Phân tích ADN ty thể của người để xác định cá thể và huyết thống

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌG Tự NHIÊN
PHÂN TÍCH ADN TY THE CỦA NGƯỜI
ĐỂ XÁC ĐỊNH CÁ THỂ VÀ HUYẾT THÔNG
■
MÃ SỐ: QT 05-23
CHỦ TRÌ ĐỂ TÀI: CHU VĂN MAN
! ĐAi HOC QUỔC GIA HÀ NÓI
I 'SUNg tam fHÒNG TIN 'Hư V ẺN
: & 2 Ể Ỉ L
HÀ NỘI - 2005
Báo cáo để tài QT 05-23
Tên đề tài:
Phân tích ADN ty thể cùa nsười dể xác định cá thể và huyết thốn
MẢ SÔ: ỌT 05-23
Chủ trì đề tài: Chu văn Mẩn
Các cán bộ tham gia:
- PGS.TS. Nguyễn Văn Mùi. ĐHKHTN, ĐHQG Hà nội
- CN. Hoàng Thị Hồng Lê, Khoa Sinh ĐHKHTN. ĐHQG Hà nội
- Nguyễn Van Minh, Khoa Sinh ĐHKHTN, ĐHQG Hà nội
Báo cáo để tà i QT 05-23
Tên đề tài: Phân tích ADN ty thể của người để xác định cá thể và huyết thống.
Mă số: QT 05-23
Chủ trì để tài: Chu Văn Mẫn
Các cán bộ tham gia:
- PGS.TS. Nguyễn Văn Mùi, ĐHKHTN, ĐHQG Hà nội
- CN. Hoàng Thị Hồng Lê, Khoa Sinh ĐHKHTN. ĐHQG Hà nội
- Nguyễn Van Minh, Khoa Sinh ĐHKHTN, ĐHQG Hà nội.
Mục tiêu và nội dung nghiên cứu:
+ Xác định phương pháp tách chiết ADN ty thê từ tóc rmười, góp phần vào
việc giám định gen trong xác định quan hệ huyẽì ihốns và nhận dạng cá thế người.

+ Giải trình tự ADN ty thể từ thân tóc người.
Các kết quả đạt được:
+ Đã xác định được phương pháp tách chiết ADN ty thể từ thân và chân tóc
của người bằng việc sử dụng dung dịch Chelex 10% và dung dịch DTT. Sản phẩm
thu được có đủ độ sạch để nhân các cặp mồi ty thể L I5965 và H I6491, L I5997 và
H I6401 ở đoạn HV1.
+ Đã hoàn thiện quy trình kỹ thuật nhân ADN ty thể bằng 2 cặp mồi L I5965
và H I6491, L I5997 và H I6401 từ tóc của người Việt.
+ Giải trình tự nucleotit đoạn ADN là sản phẩm nhân mồi LI 5997 từ thân tóc
của 4 cá thể của một gia đình có 3 thế hệ cho kết quả:
- Giữa bà ngoại và mẹ không có sự khác biệt nào ớ vùng siêu biến HVI
- Giữa con và mẹ (và bà ngoại) có sự khác nhau về 1 cặp nucleotit tại vị trí 143 (theo
trình tự ADN của người con và là vị trí 16175 trên hệ gen ty thể chuẩn) ở con là cặp
A-T, con bà và mẹ là cặp G-C.
- Giữa con và bố có tới 4 cặp nu khác nhau tại các vị trí 18 (trons; hệ gen tv thể
chuẩn là vị trí 16050), của con là T và của bố là G: vị trí 91 (trong hệ gen ty thể
chuẩn là vị trí 16123) của con là G ,và của bố là C: vị trí 145 (trong hệ °en tv thể
chuẩn là vị trí 16175) của con là A và của bố là G: vị trí 292 (trong hệ ơen ty thể
chuẩn là vị trí 16324)của con là A và của bố là G.
Kết luận: dung dịch DTT dùng để tách chiết ADN từ thán tóc người, giải
quyết đươc khó khãn trong nghiên cứu xác định cá thể và huyết thống khi mẫu vật
đã bị phân huỷ, trong nghiên cứu hài cốt cổ nhãn Kết quá trẽn cho thây sự khác
biêt di truyền hệ sen ty thể giữa dòng bà-mẹ-con gái và bố - con gái. Đổng thời tại
vùng siêu biến HVI này (được đãc trưng bằns 2 cặp mồi đã sử dun2 là Lí 5965 và
H I6491. L I5997 và H I6401) thực sự là vùna có nhiều biến đối o' cấp độ phán tử,
điểu đó cho phép xác định chính xác lới mức cá thế.
-Tình hình kinh phí của đề tài:
Tons kinh phí được cấp: 20 000000 đ
Mua hoá chất, dụng cụ: 12 000000 đ
Thuê khoán chu vén môn: 5 000000 đ

Thông tin liên lạc. vãn phòng phẩm: xooooo đ
Quán lý hành chính và chi phí.khác: 2 200000 đ
Báo cáo để tài QT 05-23
Subject o f scientific research 2005
Tile: Analysis mitochondria DNA of human for individual determination and
dercent. ■’
Code: ỌT 05-23
Leader of reasearch: Chu Van Man
Reasearch of cooperation:
Dr. Nguyen Van Mui; Bs. Hoang Thi Horn: Le; Nguyen van Minh.
Object and contens of research:
+ Establish a method to isolate mitochondrial DNA from human hair, gene
determination in the dercent relationshif and human identities.
+ DNA sequencing from human hair trunk
Results of reasearch:
+ The method to isolate mitochondrial DNA from human hair been
established by using 10% Chelex solution and DTT. Obtained products were pure
anough to amplify mitochondrial primers LI 5965 and HJ6491, LI5997 and H I6401
at HVI fragment.
+ Completion of mitochondrial DNA amplifying protocol by two
mitochondrial primer sets, L I5965 and H I6491, L 15997 and H I6401 from
Vietnamese human hair trunks and root.
+ Nucleotide sequence from Iv 15997 amplifvins products from hair trunks of
4 person beloneins to a 3-2eneration family save the followina results:
* There was no difference between the supervarianble region HVI mother and
gxandmather.
% Between child and mather (and orandmother). there was a difference of one
nucletide at position 143 (according to the DMA sequence of the child and at
position 16175 according to the mitochondria DNA sequence of human). A-T in
child and G-C in mother.

* Between child and father, there was 4 different nucleotides at following positions:
nucleotide T in child and G in father at position 18 (at position 16050 according to
the mitochondria DNA sequence of human); G in child and c in father at position
91 (at position 16123 according to the mitochondria DNA sequence of human): A in
child and G in father at position 145 (at position 16175 according to the DNA
mitochondria sequence of human); A in child and G in father at position 292 (at
position 16324 according to the mitochondria DNA sequence of human).
4
In conclusion, DTT solution used to isolate DNA from human hair trunks solve the
problems in, determining identity and dercent relationshif while samples were
decomposed Results of DNA sequence show the differences in mitochondrial
genomes among grangmather - mother - daughter and father - daushter. In addition,
the supervariable regiong HVI (specialised by two primer sets, L I5965 and
H16491, L15997 and H16401) is really a regions with lots of molecular variations,
allowing the accurate determination of indentities.
Xác nhận của BCN Khoa Sinh học
Báo cáo đê tài QT 05-23
*
PHÓ CHỦ NHIÊM KHOA
POSTS. t y Ẩ t u i ĩo tú m Ẩ y Ẳ Ị a
Xác nhặn của Trường
PHÔ HlÊu ĨRUỎNG
P S S .T S '^f ể 3 J o M í n Ắ
5
Chú trì đề tài
Báo cáo đề tài QT 05-23
1- MỤC LỤC
1- Mục lục
trang
6

2- Các chữ viết tắt
6
3- Lời mờ đầu
7
4- Nội dung chính
8
4.1 - Lịch sử nghiên cứu
8
4.2- Các rối loạn chức năng ty thể
10
4.3- Giám định ADN trong khoa học hình sự và pháp y
12
4.4- Nghiên cứu ADN ty thể ở Việt Nam
12
4.5- Sinh học phân tử và các ứng dụng trong khoa học hình sự
13
5- Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
15
5.1- Nguyên liệu, hoá chất và thiết bị.
15
5.2- Phương pháp nghiên cứu
17
6- Kết quá và thảo luận
22
6.1- Tách chiết ADN
22
6.2- Sản phẩm PCR và nhuộm bạc
22
6.3- Phương pháp tách chiết ADN ớ chân tóc người sử dụng dung dịch Chelex
24

