tạo phôi bò giai đoạn blastocyst bằng công nghệ thụ tinh trong ống nghiệm từ nguồn giao tử nội và ngoại nhập

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM
SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP.HCM






BÁO CÁO NGHIỆM THU
(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu
ngày 26 tháng 03 năm 2009)







TẠO PHÔI BÒ GIAI ĐOẠN
BLASTOCYST BẰNG CÔNG NGHỆ THỤ
TINH TRONG ỐNG NGHIỆM TỪ NGUỒN
GIAO TỬ NỘI VÀ NGOẠI NHẬP



CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: PHAN KIM NGỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
THÁNG 04/2009
TÓM TẮT
Nhân giống bằng công nghệ phôi hiện đại là giải pháp khả thi nhất góp
phần triển khai thành công Chương trình Quốc gia 200.000 bò sữa. Đề tài tiến
hành nhằm nghiên cứu và hoàn thiện quy trình tạo phôi bò bằng công nghệ thụ
tinh ống nghiệm tại khu vực Tp HCM đồng thời góp phần đào tạo cán bộ kỹ
thuật cho lĩnh vực CNSH động vật. Nội dung 1: buồng trứng được thu nhận tại lò
mổ và chuyển nhanh về phòng thí nghiệm trong nước muối sinh lý sau đó thu
nhận trứng bằng phương pháp chọc hút bằng kim tiêm 18G và xi lanh 5ml, nuôi
chín trong môi trường C
1
(TCM -199 bổ sung FBS, EGF) và tiến hành thụ tinh
trong ống nghiệm với tinh trùng đông lạnh ngoại nhập. Kết quả thụ tinh được
đánh giá thông qua phôi 2 tế bào. Tiến hành sinh thiết và xác định giới tính phôi
nang bằng kỹ thuật PCR và LAMP. Nội dung 2: trứng thu nhận bằng phương
pháp siêu âm, sau khi nuôi chín, tiến hành thụ tinh trong ống nghiệm với tinh
trùng đông lạnh ngoại nhập. Tiến hành sinh thiết và xác định giới tính phôi dâu
và phôi nang bằng kỹ thuật PCR. Nội dung 3: thụ tinh trong ống nghiệm giữa

trứng đông lạnh (do phòng thí nghiệm tự đông lạnh và trứng mua) và thử nghiệm
cấy truyền phôi cho các bò mẹ mang thai hộ. Kết quả nội dung 1: tỷ lệ trứng chín
69,83 ± 8,04% (Trứng thu tại lò mổ Vissan) và 81,19 ± 2,75% (Trứng thu tại lò
mổ Long An); tỷ lệ thu tinh 48,43 ± 6,74%; 18,01 ± 4,91% phát triển đến giai
đoạn phôi nang; sinh thiết phôi bằng kỹ thuật PCR và LAMP lần lượt đạt tỉ lệ
41,53% và 46,29%. Kết quả nội dung 2: tỷ lệ trứ
ng chín đạt 82,78 ± 7,01%; tỷ lệ
thu tinh đạt 67,83 ± 2,61%; 27,32 ± 3,68% phát triển đến phôi nang; sinh thiết
phôi đạt tỷ lệ 47,86%. Kết quả nội dung 3: tỷ lệ thụ tinh trong ống nghiệm đạt
11,67% (trứng do phòng thí nghiệm tự đông lạnh) và có 46/144 phôi (3,72%)
phát triển đến giai đoạn phôi nang và có 02 bê cái ra đời khỏe mạnh.
Từ khóa: nuôi chín trứng, thụ tinh trong ống nghiệm, đông lạnh trứng,
đông lạnh phôi, xác định giới tính phôi, chuyển phôi.

ABSTRACT
Breeding by modern embryo production technology is the most feasible
solution, contributing to the success of the 200,000 milk cows National Program.
The main target of our research is studying and improving bovine embryo
production process by in vitro fertilization technology in Ho Chi Minh city,
simultaneously, contributing to train technicians of animal biotechnology field.
In the first experiment, cow ovaries were obtained from abattoir and
transported to the laboratory in 0.9% (w/v) saline solution at 33 to 35
o
C. The
cumulus-oocyte complexes (COC) were recovered by aspiration of 2 to 8 mm
follicles using an 18-gauge needle attached to 5ml syringe. Oocytes with a two or
three layers of cumulus cells (CC) and homogeneous cytoplasm were washed in
flushing medium. Groups of 25 to 30 oocyte were placed in 100 µl drops of C
1

maturation medium (TCM-199 medium supplemented with 10% FBS, 0.2 mM
sodium pyruvate, 50µg/ml gentamicin, 10ng EGF) under sterile mineral oil at
38.5◦C in an humidified atmosphere of 5% (v/v) CO
2
in air for 22h - 24 h.
Mature oocytes were inseminated with imported sperm suspension to a final
concentration of 1.10
6
sperms/ml at 38.5◦C in a humidified atmosphere of 5%
(v/v) CO
2
in air. The insemination rate is evaluated by 2-cell embryo. Sex of
blastocyst embryos were determined by PCR and LAMP technique. In the
second experiment, the cumulus-oocyte complexes (COC) were recovered by
ultrasound guided ovum pick-up technique. After 22- 24h culture, mature
oocytes were inseminated with sperm suspension. Sex of morula and blastocyst
embryo is determined by PCR. In the last experiment, IVF was performed with
cryopreservated oocytes (from our lab or purchase). The morulas and blastocysts
created by this procedure were transferred into the recipient cows. .
In the first experiment, the rates of the metaphase II (MII) oocytes after
IVM are 69.83 ± 8.04% (Vissan slaughter - house) and 81.19 ± 2.75% (Long An
slaughter - house); insemination rates are 48.43 ± 6.74% and 18.01 ± 4.91%
blastocysts. The rates of successful sex determination by PCR and LAMP
technique are 41.53% and 46.29%, respectively. In the second experiment, the
rate of MII oocytes after IVM is 82.78 ± 7.01%; insemination rate is 67.83 ±
2.61%; and having 27.32 ± 3.68% blastocysts. The rate of successful sex
determination by PCR is 47.86%. In the last experiment, insemination rate is
11.67% (oocytes from our lab) and two calves were born.
Keywords: in vitro maturation, in vitro fertilization, cryopreservation,
vitrification, embryo biopsy, embryo transfer

