Phân lập các chủng Bacillus spp có hoạt tính probiotic từ ao nuôi cá tra

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


VĂN THỊ THÚY



ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP CÁC CHỦNG Bacillus spp CÓ HOẠT TÍNH PROBIOTIC TỪ
AO NUÔI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)



CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC
Mã số:604240


LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC



HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGUYỄN THỊ NGỌC TĨNH

TP.HCM – 2011





LỜI CẢM ƠN

Luận văn này được thực hiện ở Phòng Sinh học Thực Nghiệm- Viện Nghiên Cứu
Nuôi Trồng Thủy Sản 2 dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh.
 Kính gửi đến TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất
về sự quan tâm, giúp đỡ và tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành khóa luận này.
 Kính gửi đến Th.s Võ Minh Sơn lời cảm ơn chân thành về sự quan tâm, giúp đỡ
cũng như đã hỗ trợ kinh phí lẫn kiến thức để tôi thực hiện khóa luận.
 Kính gửi đến quý Th ầy, Cô trường Đại học Khoa học Tự Nhiên- ĐHQG
TpHCM lòng biết ơn về những kiến thức quý báu đã truyền đạt cho tôi trong suốt quá
trình học.
 Cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong cuộc sống này.
Văn Thị Thúy



ii

MỤC LỤC
Trang

Trang phụ bìa i
Mục lục ii
Danh mục chữ viết tắt v
Danh mục bảng vi
Danh mục biểu đồ vii
Danh mục hình viii
MỞ ĐẦU 1
Chương 1 – TỔNG QUAN
1.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH TRÊN ĐỘNG VẬT THỦY SẢN VÀ CÁC TÁC
ĐỘNG TIÊU CỰC CỦA VIỆC DÙNG THUỐC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
3

1.1.1 Tình trạng ô nhiễm môi trường nước trong nuôi trồng thủy sản 3
1.1.2 Mối quan hệ giữa các nhân tố gây bệnh cho động vật thủy sản 4
1.1.3 Các loại bệnh thường gặp trên động vật thủy sản 6
1.1.4 Tác động tiêu cực của việc dùng thuốc trong nuôi trồng thủy sản 9
1.2 TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
12

1.2.1 Định nghĩa probiotic 13
1.2.2 Đặc điểm chung của probiotic 14
1.2.3 Các cơ chế tác động của probiotic 14
1.2.4 Vai trò của probiotic trong nuôi trồng thủy sản 20
1.2.5 Tình hình nghiên cứu prob iotic ứng dụng trong thủy sản ở Việt Nam và
trên thế giới 21


iii
1.3 BẺ GÃY QUÁ TRÌNH QUORUM SENSING – CÁCH TIẾP CẬN MỚI
TRONG VIỆC KIỂM SOÁT HỆ VI SINH TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
23
1.3.1 Định nghĩa quá trình quorum sensing 23
1.3.2 Bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh – phương pháp tiếp
cận mới trong việc kiểm soát bệnh 24
1.3.3 Sự phân hủy sinh học quá trình quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh
25
1.4 TỔNG QUAN VI KHUẨN Bacilllus 27
1.4.1 Đặc điểm chung của chi Bacillus 27
1.4.2 Dinh dưỡng và sinh trưởng 28
1.4.3 Quá trình tạo bào tử của Bacillus 28
1.4.4 Ứng dụng của Bacillus trong nuôi trồng thủy sản 30
Chương 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 31
2.1.1 Thời gian tiến hành 31
2.1.2 Địa điểm tiến hành thí nghiệm 31
2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 31
2.2.1 Nguồn vật liệu phân lập và chủng vi sinh vật kiểm định 31
2.2.2 Địa điểm thu mẫu 31
2.2.3 Môi trường - hóa chất- thiết bị - dụng cụ sử dụng 34
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35
2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 35
2.3.2 Phương pháp thu mẫu 37
2.3.3 Phương pháp phân lập 37
2.3.4 Phương pháp chọn lọc 38
2.3.5 Định danh các chủng tuyển chọn 42


iv
2.3.6 Khảo sát các đặc tính probiotic khác 48
2.3.7 Khảo sát các đặc tính sinh lý của các chủng tuyển chọn 51
2.3.8 Khảo sát khả năng tương thích giữa các chủng tuyển chọn 55
2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 56
Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 KẾT QUẢ 57
3.1.1 Kết quả thu mẫu, phân lập và chọn lọc bước một 57
3.1.2 Kết quả sàng lọc dựa vào khả năng sinh enzyme hemolysin 58
3.1.3 Thử khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng thử nghiệm 61
3.1.4 Kết quả định danh các chủng đã tuyển chọn 65
3.1.5Kết quả khảo sát các đặc tính probiotickhác của các chủng tuyển chọn
67
3.1.6 Kết quả khảo sát một số đặc tính sinh lý của các chủng tuyển chọn
71

3.1.7 Kết quả khảo sát khả năng tương thích giữa các chủng tuyển chọn 81
3.2 THẢO LUẬN 82
Chương 4- KẾT LUẬN- ĐỀ NGHỊ
4.1 KẾT LUẬN 88
4.2 ĐỀ NGHỊ 89
TÀI LIỆU THAM KHẢO 90
PHỤ LỤC PL1








v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AHL N- Acyl Homoserine Lactone
bp base pair
CFU Colony Forming Unit
CMC Cacboxyl Methyl Cellulose
cs Cộng sự
DSM Difco Sporulation Medium
ĐC Đối chứng
EM Effective microorganism
FAO Food and Agriculture Organization
HHL N- Hexanoyl- L- Homoserine Lactone
PBS Phosphate Buffer Saline

