solanacearum (10

4
-10
5
cfu/g); CT3: đất nhiễm F. oxysporum (10
4
-10
5
bt/g); CT4:
đất nhiễm hỗn hợp các chủng vi khuẩn đối kháng; CT5: gồm CT2+hỗn hợp vi
khuẩn đối kháng; CT6: gồm CT3+hỗn hợp vi khuẩn đối kháng. Mỗi công thức
trồng 6 cây.
2.3.6. Phương pháp đánh giá độc tính của chủng vi khuẩn đối kháng trên chuột
bạch
Phương pháp đánh giá độc tính của vi khuẩn đối kháng trên chuột bạch:
theo phương pháp LD
50
oral (liều gây chết trung bình 50 % cá thể chuột khi thuốc
xâm nhập qua đường miệng) của NIAST, 2003. Chuột bạch có trọng lượng 18
g/con được nuôi ổn định trong 3 ngày, sau đó phân thành các công thức tương ứng
với số lượng chủng vi khuẩn đối kháng thí nghiệm và chủng B. subtilis trong men
tiêu hóa làm đối chứng dương, mỗi chủng vi khuẩn kiểm định được tiến hành trên
15 con và chia thành 3 lô, mỗi lô được bố trí ăn thức ăn đã đượ
c trộn với dịch vi
khuẩn đối kháng tương ứng với các nồng độ 2.10
7
;

2.10
8
và 2.10

9
tb/g thức ăn.
Theo dõi các triệu chứng bất thường của chuột trong vòng 24 giờ để đánh giá mức
độ gây độc cấp tính và theo dõi khả năng gây độc bán trường diễn trong 30 ngày
của các chủng vi khuẩn đối kháng. Nếu có chuột chết thì mổ ra quan sát tổng thể
phủ tạng, tính tỷ lệ chuột chết và xác định LD
50
theo công thức Karber-Behrens :
LD50 = Df - Sab/n
Df : Liều làm chết 100% súc vật.
a : Trị số trung hình của tổng số súc vật chết ở 2 liều kế tiếp.
b : Hiệu số giữa 2 liều kế tiếp.
n : Số súc vật chết ở mỗi liều hoặc số trung bình các lô.

23
2.3.7. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng
- Đánh giá khả năng tương tác của các chủng VSV đối kháng tuyển chọn ở
điều kiện hỗn hợp trong chế phẩm dạng lỏng và bột, thông qua việc xác định mật
độ tế bào VSV và hoạt tính sinh học của chúng ở dạng đơn lẻ và dạng hỗn hợp
trong chế phẩm.
+ Các chủng VSV l
ựa chọn sau thời gian nuôi cấy 48 h được nhiễm vào
chất mang dạng lỏng (môi trường dinh dưỡng tự nhiên hoặc nhân tạo, đảm bảo
mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn lựa chọn 10
8
- 10
9
CFU/ml(g)); hoặc dạng bột
(than bùn) với mật độ tương đương nhau. Kiểm tra xác định mật độ tế bào VSV và
hoạt tính sinh học của chúng bằng cách nêu trên sau các thời gian khác nhau.

+ Phương pháp Koch: để xác định mật độ tế bào VSV (đếm số lượng khuẩn
lạc trên đĩa môi trường để xác định đơn vị hình thành khuẩn lạc: CFU/ml).
- Nghiên cứu sản xuất sinh khối VSV hữu hiệu
+ Nghiên cứu các
điều kiện nuôi cấy thích hợp cho từng chủng VSV: nguồn
dinh dưỡng, pH, nhiệt độ, kiểu nuôi cấy, chế độ cấp khí, thời gian nuôi cấy.
+ Lựa chọn môi trường nhân sinh khối VSV từ các nguồn vật liệu rẻ tiền, dễ
kiếm song phải đảm bảo cho VSV sinh trưởng phát triển tốt.
+ Lên men thử nghiệm, xác định các thông số kỹ thuật cho nhân sinh khối
VSV trên thiết bị lên men chìm qui mô 3lít/mẻ.
- Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng. Nghiên
cứu điều kiện bảo quản sản phẩm.
+ Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất gồm: Nghiên cứu tỉ lệ phối trộn
sinh khối vi sinh vật, các chất khoáng và nguyên liệu hữu cơ khác nhau như: than
bùn, gỉ đường và phụ gia để chọn quy trình phù hợp.
+ Nghiên cứu điều kiện bảo quản sản phẩm:
Chế phẩm tạo ra sẽ được bảo
quản bằng các phương pháp khác nhau: giữ ở nhiệt độ phòng, nhiệt độ lạnh 4
0
C,

24
bổ sung chất bảo quản ; kiểm tra sự sống sót và hoạt tính sinh học của các chủng
VSV sau các thời gian bảo quản từ 1- 6 tháng.
2.3.8. Đánh giá hiệu quả hạn chế bệnh của chế phẩm vi sinh đối kháng
- Phân bón cho các thí nghiệm:
+ Cho lạc (1 ha): 25 kg N, 70 kg P
2
O
5

, 60 kg K
2
O, 400kg vôi, 8 tấn phân
chuồng.
+ Cho vừng (1ha): 57,5 kg N, 85 kg P
2
O
5
, 55 kg K
2
O, 300kg vôi, 4 tấn phân
chuồng.
- Phương pháp thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh đối
kháng đến bệnh héo xanh và năng suất cây lạc [13].
* Thí nghiệm nhà lưới
: thí nghiệm được bố trí theo phương pháp ngẫu nhiên
(Phạm Chí Thành, 1972), 3 công thức, mỗi công thức 6 xô, 6 cây/xô, lặp lại 3 lần.
CT1 (đối chứng): Đất nhiễm R.solanacearum; CT2: Đất nhiễm R. solanacearum +
chế phẩm VSV1; CT3: Đất nhiễm R. solanacearum + chế phẩm L1. Cách xử lý
chế phẩm: Hạt lạc được ủ ẩm qua đêm (đã nứt nanh) rồi ngâm trong chế phẩm
VSV1, L1 trước khi gieo 30 phút. Bổ sung 5-10 ml dịch chế phẩm với mậ
t độ 10
8
cfu/ml/hốc đất trước gieo hạt. Theo dõi tỷ lệ bệnh héo xanh sau 10, 20, 30 và 40
ngày. Đo các chỉ tiêu sinh trưởng như chiều cao cây, trọng lượng tươi, khô và
năng suất.
* Thí nghiệm ngoài đồng
: diện tích 500 m
2
chia thành 3 công thức: CT1

(Đối chứng): không nhiễm chế phẩm vi sinh vật; CT2: nhiễm chế phẩm VSV1;
CT3: nhiễm chế phẩm L1. Cách xử lý chế phẩm lần 1: Hạt lạc được ủ ẩm qua đêm
(đã nứt nanh) rồi trộn đều trong chế phẩm VSV1, L1 (với mật độ khoảng 10
8
CFU/g) trước khi gieo 30 phút. Chế phẩm được rải đều trên mặt rãnh, gieo hạt
theo tỉ lệ nhất định, lấp nhẹ một lớp đất lên trên. Cách xử lý chế phẩm lần 2: chế
phẩm được bổ sung vào quanh gốc khi cây ở giai đoạn chuẩn bị vun. Theo dõi tỷ