MỤC LỤC
Trang
Tóm tắt đề tài/dự án (gồm tiếng Việt và tiếng Anh) I
Mục lục IV
Danh sách các chữ viết tắt VII
Danh sách bảng VIII
Danh sách hình IX
PHẦN MỞ ĐẦU
1
1. Tên đề tài/dự án
Chủ nhiệm đề tài/dự án
Cơ quan chủ trì
Thời gian thực hiện
Kinh phí được duyệt
Kinh phí đã cấp
1
1
1
1
1
1
2. Mục tiêu 1
3. Nội dung 2
4. Sản phẩm của đề tài/dự án 2

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆ
U

1.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
5
1.1.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 5
1.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 10
1.2. Lý do chọn đề tài
14
1.3. Đối tượng nghiên cứu
15
1.4. Ý nghĩa khoa học và khả năng ứng dụng thực tiễn
15
CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1. Nội dung 1: Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst bằng trứng
thu nhận từ lò mổ và tinh trùng ngoại nhập đông lạnh
16
2.1.1. Chuẩn bị trứng 16
2.1.2. Chuẩn bị tinh trùng 19
2.1.3. Thụ tinh trong ống nghiệm 20
2.1.4. Nuôi phôi và đánh giá phôi 21
2.1.5. Sinh thiết phôi 21
2.1.6. Xác định giới tính bằng kĩ thuật PCR và LAMP 23
2.1.7. Đông lạnh phôi 26
2.2. Nội dung 2: Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst bằng trứng
thu từ siêu âm và tinh trùng ngoại nhập đông lạnh
28
2.3. Nội dung 3: Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst bằng trứng
đông lạnh và tinh trùng ngoại nhập đông lạnh

29
2.4. Xử lí số liệu
31
CH
ƯƠNG III: KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả nghiên cứu nội dung 1
32
3.1.1. Kết quả thu nhận và nuôi trứng trửơng thành
32
3.1.2. Kết quả đông lạnh trứng
35
3.1.3. Kết quả thụ tinh trong ống nghiệm
36
3.1.4. Kết quả nuôi phôi
37
3.1.5. Kết quả sinh thiết phôi
39
3.1.6. Kết quả xác định giới tính
40
3.1.7. Kết quả đông lạnh phôi
42
3.2. Kết quả nghiên cứu nội dung 2
42
3.2.1. Kết quả thu nhận và nuôi trưởng thành trứng
42
3.2.2. Kết quả thụ tinh trong ống nghiệm
44
3.2.3. Kết quả nuôi phôi

3.2.4. Kết quả sinh thiết phôi
46
3.2.5 Kết quả xác định giới tính
46
3.2.6. Kết quả đông lạnh phôi
47
3.3. Kết quả nghiên cứu nội dung 3
48
3.3.1. Kết quả giải đông trứng mua
48
3.3.2. Kết quả thụ tinh trong ống nghiệm
49
3.3.3. Kết quả nuôi phôi
53
3.3.4. Kết quả đông lạnh phôi
55
3.4. So sánh kết quả của các nội dung thí nghiệm
58
3.4.1. So sánh kết quả nuôi chín trứng từ các nguồn trứng khác nhau 58
3.4.2. So sánh kết quả IVF từ
các nguồn trứng khác nhau
58

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. Kết luận
61
4.2. Kiến nghị
61

TÀI LIỆU THAM KHẢO
62

PHỤ LỤC



DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT


DMSO Dimethyl sulfoxide
EG Ehthylen glycol
FSH Folliccle Stimulating Hormone Hormone kích thích nang trứng
GVBD Germinal vesicle break dowm Giai đoạn túi mầm
ICSI Intracytoplasmic sperm injection Tiêm tinh trùng vào bào tương trứng

IVF In Vitro Fertilization Thụ tinh trong ống nghiệm
IVM In Vitro Maturation Nuôi trưởng thành trong ống nghiệm
LAMP Loop mediated isothermal amplification
Phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt
MII Methaphase II Kỳ methaphase của nhiễm phân II.
MPF Maturation Promoting Factor Nhân tố thúc đẩy sự trưởng thành.
PCR Polymere Chain Reaction Phản ứng chuỗi
PN Pronuclear Tiền nhân
PTN Phòng thí nghiệm
PVP polyvinylpyrolidone
PZD Partial Zona Disection Tiêm tinh trùng vào khoang quanh
noãn
SUZI Subzonal Sperm Injection Tạo lỗ thủng nhân tạo ở màng zona.
TE Trophoblast embryonic Lớp dưỡng bào phôi

ZP Zona pellucidae Lớp màng trong su
ốt bảo vệ trứng.

DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 2. 1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 1 Error! Bookmark not defined.
Hình 2. 2. Rửa buồng trứng Error! Bookmark not defined.
Hình 2. 3. Thu nhận trứng từ buồng trứng Error! Bookmark not defined.
Hình 2. 4. Cọng rạ chứa trứng Error! Bookmark not defined.
Hình 2. 5. Giải đông cọng rạ chứa tinh trùng trong water bath 37
0
C. Error!
Bookmark not defined.
Hình 2. 8. Cách hút phôi vào cọng rạ Error! Bookmark not defined.
Hình 2. 9. Hút phôi vào cọng rạ Error! Bookmark not defined.
Hình 2. 10.Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 2 Error! Bookmark not defined.
Hình 2. 11. Một số hình ảnh siêu âm thu nhận trứng bò Error! Bookmark not
defined.
Hình 2. 12. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nội dung 3 Error! Bookmark not defined.
Hình 3. 1.Trứng bò trước khi IVM (a) và sau khi IVM (b; c); trứng trưởng thành
xuất hiện thể cực thứ nhất sau 22 – 24h nuôi (d)
Error! Bookmark not defined.
Hình 3. 2. Phôi 4 tế bào Error! Bookmark not defined.
Hình 3. 3. Phôi 8 tế bào Error! Bookmark not defined.
Hình 3. 4. Phôi dâu Error! Bookmark not defined.
Hình 3. 5. Phôi nang Error! Bookmark not defined.
Hình 3.6. Xác định giới tính phôi bò bằng phản ứng PCR. M: thang chuẩn, Giếng
1: thịt bò đực, Giếng 2: Thịt bò cái, Giếng 3, 4: Phôi đực, Giếng 5, 6,7: Phôi cái,
Giếng 8, 9: Phôi không xác định.
Error! Bookmark not defined.