OD Optical Density
WHO World Health Organization













vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Địa điểm và thời gian thu mẫu 31
Bảng 3.1: Kết quả thử nghiệm khả năng sinh hemolysin 58
Bảng 3.2: Kết quả thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngoại bào 61
Bảng 3.3: Kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa 66
Bảng 3.4: Tóm tắt kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa và sinh học phân tử .
67
Bảng 3.5: Kết quả đối kháng của các chủng thử nghiệm với một số chủng gây bệnh
67
Bảng 3.6: Tốc độ phân hủy phân tử HHL bởi các chủng tuyển chọn ở thời điểm 9h và
24h 69
Bảng 3.7: Log (cfu/ml) các chủng vi khuẩn thử nghiệm ở các nồng độ muối khác nhau

sau 24 giờ 71
Bảng 3.8: Log( cfu/ml) các chủng vi khuẩn thử nghiệm ở các giá trị pH khác nhau sau
24 giờ 73
Bảng 3.9: Log (cfu/ml) các chủng khảo sát sau 24giờ nuôi ở các nhiệt độ 74
Bảng 3.10: Tỷ lệ sống sót (%) của các chủng khảo sát ở nồng độ muối mật khác nhau
vào các thời điểm 1giờ, 2giờ, 3giờ và 6giờ 75
Bảng 3.11: Tỷ lệ sống sót (%) của các chủng khảo sát ở pH2 và pH3 theo thời gian
79
Bảng 3.12: Kết quả tương thích giữa các chủng khảo sát 81







vii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ phần trăm số lượng enzyme của các chủng khảo sát 64
Biểu đồ 3.2: Mối tương quan giữa đường kính vòng violacein và Ln[HHL] 69
Biểu đồ 3.3: Tốc độ phân hủy HHL ở thời điểm 9 giờ và 24 giờ 70
Biểu đồ 3.4: Log(cfu/ml) của các chủng thử nghiệm ở các nồng độ muối khác nhau sau
24 giờ 72
Biểu đồ 3.5: Log( cfu/ml) các chủng vi khuẩn thử nghiệm ở các giá trị pH4- pH10 sau
24 giờ khảo sát 73
Biểu đồ 3.6: Tỷ lệ sống sót của các chủng khảo sát theo thời gian ở nồng độ muối mật
0,5%, 1%, 2% 77
Biểu đồ 3.7: Tỷ lệ sống sót của các chủng khảo sát theo thời gian ở pH2 và pH3 80

viii
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Mối quan hệ giữa các nhân tố gây bệnh 6
Hình 1.2: Vi khuẩn Aeromonas và cá tra bị xuất huyết do Aeromonas 6
Hình 1.3: Vi khuẩn Vibrio phát sáng trên môi trường TCBS và mang tôm sú bị đen do
nhiễm Vibrio 7
Hình 1.4: Vi khuẩn E.ictaluri và cá tra bị bệnh do nhiễm Edwardsiella 8
Hình 1.5: Sơ đồ các phương pháp bẻ gãy quá trình quorum sensing ở vi khuẩn 25
Hình 1.6: Sự phân hủy phân tử AHL bằng enzyme 26
Hình 1.7: Mặt cắt ngang của bào tử Bacillus 29
Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 36
Hình 2.2. Dụng cụ thu mẫu nước và bùn của ao nuôi cá tra 37
Hình 2.3: Bảng đặc tính sinh hóa của một số chủng Bacillus 43
Hình 2.4: Phương pháp cấy vạch thẳng vuông góc 49

Hình 3.1: Sự đa dạng khuẩn lạc từ mẫu phân lập trên môi trường DSM 57
Hình 3.2:Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường DSM 57
Hình 3.3: Tế bào tạo nội bào tử và tế bào sinh dưỡng 58
Hình 3.4: Kết quả kiểm tra enzyme catalase: catalase dương tính, catalase âm tính
58
Hình 3.5: Kết quả thử khả năng sinh hemolysin 61
Hình 3.6: Thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngoại bào 65
Hình 3.7: Chủng N3.19.2 đối kháng với V.alginolyticus 68
Hình 3.8: Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen aiiA của chủng N3.19.2 68
Hình 3.9: Đường kính vòng violacein ở nghiệm thức đối chứng ở các thời điểm 0 giờ,
9 giờ và 24 giờ 70
Hình 3.10: Vòng violacein của chủng N3.10.1 ở thời điểm 9h và 24h 71




ix



1

MỞ ĐẦU
Nuôi trồng thủy sản là thế mạnh của nước ta, trong 10 năm gần đây ngành thủy
sản nói chung và nuôi trồng thủy sản nói riêng đã và đang phát triển mạnh mẽ. Theo
thống kê của Bộ Nông Nghiệp và Phát triển nông thôn, đến năm 2010, diện tích nuôi
trồng thủy sản được mở rộng lên 1,1 triệu ha, sản lượng đạt 2,8 triệu tấn và giá trị xuất
khẩu thủy sản đạt 5,034 tỉ USD [3]. Vấn đề dịch bệnh, năng suất và chất lượng của sản
phẩm thủy sản luôn được đặt lên hàng đầu. Để quản lý dịch bệnh thì kháng sinh đã và
đang là sự lựa chọn hàng đầu của nhiều hộ nuôi, hệ quả là chất lượng thủy sản giảm do

