Nghiên cứu tinh sạch, tính chất đặc trưng và ứng dụng của Acetylcholinesterase từ ốc bươu vàng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN




LÊ MINH TRÍ



NGHIÊN CỨU TINH SẠCH, TÍNH CHẤT ĐẶC TRƯNG
VÀ ỨNG DỤNG CỦA ACETYLCHOLINESTERASE
TỪ ỐC BƯƠU VÀNG



LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC



H À NỘI, 2011






ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN





LÊ MINH TRÍ



NGHIÊN CỨU TINH SẠCH, TÍNH CHẤT ĐẶC TRƯNG
VÀ ỨNG DỤNG CỦA ACETYLCHOLINESTERASE
TỪ ỐC BƯƠU VÀNG



Chuyên ngành : Hoá sinh học
Mã số : 62.42.30.15



LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC




NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1. GS.TS. NGUYỄN QUỐC KHANG
2. PGS.TS. BÙI PHƯƠNG THUẬN

H À NỘI, 2011
MỤC LỤC


Trang
MỞ ĐẦU
1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
3
1.1.
Ốc bƣơu vàng
3
1.1.1.
Tác hại và lợi ích của ốc bươu vàng
4
1.1.1.1.
Tác hại của ốc bươu vàng
4
1.1.1.2.
Lợi ích của ốc bươu vàng
5
1.1.2.
Các biện pháp diệt ốc bươu vàng
6
1.1.3.

Các biện pháp diệt ốc bươu vàng ở Việt Nam
6
1.2.
Acetylcholinesterase (AChE)
7
1.2.1.
Giới thiệu chung về Acetylcholinesterase (AChE)
7
1.2.1.1.
Phân loại
8
1.2.1.2.
Cấu trúc trung tâm hoạt động của AChE
9
1.2.2.
Vai trò của AChE trong hoạt động thần kinh
14
1.2.3.
Cơ chế ức chế AChE
16
1.2.4.
Nghiên cứu khả năng sử dụng AChE để phát hiện thuốc trừ sâu
21
1.2.5.
Ứng dụng của AChE
21
1.3.
Chất ức chế AChE
22
1.3.1.

Chất ức chế AChE từ thiên nhiên
22
1.3.2.
Các chất ức chế tổng hợp hóa học
23
1.3.2.1.
Các chất độc hóa học dùng trong chiến tranh
23
1.3.2.2.
Thuốc bảo vệ thực vật
24
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
30
2.1.
Đối tƣợng nghiên cứu
30
2.2.
Phƣơng pháp
30
2.2.1.
Định lượng protein
30
2.2.2.
Tách chiết enzyme
30
2.2.3.
Tinh sạch enzyme
31
2.2.4.
Kiểm tra độ sạch của AChE bằng điện di biến tính trên gel

polyacrylamide (SDS - PAGE)
32
2.2.5.
Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme AChE
33
2.2.6.
Phương pháp cố định AChE trên màng polymer đồng trùng hợp
35
2.2.7.
Phương pháp kế hoạch hoá thực nghiệm và xử lý số liệu
35
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
37
3.1.
Khảo sát hàm lƣợng AChE của một số đối tƣợng nghiên cứu
37
3.2
Kết quả khảo sát đặc điểm sinh học của ốc bƣơu vàng
39
3.2.1.
Kích thước vỏ và tỉ lệ giới tính
39
3.2.2.
Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường tới các đặc điểm sinh thái của
ốc bươu vàng
40
3.2.2.1.
Ảnh hưởng của bùn tới khả năng đẻ trứng của ốc bươu vàng
40
3.2.2.2.