Hình 3.7. Xác định giới tính phôi bò bằng phản ứng LAMP Error! Bookmark
not defined.
Hình 3.8. Trứng bò trước khi IVM (a) xuất hiện thể cực sau khi IVM (b) Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.9. Phôi 2 tế bào (a) 8 tế bào (b), phôi morula (c) và phôi nang (d) Error!
Bookmark not defined.
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR, các mẫu phôi bò đực (a), bò cái (b)
Error! Bookmark not defined.
Hình 3.11.Phôi 2 tế bào, thụ tinh bằng tinh trùng đông lạnh với trứng đông lạnh
Error! Bookmark not defined.
Hình 3. 12. Trứng đã thụ tinh (phôi 2) từ IVF trứng mua Error! Bookmark not
defined.
Hình 3.13. Phôi bò. (a) 4-8 tế bào, (b) 16 tế bào, (c) morula và (d) phôi nang.
Phôi này thu được từ IVF từ trứng đông lạnh
Error! Bookmark not defined.
Hình 3.14. Bê cái sinh ra từ phôi tạo ra trong ống nghiệm từ trứng đông lạnh vào
ngày 17/04/2008 tại gia đình ông Nguyễn Văn Cường
Error! Bookmark not
defined.
Hình 3.15. Bê cái sinh ra từ phôi tạo ra trong ống nghiệm từ trứng đông lạnh vào
ngày 26/02/2008 tại gia đình ông Võ Văn Sa
Error! Bookmark not defined.
Hình 3.16. Bê cái (có đốm trắng dười bụng) sinh ra từ phôi tạo ra trong ống
nghiệm từ trứng đông lạnh vào ngày 26/02/2008
Error! Bookmark not defined.

Biểu đồ 3. 1. Kết quả nuôi trứng từ nguồn trứng thu tại lò mổ Error! Bookmark
not defined.
Biểu đồ 3. 2. Kết quả đông lạnh trứng Error! Bookmark not defined.
Biểu đồ 3.3. Kết quả nuôi trứng từ nguồn trứng siêu âm Error! Bookmark not

defined.
Biểu đồ 3.4. Kết quả thu nhận trứng sau giải đông Error! Bookmark not
defined.
Biểu đồ 3.5. Kết quả thụ tinh từ nguồn trứng đông lạnh Error! Bookmark not
defined.
Biểu đồ 3.6. So sánh hiệu quả tạo phôi ở các giai đoạn khác nhau ………… 59

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3. 1. Kết quả nuôi trứng từ nguồn trứng thu tại lò mổ Error! Bookmark
not defined.
Bảng 3. 2. Kết quả đông lạnh trứng từ nguồn trứng thu nhận tại lò mổ Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3. 3. Kết quả thụ tinh từ trứng thu nhận từ lò mổ Error! Bookmark not
defined.
Bảng 3. 4.Các giai đoạn phát triển của phôi từ nguồn thu ở lò mổ Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3. 5.Sự chuyển tiếp của phôi lên các giai đoạn chính Error! Bookmark not
defined.
Bảng 3. 6. Kết quả xác định giới tính phôi Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.7. Kết quả nuôi trứng từ nguồn trứng siêu âm Error! Bookmark not
defined.
Bảng 3.8. Tỷ lệ trứng thụ tinh từ nguồn trứng thu nhận bằng siêu âm Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3.9. Các giai đoạn phát triển của phôi từ nguồn trứng thu nhận bằng
phương pháp siêu âm
Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.10. Kết quả xác định giới tính phôi bằng PCR Error! Bookmark not
defined.
Bảng 3.11. Các giai đoạn của phôi trước khi đông lạnh Error! Bookmark not

defined.
Bảng 3.12. Kết quả thu nhận trứng sau giải đông Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.13. Kết quả IVF từ trứng đông lạnh Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.14. Tỷ lệ trứng thụ tinh từ nguồn trứng mua Error! Bookmark not
defined.
Bảng 3.15. Các giai đoạn phát triển của phôi từ nguồn trứng đông lạnh Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3.16. Sự chuyển tiếp của phôi lên các giai đoạn chính ở trứng đông lạnh
Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.17. Các giai đoạn phát triển của phôi từ nguồn trứng đông lạnh Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3.18. Các giai đoạn của phôi trước khi đông lạnh Error! Bookmark not
defined.
Bảng 3.19. Bê sinh ra từ việc cấy truyền phôi tạo ra trong ống nghiệm Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3.20. Kết quả nuôi trứng chín từ các nguồn trứng Error! Bookmark not
defined.
Bảng 3.21. Kết quả IVF từ các nguồn trứng Error! Bookmark not defined.

PHẦN MỞ ĐẦU
1. TÊN ĐỀ TÀI
TẠO PHÔI BÒ GIAI ĐOẠN BLASTOCYST BẰNG CÔNG NGHỆ THỤ TINH
TRONG ỐNG NGHIỆM TỪ NGUỒN GIAO TỬ NỘI VÀ NGOẠI NHẬP
Chủ nhiệm đề tài: Phan Kim Ngọc
Cơ quan chủ trì: Trường ĐH KHTN, ĐH Quốc gia TPHCM.
Thời gian thực hiện: 24 tháng, từ tháng 12/2006 đến tháng 12/2008
Kinh phí được duyệt: 305.000.000 đồng.
Kinh phí đã cấp:
- Đợt 1: 180.000.000 đồng, theo TB số: 246, TB-SKHCN ngày
30/11/2005

- Đợt 2: 95.000.000 đồng, theo TB số 49, TB-SKHCN ngày 11/04/2007
- Còn lại: 30.000.000 đồng sẽ giao sau khi nghiệ
m thu.
2. MỤC TIÊU
(1) Xây dựng và hoàn thiện quy trình tạo phôi bò bằng công nghệ thụ tinh
ống nghiệm tại khu vực Tp HCM.
- Thiết lập quy trình kĩ thuật hoàn thiện nhằm chủ động tạo được nguồn
phôi từ công nghệ thụ tinh in vitro làm tiền đề cho khả năng ứng dụng quy
trình vào sản xuất quy mô công nghiệp nguồn phôi bò với chất lượng cao
và giá thành hạ, nguyên liệu cho công tác phát triển và nhân nhanh đàn bò
sữa của Tp. Hồ Chí Minh.
- Thử nghiệm nghiên cứu một số quy trình nhằm bảo quản nguồn phôi in
vitro tạo ra cho công tác cấy truyền về sau, quy trình xác định giới tính
phôi (nhằm chọn được phôi cái).
(2) Góp phần đào tạo cán bộ kỹ thuật cho lĩnh vực CNSH động vật.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nội dung 1: Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst từ trứng lò mổ và tinh trùng nhập
ngoại đông lạnh.
Nội dung 2: Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst từ
trứng siêu âm bò lai F2 và tinh
trùng nhập ngoại đông lạnh.
Nội dung 3: Tạo phôi bò giai đoạn blastocyst từ trứng đông lạnh và tinh trùng
đông lạnh nhập ngoại.
4. SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI
1.7.1 Kết quả khoa học
- 01 Quy trình tạo phôi và xác định giới tính phôi bằng kĩ thuật PCR và LAMP
bằng trứng thu từ lò mổ với tinh trùng đông lạnh. Trong quy trình này bao gồm: quy
trình chuẩn bị trứng, chuẩn bị tinh trùng, thụ tinh IVF, nuôi phôi, sinh thiết phôi, xác
định giới tính phôi và đông lạnh phôi. (Xem Phụ lục 1)
- 01 Quy trình tạo phôi và xác định giới tính phôi bằng kĩ thuật PCR và LAMP