hàm lượng kháng sinh tồn dư trong sản phẩm sau khi thu hoạch. Việc lạm dụng kháng
sinh quá mức còn gây ra nguy cơ kháng kháng sinh của các chủng gây bệnh, khiến cho
liều lượng kháng sinh sử dụng mùa sau cao hơn mùa trước hoặc phải sử dụng luân
vòng kháng sinh gây khó khăn cho việc điều trị và kiểm soát dịch bệnh [122].
Với mục tiêu thay thế dần phương pháp phòng và trị bệnh truyền thống, các
phương pháp phòng và trị bệnh bằng liệu pháp sinh học ngày càng được ưa chuộng
như vaccine, các chất tăng cường hệ miễn dịch (immuno stimulants), chế phẩm sinh
học như probiotic. Nghiên cứu về vaccine ứng dụng trên đối tượng thủy sản vẫn đang
được nhiều nhà khoa học quan tâm . Vaccine được cho là phương pháp hiệu quả nhất
trong phòng nga một số bệnh gây ra bởi vi khuẩn và virus , nhưng chưa được sử dụng
ph biến có thể là do giá thành quá cao, thời gian nghiên cứu lâu và thường gây sốc đối
với vật nuôi [117]. Do đó, phương pháp trị liệu sinh họ c bằng vi sinh vật có lợi như
probiotic đang được đánh giá cao và trở thành công cụ phòng nga , điều trị nhiều bệnh
hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản thông qua khả năng cải thiện môi trường nước và ức
chế vi sinh gây bệnh.
Hiện nay có khoảng hơn 400 thương hiệu chế phẩm sinh học đang lưu hành trên
thị trường Việt Nam, tuy nhiên các chế phẩm này chủ yếu có nguồn gốc ngoại nhập
hoặc sản xuất trong nước, đa số chưa rõ nguồn gốc, các chủng được sử dụng làm


2

probiotic chủ yếu thuộc nhóm Bacillus sp., Lactobacillus sp., Nitrosomonas sp.,
Saccharomyces, Nitrobacter sp [11].
Trong số các nhóm vi sinh vật nói trên thì Bacillus là một ứng viên quan trọng
cho việc sản xuất probiotic vì nhóm này có các đặc tính như: c ó khả năng sinh bào tử,
và có khả năng sản sinh các sản phẩm thứ cấp như chất kháng khuẩn, enzyme, hầu hết
không gây hại cho người và động vật. Enzyme của Bacillus phân cắt các hợp chất
carbohydrate, lipid, protein… rất hiệu quả [29], [79], [108], [120]. Vì những lý do trên,
cùng sự hướng dẫn của Tiến sĩ Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và sự cho phép của Khoa Sinh

học trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, tôi thực hiện đề tài “Phân lập các chủng
Bacillus spp có hoạt tính probiotic t ao nuôi cá tra”.

















3

1.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH TRÊN ĐỘNG VẬT THỦY SẢN VÀ CÁC TÁC
ĐỘNG TIÊU CỰC CỦA VIỆC DÙNG THUỐC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY
SẢN
1.1.1 Tình trạng ô nhiễm môi trường nước trong nuôi trồng thủy sản
Ước tính mỗi năm, ngành nuôi trồng thủy trên toàn thế giớ i đã thải ra môi
trường nước xấp xỉ 3 triệu tấn bùn ở dạng chất thải hữu cơ gần như chưa được xử lý.
Mầm bệnh t các ao nuôi cũng đã đi theo nguồn thải này ra hệ thống sông rạch làm
chất lượng nhiều vùng nước suy giảm nặng nề [7].
Cùng với sự phát triển của ngành nuôi trồng thủy sản, để đáp ứng cho nhu cầu

xuất khẩu và tiêu dùng ngày càng tăng cao, người nuôi thường thả với mật độ quá dày
trong khi không có biện pháp xử lý môi trường thích hợp sẽ dẫn đến hiện tượng thối
ao, làm giảm oxy hòa tan. Các chất độc sinh ra làm cho động vật bị stress và ngộ độc,
có thể gây chết hàng loạt cho tôm cá, không những gây thiệt hại cho nuôi trồng thủy
sản mà còn gây ô nhiễm môi trường xung quanh [7].
1.1.1.1 Độc tính của chất hữu cơ
Các chất hữu cơ trong đầm ao được tích lũy ngày càng tăng sẽ gây ô nhiễm môi
trường nước, làm giảm lượng oxy hòa tan. Hàm lượng oxy hòa tan nằm dưới ngưỡng
chịu đựng của tôm, cá sẽ gây ngạt thở và hội chứng stress. Ngoài ra, lớp bùn hữu cơ
lắng đọng lâu ngày là môi trường thuận lợi cho vi khuẩn kị khí có khả năng sinh metan
gây độc cho động vật thủy sản [7].
1.1.1.2 Độc tính của amonia
Amonia tồn tại dưới dạng NH
3
hoặc NH
4
tùy thuộc vào pH môi trường. Trong
môi trường pH cao thì amonia dễ chuyển thành NH
3
có độc tính cao. Khi nồng độ NH
3

lên cao sẽ gây độc cấp tính và sẽ làm cho tôm cá chết trong thời gian ngắn. Amonia sẽ
chuyển thành nitrite nhờ vi khuẩn oxy hóa amon kết hợp với oxy trong nước [7].
1.1.1.3 Độc tính của hợp chất chứa nitơ dạng oxy hóa
HNO
2
+ H
2
O NH

3
+ O
2

Vi khuẩn oxy hóa amon


4

Hợp chất chứa nitơ dạng oxy hóa gồm nitrite (NO
2
-
) và nitrate (NO
3
-
). Nồng độ
nitrite cho phép trong nuôi trồng thủy sản là dưới 0,1 mg/l, nếu vượt quá ngưỡng cho
phép sẽ gây độc. Nitrate được tạo thành nhờ vi khuẩn oxy hóa nitrite:

Nồng độ nitrate cho phép trong môi trường nuôi trồng hải sản là < 10mg/l. Ở
nồng độ lớn hơn hoặc bằng 10mg/l sẽ làm cho tảo phát triển. Khi tảo quá nhiều sẽ kết
thành khối ni lên mặt nước, khi bị phân hủy sẽ gây ô nhiễm nước làm nước bị đục,
thối, giảm nồng độ oxy hòa tan. Khi nồng độ nitrate > 50mg/l sẽ gây sốc nghiêm trọng
cho tôm, cá [7].
1.1.2 Mối quan hệ giữa các nhân tố gây bệnh cho động vật thủy sản
Động vật thủy sản và môi trường sống là một thể thống nhất, khi chúng mắc
bệnh là kết quả tác động qua lại của ba nhân tố: Môi trường sống, tác nhân gây bệnh,
vật chủ- động vật thủy sản.
1.1.2.1 Môi trường sống
Các yếu tố môi trường đều là các mối nguy trong nuôi trồng thủy sản, bởi tỷ lệ

sống, sinh sản và sinh trưởng của các loài động vật thủy sản phụ thuộc vào môi trường
thích hợp. Có nhiều yếu tố môi trường có khả năng ảnh hưởng đến nuôi trồng thủy sản,
nhưng chỉ một số có vai trò quyết định. Nhiệt độ và độ mặn là giới hạn quan trọng của
loài nuôi thủy sản ở một địa điểm nhất định. Dinh dưỡng, độ kiềm tng số và độ cứng
tng số cũng là những yếu tố quan trọng không những điều chỉnh thực vật phát triển
mà chúng còn ảnh hưởng đến s inh vật thủy sản. Độ trong ảnh hưởng đến mức độ ánh
sáng chiếu vào nước, tác động đến sự quang hợp và các chuỗi thức ăn, độ trong cũng
ảnh hưởng trực tiếp đến cá và các động vật không xương sống khác. Những yếu tố môi
trường khác ảnh hưởng đến nuôi trồng thủy sản là pH, oxy hòa tan, CO
2
, NH
3
, nitrite,
H
2
S [8].
1.1.2.2 Tác nhân gây bệnh
NO
2
-
+ O
2
NO
3
-

Vi khuẩn oxy hóa nitrite


5

Các yếu tố hữu sinh làm cho động vật thủy sản mắc bệnh gọi là tác nhân gây
bệnh. Các tác nhân gây bệnh được chia ra hai nhóm:
- Tác nhân gây bệnh truyền nhiễm: Virus, Ricketsia, vi khuẩn, nấm.
- Tác nhân gây bệnh kí sinh: Nguyên sinh động vật, giun, sán, đỉa, giáp xác [8].
1.1.2.3 Vật chủ
Khi chỉ có các nhân tố ngoại cảnh (yếu tố vô sinh và hữu sinh) tác động thì động
vật thủy sản không thể mắc bệnh được, mà nó còn phụ thuộc vào sức đề kháng của cơ
thể với tng loại bệnh: Vật chủ thường biểu hiện bằng những phản ứng khi môi trường
thay đi. Những phản ứng của cơ thể có thể kéo dài 2-3 ngày hoặc 2 -3 tuần tùy theo
mức độ bệnh [8].
1.1.2.4 Mối quan hệ giữa các nhân tố gây bệnh cho thủy sản
Nước là môi trường sống của động vật thủy sản. Động vật thủy sản sống được
phải có môi trường sống tốt, đồng thời chúng cũng phải có khả năng thích ứng tốt với
môi trường sống. Nếu môi trường sống của động vật thủy sản xảy ra những thay đi
không có lợi cho chúng , những con nào thích ứng sẽ duy trì được cuộc sống, những
con nào không thích ứng được thì sẽ mắc bệnh hoặc chết.
Khi cả ba nhân tố (môi trường, tác nhân gây bệnh, vật chủ) được duy trì ở mức
có lợi thì động vật thủy sản không mắc bệnh. Nếu giữ môi trường nuôi tốt sẽ tăng sức
đề kháng với mầm bệnh cho động vật thủy sản, khi đó động vật thủy sản có mang mầm
bệnh thì bệnh không thể phát sinh được. Để ngăn cản những nhân tố trên không thay
đi theo chiều hướng xấu cho động vật thủy sản thì con người phải tác động vào ba
nhân tố như: cải tạo ao tốt, tẩy trùng ao hồ, diệt mầm bệnh, thả giống tốt, cung cấp thức
ăn đầy đủ về chất và lượng thì bệnh khó xuất hiện [8].

6










Hình 1.1: Mối quan hệ giữa các nhân tố gây bệnh [8].
1.1.3 Các loại bệnh thường gặp trên động vật thủy sản
1.1.3.1 Bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn Aeromonas di động






Hình 1.2: Vi khuẩn Aeromonas (hình a) và cá tra bị xuất huyết do Aeromonas (hình b)
[7], [115].
Chi Aeromonas thuộc họ Aeromonadaceae, bộ Aeromonadales, lớp Gamma
proteobacteria, ngành Proteobacteria. Trong chi Aeromonas có hai nhóm:
 Nhóm 1: Bao gồm các loài Aeromonas không di động ( A.salmonicida) thường
gây bệnh ở môi trường nước lạnh.
 Nhóm 2: Bao gồm các loài Aeromonas di động, bao gồm A.hydrophila,
A.caviae, A.sorbia, di động nhờ tiên mao. C ác loài vi khuẩn Aeromonas di động đều
phân lập t cá nước ngọt nhiễm bệnh, thường gặp nhất là loài A.hydrophila. Bệnh
Môi