6.4- Phương pháp tách chiết ADN ở chân tóc người sử dụng dung dịch DTT
27
7- Kết luận và dể nghị
38
8- Tài liệu tham kháo chính
39
9- Phụ lục
41
6
CÁC CHỮ VIẾT TẤT
ADN
Axit deoxyribonucleic
ADNmt
Gen ty thể (Mitochondrion DNA)
Bp
Cặp bazơ nitơ ( Base pairs )
CI
Chloroform : isoamyalcohol (24:1)
DTT
Dithiothreitol
dNTPs: Các deoxyribonucleotit
EDTA:
ỉthylen Diamin Tetra Axetic
HV1
Đoạn siêu biến 1 (Hyperariable)
HV2
Đoạn siêu biến 2 (Hyperariable)
NST
Nhiễm sắc thể
PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp
RFLP
Đa hình các mảnh cắt giới hạn
(Polymerase Chain Reaction)
TE MED
N,N,N.N Tetra Methyl Ethvlen Diamin
6
2 - LỜI MỞ ĐẨU
Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật và công nghệ thông tin vào nhữns
năm cuối thế kỷ XX - đầu thế kỷ XXI. Sinh học phân tử và Côn2 nghệ gen đã có
những bước phát triển nhảy vọt, đặc biệt là việc giải mã ra bộ °en người. Bộ gen
người gồm 2 phần chính : Bộ sen nhãn (23 cặp nhiễm sác thê = 3.2 tý bp) và bộ gen
tế bào chất (genome ty thể - 16569 bp). Việc giai mã ra bộ gen ty thê đã góp phần
rất lớn trong việc chẩn đoán, điều trị các bệnh liên quan đến di truyền ty thể, và
cũng như trong khoa học hình sự và pháp y.
Trinh tự hoàn chỉnh của hệ gen ty thể người đầu tiên có kích thước 16569 bp
được công bố vào năm 1981. Cho đến nay, có hàn2 ngàn trình tự các đoạn gen ty thế
của các dân tộc khác nhau trên thế giới được giải mã và đăn° ký trona các ngân
hàng trình tự gen quốc tế : EMBL/EBI (Anh), Gcnbank (Mỹ). Hệ °en ty thẻ ]à kiểu
đơn di truyền hoàn toàn theo mẫu hệ. vì vậy nó là công cụ rất hữu hiệu để phản tích
di truyền quần thể người. Hiện nay, người ta biết đến hàng trăm bệnh di truyền ty
thể do đột biến ADN . Phân tích các đột biến ADN ty thể có thể dùng để chẩn đoán
nhanh và chính xác cũng như hướng điều trị một số bệnh.
Xác định và so sánh trinh tự ADN ty thể, nhất là các đoạn siêu biến
(hypervariable) H V 1 và HV2 của D-Loop là phương pháp có độ tin cậy cao và chính
xác, được sử dụng rộng rãi trong khoa học hình sự và pháp y trên thế giới đễ giám
định cá thể và huyết thống. Vì vậy nên việc nghiên cứu ADN ty thể có ý nghĩa thực
tiễn rất cao. Nhưng do thời gian và mục đích cho phép nén chúng tôi chỉ tiến hành
đề tài dựa trên những ứng dụns vào trong khoa học hình sự và pháp V.
Công nghệ gen ứng dụna vào khoa học hình sự trên thế giới được biết đến lẩn

đầu tiên vào nãm 1985 nhờ công trình nghiên cứu của Alex Jeffrey và các cộng sự.
Đâv là công nghệ có tính đột phá trong khoa học hình sự, giúp giải quyết mọi vụ án
tưởng chừne như bế tắc. Tuy nhiên, ở nước ta việc ạiám định ADN ty thể trong xác
định huyết thống đã đang bắt đầu. Ngoài một số các đề tài của Viên công nghệ sinh
học thì Viện khoa học hình sự - Bộ Công an dã tiến hành giám định ADN ty thể sử
dụng sự tổ hợp của 2 cặp mồi cho đoạn siêu biến HVl,để giải quyết nhừns vụ việc
mang tính hình sựnhuna chưa có tính chất phổ cáp rộns rãi.
Xuất phát từ tinh hình trẽn mà chúns tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân tích
ADN ty thế của người dể xác định cá thê và huyêt thốns nhằm góp phán vào việc
giám định gen trong xác định quan hệ huyết thốn" và nhận dang cá thể người.
Báo cáo đề tài QT 05-23 ' /s
*
7
Báo cáo để tài QT ()o-23
4- NỘI DUNG CHÍNH
4.1. Lịch sử nghiên cứu
Bộ gen người gồm 2 phần chính : Bộ gen nhân (23 cặp nhiễm sãc thể = 3.2
tỷ bp) và bộ gen tế bào chất (aenome ty thể = 16569 bp).
4.1.1. Cấn trúc ADN /V the à lìgười
Ty thê (phần lớn là các bào quan có chứa các enzym chịu trách nhiệm san xuất
nãng lượng) là các cơ quan tử sán xuất ra nãns lượng của tẽ bào. Ty thể thường có
dạng thuôn hoặc dạnơ hình trứng. Ở cá tê bào thực vật và tế bào động vật đều có
chứa ty thể. Sô' lượng ty thế trong mỗi tế bào thay đổi tùy thuộc vào loại tế bào, có
một vài ty thể trong tế bào biểu bì cho đến hàng nsàn ty thể ờ trong tế bào cơ vân.
Không giống như các bào quan khác, ty thè có 2 màng riêng biệt. Màns ngoài
tương đối xốp, có chứa protein được gọi là Porin. Tuv nhiên, màng trono rất ít khi
kháng và tập trung các lon. cực âm có phospholnpid gọi là Cardiolopin. Ngoài ra,
màng trong còn tính xoắn cao với cấc nếp gấp iĩọi là cristae, chúng làm cho diện
tích bể mặt tiếp xúc cùa tế bào tăng lên. Màng trong cũng có các enzym xúc tác cho
quá trình hô hấp tế bào, qua đó để cung cấp năng lượng cho tế bào [20].

Không gian ở trona của màng trong gọi là chất gian bào. ở trong chất gian
bào và màng trong, các chuỗi phản ứng hoa học xảy ra để cung cấp năng lượng cho
tế bào. Đường và axit béo bị phân huv thành hai đơn bị cacbon, sau đó đi vào các
chuồi phản ứng như axit citric hay chu trình Krebs. Đường bị phán huỷ trong tế bào
chất trong khi axit béo bị phân huỷ trong ty thế bởi chu trình p oxi hoá. Chu trinh
axil citric sinh ra các electron đẽ đi vào chuỗi vận chuyển điện tử.
Tiếp theo, quá trình sản xuất nàng lượna là do proton được sinh ra bởi các
electron thông qua chuỗi vận chuyển điện tử, quá trình này còn được gọi là quá trình
tổng hợp ATP - đó chính là nãng lượng sinh học đáu tiên trong hệ thống sinh vật
học. ADN có trong màns sinh chất khác biệt so với ADN ớ trons nhãn của tế bào.
ADN ty thế này tổn tại tron2 NST đơn mạch vòna khá hoàn chính. ADNmt có kích
Ihưóc 16569 bp và 2ồm 37 sen. ADNmt mã hoa cho 13 polypeptit trons chuỏi hỏ
hấp. ADN ty thê mã hoá cho protein ở phức hệ I và IV của chuỗi vận chuyến điện
tử. Như đã biết, ADNmt cũna mã hoá cho ARNr và cho cá quá trinh tống hợp ATP.
Ngoài ra, ADN ty thế có chứa cytochrom B. đay là một yếu tố quan trọng khác
khôn2 thế thiếu trong chuỗi vận chuyên điện tử mà trong đó. ADNmt chỉ mã hoá
một phẩn và ADN trong nhân sẽ mã hoá nốt phán còn lại [20], Hệ gen ty thể hoàn
chỉnh của nsười đẩu tiên được Anderson và các tác si ả khác tai Cambridse (Anh)
công bô vào năm 1981 và được chinh sửa lại vào năm 1999 (Anderson cl uì., 1981;
Andrew ct ư! 1999). Đãv là hệ sen ty thê cua đai diên nsưòi đa tráng và được coi là
trình lự chuán. Cho đến nav. đã có 186 trình tự hoàn chinh của “ínome ty thế na ười
ihuộc các ch Ún" tộc và dán tộc khác nhau được n°hiẽn cứu và đãns kv trona các
Nsũin hàne trình lự aen quốc tế EMBL (EBI)/Genbank/DDBJ(Insman. 2003).
Các cons bố này cho thấy trình tự ADN t\ thế cua các chúng tộc và dân lộc
khác nhau có nhữna khác biệt nhất định, về cấu trúc, aenome ty ihế người là phán
lử ADN mạch vòns, bao gồm 37 sen. mã hoá cho 13 chuỗi polypeptide tham gia
vào chuỗi hô hấp tế bào. 22tARN và 2i ARN và dược di truyén theo mầu hệ [6] . Sơ
đổ như hình !.
8
Báo cáo đề tài QT 05-23