bằng trứng thu từ siêu âm và tinh trùng đông lạnh. Trong quy trình này bao gồm: quy
trình chuẩn bị trứng, chuẩn bị
tinh trùng, thụ tinh IVF, nuôi phôi, sinh thiết phôi, xác
định giới tính phôi và đông lạnh phôi. (Xem Phụ lục 2)
- 01 Quy trình tạo phôi bằng trứng đông lạnh và tinh trùng đông lạnh. Trong quy
trình này bao gồm: quy trình chuẩn bị trứng, quy trình đông lạnh trứng, chuẩn bị tinh
trùng, thụ tinh IVF, nuôi phôi, và đông lạnh phôi. (Xem Phụ lục 3)
1.7.2. Kết quả sản phẩm
Đã tạo được 2 bê cái khỏe mạnh.
1.7.3. Kết quả đào tạo
- 1 nghiên cứu sinh (Nghiên cứu sinh: Nguyễn Thị Thương Huyền); với đề tài Tiến sĩ:
Khảo sát tác động làm lạnh lên màng thụ tinh ở trứng đông lạnh.
- 2 Thạc sĩ: Đặng Thị Thu Thủy (Tạo phôi bò trong ống nghiệm từ nguồn trứng đông
lạnh); Ngô Hồng Anh (Xác định giới tính phôi bò bằng kĩ thuật LAMP).
- 8 Cử nhân: + Đặ
ng Hoàng Lâm: Xác định giới tính bằng kĩ thuật PCR và LAMP
+ Khưu Bảo Hoàng: Thiết lập quy trình sinh thiết phôi bò giai đoạn 4-8
tế bào
+ Trần Thị Thanh Khương: Tạo phôi bò bằng kĩ thuật ICSI
+ Quách Hoa Thiên Cung: Tạo phôi bò bằng kĩ thuật thụ tinh trong ống
nghiệm
+ Trần Duy Bình: Khảo sát tác động của EGF lên sự trưởng thành trứng
bò in vitro.
+ Võ Thị Tuyết Nga: Thử nghiệm đông lạnh trứng bò trưởng thành bằng
phương pháp th
ủy tinh hóa (Vitrification)
+ Nguyễn Thị Phương Dung: Thử nghiệm nuôi trứng bò từ nguồn trứng
đông lạnh bằng phương pháp thủy tinh hóa (Vitrification)
+ Nguyễn Thị Thanh Xuân: Thử nghiệm thụ tinh trong ống nghiệm từ
nguồn trứng bò đông lạnh

1.7.4. Bài báo, báo cáo đã công bố
- 01 bài đăng trong Hội nghị Công nghệ sinh học trong nông nghiệp tại Đại học
Nông Lâm, 2007. (Ứng dụng kĩ thuật thụ tinh trong ống nghiệm tạo phôi bò).
- 01 bài đăng trong Hội nghị Sinh hóa và Sinh học Phân tử, Hà Nội, 2008. (Xác
định giới tính phôi bò bằng kĩ thuật LAMP).
- 01 bài đăng trong Hội nghị Khoa học, Đại học Khoa học Tự nhiên, 2008 (Bảo
quản trứng bò bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ).
- 01 bài đăng trong Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, 2009 (Bảo quản
trứng bò bằng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ; đang chờ phản biện).
- 01 bài đăng trong Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2009 (Thử
nghiệm cấy truyền
phôi bò đông lạnh đã xác định giới tính từ thụ tinh trong ống nghiệm của giao tử đông
lạnh; đang chờ phản biện)
- 01 bài đăng trong Tạp chí Sinh học, 2009 (So sánh hiệu quả tạo phôi của trứng
thu từ lò mổ, siêu âm và đông lạnh với tinh trùng đông lạnh; đang chờ phản biện).

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
1.1.1. Tình hình ngiên cứu ngoài nước
Thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro fertilization_IVF) được tiến hành lần
đầu tiên trên thỏ bởi Dauzier et al. vào năm 1954. Kỹ thuật này được Brackett
ứng dụng vào chăn nuôi bò sữa từ năm 1982. Từ đó, IVF được nghiên cứu và áp
dụng rộng rãi ở các nước chăn nuôi phát triển.
Quy trình IVF gồm những bước cơ bản: thu nhận và chọn lọc giao tử đực
và cái; thụ tinh; nuôi hợp tử phát triển thành phôi; cấy truyền phôi tươi hoặc phôi
đông lạnh cho con cái nhận phôi. Mỗi bước trong quy trình đều đóng vai trò quan
trọng như nhau nhằm đảm bảo được khả năng hình thành và phát triển phôi tối
đa.