trường
(1)
Mầm
bệnh (2)
Vật chủ (3)
Bệnh
(1+

2+3)
a b


7

nhiễm trùng do nhóm vi khuẩn Aeromonas spp., di động thường gặp ở nhiều loại động
vật thủy sản nước ngọt. Ở Việt Nam các loài cá nuôi lồn g, bè và nuôi ao nước ngọt
thường gặp bệnh đốm đỏ như: cá trắm cỏ, cá trôi, cá chép, cá tra….Ngoài ra nhóm vi
khuẩn còn có thể gây bệnh ở ba ba, cá sấu, bệnh đỏ chân ở ếch, đốm nâu ở tôm càng
xanh. Tỷ lệ tử vong ở động vật thủy sản thường 30-70%, ở cá giống có thể lên đến
100% [9], [118].
1.1.3.2 Bệnh do vi khuẩn Vibrio ở động vật thủy sản
Chi Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, bộ Vibrionales, lớp Gammaproteobacteria,
ngành Proteobacteria. Chúng không hình thành bào tử và di động nhờ m ột tiên mao
hoặc nhiều tiên mao. Chúng sống trong môi trường nước, đặc biệt là nước biển và cửa
sông, liên quan đến các động vật biển, một số loài là tác nhân gây bệnh cho người và
động vật biển. Đối với cá, Vibrio sp gây bệnh nhiễm trùng máu là chủ yếu, đối với tôm
Vibrio sp gây bệnh phát sáng, đỏ dọc thân, ăn mòn vỏ kittin. Vibrio sp gây bệnh ở cả
hai nhóm động vật thủy sản nước mặn và ngọt: cá, giáp xác, nhuyễn thể. Những vi
khuẩn này thường là tác nhân cơ hội, khi động vật thủy sản sốc do biến đi xấu hoặc bị
nhiễm các bệnh khác như nấm, virus, kí sinh trùng, các loài vi khuẩn Vibrio sp có cơ

hội gây bệnh nặng làm động vật thủy sản chết rải rác tới hàng loạt [9].







Hình 1.3: Vi khuẩn Vibrio phát sáng trên môi trường TCBS (hình a), mang tôm sú bị
đen do nhiễm Vibrio (hình b) [9].
a b


8

1.1.3.3 Bệnh đốm trắng (hoại tử cơ quan nội tạng) cá da trơn do vi khuẩn
Edwardsiella
Chi Edwardsiella thuộc họ Enterobacteriaceae, bộ Enterobacteriales, lớp
Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria. Thường gặp hai loài gây bệnh là:
E.tarda và E.ictaluri.
E.tarda là tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn ở cá nước ấm, đặc biệt là cá da trơn.
E. ictaluri gây bệnh nhiễm khuẩn trong các cơ quan nội tạng như gan, thận, tụy của cá
không vảy , gây bệnh nhiễm trùng đường ruột trên cá da trơn ở Mỹ , là tác nhân gây
bệnh gan thận mũ trên cá tra ở Việt Nam.
Edwardsiella thường gây bệnh ở động vật máu lạnh: rắn, cá sấu, cá… và một số
động vật thủy sản khác. Bệnh gây thiệt hại trong các ao nuôi cá hương (cỡ t 4-6cm)
đến 5-6 tháng tui, ít xuất hiện hơn ở cá có kích cỡ trên 15cm, tỷ lệ tử vong của cá t
60-70%, có trường hợp tới 100%. Bệnh xuất hiện nhiều nhất vào mùa xuân, mùa thu
và trong ao nuôi mật độ cao, nuôi cá lồng bè [9], [18], [32], [121].

Hình 1.4: Vi khuẩn E.ictaluri (hình a), nội tạng cá tra bị bệnh do nhiễm Edwardsiella
(hình b) [121].
1.1.3.4 Một số bệnh nhiễm khuẩn khác trên đối tượng thủy sản
Ngoài các bệnh trên, động vật thủy sản còn gặp một số bệnh như bệnh sưng phù
và n mắt trên cá lóc, cá lóc bông và nhiều loài cá nước ngọt cũng như cá biển do vi
khuẩn Streptococcus spp., bệnh xuất huyết và nhiễm trùng máu trên cá hương mè,
trắm cỏ, mè vinh, cá trê, tôm càng xanh do vi khuẩn Pseudomonas spp., bệnh đục cơ
a b


9

trên tôm càng xanh do cầu khuẩn Lactococcus garvieae, bệnh xuất huyết, hoại tử da,
cơ ở cá nước ngọt và nước mặn như cá lóc, cá trác… do vi khuẩn Mycobacterium,
bệnh hoại tử cơ ở cá nheo mỹ do Bacillus mycoides …[9], [17].
1.1.4 Tác động tiêu cực của việc dùng thuốc trong nuôi trồng thủy sản
Việc dùng thuốc trong nuôi trồng thủy sản có thể mang nhiều lợi ích khác nhau:
tăng hiệu quả sản xuất, tăng tỷ lệ sống sót, tiêu diệt tác nhân gây bệnh…. Đến nay
không thể phủ nhận một điều là thuốc sử dụng hiện nay đã và đang làm giảm đáng kể
rủi ro do bệnh tật, việc dùng thuốc đúng cách, đúng liều lượng và đúng thời điểm đã
phòng trị được một số bệnh do nhiễm khuẩn, nấm, kí sinh trùng. Tuy nhiên việc dùng
thuốc quá lạm dụng trong nuôi trồng thủy sản nói chung và trong nuôi công nghiệp đã
và đang ph biến ở Việt Nam cũng như một số nước trên thế giới có thể dẫn tới hậu
quả nghiêm trọng cho sức khỏe con người, phá hủy môi trường sinh thái, làm ảnh
hưởng đến chất lượng sản phẩm và tạo ra các chủng kháng thuốc…. Những ảnh hưởng