KS ATPase 8/6 ■C om plex 1 I I tRHAạ
I I Cytochrome b im Complex 4 H I rRNAs
Hình 1 : Cấu trúc ADN tv thế ó' người
4.1.2. Quá trình tiến hóa AD N ty thể ở người
Do các đặc điểm như : di truyền theo mẫu hệ, mức độ đột biến cao. số lượng
bún sao lớn và không tái tổ hợp. ADN ty thế là một công cụ híĩu hiệu cho nghiến
cứu sự tiến hoá ớ người. Các biên thế ADN ty the là trung tính sẽ tránh khỏi không
bị loại bỏ trong quá trình chọn lọc tự nhiên đẽ trở thành phố biến theo xu thế di
truyền. Nghiên cứu phân loại các nhóm kiểu đon/nhóm đơn bội hay dòng pha hệ
được tiến hành sớm vào đầu thập kỷ 80. trên cơ sở sử dụng các enzvm hạn chế đế
cắt ADN ty thê người sau khi tách tinh sạch (Brown, 1980; Denaro et £// 1981:
Johnson et £//.,1983, Cann <7 aì., 1987). Kỹ thuật RFLP, trên cơ sơ có mặt hay không
có mặt một điếm cắt enzym hạn ché nào đó. ADN ty thể cua một cá thể, quán the
(dàn tộc) có thể được xếp vào một nhóm đơn boi nhái định. Ví du : Khoảng 76%
ADN ty thế của người Châu Phi được xếp vào nhóm đơn bội L. dặc trưng cho sự cỏ
mặt của các điếm cát của Hpư\ và Dclrỉ tại các vị trí 3592 và Ị 0394 tương ứng.
9
Báo cáo dể tài QT 1)5-23
Nhóm đơn bội L rát lớn này sau đó được chia ra ihành các nhóm đơn bội nhỏ hơn là
LI, L2 và L3 (Watson er aì 1996). Trên 77% nu ười Châu Á hình thành nhóm đơn
bội hay còn gọi là nhóm đơn bội M, với đặc tnrng là sự có mặt của điếm cắt của
Dclcỉ tại vị trí 10394 và Aliiỉ tại vị trí 10397. Siêu nhóm đơn bội này được chia làm 2
nhánh/nhóm đơn bội M và N. Dựa trên số liệu RFLP với sớ enzym nhiều hơn. người
ta đã phân loại ADN ty thể người thành 3 nhóm đơn bội đối với người Phi. 9 nhóm
dơn bội (H.U,K,T.U,V,W và X bao gổm háu lút ADN ty thế người Châu Âu. Bác
Phi và người da trắng ở vùng Tây Á, và 9 nhóm đơn bội khác là A.B.C.D.E.F.G.M
và N là nsười Cháu Á. Châu Đại Dương và Bắc Mv. Ngoài ra người ta cũng gộp
được một sô' nhóm đơn bội thành các cụm nhóm dơn bội, ví dụ HV. UK, TJ. WIX
Gần đâv, các nshiên cứu đọc trình tự hàns (ự nucleotit của các vùng siêu biến
HV1 và HV2 trẽn đoạn điều khiến D-Loop cũng như các gen tv thế. đặc biệt là việc

aiái mã toàn bộ hê gen ty thể của nhiều đại diện các dán tộc đã cung cấp một cách
chi tiết và chính xác hơn rất nhiều (Igman et a i, 2000; Kivisild et a l 2002; Kong et
a! 2003). Các nhóm đơn bội hiện riay được ký hiệu bằng chữ in hoa nói trên, rồi
được chia thành các nhóm nhỏ hơn với các chữ số Ai Cập (1,2,3

) sau đó lại chia
nhỏ tiếp nữa theo các chữ viết thường a,b,c
4.1.3. Nghiên cứu ADN tỵ thể người ở vùng Đỏng Á
Trong các trình tự gen hoàn chinh có đại diện của người Hoa (Truns Quốc),
n°ười Nhật Bản, người Hàn Quốc, người Hoa \à người bán xứ (Đài Loan), người
Philipin. naười Mã Lai và người Thái Lan là những nsười Châu Á có quan hệ mật
thiết với nsười Việt Nam. Đặc biệt, gần đáy nhóm nghiên cứu của Trươna á Bình
(Zhans Ya-Ping) tại Viện Động Vật học Côn Minh, thuộc viên Hàn Lâm Khoa học
Trung Quốc, đã và đang tiến hành dự án giái mã genome ty thể và nhiễm sắc thế Y
của 56 dân tộc cư trú tại Truna Quốc (Kong et aL, 2003). Đồns thời, các tác giả
Trung Quốc (Yuan eĩ ơl., 2001; Li et aì 2002: Kona et í// 2003) cũng đã phản tích
trình tự đoạn D-Loop và các gen khác trên hệ 2en tv thế đế nghiên cứu quan hệ di
truyền tiến hoá của các dãn tộc khác nhau, tro ne dó đáng chú V là có cá các dân tộc
như Miao (H’Mons). Yao (Dao). Buyi/Bouvei (Bô' Y). Lahu (La Hủ) là các dân
tộc ít người có tại Việt Nam, hay các dân tộc Zhuang (Choang, gán gũi với người
Tàv Nùng của Việt Nam). Tại Thái Lan. cũng đã có côn° trình nahiên cứu so sánh
trình tự đoạn D-Loop của ADN ty thế naưòi Thái và các sắc tộc miền núi (hill
tribes) như neưòi Lisu, người Musu, người Phuthai. na ười Lao Sons, người Chona.
nsười bán xứ Sakai (Fucharoen eỉ aỉ., 2001). Nsoài mục đích nshiẽn cứu về quan
hệ di truyền tiến hoá. các nshiên cứu hệ sen IV thể của các tộc nsười trẽn thế ai ới
déu có các định hướns ứna dụns rộns rãi tron2 chán đoán và điéu trị các bênh di
truyền ty thế. irons xác đinh cá thê và quan hệ huyêt thốna. điẽu tra tội phạm và
quan lý nhãn sự [6]
4.2. Các rỏi loạn chức năng ty thế
Như ta đã biết, hệ sen ty thể chi siái mã hoá cho một số lượng rấi ít pioiein /

enzym. Vì vậy. chức năns ty thể được thực hiện nhờ vào hàna loai các protein /
enzym do ìien nhàn quvét định \'à dược tons hop tron Lĩ ló' bào chất rói được \ận
chuycn đến ty the. Do vậy. các rối loạn IV the (huy bònh do ty thú’) có the phái sinh
do nhữne dột biến ơ ccn nhân hoặc 0' gen ly thế. Mọt so roi loan t\ ihó chí ánh
hướiiiĩ dến mộl co quan {ví dụ. bệnh thán kỉnh thi iiiãc di liu\cn Lchcr). Nhưnii cũiiíi
10
Báo cáo đê tài QT <>0-23
có những rối loạn ảnh hưởng đến rất nhiều cơ quan và thường có những đặc điểm
nổi trội (ví dụ các bệnh về thần kinh cơ). Những rối loạn ty thể có thể có ỏ bất cứ lứa
tuổi nào. Những đột biến ADN nhãn thường thây ở tuổi ấu thơ. còn những đột biến
ADN.ity thế thì xảy ra muộn hơn[6].
4.2.1. Cúc rối loạn ly th ể do ADN nhân
Những dột biến và thav đổi ADN nhân thường gây nên hàng loai những rối
loạn ớ chuỗi hô hấp và !à nauyên nhân chính của khá nhiều bệnh. Người ta đã quan
sát thấy Hội chứng Leigh (Leigh syndrone) có liên quan đến hiện tượng nhân đói
các đoạn 5 bp trong gen mã hoá tiểu phần 18kDa AQDQ complex I (Van den
Heuvel et al., 1998) và đột biến gen hóa các tiểu phán NDUFS7 complex I (Triepels
ct al 1999). Các bệnh loạn dưỡng chất trắng não và độna kinh co giật
(Leukodistrophy and mvoclonic epvlepsv) liên quan đến đột biến của các gen mã
hoá tiểu phần NDUFV1 complex I (Scheulke el al 1999). Bệnh viêm não cơ tim
(Cardioencephalomyopathy) do đột biến gen mã hoá tiếu phần NDUFS2 complex I
(Loeffen et ơ/., 2001). Còn bệnh teo thị giác và mất điều hoà (Optic astropy and
ataxia) do đột biến genmã hoá tiểu 'phần Fp của complex II (Brich-Machin et ơ i.
2000).
Những rối loạn ty thể có thế làm ảnh hướng đến sự hợp nhất của các enzym
chuỗi hô hấp (chủ yếu là thiếu hụt các enzym trong Complex IV). Hội chứng Leigh
thường xảy ra do đột biến các tiểu phần SURF-1 (Tirati et £// 1998: Zhu et a!
1998) và COXIO (Vainol ei ui., 2000).
Cũng có những rối loạn có liên quan đến mất đoạn ADN ty thể thứ phái. Mất
đoạn ở gen Aní 1 (Kaukonen el a l 2000) hoãc Twinkle (Spelbrink et uì 2001) đều