Nguồn trứng sử dụng cho IVF có thể thu từ những động vật sống được
kích hoạt bằng kích dục tố để gây rụng trứng hàng loạt; từ buồng trứng động vật
giết mổ hay sử dụng trứng đông lạnh. Theo Long et al. (1993), các nang trứng có
đường kính 2-8 mm hiện diện ở vùng vỏ của buồng trứng được sử dụng cho việc
thu nhận các trứng chưa trưởng thành phục vụ cho kĩ thuật IVF. Trong kĩ thuật
IVF, nếu sử dụng các trứng chưa trưởng thành cần có sự hỗ trợ của quá trình nuôi
trứng trưởng thành (In Vitro Maturation_IVM). Ngoài ra, sử dụng trứng đông
lạnh trong quá trình IVF cũng là một thử thách lớn vì tỉ lệ thụ tinh và phát triển
phôi không cao do những tổn thương khó phục hồi ở màng nội chất và màng
zona pellucida của trứng trong quá trình bảo quản. Theo Shinichi Hochi (2003),
tỉ lệ trứng thụ tinh sau rã đông là 36% và tỷ lệ phát triển lên blastocyst là 5%. Vì
thế, việc sử dụng nguồn trứng đông lạnh ngoại nhập cần tuân thủ nghiêm ngặt
quy trình giải đông trứng của nhà cung cấp nh
ằm đảm bảo được tỉ lệ sống cao
nhất của nguồn giao tử này.
Sự xâm nhập thành công của tinh trùng vào các tế bào trứng đã được thực
hiện với tinh tươi hoặc tinh đông lạnh qua giải đông. Ở nhiều phòng thí nghiệm,
do khó khăn trong bảo quản lạnh nên tinh tươi vẫn là nguồn tinh trùng chính cho
các nghiên cứu IVF. Tuy nhiên, theo nghiên cứu, trong tinh dịch tươi có một số
thành phần không có lợi cho hoạt động của tinh trùng. Mục đích của các phương
pháp thu nhận tinh trùng theo các nghiên cứu nhằm chọn được các tinh trùng
bình thường có độ di động tốt, loại được các tế bào chết, các vi sinh vật và các
chất độc, hoạt hóa đầu tinh trùng, tạo thuận lợi cho quá trình thụ tinh với trứng.
Hệ thống thụ tinh IVF đòi hỏi nghiêm ngặt về các điều kiện nhiệt độ, độ
ẩm, thời gian thụ tinh, áp suất thẩm thấu của môi trường nuôi cấy. Hầu hết các
môi trường IVF cần bổ sung những yếu tố có vai trò hoạt hóa tinh trùng, tăng khả
năng hoạt động của chúng. Ngoài ra, cũng bổ sung những yếu tố cần thiết giúp
chúng duy trì khả năng thụ tinh. Bên cạnh đó, môi trường IVF cũng ảnh hưởng
đến tỉ lệ thụ tinh đ
a tinh trùng. Martinez-Mardrid et al. (2001) đã sử dụng hai môi

trường IVF khác nhau gồm môi trường đệm Tris cải tiến (mTBM) và môi trường
Tyrode cải tiến (mTALP) để so sánh. Kết quả này cho thấy, trong mTALP tinh
trùng có tỉ lệ xâm nhập cao hơn (92-94% so với 61-67%). Vì thế, lựa chọn môi
trường IVF thích hợp cũng là một yếu tố quan trọng để giảm tối thiểu tỷ lệ đa
tinh trùng nhưng đạt tỉ lệ thụ tinh cao.
Hệ thống nuôi phôi phải
đảm bảo các điều kiện đặc biệt về áp suất thẩm
thấu. Do đó, các yếu tố bảo vệ áp suất thẩm thấu được sử dụng như taurine,
hypotaurine, sorbitol. Ngoài ra, huyết thanh thường được sử dụng với hàm lượng
cao hơn so với môi trường nuôi trứng nhằm kích thích khả năng phân chia các
nguyên bào phôi, đặc biệt trong giai đoạn phát triển muộn của phôi (từ giai đoạn
phôi dâu trở lên). Trong nhi
ều thập kỉ qua, đã có nhiều nghiên cứu và pha chế
nhiều môi trường nuôi cấy khác nhau như môi trường Whitten cải tiến, môi
trường NCSU, môi trường ISU và môi trường Beltsville 3 đã cho phép hơn 70%
phôi (thu nhận in vivo) phát triển đến giai đoạn phôi nang.
Wilmut và Kowon (1973) lần đầu tiên thực hiện kĩ thuật đông lạnh phôi
bò bằng dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline) có thành phần Dimethyl
sulfoxide (DMSO) với quy trình đông lạnh chậm (0,2
o
C/phút) và giải đông
nhanh đã cấy chuyển thành công cho bò mang mang thai. Tiếp theo sau là những
nghiên cứu của Willadsen et al. (1977-1978); Truoson et al. (1978; Lehsen et al.
(19787); Schneider et al. (1980) nhằm đổi mới phương pháp đông lạnh theo xu
hướng đông lạnh và giải đông nhanh nhưng vẫn đảm bảo được sức sống của phôi
và đã thu được kết quả tốt ở cả chuột và bò. Hiện nay, kĩ thuật đông lạnh phôi đã
được đơn giản hóa rất nhiều và tiến đến phương pháp một bước do Leibo et al.
(1982) và Reinard et al. (1982) đã thiết lập. Với phương pháp này, phôi sống đạt
trên 80% sau khi giải đông và tỉ lệ thụ thai đạt 50-60%. Việc trữ lạnh phôi có thể
áp dụng trên cả phôi giai đoạn sớm và muộn với các quy trình và thành phần chất

bảo quản hơi khác nhau nhằm đảm bảo tối đa sức sống của phôi.
Cấy truyền phôi là quá trình chuyển phôi vào cá thể nhận giúp cho sự phát
triển bình thường của phôi đến giai đoạn phát triển hoàn chỉnh. Hiệu quả của kĩ
thuật này giúp tạo đượ
c thế hệ con nhanh thông qua việc cấy chuyển hàng loạt
các phôi được tạo ra in vivo hoặc in vitro; và nguồn phôi sử dụng có thể là phôi
tươi hoặc phôi đông lạnh. Kĩ thuật cấy truyền phôi được thực hiện lần đầu tiên
trên thỏ (1890) do Walter Heap thực hiện. Vào năm 1951, bê đầu tiên trên thế
giới ra đời nhờ kĩ thuật này do Willet et al. tiến hành. Sau đó, Bilton và More
(1972), Wilmut và Rowson (1973) thành công việc cấy truyền phôi bò đông lạnh.
Tiếp theo là sự thành công của cấy truyền hai phôi bò từ kĩ thuật cắt đôi phôi
(William et al., 1984). Năm 1992, kĩ thuật nhân bản vô tính đã thành công với 5
phôi bò được tạo ra từ một phôi. Nhìn chung, công nghệ kỹ thuật cấy truyền phôi
đã được nghiên cứu và ứng dụng ở hầu hết các nước trên thế giới, đặc biệt là các
nước chăn nuôi phát triển.
Kỹ thuật đông lạnh bằng phương pháp th
ủy tinh hóa áp dụng thành công
trên trứng bò (Martino và cs.,1996b). Trên chuột, tỷ lệ hình thái trứng sống sau
quy trình đông lạnh và rã đông bằng phương pháp thủy tinh hóa là 88% (Nakaga,
1989); 80% (Shaw, 1991); 95% (O’Neill, 1997); 99% (Lane, 2001); 90% (Kim,
2006). Trên bò, tỷ lệ trứng sống sau đông lạnh và rã đông là 85% (Otoi,1998);
87% (Asada, 2002); 88% (Men, 2002); đặc biệt Chian thu được tỷ lệ trứng bò
sống sau rã đông đạt 92% khi dùng chất bảo quản đông lạnh là 15% ethylene
glycol (EG) kết hợp với 15% dimethyl sulphoside (DMSO), và đạt 98% khi dùng
15% ethylene glycol (EG) kết hợp với 15% propylene glycol (PG)
Năm 2004, Chian đã thành công trong việ
c đông lạnh và giải đông trứng
đạt tỷ lệ 92% trứng sống sau rã đông với phương pháp thủy tinh hóa, khi sử dụng
chất bảo quản đông lạnh là 15% ethylene glycol (EG) kết hợp với 15% dimethyl
sulphoside (DMSO).