này càng nặng nề khi người nuôi trồng không có ý thức và hiểu biết ít về hiệu quả và
tác dụng của tng loại thuốc mà họ dùng hàng ngày [8].
Khi sử dụng thuốc trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản người ta đặc biệt chú ý tới
các tác động tiêu cực sau:
1.1.4.1 Tác động đến môi trường sinh thái
Một số loại thuốc có khả năng diệt khuẩn cao, ph diệt khuẩn rộng như các chất
sát trùng, các chất diệt địch hại, khi cho vào môi trường, ngoài tác dụng tiêu diệt tác
nhân gây bệnh và địch hại, chúng còn tiêu diệt luôn cả những sinh vật có lợi cho môi
trường sinh thái hay có lợi cho con người.
Khi dùng các hóa chất như: Nuval, Iodine, Formol… diệt kí sinh trùng trong các
ao nuôi tôm, cá có thể tiêu diệt luôn cả những thực vật và động vật có lợi trong ao nuôi,
làm nghèo hệ sinh vật phù du và sinh vật đáy. Khi dùng kháng sinh để phòng và trị
bệnh nhiễm khuẩn trong nuôi trồng thủy sản, một phần kháng sinh không được vật


10

nuôi hấp thụ và đào thải ra môi trường, gây tác động đáng kể đến môi trường xung
quanh khu vực nuôi.
Ngoài ra, việc điều trị bằng kháng sinh và hóa chất, đặc biệt khi dùng quá nhiều
hóa chất sẽ tiêu diệt phần lớn các vi khuẩn có lợi trong nước ao, chứ không chỉ các vi
khuẩn gây bệnh. Các kháng sinh và hoá chất không thể sử dụng để phục hồi sự suy
giảm chất lượng nước và môi trường sinh thái.
Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng một phần nhỏ kháng sinh sẽ hòa tan
trong nước nên tác động đến hệ sinh thái không lớn, nhưng phần lớn dư lượng kháng
sinh lại lắng đọng cùng với các trầm tích, gây tác động không nhỏ đến môi trường sinh
thái. Dư lượng kháng sinh tồn tại trong lớp trầm tích đáy làm giảm mật độ hệ vi sinh
vật có nhiệm vụ phân hủy các chất hữu cơ, làm chậm quá trình tự làm sạch vùng nuôi,
tăng quá trình phân hủy yếm khí, sản sinh ra nhiều khí độc vào nước. T đó làm xáo
trộn hệ vi sinh vật dẫn đến những xáo trộn theo chiều hướng xấu của hệ sinh thái [7].

1.1.4.2 Ảnh hưởng tới vật nuôi thủy sản
Những loại thuốc dùng trong nuôi trồng thủy sản để tiêu diệt tác nhân gây bệnh
hoặc địch hại, còn có tác động tiêu cực tới sức khỏe vật nuôi. Sau khi dùng kháng sinh
trộn vào thức ăn tôm cá, kháng sinh có thể gây độc cho gan, thận và tiêu diệt những
sinh vật có lợi trong đường ruột, làm giảm khả năng tiêu hóa và hấp thụ thức ăn của vật
nuôi, gây hiện tượng chậm lớn, còi cọc ở đàn cá nuôi thương phẩm và chậm phát dục ở
đàn cá nuôi vỗ thành thục.
Trong sản xuất tôm sú giống ở Việt Nam, để phòng bệnh nhiễm khuẩn người ta
thường dùng nhiều loại kháng sinh liên tục trong suốt quá trình ương ấp, tác dụng
phòng bệnh rất hạn chế nhưng lại làm suy yếu sức khỏe của đàn cá giống, khi thả
chúng ra ao nuôi thương phẩm những con giống này sẽ trở nên mẫn cảm với tác nhân
gây bệnh [7].
1.1.4.3 Gây hiện tượng kháng thuốc ở vi khuẩn gây bệnh


11

Khi động vật thuỷ sản mắc bệnh thì nguyên nhân chủ yếu là do vi khuẩn gây ra.
Thông thường, người ta sử dụng thuốc kháng sinh để kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh.
Do việc sử dụng không đúng cách và quá nhiều loại thuốc kháng sinh nên đã gây ra
hiện tượng vi khuẩn kháng kháng sinh và tích tụ dư lượng kháng sinh trong cơ thể
động vật thuỷ sản.
Hiện tượng kháng kháng sinh là khả năng mà một sinh vật có thể chịu được tác
động của một hoặc nhiều loại kháng sinh. Các gen kháng thuốc có thể được hình thành
trong các loài vi khuẩn khác thông qua sự trao đi gen với một vi khuẩn có mang gen
kháng, do vậy chúng có khả năng tạo ra cơ chế làm trung hoà hoặc phá huỷ tác dụng
của các loại kháng sinh [122].
1.1.4.4 Ảnh hưởng tới sức khỏe con người
Mặc dù kháng sinh đóng vai trò hết sức quan trọng trong việc chống lại nhiều
bệnh tật cho con người và các loài động vật thuỷ sinh, nhưng việc sử dụng ba bãi