có thể gây bệnh liệt mất cơ ngoài trội do nhiễm sắc thế thường (Autosomal
dominant external ophthalmoplegia). Mất đoạn ó' sen POLG (Van Goethem et aỉ.,
2001) có thê sây các bệnh liệt mắt cơ ngoái lặn do nhiễm sắc thể thườne
(Autosomal recessive external ophthalmoplegia) hoặc liệt mát cơ nsoài trội do
nhiễm sắc thê thường. Mất đoạn ở gen Thymidine phosphorvlase (Nishion ct a!
1999) gây bệnh não tuý thần kinh dạ dày ruột (Mitochondria! neuroaastrointeriinal
encephalomyophathy).
4.2.2. Các rối loụn (lo ADN ty thê
Cho đến nay, nsười ta đã biết đến trên 150 bệnh tật di truyền khác nhau theo
mẫu hẻ do tv thể quyết đinh. Các bệnh do rối loạn ADN ty thế thường được biếu
hiện rất đa dạng. Chúns có thế liên quan đén rối loạn quá trình mã hoá protein hoãc
đơn thuần chi là nhũna đột biến thav đối các nucleotit (Servidei. 2002)
Các bệnh như liệt mất tãna tiến kinh niên (Chronic progressive external
ophthalmoplegia. CPEO). hội chứns Kearns-Saue (Kearns-Savre syndrome. KSS).
đái dườn2 và điếc (Diabetes and deafness) đểu do mãt đoạn hoặc sắp xếp lại irons
son. Các đột biến GI 1777A.T]4484C. G 3460A cũng làm biến dổi protein, dẫn đen
liệt thần kinh thị giác di truyền Leber (Leber hereditary opticneuropalhy. LHON).
Đột biến trons Hen Cytb «áy bệnh khôna dune nạp vận độns \à mvoslobin niệu
(Exercise intolerance and myoslobulinuria).
Nhữns đột biến thay đổi các nueleotit trẽn ARNĩ có thế £ây khá nhiều bệnh:
Các thay đổi A3243G. T3271C.A3251G sây viêm não tuv nhiễm lactic acid với các
tình net aiốne dột quy (Mitochondrial encephalomyppathy with ladies acidosis and
stroke-like episodes. MELASi: A8344G.T8356C ãV■ hộnh llìân kinh co uiát cơ
(Myoclonic epilepsy with racíied-rcd fibers, Ml-RRF): A3243G. T4274C Líáy 11 cl
Báo cáo dế tài QT 1)5-23
mál cơ ngoài tăns tiến kinh niên (Chronic proaessive external ophthalmoplegia.
CPEO): T 14709, A12320G gãy bệnh liệt cơ (Myophathy)I A3243G.A4269G gây
bệnh liệt cơ tim (Cardiomyopathy); A3243G.C12238A 2âỵ bệnh đái CÌƯÒT12 và điếc
(Diabetes and deafness): G1606A. T10010C gảy bệnh liệt não
(Encephalomyopalhv): A7445G gây điếc do thần kinh cảm nhận không hội chứng

(Nonsyndromic sensorineural deafness); A1555G sây điếc không hội chứng do
aminoglycoside (Amino-alycoside-induced nons\ ndromíc deafness)[6].
4.3. Giám định ADN tv thế trong khoa học hình sự và pháp V
Vùng điều khiển (D-Loop) có 2 đoạn siêu biến HVl và HV2 với tốc độ tiên
hoá nhanh, do đó thỏno tin vể các trình tự này có ý nshla quan trọna cho giám định
cá thế và giám định huyết thốna trong khoa học hình sự (Forensic Science) và pháp
y (Legal Medicine). Hiện nav. tại Mỹ. Tây Au. Nhật Bán và các quốc gia khác, việc
tìm kiếm người mất tích, các diều tra hình sự đều dựa trên các giám định gen.
trong đó bao gồm phân tích trình tự các đoạn ADN nhân và ADN ty thể. Đặc biệt,
trong những trườns hợp mẫu sinh phẩm còn sót lại sau thời gian đã quá lâu (hàng
chục hay hàng trãm năm) ADN nhân' do mạch thắng bị phân huý rất nhiều nên việc
phán tích là rất khó khăn. Trong khi đó, ADN ty thể mạch vòng, có kích thước tương
đối nhỏ nên tồn tại láu bền theo thời gian trong các mỏ xương, răng và tóc. Một số
công trinh nổi tiếng về ứng dụng ADN ty thể trong giám định cá thể như giám định
hài cốt của các thành viên trong gia đinh Nga hoàng (Gill eí uìì., 1994; Ivannov el
ứ/ 1996), di hài \ua Louis XVII của Pháp (Jehaos el ill.,2001) Chươna trình tìm
kiếm lính Mỹ mất tích trong chiến tranh tai Việt Nam và Triều Tiên chủ yếu cũng
dựa trên giám định ADN trong đó có ADN ty thể.
4.4. Nghiên cứu ADN ty thê ỏ Việt Nam
Cho đến nay. các nshiên cứu irons nước YC đặc điếm hệ sen của các dân tộc
(tộc người) Việt Nam bao gồm cấu trúc hệ gen ty thế còn rất ít ói và các thône tin có
dược còn rất hạn chế.
Trong khi đó. ờ nước nsoài từ nhữns nãm 1992 đã có cỏn° bỏ của các nhà
khoa học Mỹ (Ballinger er ưỉ 1992) dùng phương pháp PCR- RFLP và lai phân tứ
để nghiên cứu ADN ty thế của naười di cư thuộc chủng tộc Mongoloid cổ đại, trons
đó có đừns các mẫu ADN người Việt' (không rõ nguồn gốc).
Tiếp theo đó. sau này có thêm côns trình nrơne lự về sự đa hình ADN ty thế
nmrời Việt Nam. với số mẫu bao 2ồm 50 nsười Việt (Kinh) thu thập tại Hà Nội của
nhóm các nhà khoa học Pháp kết hợp với Vũ Triệu An. Trường Đại học Y, Hà Nội.
Bans kỹ thuật PCR-RFLP trẽn ADN ty thế và HLA, các tác gia này đã đưa ra két

luận ùns hộ 2Ìa thuyết cho rằns neười Việt (Kinh* có nsuổn sóc kép lừneười Truns
Quóc và các quán thế Thái-Indonesia (Invanova ci ui 1999) [8J.
Tuv nhién. phưưns pháp PCR-RFLP còn co nhiêu han ché. nén ké! luận này
đòi hòi phai có nhữns nehièn cứu kiếm chứng them. Việc giái mã hê sen ty thế diãc
chăn sẽ có dỏne 2Óp quvết định cho câu irá lòi (.liính xác \ ẽ quan hệ di truyền liến
hoá cua II2ười Việt Nam.
Bẽn canh mội số nehiẻn cứu cua các lác 2 Íá Trung Quốc và Thái Lan vé hệ
CL'I1 tv thế (chú \cu là đoan D-Loop) cùa mội số dãn lõc ít neười cư trú tại các nước
do cũns như ơ \ 1 cI Nam hệ ucn nói chung va hệ gcn ly ihè nói riC112 cua các tộc
n^nrời Viêt Nam . cũn" dã có dự án cấp nhà nưoc cua Viện Cone ns:hệ Sinh học
\ ’iột Nam ntihiẽn cứu \c hộ een ty ihõ cua người Viẽi Nam.
Báo cáo đê tài QT 05-23
4.5. Sinh học phán tử và các ứng dụng trong khoa học hình sự
4.5.1. Lịch sứ phát triển cửa khoa học hình sự
Sinh học hình sự trên thế giới có lịch sử phát triển khoáns hơn 50 năm. Xuất
phát từ nhu cầu thực tiễn, hơn 50 năm trước đây. khoa học hình sự thế giới đã ứng
dụng các thành tựu của sinh học, y học nói chuns và huyết học nói riêns vào công
tác điều tra xác dịnh tội phạm. Những nghiên cứu này chủ vếu dựa vào sự phàn biệt
nhóm máu ABO, hệ MN. các nhóm protein huyết thanh Nhưng kết quá của
những nghiên cứu trên chi có tác đụng loại trù mà không có kha nãna xác định
chính xác đến từng cá thế neười. Thực tế đã cho thấy độ tin cậy cùa phương pháp
huyết học là khống cao [2],
Vào những năm cuối thể kv XX, cùrm VỚI sự phát triến cua các ngành cõng
nghệ khác, thì công nghệ sinh học cũng phái triển mạnh. Một phát minh quan trọng
đó !à phát minh ra chuỗi phán ứna polymeraz (I’CR) do Kary Mullis tiến hành tại
nước Anh vào năm 1985. Và phương pháp này nhanh chóng được sử dụng rộng rãi
trong nhiềũ lĩnh vực nghiên cứu y-sinh học khác nhau do khá năng nhân bội và độ
nhạy của nó rất cao.
Công nghệ gen ứng dụng vào khoa học hình sự trên thế giới được biết đến lần
đầu tiên vào năm 1985 tại nước Anh hhờ công trình nghiên cứu của Alex Jeffreys và