Vào năm 2005, Fujihira thực hiện quy trình đông lạnh và rã đông trứng
heo bằng phương pháp thủy tinh hóa sử dụng Cryotop, với nồng độ EG trong
dung dịch thủy tinh hóa là 30%, thu được tỷ lệ sống sau rã đông là 54 – 56%.
Cũng trong thời gian này Yunus Cetin và Ayhan Bastan đã bảo quản trứng bò
chưa trưởng thành bằng phương pháp thủy tinh hóa với các chất bảo quản khác
nhau, tỷ lệ
sống trên 20% so với nhóm đối chứng là 79,6%. Trong năm này R.D.
Martin và cs đã đông lạnh trứng bò chưa chín bằng phương pháp thủy tinh hóa,
sử dụng chất bảo quản là EG và sucrose, tỷ lệ trứng sống là 20% so với nhóm đối
chứng là 74,6%. Gần đây, người ta đã công bố ứng dụng phương pháp thủy tinh
hóa trong dự trữ trứng người. Trong công bố ngày 19/6/2006, Kuwayama cho
đông lạnh 111 trứng, trong đó 94,5% sống sau khi được rã đông và tỷ lệ thụ tinh
bằng kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (Intra cytoplasmic sperm
injection_ICSI) đạt 41,9%.
Ở động vật hữu nhũ, quá trình xác định giới tính là một mô hình về sự
“đóng mở” di truyền các chương trình nối tiếp nhau trong suốt sự phát triển của
các thể. Gene chủ đạo có vai trò khởi đầu cho những sự kiện hình thái mang tính
di truyền là gene sry. Ở bò, SRY được biểu hiện trong giai đoạn phôi 4 – 8 tế bào
đến giai đoạn phôi nang. Tiềm năng của kĩ thuật PCR (Polymerase Chain
Reaction) trong chẩn đoán tiền sinh ở phôi bò và chuột được chứng minh vào
năm 1988 bởi King và Wall. Chẳng bao lâu sau việc xác định giới tính bằng PCR
trên các phôi bò đã được áp dụng thực tế trong chăn nuôi gia súc mang lại nhiều
lợi ích kinh tế. Bởi vì, thông qua đó, người ta có thể chọn lọc được các phôi cần
cấy chuyển nhằm giảm chi phí sản xuất.
PCR được thiết kế để thu nhậ
n các đoạn sản phẩm có kích thước khác
nhau trên nhiễm sắc thể Y và trình tự trên nhiễm sắc thể dinh dưỡng. Các sản
phẩm này được phân biệt bằng điện di trên gel agarose. Trong các báo cáo trước
đây, hiệu suất xác định giới tính phôi bằng PCR là 90-95% và độ chính xác đạt
93-98%.

Schroder và cs (1990) đã công bố công trình xác định giới tính phôi bò
giai đoạn 6-7 ngày tuổi dựa trên phản ứng PCR. Đầu tiên, tác giả thiết lập phản
ứng bằng cách sử dụng các tế bào bạch cầu. Sau đó, quy trình được áp dụng trên
các mẫu sinh thiết có từ 1-3 tế bào thu nhận từ phôi. Kết quả xác định giới tính
bằng PCR được so sánh với phương pháp chuẩn đoán tế bào là nhuộm nhiễm sắc
thể và phương pháp lai tại chỗ được tiến hành song song trong thử nghiệm này.
Kết quả cho thấy phương pháp PCR cho hiệu quả phân tích cao hơn so với hai
phương pháp còn lại.
Peura và cs (1991) với công trình xác định giới tính phôi bò bằng kĩ thuật
PCR đã khẳng định thêm tính khả thi của PCR trong xác định giới tính phôi.
Trong bước đầu thiết lập quy trình, tác giả đã sử dụng tế bào bạch cầu và xác
định độ chính xác của phương pháp là 100% ở tất cả các mẫu kiểm tra khi so
sánh giữa kết quả xác định bằng PCR và kết quả phân tích hình thái học. Sau đó,
quy trình đước áp dụng trên các mẫu sinh thiết có từ 20-30 tế bào thu nhận từ
phôi dâu. Lopes và cs (1992) công bố kết quả sử dụng các mẫu sinh thiết gồm 4-
20 tế bào từ phôi cho phản ứng PCR xác định giới tính.
Bredbacka và cs (1994) nghiên cứu quy trình xác định giới tính phôi bằng
kĩ thuật PCR. Trong công trình này, các tác giả thực hiện sinh thiết phôi ở giai
đoạn phôi dâu và lấy đi 2-8 tế bào từ
phôi để thực hiện việc xác định giới tính.
Trong nghiên cứu, các tác giả chỉ sử dụng mồi đặc hiệu cho giới tính đực mà
không sử dụng mồi cho các trình tự mồi cho các trình tự chung của hai giới để
kiểm tra hiệu quả nhân bản của phản ứng. Các tác giả cho rằng việc sử dụng mồi
cho các trình tự chung này là không cần thiết nếu như đã thực hiện việc kiểm tra
sự hiện diện của mẫu sinh thiết trước khi thực hiện phản ứng PCR. Tuy nhiên,
một số phản ứng cho kết quả không rõ ràng.
Hiện nay, một phương pháp đơn giản và hiệu quả hơn PCR trong xác định
giới tính được sử dụng, đó là phương pháp LAMP. LAMP (loop-mediated
isothermal amplification) là sự khuếch đại DNA ở điều kiện đẳng nhiệt thông qua
loop. LAMP được phát triển đầu tiên vào năm 2000 bởi nhóm của tác giả