trong nuôi trồng thuỷ sản có thể gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng như gây độc, biến
đi hệ vi sinh của người tiêu dùng hoặc làm cho người tiêu dùng cũng bị kháng thuốc
[122]. Theo báo cáo mới đây của Tiến sĩ Felipe Cabello và các cộng sự tại trường Cao
đẳng Y tế New York, việc lạm dụng kháng sinh trong hoạt động nuôi trồng thuỷ sản có
thể gây hại cho sức khoẻ thuỷ sản, động vật và cả con người.
Việc lạm dụng thuốc kháng sinh sẽ gây nhờn thuốc và có thể dẫn đến sự phát
triển của các vi khuẩn có khả năng kháng thuốc trong cơ thể động vật và người, cũng
như trong thuỷ sản. Đặc tính kháng thuốc ở vi khuẩn trong nước có thể truyền sang
các vi khuẩn gây bệnh ở người và động vật [9].
Nếu kháng sinh được trộn vào thức ăn nuôi thuỷ sản, có thể tìm thấy dư lượng
kháng sinh trong thịt động vật thuỷ sản và các sản phẩm chế biến. Những người ăn
động vật thuỷ sản chứa dư lượng kháng sinh sẽ vô tình hấp thụ kháng sinh vào cơ


12

thể, dẫn đến những thay đi trong hệ vi khuẩn bình thường, khiến họ trở nên dễ bị
nhiễm khuẩn hơn [122].
Trước những tác động tiêu cực của việc dùng hóa chất, kháng sinh trong nuôi
trồng thủy sản, việc tìm ra các giải pháp thay thế là khá cấp thiết. Việc ứng dụng các
sinh vật có lợi (probiotic) bắt đầu t những năm 1980 là cách tiếp cận hiệu quả, thân
thiện với môi trường trong việc phòng nga dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản [7].
1.2 TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
Nhu cầu tiêu dùng thủy sản của thế giới ngày càng gia tăng, sản lượng thủy sản
khai thác tự nhiên không thể đáp ứng đủ cho nhu cầu tiêu dùng. Do đó, nuôi trồng thủy
sản là vấn đề cấp thiết để giải quyết nhu cầu này. Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy sản
hiện nay đang gặp khó khăn do vấn đề dịch bệnh, chủ yếu là bệnh do vi khuẩn. Khi
phát hiện bệnh, nông dân thường sử dụng các hợp ch ất kháng khuẩn để điều trị bệnh,
rất nhiều nông dân sử dụng kháng sinh với số lượng lớn để phòng tr bệnh, thậm chí
khi chưa xác định được tác nhân gây bệnh.

Lời giải cho vấn đề này nằm ở lĩnh vực sinh thái học chứ không phải ở lĩnh vực
dược học. Nông dân cần phải học cách chung sống nhờ vào một quần xã vi si nh phức
tạp và điều khiển chúng. Phương pháp sử dụng các vi khuẩn có lợi, tức là probiotic để
loại tr các vi khuẩn có hại tốt hơn nhiều so với sử dụng kháng sinh. Ngày nay, kháng
sinh đã bị hạn chế sử dụng làm chất kích thích sinh trưởng và phòng bệnh trong nuôi
trồng thủy sản (NTTS).
Xu hướng sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản ngày càng tăng lên, các
kết quả nghiên cứu cho thấy chúng có khả năng làm tăng năng suất và ngăn nga bệnh.
Có hai phương pháp sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản: Đưa trực tiếp vào
nước để vi khuẩn probiotic khu trú trong nước và trộn vào thức ăn [14].




13

1.2.1 Định nghĩa probiotic
Thuật ngữ probiotic bắt nguồn t tiếng Hy lạp “probios” có nghĩa là “cho sự
sống”. Thông qua thời gian cùng với sự phát triển của khoa học và sự hiểu biết của
nhân loại thuật ngữ này được định nghĩa lại nhiều lần.
Vào năm 1965, Lilly và Still đã định nghĩa probiotic là những nhân tố thúc đẩy
phát triển được sản xuất bởi vi sinh vật. Vào năm 1974 Parker đã định nghĩa probiotic
dựa trên mối quan hệ giữa vi sinh với vật chủ “probiotic là những sinh vật và những cơ
chất có lợi cho động vật, có khả năng cải thiện hệ vi sinh đường ruột”. Đến năm 1989,
Fuller mở rộng định nghĩa “probiotic là sinh vật sống được cung cấp dưới dạng thức ăn
cho động vật nhằm cải thiện cân bằng hệ sinh vật đường ruột”. Havenaar và Huis Int
Veld (1992) định nghĩa “probiotic là một chủng hay một hỗn hợp vi sinh vật sống,
cung cấp cho người hoặc động vật, có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện đặc tính hệ vi
sinh bản địa”. Gatesoup (1999) định nghĩa “probiotic là những sinh vật sống cung cấp
dưới dạng thức ăn nhằm cải thiện sức khỏe cho vật chủ”.

Reid và cs (2003) định nghĩa “probiotic là những vi sinh vật sống được kiểm
soát chặt chẽ, với lượng thích hợp mang lại lợi ích cho vật chủ”.
Vào năm 2003, Fioramonti và cs đã định nghĩa probiotic một cách ngắn gọn
nhưng đầy xúc tích: “probiotic được định nghĩa là những vi sinh vật ảnh hưởng có lợi
lên sức khỏe và tốt cho vật chủ”
Trước đây, probiotic thường được ứng dụng cho con người và động vật trên cạn,
vì vậy thuật ngữ probiotic thường được ngụ ý là những vi khuẩn gram dương chủ yếu
là Lactobacillus. Dần dần các sinh vật được áp dụng làm probiotic ngày càng đa dạng
bao gồm cả vi khuẩn gram âm, vi khuẩn gram dương, bacteriophage, nấm men và tảo
đơn bào, phạm vi sử dụng rộng hơn, ngoài con người và động vật trên cạn, probiotic
ngày nay được ứng dụng trên cả đối tượng động vật thủy sản [60], [87].
Khác với người và động vật trên cạn, động vật thủy sản được bao bọc bởi môi
trường nước và ở đó các tác nhân gây bệnh tồn tại một cách độc lập với vật chủ.