các cộng sự. Khi nghiên cứu các đoạn ADN mã hoá protein trong máu người,
Jeffreys đã phái hiện ra trình tự đoạn ADN được lặp lại một số lẩn. các đoạn lặp nàv
được gọi là tiểu vệ tinh (minisatellites). Các tiểu vệ tinh này được phát hiện thấy
trong mọi tẻ và ở những vị trí khác nhau trnns hệ sen nsười. Ông CŨI1S phát hiện ra
số lần lặp lại của các doạn ADN này ở mồi cá thê ỉà khác nhau. Bans cách ứna dụne
kỹ thuật xác định chiều dài, trinh tự của nhữn° đoạn ADN lặp lại này, Jeffreys đã
tạo ra phương pháp định dạns ADN nsưòi (DNA linaer printing) [II].
Từ đây giám định tư pháp vể gen ra đời. gọi là ADN finger printing (ván tay
di truyền) hay còn có tên khác là ADN profile {tổ hơp các kiểu gen trons giám định
gen của một cá thể cần phân tích). Vùng lặp lại được biết đẽn đáu tiên nàv gọi là
nhĩms đoạn lặp có tần số truns bình. Kỹ thuật mà Jeffreys thực hiện aọi là phán tích
lính đa hình về chiều dài cứa các đoan ADN dược tạo bới các enzvin giới hạn
(RFLP) [11]. Phươna pháp này được sử dụns lần đầu tién đẽ phán tích ADN nhữns
người nhập cư vào Anh, sau đó một thời gian ngắn được dùng đế xác định thu phạm
một vụ siết nsưòi. Nsàv nay. phươns pháp định dans ADN Ứ02 dụna trons khoa
học hình sự đã trở nên phố biên trên thê giới và thực sự mans lại hiệu quá rất cao
trong xác định tội phạm, xác định huyết thống. Đã có hàng trăm phòns thí nahiệm
cua Mv tiến hành phân tích ADN, phần lớn các nước ỏ' Cháu Âu và Cháu Á có
chươne trình ứns dụns phưưns pháp định dans ADN vào trona khoa hoc hình sự.
4.5.2. Cứt phifo'níi pháp thường ilìuìV trong smlì hoc hình sự
/) Pluicnạ pháp phân Hell ADN
Phương pháp phân tích ADN được dùns tie xác định huyet ihõnu cha - con.
mẹ - con hay cá thể chính xác.
2) C ơ sỡ khoa học của việc ỉiiứm (lịnh XCI1 iron i> Aiìc ílinli huyết thniìx
Năm 1956, Jot* Hintjio và Albert Levan đã xác định chính xác răna o nsười
trona mỏi cá thế ớ Irons nhãn tẽ bào có chứa 46 nhicm sãc tho xếp thành 23 cặp
nhiễm sãc thế Iil'ona done (lức 2ÌỐH2 nhau từn<j dõi mội). Tron2 đó cặp thứ 23 là
nhiễm sác thê, eiói lính, các cặp còn lại co chức năng xác định các đặc lính khác
nhau cua cơ lliẽ. Bộ nliiẻm NŨC thé dược bao lỏn. du> trì lừ the hộ nav sail” the he
khác. Ne oa I trừ tế bào trứiií’ \'à tinh trùne chi có 23 nliiẻm sác thè (tc hào đơn bôi)

Báo cáo đề tài QT 05-23
còn tấl cả các tê bào khác đéu có sơ lượng nhiẻm sác thế là 46 (tế bào lưỡng bội).
Thê hệ con cái bao giò cũng được thừa hưởna các đặc tính di truyền từ thê hệ bỏ mẹ
với xác suất ngang nhau, nshĩa là 23 nhiễin sác thế từ bố thôn° qua tinh irùns. 23
nhiêm săc thế từ mẹ thông qua trứng. Sự kết họp iỉiữa trứng và linh irùns đã báo tổn
được bộ nhiễm'sắc thế từ mẹ thỏna qua trứng. Sự kết hợp giữa trứns và tinh trùns đã
bảo tồn được bộ nhiễm sắc thể là 46 đê tạo nên một cơ thẻ hoàn chính. Từ nauyên lv
này mà trong giám định gen. người ta đã ứns dung đế xác định quan hệ cha - con.
mẹ - con.
Khi nghiên cứu về cấu trúc ADN của sinh vật nhân chuấn. người ta thấy rãne
ADN bao gổm các trình tự mã hoá (exon) và các trình tự khôns mã hoá(intron). Các
trình tự mã hoá ở sinh vật nhãn chuán chìm trong một khối ADN lớn mà hiện nay
còn chưa rõ tác dụng. Tuỳ mức độ hiện diện cua chúng trort
2 nhãn, các trình tự
ADN được chia làm 3 loại [1] :
- Các trình tự lặp lại nhiều lần chiếm 10 - 15% hệ sen động vật có vú. Đó là
những trinh tự ADN ngắn (10 - 200 Kb) khôns mã hoá.
- Các trình tự có số lần lặp lại trung bình chiếm khoảng 25 - 40% hệ gen
người, chúng có kích thước lớn hơn (100 - 1000 Kb) và đa dạng hơn các trình tự lặp
lại nhiều lần. Các trình tự này không tập trung mà phân tán trên toàn bộ bộ gen.
- Các trình tự duy nhất là các gen mã hoá cho các protein có trình tự đặc
trưng cho từng gen (Hồ Huỳnh Thuỳ Dươna, 199S).
Các intron là các trình tự không mã hoá bao sồm các đoạn lặp lại nhiều lần
(STR) và các đoạn lặp lại trung bình (VNTR). bởi vậy chúng có tính đa hình cao nên
rất có giá trị đê phân biệt cá thể. Đây chính là điếm mấu chốt đế ứns dụno trons
siám định gen hình sự.
3) Phương pháp RFLP Các tiếu vệ tinh (minisarelìiỉe.s)
Nãm 1985. tại nước Anh, Alec Jefreys và các cộns sự khi nehién cứu các
đoạn ADN mã hoá protein trons máu naười mvoglobulín đã phát hiện ra
minisatellites (tiêu vệ tinh )

• Đặc điểm của các tiểu vệ tinh [7]
Là những đoạn trình tư ADN lặp lại mói số lán có Irons mọi tè bào và ớ
nhữns vị trí khác nhau trong hệ sen n°ưò'i.
Mỗi đoạn lặp có chiểu dài từ 9 - 24bp. tone côns chiểu dài năm trong khoáng
từ 0.5 Kb - 30 Kb [8].
Các trình tư nàv có số lẩn lặp lai khác nhau o các alen khác nhau của cùnc
một locus.
• Phương pháp RFLP
Bans cách ứna dụna kỹ ihuật xác định Hình lự chiéu dài cùa nhũng đoạn
ADN lặp lại này. Jefrevs đã tạo ra phuons pháp RFLP. Phươna pháp này xác đinh
tính đa hình về chiều dài các đoạn ADN được lao ra bới các enzvin giỏi hạn. Các
enzvm eiới hạn sẽ cát \ùns bao quanh đoạn lặp lại với tân sò irung binh này. Các
đoạn này được phân siui bãns điện di trẽn gel agaroza. Các cá thê khác nhau sẽ cho
các băn‘_z \'ới kích thước dài neãn khác nhau. Nhirns với các bãns hon kéin nhau vài
nucleolit sẽ rãt khó phân biệt [9]. Đế khăc phu vân dẽ này. 112ười ta dùna phương
pháp phân lích Southern với các mau dò da locus đe tìm ra các băn" nòi bậl đưực
phàn biệt một cách dẻ dàns.
Mặc dù có ưu diẽm là có độ chính xác cao nhunc phưưna pháp phán lích
Southern \o'i các mẫu dò đa locus dô lìm ra cát bán£ nói bát duơc phân hiệi một
cách dẻ dàng.
14
Báo cáo đẽ tài QT OÕ-23
Mặc dù có ưu điểm là có độ chính xác cao nhưng phương pháp này van có
những hạn chế [9]:
Phương pháp này đòi hỏi lượng mẫu ADN' lớn ( khoáng 100 nanooram) và
ADN phái còn nguyên vẹn. khóna bị phân huỷ.
Các bước tiên hành phức tạp. dòi hỏi kỹ thuật viên có trinh độ cao.
Không tự độns hoá được.
Với những trườns hợp ADN bị tách mạch, enzym 2ÍỚÍ hạn sẽ khõng cắt được
4) Định dạng các đoạn ADN lặp lợi ngắn (STR typing)

• Các đoạn ADN lặp lại đoạn ngắn (STR)
Qua “chương trinh hệ gen người” các nhà khoa học đã phát hiện ra các đoan
ADN lặp lại đoạn nsắn có tần số cao (microsatellites hav short tandem repeat). Đặc
điếm của STR [8] :
Là các trình tự nucleotide ngắn được lặp lại nhiều lần liên tiếp nhau và có
số lần lặp lại khác nhau ớ các cá thế khác nhau.
Một đơn vị lặp lại có chiều dài từ 2 - 5 nucleotide. Vớt các dạng lặp lại 2
nucleotide:
+ Dạng CA / GT chiếm khoảng 0,5% hệ gen.
+ Dạng CT / GA chiếm khoáng 0,2% hệ gen.
Tuy nhiên, người ta sử dụng dang lặp lại 4 nucleotide trong giám dịnh gen do
nó có độ phân giải cao và hệ số trùng' lặp tương đối thấp.
Tổng cộns chiều dài < 100 bp.
• Phưong pháp xác định trinh tự đoạn ngắn STR ( STR typing )
Phương pháp này xác định tính đa hình của các đoạn STR nhò' phản ứng
PCR. Uu điểm nổi bát của phương pháp PCR là khá năng nhãn nhanh một đoan
ADN lên hàng triệu lần sau một thời gian n°ắn [61. Phương pháp này có ưu điểm :
Phân tích các đoạn ADN ngắn nên có tính báo tồn cao.
- Đòi hỏi một lượng mẫu ADN rất nhỏ. phương pháp có thẻ thành công chi
với một sợi tóc hoặc 40 tinh trùng [7],
- Thời gian phân tích naắn.
- Có thể thế tự động hoá đuục.
5. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cử u
5.1. Nguvên liệu, hoá chất và thiết bị
5././. Đôi H(Ợnf> níịhiéìì cứu
* Tóc của thế hê bà, thế hệ bố. me và con. (lây cá phần chăn tóc và phán thán
tóc)
Tóc [9J : Hình dạns tóc là một đặc điếm hình thai cua cơ thê níiưòi được di truyén.
ne ười ta coi đó là mội [rone nhữne đặc điếm .quan trọne nhất trong nshién cứu
Chuns lộc.