Tsugunori Notomi, đây là một phương pháp khuếch đại DNA có tính đặc hiệu,
hiệu quả cao và thời gian ngắn. Phương pháp này sử dụng đặc tính của DNA
polymerase và một loạt 4 mồi được thiết kế đặc biệt để nhận diện toàn bộ 6 trình
tự cách xa nhau trên DNA đích. Phương pháp này dựa trên sự tổng hợp DNA
thay thế chuỗi tự xoay vòng được thực hiện bởi một DNA polymerase với hoạt
động thay thế chuỗi cao và một bộ hai mồi trong và hai mồi ngoài được thiết kế
đặc biệt. Ở các bước khởi đầu của phản ứng LAMP cả bốn mồi được sử dụng,
nhưng sau đó trong suốt phản ứng chu kỳ chỉ các mồi trong được sử dụng để
tổng hợp DNA thay thế chuỗi. Các mồi trong được gọi là mồi trong tiến trước
(Forward inner primer - FIP) và mồi trong tiến sau (Backward inner primer -
BIP) và mỗi một mồi có chứa hai trình tự riêng biệt tương ứng với trình tự sense
và antisense của DNA đích, một cho việc mồi ở giai đoạn đầu tiên và cái còn l
ại
là tự mồi trong các giai đoạn sau. Để dễ dàng hơn cho việc giải thích, trình tự
(khoảng 23 -24 nt) bên trong hai đầu của vùng đích cho khuếch đại trên DNA chỉ
định lần lượt là F2c và B2. Hai trình tự trong (khoảng 23-24 nt) cách 40 nt từ đầu
của F2c và B2 được chỉ định là F1c và B1 và hai trình tự (17-21 nt) bên ngoài
đầu F2c và B2 được chỉ định là F3c và B3. Trình tự của FIP và BIP sẽ được thiết
kế như sau:
• FIP chứa F1c , một đoạn TTTT và một trình tự (F2) bổ sung v
ới F2c.
• BIP sẽ chứa trình tự (B1c) bổ sung cho B1, một đoạn TTTT và B2.
• Hai mồi bên ngoài là B3 và trình tự (F3) bổ sung cho F3c.
Mẫu DNA chứa trình tự đích và bốn mồi bị biến tính bởi nhiệt và nhanh
chóng cho vào đá sau đó. Phản ứng LAMP được khởi đầu bằng việc thêm mảnh
lớn Bst DNA polymerase thực hiện ở 65
o
C trong 1h.
Sinh thiết phôi là một giai đoạn quan trọng được thực hiện trước kỹ thuật

PCR hay LAMP. Tuy nhiên, việc lấy ra một số lượng tế bào từ phôi có khả năng
làm giảm sức sống của phôi nếu như thao tác không chuẩn. Trong hầu hết các
trường hợp sinh thiết, khoảng 10-20% của khối tế bào phôi được tách ra. Việc
sinh thiết phôi được thực hiện chủ yếu bởi các kỹ thuật vi thao tác.
1.1.2. Tình hình nghiên c
ứu trong nước
Từ thập niên 1990, lĩnh vực chăn nuôi ở Việt Nam đã từng bước thực hiện
những chiến lược phát triển theo định hướng công nghệ sinh học. Tuy nhiên,
những bước nghiên cứu đầu tiên vẫn còn nhiều khó khăn do yếu kém vể kỹ thuật
và thiếu thốn về kinh phí. Mặc dù vậy, nhiều nghiên cứu thuộc lĩnh vực ứng dụng
các kỹ thuật công nghệ sinh học trong nhân giống vẫn được triển khai. Trong đó,
việc áp dụng các kỹ thuật cao như công nghệ thụ tinh ống nghiệm, cấy truyền
phôi, xác định giới tính phôi đã mở ra một hướng mới cho việc nhân nhanh và cải
tạo hiệu quả các giống vật nuôi. Đặc biệt, những kỹ thuật này đã được nghiên
cứu, áp dụng trên bò - một đối tượng quan trọng nằm trong chương trình định
hướng phát triển nông nghiệp chung của cả nước.
Ở nước ta, sự ra đời Bộ môn Cấy truyền phôi vào năm 1989 thuộc Viện
Chăn nuôi Quốc gia làm tiền đề cho khả năng nghiên cứu, ứng dụng và chuyển
giao kỹ thuật này trong cả nước. Cuối năm 1989, 50 phôi bò đông lạnh cùng các
chuyên gia nước ngoài (Cuba) đã hỗ trợ cho Viện Chăn nuôi tổ chức cấy phôi.
Vào năm 1990, Viện Công nghệ sinh học thuộc Trung tâm Khoa học Tự
nhiên và Công nghệ Quốc gia đã ứng dụng công nghệ cấy truyền phôi trên bò.
Năm 1996 và 1997, 150 phôi đông lạnh được nhập và hai chuyên gia New
Zealand đã đến Việt Nam tiến hành kỹ thuật cấy truyền phôi bò sữa cho đàn bò
miền Nam và Hà Nội. Kết quả chuyển giao kỹ thuật cho thấy, một số bê ra đời,
sinh trưởng, phát triển và sinh sản bình thường, đặc biệt năng suất sữa cao hơn
hẳn so với bò bình thường, với tỷ lệ mang thai đạt 42,86% (18/42) và tỷ lệ bê con
sinh ra là 33,3% (14/42). Trên cơ sở đó, tiềm năng áp dụng các kỹ thuật trên là
hoàn toàn có thể cho điều kiện chăn nuôi bò ở nước ta.
Một bước tiến hơn nữa trong việc chủ động tạo nguồn phôi cho việc cấ