14

Những vi sinh vật gây bệnh được hấp thụ liên tục bởi vật chủ thông qua quá trình tiêu
thụ thức ăn, động vật thủy sản tiêu hóa một lượng lớn vi khuẩn t môi trường nước, kết
quả của mối tương tác tự nhiên giữa khu hệ vi sinh trong môi trường và đối tượng thủy
sản. Trong nuôi trồng thủy sản mối tương tác giữa probiotic và vật chủ không chỉ giới
hạn trong đường ruột của vật chủ, probiotic còn có thể hoạt động trên mang, da và cả
môi trường nước xung quanh vật chủ. Do vậy, Verschuere và cs (2000) đã đề xuất một
định nghĩa mới cho phép mở rộng ứng dụng của thuật ngữ probiotic trong nuôi trồng
thủy sản “probiotic là hỗn hợp vi sinh vật sống được b sung và ảnh hưởng có lợi cho
vật chủ bằng cách thay đi các nhân tố liên quan đến vật chủ hoặc quần xã vi sinh vật
xung quanh, cải thiện khả năng sử dụng thức ăn hoặc giá trị dinh dưỡng, tăng cường
khả năng chống chịu bệnh, cải thiện chất lượng môi trường sống của vật chủ”.
1.2.2 Đặc điểm chung của probiotic
 Có khả năng sống sót trong môi trường acid dạ dày, tồn tại tạm thời hoặc hình

thành khuẩn lạc trong ruột non.
 Không gây hại cho vật chủ.
 Probiotic phải được đưa tới đúng vị trí cần tác động trong cơ thể vật chủ.
 Biểu hiện có lợi đối với vật chủ (cạnh tranh đối kháng với các sinh vật gây bệnh,
sinh các enzyme hoặc các chế phẩm cuối cùng mà vật chủ có thể sử dụng được).
 Không chứa gen gây độc hoặc gen kháng kháng sinh [69], [123].
1.2.3 Các cơ chế tác động của probiotic
Gia tăng khả năng bám hoặc đối kháng trực tiếp những ảnh hưởng có hại của tác
nhân gây bệnh là những yếu tố quan trọng của probiotic để làm giảm tính gây độc
trong suốt quá trình nhiễm bệnh . Các chủng probiotic phải có đặc tính kháng lại vi
khuẩn gây bệnh ở điều kiện in vitro lẫn in vivo thông qua một số cơ chế khác nhau. Đa
số các nghiên cứu về probiotic đã được công bố trong thập niên qua, trong đó có nhiều
nghiên cứu giải thích cơ chế tác động của probiotic. Nhìn chung, probiotic có các cơ
chế tác động sau:


15

1.2.3.1 Sản sinh ra các hợp chất ức chế
Kháng khuẩn là một hiện tượng ph biến trong tự nhiên. Vì vậy, sự tương tác
giữa các vi sinh vật đóng vai trò quan trọng đảm bảo trạng thái cân bằng giữa vi sinh
vật hữu ích và những vi sinh vật gây bệnh [20].
Những loài vi khuẩn khác nhau có thể giải phóng ra một số hợp chất hóa học có
khả năng tiêu diệt hoặc kiềm hãm các vi khuẩn khác để đấu tranh giành lấy năng lượng
hay các chất hóa học . Những hợp chất này bao gồm: bacteriocin, siderophore,
lysozyme, protease, hydrogen peroxide và các acid hữu cơ. V i khuẩn sinh acid lactic
tạo hợp chất bacteriocin giúp ức chế các vi khuẩn khác. Có rất nhiều nghiên cứu in
vitro đã chứng minh khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh của một số chủng vi khuẩn
được chọn lựa b sung vào môi trường ương nuôi ấu trùng [102].
Gaixa (1889) đã có báo cáo đầu tiên về sự tồn tại của vi khuẩn trong nước biển

có khả năng ức chế Vibrio sp. Sau đó, Rosenfeld và Zobell (1947) nghiên cứu việc sản
sinh chất ức chế vi sinh vật biển và kể t đó nhiều nghiên cứu tiếp theo theo hướng sử
dụng vi sinh vật như một tác nhân kiểm soát sinh học. Nogami
và Maeda (1992),
Nogami và cs (1997) đã chứng minh vi khuẩn Thalasobacter utilis ức chế vi khuẩn
Vibrio anguillarum, do đó làm gia tăng khả năng sống sót của ấu trùng cua xanh
Portunus trituberculatus, đồng thời cũng làm giảm số lượng Vibrio trong nước ương
ấu trùng. Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy chủng này ngăn chặn sự phát triển của vi
khuẩn V. angillarum trên cá bơn trưởng thành Scophthalmus maximus và Limanda
limanda. Sử dụng V. alginolyticus như một probiotic đã được đề cập để tăng cường khả
năng sống sót và phát triển của ấu trùng tôm chân trắng Litopenaeus vannamei ở các
trại nuôi ở Ecuador. Theo Chythanya và cs (2002), một chủng vi khuẩn nước mặn,
Pseudomonas I2, có khả năng sinh hợp chất ức chế lại Vibrio gây bệnh trên tôm. Hợp
chất kháng khuẩn này được chứng minh có khối lượng phân tử thấp, bền nhiệt, tan
trong chloroform, và kháng được sự thủy giải của các ezyme [24], [85].

1.2.3.2 Cạnh tranh chất dinh dưỡng hay năng lượng sẵn có