Tóc dược chia làm hai phán : thân tóc và chân lóc.
- Thân tóc là phần nhỏ ra khỏi bể mặt da. đươc câu tao từ 3 lớp như sau :
+ Lóp tuý : ó' irons cùna. bao sồm các tế bào đã hoá sừne. nhưns còn chứa di tích
nhãn tê bào. khỏns chứa sãc tó’.
+ Lóp bao : là lớp vó neoài. 2ổm c;’tc tẽ hào vuv sùìii: dã mũi di lích nhãn và khòne
chứa săc tố.
+ Lớp vo năm "iữa 2 lóp tuy và bao. Đây là lớp chu \ẽu lao nen lóc. sỏm các lé hào
váy Mine, còn chứa di tích và co sãc tố. Hai lớp vỏ và luv ihườníĩ chứa các hot khí.
nhất là trong lóc bạc.
15
Báo cáo đê tài QT 1)5-23
- Chân tóc là phán nằm khuất trong da. ở phía cuối, rể tóc dầy lên để hình thành
hành tông hay tầng sinh lông. Tại đáv có các mạch máu đi tới để nuôi tóc. Rẻ và
hành !ông được chứa trons bao lỏns. Trên thành mỗi bao lóne có lừ 2-5 lỏ mơ của
các tuyến nhờn. Mày tóc được quv định bới số Iươn2 và trạns thái cua sắc tỏ
melanin trong lớp vỏ, sắc tớ ở trạng'thái đa hạt sẽ làm cho lóc đen. sác tò ó trạng
thái phán tán sẽ làm cho tóc có màu đỏ hoe hay màu nâu.
5.1.2, Hoủ chất
- Hoá chất tách chiết A D \
Tên hoá chái H ãn” san xuất
Chelex-100 10% Sigma
DTT Invitroaen
PCR buffer 10X Invitrogen
ProteinaseK Sigma
Phenol Sisma
Isopropanol Pháp
Chloroform Sigma
Isoaminalcohol Sigma
Ethanol Việt Nam
Trung tám SH1T và CNTB-trườna ĐHKHTN.

- Hoá chất dùng cho phản ứng PCR.
Tên hoá chất ■ Hãns sản xuất
Đệm PCR 10X Invitrogen
dNTPs Sigma
Mồi Invitrogen
Taq-polymeraza Trung tám SHPT và CNTB trườns ĐHKHTN.
Kv hiệu và trình tự mói tv thể đả sử dụng như sau :
Tt Tên mồi Trình tự mồi
i L I5965 5’- CCA AGG ACA ATA CAG AGA AAA - 3’
2 H 16491 5’- GTA GGA ACC AAA TAT CGG ATA 3’
LI 5997
5'- CAC CAT TAG CAC CCA A AG CT
4 H 16 40 1
.V- TO A TTT CAC GGA GGA TC-G TG 3
5.1 3. Thiel hi
Các thiết bị thuộc Ti una lâm SHPT và CNTB irirờn” ĐHKHTN:
- Máy ổn nhiệt ( Block heater Anh ).
- Máy li lâm Eppenđorl centrifuge 5417R i Eppcnclorf - Đức)
- Máv li tâm Eppendoi f cenlníiiiỉL- >804 (f ppcndor! - Đức )
- Mú\' tit) pH (Beckman Mỹ)
- Máy vortex - Mini Sharker (Kika Works - Malaysia)
16
Báo cáo để tài QT 1)0-23
- Bộ điện di đứng nhò. mini - sub cellGT (Bio - rad - Italy).
- Máy PCR Thermalcycler (Singapore)
- Và một số thiết bị khác.
Các thiết bị được sử dụng thuộc Phòng thí nghiệm Irọng điếm Côn° nghệ een. Viện
Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Cõns ngliệ Việt Nam, bao gồm:
Tủ lạnh -20°c, -84(lc (Sanyo; Nhật Bản); Pipetman các loại (Gilson. Pháp):
Cán phán tích (Mettler Toledo, Thụy Sỹ); Bể ổn nhiệt (Tempette Junior Techne):

Máv Vortex (OSI Rotolab): Máy làm khô chân không (Speed Vac Sc ] 10A )
(Savant); Máy li tâm (Sorvall): Máy li tám Eppendorf 5415C (Eppendorf. CHLB
Đức); Máy chạy điện di PowerPac 300 (Bio-Rad. Mv): Máy chụp ánh Bio-Rad (Bio-
Rad, Mỹ); Máy GeneAmp" PCR System 9700 (ABL Mỹ): Máy PCR PTC-100™
(MJ - Research. Mỹ); Máy xác định trình tự ARI PRISM" 3100 Genetic Analvzer
(ABI, Mỹ)
5.2. Phương pháp nghiên cứu
5.2.1. Phương pháp tách chiết ADN sử dụng Cheìex
Chelex là một loại nhựa tạo phức có ái lực cao đối với các ion kim loại đa hoá
trị. Nó là chất trùng hợp của Styren divinylbezen, có chứa những ion iminodiacetat
và hoạt động như nhóm tạo phức. Khi có mặt của Chelex trong quá trình đun nóns
sẽ tránh được sự biến tính cùa ADN bởi các ion kim loại tạo phức có thể xúc tác
trong quá trình làm gãy ADN ờ nhiệt độ cao tron^ những dung dịch có cường độ ion
thấp. Chelex còn liên kết với những tạp chất nsăn cản quá trình nhân bội
ADN(PCR) [4],
Tách chiết ADN từ chân tóc 1 16!
1. Cắt chân tóc dài khoảng 0,5 cm cho vào ống Eppendorf loại 1.5 ml. Cho thêm 1
ml nước cất loại ion. lắc đều.
2. Li tâm 10 phứt, tốc độ 12000 vòng/phút.
3. Loại bỏ nước, giữ lại chân tóc. Lặp lại bước nàv 3 lần.
4. Cho thêm vào ốn° Eppendorf 100 Ltl Chcle.x \0 c/(.
5. u ớ nhiệt độ .%°c qua đêm.
6. Lác nhẹ, ủ ỏ' 100°c trong 8 phút.
7. Ly râm 12000 vòna/phút trong 3 phút.
Lảy dịch bên trẽn làm phản ứng PCR.
5.2.2. Phương pháp tách chiết ADN sử (lụng DT1
Do thành phần của thán tóc chu yếu là melanin, mà tron2 đó có rất nhiều cầu
nối disulfide, nên DTT là chất hoá hoc có kha năng căt cáu disulfide tronẹ thán tóc.
Đồng thời nó làm tan hoàn toàn thân lóc thành một duns dịch mà tron° dó có chứa
rất nhiéu ADN ly thế.

- Tách chiếl ADN lliân lóc [ 16]
ỉ . Cãt tóc thành các đoạn nho cho vào ốn° eppendorí
2. Rửa bằna 0.5 ml cồn luvệt đối iron2 20 phút.
3. Để khô tự nhiên.
4. Cho thêm vào:
10 Lil PCR buffer
5 Lil l^T T 1 M
15 Lil ProlciiiasL'K 5nm/ml __________
_
_________
70 ul 1111'Ó'C loại ion. j t A: QUÒC GIA HÀ Noi I
; ĨAV- IhQ str;. TI^ ;Hi; v Ệrj Ị
17 L. . Ề . ĩ / 5 C I
Báo cáo đề tài QT 05-23
5. u ớ nhiệt dộ 56°c qua đêm.
6. Lác nhẹ, ủ ớ 100°c trong 15 phút.
7. Ly tâm 12000 vòns/phút trong 3 phút. Lấy dịch bẽn trên làm phan ứne
PCR.
5.2.3. Phương pháp định hrợiii’ ADN bâng quan í’ phó ké /4!
Nguyên tắc : Dựa vào sự hấp thụ ánh sánu tứ ngoai ở bước sóng 260nm cua
các bazơ purin và pyrimidin. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu
cho phép xác định nồng dộ ADN trong mẫu dựa vào tương quan sau:
Một đơn vị OD2fi,imn tương ứng'với một nồn« độ là :
50ịig cho một duns dịch ADN sợi đôi
40p.g cho một dung dịch ADN sợi đơn
Đế kiểm tra độ sạch của dung dịch ta do thêm giá trị OD ớ 280 nin. Tại bước
sóng nàv các protein có mức hấp thụ cao nhất. Một dung dịch axit nucleic được xem
là sạch (không lẫn nhiều protein) khi có tỉ số OD;w,mn/OD2K{)nm khoáng 1,8 - 2.0.
5.2.4. Phương pháp rinh sạch sán phẩm PCR
Phương pháp tinh sạch sán phẩm PCR dược tiến hành theo Kit của hãng