y
chuyển đã được ghi nhận tại Viện Công nghệ sinh học của nhóm tác giả Nguyễn
Thị Ước và cs (1999) với hướng ứng dụng công nghệ thụ tinh in vitro tạo phô bò
trên đối tượng bò vàng địa phương Việt Nam và bò lai Hà - Ấn. Hướng nghiên
cứu khẳng định về khả năng tạo được nguồn phôi ở quy mô công nghiệp và giá
thành rẻ để thay thế công nghệ sản xuất phôi bằng kỹ thuậ
t gây rụng trứng nhiều.
Kết quả cho thấy tỷ lệ thụ tinh đạt 54,7-60,9% và tỷ lệ phát triển thành phôi dâu
và phôi nang từ 22,8-26,9% tùy theo giống bò dùng khai thác trứng. Tuy nhiên,
các tác giả khẳng định cần cải thiện quy trình nuôi trưởng thành trứng nhằm nâng
cao tỷ lệ tạo phôi có khả năng cấy chuyển.
Nghiên cứu xây dụng ngân hàng tế bào và phôi đông lạnh là hướng cần
quan tâm khi mà khả năng thành công của công nghệ thụ tinh nhân tạo và cấy
phôi đã đạt được. Thông qua đó sẽ hỗ trợ rất nhiều cho việc cấy chuyển phôi
được chủ động hơn, đơn giản hóa các quá trình trao đổi giống gia súc giữa các
khu vực, bảo quản mẫu để sử dụng trong các dây chuyền công nghệ sinh sản, bảo
vệ đa dạng các loại vật nuôi và động vật hoang dã. Từ những định hướng đó,
nhóm tác giả Bùi Xuân Nguyên và cs (1999) đã tiến hành xây dựng ngân hàng
động lạnh tế bào và phôi của các động vật như chuột, dê, trâu, bò với các phương
pháp đông lạnh khác nhau. Kết quả nghiên cứu trên phôi bò cho thấy, tỷ lệ thành
công phôi sống in vitro đạt được dao động từ 50-90% tùy thuộc loại phôi bò
được khai thác sử dụng (phôi từ bò gây rụng trứng, từ quy trình thụ tinh in vitro,
từ
kỹ thuật vi thao tác) và phương pháp đông lạnh.
Trong thực tế chăn nuôi, đối với những đàn bò khai thác sữa thì bò cái là
đối tượng cần quan tâm; ngược lại, đối với đàn bò cần khai thác tinh thì con đực
là cần thiết. Vì thế, việc điều khiển và chọn giới tính vật nuôi luôn được quan
tâm từ nhiều góc độ khác nhau. Trên cơ sở đó, nghiên cứu sử dụng kỹ thuật sinh
học phân tử như PCR, LAMP với những ưu điểm về thời gian và kỹ thuật đơn
giản để chọn lọc giới tính phôi ở giai đoạn phát triển sớm là một công nghệ được

áp dụng trên nhiều đối tượng khác nhau, trong đó có bò, ở nhiều quốc gia trên thế
giới. Dựa trên những tham khảo trên, các tác giả Bùi Linh Chi et al. (1999) thuộc
Viện Công nghệ sinh học đã áp dụng kỹ thuật này để xác định giớ
i tính nguồn
phôi bò được tạo ra trong điều kiện phòng thí nghiệm phục vụ cho công tác cải
tạo giống và phát triển nhanh đàn bò sữa Việt Nam trong giai đoan 2000-2010.
Các tác giả đã thiết lập được quy trình PCR với các cặp mồi đặc hiệu giới tính do
tổ chức INRA (Pháp) cung cấp và hướng dẫn. Kết quả thử nghiệm đã khẳng định
về khả năng xác định chính xác giới tính phôi ở các giai đoạ
n khác nhau từ 2 tế
bào đến giai đoan phôi nang.
Nhóm tác giả Lê Văn Ty et al. (1999) đã báo cáo về khả năng áp dụng kỹ
thuật vi thao tác vào công nghệ phôi, đặc biệt là phôi bò. Các tác giả đã sử dụng
kỹ thuật vi thao tác để cắt mảnh phôi sử dụng cho việc xác định giới tính phôi với
tỷ lệ sống đạt 80% sau cắt; tiêm tinh trùng vào trứng đạt tỷ lệ tạo phôi là 70-90%
với phương pháp cải tiến.
Vào năm 2003, nhóm nghiên cứu Nguyễn Văn Lý et al. thuộc Viện Chăn
nuôi Quốc gia đã báo cáo đề tài “Nghiên cứu tạo đàn bê bằng phôi thụ tinh trong
ống nghiệm” với khả năng hình thành một quy trình khép kín từ việc tạo phôi
trong điều kiện in vitro và cấy chuyển cho bò nhận phôi. Kết quả thụ tinh in vitro
đạt được là 50,6%; tỷ lệ phôi dâu và phôi nang sau nuôi cấy in vitro 32,37%. Kết
quả về tỷ lệ phát triển phôi đạt cao hơn so với nhóm tác giả Nguyễn Thị Ước et
al. (1999). Tỷ lệ bò mang thai sau cấy chuyển phôi tươi và phôi đông lạnh là
40% và 35%. Cùng hướng nghiên cứu trên, nhóm tác giả Nguyễn Hữu Đức và cs
(2003) thuộc Viện Công nghệ Sinh học đã trình bày về kết quả thụ tinh ống
nghiệm và cấy phôi bò Lai Sind. Trong nghiên cứu này, t
ỷ lệ phân chia đạt
72,9% và tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang đạt 25,88%. Kết quả này
thấp hơn so với hai nhóm tác giả Nguyễn Thị Ước và cs (1999) và nhóm Nguyễn
Văn Lý và cs (2003). Tỷ lệ bò mang thai là 25% và có 6 bê con ra đời từ kết quả

cấy truyền phôi.
Bò sữa vẫn là đối tượng được quan tâm hàng đầu của ngành chăn nuôi
nước ta. Do đó, vấn đề nghiên cứu sản xuất bò sữa giống thương phẩm bằng cấy
phôi thụ tinh trong ống nghiệm và xác định giới tính đã được nhóm tác giả
Nguyễn Thị Ước và cs (2003) tiếp tục thực hiện. trong nghiên cứu, các tác giả sử
dụng giống bò sữa Holstein có năng suất sữa từ 6000 – 8000 lít/chu kì làm nguồn
khai thác trứng và nguồn tinh trùng từ bò đực giống Holstein hướng sữa (Gir).
Các phôi tạo ra được kiểm tra giới tính bằng kĩ thuật PCR giới tính trước cấy
truyền, các phôi cái được ch
ọn cho cấy truyền vào bò nhận. Kết quả tạo phôi đạt
tỷ lệ phát tiển đến giai đoạn phôi dâu, phôi nang là 60%. Kết quả xác định giới
tính phôi cho thấy số phôi cái chiếm tỷ lệ trung bình 54,5%. Tỷ lệ thụ thai sau
cấy truyền đạt 64% và có sáu bê cái được sinh ra. Như vậy, kết quả nghiên cứu
khẳng định khả năng tạo được bê cái do cấy phôi thụ tinh trong ống nghiệm và
xác định giới tính đầ
u tiên ở Việt Nam.
Tóm lại, công nghệ phôi nói chung gồm nhiều kỹ thuật như kỹ thuật nuôi
trưởng thành các loại tế bào giao tử, kỹ thuật thụ tinh in vitro, vi thao tác, kỹ