Promega bao gồm các bước như sau:
Bưđc 1: Bổ sung một thể tích tương đương duns dịch liên kết màng (membrane
Binding Solution) vào sản phẩm PCR, đảo nhẹ.
Bước 2: Đặt cột nhỏ (SV Minicolumn) vào trons õng thu mẫu (Collection Tube).
Chuyển hỗn hợp sán phấm PCR và dung dịch liên kết màng vào trons cột nhỏ và đẽ
1 phút ở nhiệt độ phòng.
Bước 3: Ly tâm 12000 v/p, 2 phút ó' 4°c . Đổ dịch trong. ốna ihu mẫu.
Buóc 4: Bổ sung 700 Ị0.1 dung dịch ríra màng (Membrane Washino Solution) vào cột
nhỏ. Ly tâm 12000 v/p. 2 phút, 4°c. Đổ dịch trons ống thu mẫu.
Bước 5: Rửa lại với 500 ni dung dịch rửa màna và ly tâm 12000 v/p, 5 phút ở 4°c.
Bước 6: Chuyển cột nhỏ sang Eppendorf 1.5 ml mới và bố suns 50 |il nước. Đế o
nhiệt độ phòns 1 phút. Sau đó ly lâm 12000 v/p irons 1 phút.
Bước 7: Bỏ cột nhỏ và thu lại dịch ó Eppendorf có chứa ADN dạna hoà tan. A D \
tinh sạch được siữ 0' 4°c hoặc -20°c sau khi được điện di kiểm tra trẽn sel aaarose
0.8%.
.'.2.5. Phán ứnỊỊ PCR
- Nguyên ly PCR [20]
PCR là phươns pháp in vitro đê tống hợp một đoạn ADN nhờ 2 đoạn mói
olisonucleotide (primer) tương hợp với 2 đáu 3' O' ca 2 sợi đối cua đoan ADN đích
(target sequence) \ ới sự tham
2Ìa của ADN poI\mearza. Đoan mỏi sẽ liên két ilieo
neuyên tác bổ SUI1S \'ới đoan ADN đích ớ đáu 3' và đoạn bát đầu luna hợp được xác
đinh tại \’Ị II í 5’ cua mồi.
Một chu kỳ PCR dược thực hiện qua 3 2Íai đoan :
1. Giai đoạn biến tính ADN khuôn : 2 sợi của chuỗi xoăn kép ADN được
tách ra khi nhiệt độ lên cao trên 90°c.
2. Giai đoan iỉán mỏi : Khi nhiệt độ phan lìng giam \unna (khoan” từ 45
- 65°C). mổi licn kết với đoạn đặc thù theo nguyên tãc bỏ sung.
3. Giai đoạnkéo dài mỏi nhừ ADN pol>meia/a (illLIÕ11 LI ơ 70c - 72‘C).
IS

Báo cáo để tài QT 05-23
Sản phẩm PCR được tính theo hàm số mũ vì mỗi đoạn do mồi kéo dài lại làm
khuôn cho chu kỳ sau. Như vậy, sau mỗi chu kỳ sô bản sao của ADN gấp 2 lần và
sau n chu kỳ sán phẩm thu được là 2"
- Mô tả kỹ thuật PCR
Thành phần phản ứng PCR :
- ADN khuôn
- ADN oligonucleotit (primer)
- dNTPs đã hoạt hoá
- ADN polymeraza
- Đệm PCR
Để phản ứng sao chép ADN khởi động, ADN phải ớ trạng thái liên kết biên
tính nghĩa là 2 chuỗi ADN tách rời nhau sau khi tất cả các liên kết hydro bị phá vỡ.
Trong kỹ thuật PCR, hiện tượng biếri tính này được thực hiện ở nhiệt độ trên 94°c.
Sau khi nhiệt độ giảm xuống, ADN mồi sẽ lai ghép với ADN sợi đơn. Phăn tứ lai
ghép ADN mồi - ADN mẫu là đúng cơ chất của ADN-polyineraza. Tổng hợp ADN
sẽ tiến hành ở nhiệt độ tối ưu và enzym có vai trò kéo dài ADN mồi bằng cách nôi
các nucleotide hoạt hoá với nhau theo một trình tư bổ sung với chuỗi ADN mẫu.
Step 1: denatiưatií Giai doan 1: Biến tính ớ
94" c trong 1 phút
1 miaul 94 °c
Step 2: annealing Giai đoan 2: Gắn mồi ứ
54° c trong 45 giây
45
seconds 54
°c
loiward iind rout
pr mer>"!
Step 3:
extension

Giai doan 3: Kéo dài
chuỏi ỏ 72" c trong 2
2 minutes 72 °c p^ul
or V JNTP's
1 \iyh Wi.'fifc S'*.
Hình 2: Các giai đoạn cua pliíin ứng PCR
Việc khuếch đại ADN đòi hỏi việc sao chcp được lặp lại nhiêu lãn VI thế PCR
được thực hiện qua 30 - 40 chu kỳ và mỗi chu kỳ gổm có 3 giai đoan biến tính, gân
19
Báo cáo đề tài QT OÕ-23
mổi và tổng hợp phái có 2 đoạn mồi mới khuếch đại được một YÙne đặc hiệu của
ADN. Đặc điểm của 2 đoạn mồi nàv là phái dài khoảng 15 - 30 bp. chúng có trình
tự giống 2 đầu đoạn ADN đích cần nhản lên. mỏi ADN mồi lai shép được với mồi
một chuỗi ADN đích và XII hướns tổng hợp của mội chuỗi ADN đích và xu hưứne
tốna hợp ADN lừ 2 mồi này ỉà nsược chiều nhau. ADN mồi thứ nhất chi huy sự tống
hợp của một chuồi ADN và chuỗi này sẽ lai ghép tiếp với ADN mồi thứ 2 ỏ' chu kỳ
tiếp theo.Sau chu kỳ thứ nhất, sàn phẩm ADN là loại dài được tổng hợp quá xa trình
tự bố suns của ADN mồi kia. Sau chu kỳ thứ hai. xuất hiện các sán phấin ADN ngắn
lai 2hép với ADN dài. Sau chu kỳ thứ 3, có các sán phẩm ADN kép ngắn.
Trong những chu kỳ tiếp theo, sản phẩm này nhân lẽn theo hàm số mũ đến
khi một trong các thành phần hỏn hợp của duns dịch phán ứns bị giới hạn hoặc
polymeraza giảm hoạt tính. Trons thực tế sự nhán lên của một đoạn ADN chi trung
binh là 10K lan.
5.2.6. Kỹ thuật điện di
- Nguyên lý
Mọi phân tử sinh học có tích điện đều có khả năng di chuyến trong điện
trường. Tuỳ thuộc vào mỗi loại phân tử có tích điện khác nhau mà chúng có hướng
di chuyển về cực âm hay dương. Dựa vào tính chất này mà người ta dùng phương
pháp điện di để phán tách các đoạn ADN có kích Ihước, trọng lượng khác nhau.
Dưới tác dụns của dòng điện mội chiều, các đoạn ADN sẽ di chuvển từ cực

ám sans cực dương. Đoạn nào có trọng lượng phân tử thấp hơn, kích thước nhỏ hơn
sẽ di chuyển nhanh hơn và nsược lại.
Tính linh độn° của phân tử trong bán gel dưới tác dụng của một điện trườns
được tính theo công thức :
L02 |a = Los 14, - K,c
Trons đó :
Loa p.,,: tính linh độn2 của phân tử trong môi trườna lỏna
c : Nổns độ sel.
K, : Hầns số làm châm do cấu trúc ael dổns thời cũng phụ thuộc vào khối
lượna phân tử của phán tử axit nucleic.
Qua đó ta thấy đươc tính linh động của phán tứ phu thuộc vào hai chi tiêu
khối lưọna phân tứ và nổns độ các chất cấu thành sel. Hai loại 2el được sử dụns
trona nshiẽn cún axit nucleic là polyacrylamide và aearoza. Việc lựa chọn loại sel
cũna như như nổns độ các chất tao thành gel tuỳ thuộc vào kích thước truns bình
cua các đoạn axit nucleic cần phân tích [13].
Nổns độ Acrylamide Kích thước trune bình các đoạn cần phân tích
(‘vrw/v) (bp>
3.5 1000-2000
5.0 80 50(1
8.0 6 0-4 0 0
12 0 4 0 - 200
1x0 ■ 2 5-1 50
20.0 6 100
- PhưtOìạ pháp
Lau sạch han kính. lược, uiá kọp bails’ con. Đé kho ư nhiệt độ phone irons 20
phút.
Đổ sel polvacrvlamit 8rr theo cõng thức sau :
20
Báo cáo đê tài QT 05-23
Acrylamit 30% : 6 ml

Glvxerol 5% : 1 mi
APS \0 c/c : 60ul
TEMED : 6ịi\
Đợi cho 2el trùna hợp hoàn toàn trong ít nhất 1 2ÌỜ.
Lãp bán gel vào binh điên di.
Tra mẫu, chạy điện di ỏ' điện áp 100 - 120 voi trong 2 giờ.
5.2.7. KỸ thuật nhuộm bạc
Chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm bạc cùa Budowle B (1991). Phươns
pháp này có ưu điểm đơn giản và hiệu quả cao, thời sian tiến hành nsắn. độ nhạy
cao (chí với 1 ng cũne cho kết qua tốt).
Các bước tiến hành :
Cố định 3 phút với lOOml HNOì 1 (r
Rửa 5 aiâv với 200 ml H20 loại ion.
Nhuộm 20 phút với 20Óml AgNO^ 0.2%
Rửa 5 giây với 200 ml nước loại ion
Hiên 2 - 5 D h ú t với 200 ml Na-,CO, và 11
5. Hiện 2 -5 phút với 200 ml Na2CO, và 170 ul Formandehyt
6. Dừns phán ứng với 250 ml CH,CO()H 10%.
5.2.8. Phương pháp xác định trình tự đoạn ADN sau rinh sạcli
Trình tự đoạn ADN sau tinh sạch được xác định theo phươns pháp của
Sanger. Nguyên tắc cùa phươna pháp này là tạo ra các đoan hon kém nhau một
nucleotid. kết thúc bằng các ddNTP dược đánh dan huỳnh quane. Đẻ tạo ra các đoạn
xếp kết thúc bảng các loại ddNTP khác nhau, chúns tỏi đã tiến hành PCR sử dụng
BigDve® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit có chứa các hóa chất cần thiết của
phản ứns đọc trình tự như các dNTP. ADN polymerase, các ddXTP Do vậy chún°
tôi chi cần bổ sung thêm ADN khuôn (ADN plasmid hoặc sán phẩm PCR tinh sạch),
mồi, đệm thích hợp. Do 4 loại ddNTP trons BiuDve được đánh dấu huỲnh quans
bans 4 mầu khác nhau nên chi cán tiến hành PCR irons một Eppendorf.
Thành phẩn cua phan ứns PCR gồm: BitiDye 0.5X-, đêm IX; mối 3.2 pM:
ADN khuôn (ADN plasmid hoặc sán phấm PCR đã rinh sạch). Tons thê tích phan

ứng là 15 (0.1. Chu trình nhiệt cua phản ứng PCR trên máy luân nhiệt GenAmp~ PCR
System 9700 như sau: 96"c. 1 phút: 25 chu kỳ (96 'C. 10 eiãv: 50"c. 5 eiãy: 60''C. 4
phút): siữ ở 4°c.
Sán phẩm PCR đươc tinh sach bằng phương pháp tủa EtOH/EDTA: bố suns
5 ul EDTA 125 mM. pH 8: 60 Lil ElOH I00rr. Đao nhẹ hỏn họp va đẽ O' nhiệt độ
phòne tron tỉ 15 phút. Tiẽp đỏ ly tám 12000 v/p. 15 phút. 4’c dẽ loại ho EtOH. Bổ
SUI1H 60 Lil EtOH 10c( và ly tâm 12000 v/p troiiL 10 phút. Lam khó ADN. bỏ suns
10 ụl Hi-Di™ Formamide và biến tính tại 95"C nons 5 phút. Các mẫu được cho vào
các giêng cua khay đựna mảu sau đó điện dr trong ống mao quan 80 cm X 50 um
chứa POP-4™ cúa hãng ABI. Mỹ.
G ia i trình rự và M í / v sô liệu
Trình tự nucleotit cua ADN vùne '\si'cu h i m do i" được uiai trinh irén má\ tự
độns ABI-377 (AB1-377 automated sequencer) cua Hãng Perkin-Eỉmer (Mỹ). Chuỏi
nucleotit ihu được lừ AL)\ ly thè thãn tóc cua CMC mau. dược SƯ dune de iru\ cap
Noãn hàn2 een bãrìii chươnt! trình BLAST <Ị ijjr v\ -1 u ỉ1;-11 InI.IÌI||.LV\ hkM j.
Ch ươn s trình AssemblvLIGX V. 1.9 và hệ chưoìic trinh Mac Vector 7.2 f Accel rv\
Báo cáo để tài QT 05-23
Inc.) và hệ chương trình GENEDOC 2.5 (Nicholas and Nicholas. 1LW ) được sứ
dụng để so sánh và đôi chiếu phán tích.
6. KẾT QUẢ VÀ THÁO LUẬN
6.1.Tách chiết ADN
Sau khi tách chiết ADN của tóc bằng phươnH pháp sử dụne Chelex và sử
dụng DTT, độ sạch ADN được xác định bằng máy đo quang phổ. Các bước định
lượng như sau :
- Cho H20 vào cuvet để làm đối chứns.
- Cho vào cuvet khác 1 ml ADN đã được pha loãno ớ nồng độ thích hợp (loãng
50 lần).
Kết quá OD được tính toán theo công thức sau :
Cadn (ng/ml) = OD2(Sllnm X độ pha loãng X 50 ug
VỚI phương pháp tách chiết này các mẫu ADN của tóc có độ sạch

(ODofionm/ODjxonm) từ 1,45 - 1,65. Vậy ADN tách chiết được có thể dùng cho phản
ứng PCR.
6.2. Sản phẩm PCR và nhuộm bạc
Nguyên tắc
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là sử dụng ADN polymerase chịu nhiệt đế tổng
hợp các đoạn ADN mới từ mạch khuôn trong mỏi trường có các dNTP và cãp mồi
dặc hiệu. Các đoạn ADN mới được tạo thành lại dược sử dụng làm khuôn. Sau nhiều
chu kỳ. đoạn ADN quan tâm được nhân lén gấp bội. nhờ vậy có thế có du số lượns
phục vụ cho nhữns nshién cứu tiếp theo.
Mỗi một chu kỳ PCR gồm 3 giai đoạn sau:
- Giai đoạn biến tinh: ADN mạch kép tách thành hai mạch đơn nhờ nhiệt độ cao
(94nC-96"C).
- Giai đoạn gân mói: ở nhiệt độ thích hợp, hai mồi sẽ bám vào hai đáu của đoạn
ADN đích theo nguvẻn tắc bổ sung.
- Giai đoạn kéo dùi chuối', nhiệt độ của hỏn hợp phan ứne đươc tãn« lén khoans 70 -
SO" c là nhiệt độ ihích hợp để cho Taq ADN polymerase kéo dài chuỗi.
Quy trình
Mẫu ADN tách chiết ớ trên đem thực hiện phan ứna PCR. Thanh phán cua
phản ứne 2ổm có :
Giai đoan 1 :
Đêm PCR 10X
2.5ul
dXTPs
2.5ịiì
Mỏi 15965
1.25 ul
Mồi 16491
1,25ul
H:0
12.7j.ll

Taq
0.3|il
ADN khuỏn
?.0.ul
Tons số
25 ị.il
Giai đoan 2 :
Đém PCR K'X
2.5ul
dNTPs
• 2.5ul
Mỏi 15997
1,25ul
-n
Báo cáo đê tài QT 05-23
Mồi 1640] l,25nl
H20 12.7ịx1
Taq 0-3f.ll
ADN khuôn 5.Ó|J.]
Tống số : 25 ul
Chu trình nhiệt của cá 2 giai đoạn như sau :
94°c : 2phút ^
94°c : 30 giây
55"c : 30 giây r" X 30 chu kỳ
72°c : 1 phút'
72°c : 7 phút
4°c ( báo quán )
Sau khi thực hiện phản ứng PCR, tiến hành điện di trên gel polyacrylamide
8% với mỗi giếng 3 |il mẫu và 0,5|il đệm mẫu. Điện di ở điện thế 100 vol, 90 mA
trong 2 giờ. Sau đó nhuộm bạc.

Với điều kiện của phòng thí nghiệm, chúni> tôi khảo sát 6 gia đình: tách chiết
ADN của tóc bàng phương pháp sử dụng dung dịch Chelex và DTT, sau đó nhân
đoạn mồi dùng 2 cặp mồi ty thể LI5965 và Hlfi491. L I5997 và H I6401, kết quả
của sản phẩm PCR được điện di và xác định sản phẩm xen có đúng là đoạn ADN
cần nhân hay khỏna.
Gia đình thứ 7 chúns tỏi tiến hành khảo S i lt tại phòng thí nghiệm trọng điếm
Công nshệ gen, Viện cỏna nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Cóng nghệ Việt
Nam. Kết quả giải trình tự ADN ty thể của cả 4 thành viên trong gia đỉnh này được
sử dụng để truv cập Ngán hàng gen bàng chươns trình BLAST
(httpy/wu'w. ncbi.nlm.nih.gov/hlasi )■
Chương trình AssemblyLIGN V . 1.9 và hệ chươns trình MacVeclor 7.2
(Accelrvs Inc.) và hệ chuơns irình GENEDOC 2.5 (Nicholas and Nicholas. 1CW )
được sử dụno đê so sánh \'à đối chiếu phân tích.
23
Báo cáo đê tài QT 05-23
6.3. Phương pháp tách chiết ADN ớ chân tóc người sử dụng dung dịch Chelex
1) Gia đình thứ nhất:
Gồm 4 người và hai thế hệ, tách chiết ADN của chân tóc bằng phương pháp
sử dụng dung dịch Chelex, sau đó nhân đoạn mồi dùng 2 cặp mồi ty thể LI 5965 và
H I6491, L I5997 và H I6401, kết quả điện di sản phẩm PCR trên hình 3 .
300 bp
i(H> fa n
Hình 3 : Ảnh điện di sản phẩm PCR của gia đình 1 dùng 2 cập mồi tv thế
L15965 và H 1649Ỉ, L15997 và H16401, tách chiết ADN chân tóc bằng Chelex
L : Ladder
B : Bố
M : Mẹ,
C1 : Con thứ nhất,
C2 : Con thứ hai
Từ hình 3, dựa vào ADN ladder lOObp cho thấy sán phẩm PCR nhân lên nằm

trong khoáng 400-500 bp, đúng với kích thước cua đoạn mồi đã sir dụng là L 15965
và H I6491, LI5997 và HI6401 để nhân đoạn ADN của vùng siêu biến đổi HVI.
Tất cả các mẫu ADN tv thể ở chân tóc của bố. mẹ và hai con có băng điện di
đều lên chứng tỏ việc tách chiết ADN ty thê từ chân tóc của người bằng Chelex 10c/ í
đã cho kết quá tốt.
24