Ảnh hưởng của độ sâu lớp nước đến khả năng đẻ trứng và tỉ lệ chết
của ốc bươu vàng
41
3.2.3.
Hàm lượng AChE của ốc bươu vàng qua các thời kỳ trong năm
43
3.2.4.
Lựa chọn nguồn tách chiết và tinh sạch AChE
46
3.3
Tách chiết, nghiên cứu tính chất của AChE từ ốc bƣơu vàng
47
3.3.1.
Tinh sạch AChE bằng sắc ký trao đổi ion
49
3.3.2.
Kiểm tra độ sạch và xác định KLPT của AChE bằng phương pháp
điện di trên Gel SDS-PAGE
50
3.3.3.
Quy trình tách chiết và tinh sạch AChE
51
3.3.4.
Xác định khối lượng phân tử của AChE từ ốc bươu vàng
54
3.3.4.1.
Xác định khối lượng phân tử của AChE bằng phương pháp HPLC
54
3.3.4.2.
Xác định hoạt độ thuỷ phân acetylcholin của chế phẩm AChE từ ốc

bươu vàng
56
3.4.
Ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng đến hoạt độ AChE từ ốc
bƣơu vàng
57
3.4.1.
Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ AChE
57
3.4.2.
Độ bền pH
59
3.4.3.
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ AChE
59
3.4.4.
Độ bền nhiệt
61
3.4.5.
Sự biến đổi hoạt độ AChE theo thời gian
61
3.4.6.
Ảnh hưởng của một số ion kim loại và gốc phospho peroxide (P
2
O
5
)
đến hoạt độ AChE.
62
3.5.

Ảnh hƣởng của một số chế phẩm trừ sâu đến hoạt độ AChE từ ốc
bƣơu vàng
64
3.5.1.
Ảnh hưởng của một số chế phẩm thảo mộc diệt ốc bươu vàng đến
65
hoạt độ AChE
3.5.2.
Ảnh hưởng của flavonoid tổng số chiết từ một số cây thuốc đến
hoạt độ AChE
66
3.5.3.
Ảnh hưởng của một số loại thuốc trừ sâu đến hoạt độ AChE từ ốc
bươu vàng
67
3.5.3.1.
Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Ofatox (Dipterex, Dylox) đến hoạt
độ AChE
68
3.5.3.2.
Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Secsaigon đến hoạt độ AChE
70
3.5.3.3.
Ảnh hưởng của thuốc diệt ốc bươu vàng Dioto 250EC đến hoạt độ
AChE
72
3.5.3.4.
Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Topsin đến hoạt độ AChE
73
3.6.

Nghiên cứu động học ức chế của AChE
74
3.6.1.
Các thông số động học đặc trưng V
M
, K
M
của AChE
74
3.6.2.
Nghiên cứu ảnh hưởng ức chế của flavonoid từ các cây thuốc
khác nhau
76
3.6.3.
Nghiên cứu ảnh hưởng ức chế của flavonoid chiết từ cây Bạch
đồng nữ
77
3.7.
Xây dựng phƣơng pháp phát hiện HCBVTV trên cơ sở sử dụng
AChE
81
3.7.1.
Nghiên cứu, ứng dụng AChE tinh sạch phát hiện một số loại thuốc
trừ sâu phospho hữu cơ
81
3.7.2.
Nghiên cứu cố định AChE trên màng polymer đồng trùng hợp
86
KẾT LUẬN
87

ĐỀ NGHỊ
88
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN
QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
89
TÀI LIỆU THAM KHẢO
90

















1
MỞ ĐẦU
Ốc bươu vàng là loài sinh vật được du nhập vào nước ta từ những năm
80 của thế kỷ trước và hiện nay đã sinh sôi trên diện rộng gây hại cho cây
trồng, hoa màu; đặc biệt là cây lúa. Ốc bươu vàng có nguồn gốc từ Trung và
Nam Mỹ nhưng thích ứng rất nhanh với điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm

của Việt Nam. Ốc bươu vàng có mặt ở khắp nơi: đồng ruộng, kênh mương, ao
hồ,…. Vì thức ăn chủ yếu là lá lúa nên ốc bươu vàng đã trở thành sinh vật phá
hoại lúa nghiêm trọng. Đến nay, diệt ốc bươu vàng triệt để là việc không thể dù
hàng năm Nhà nước đã tốn nhiều tỷ đồng.
Bên cạnh những tác hại, thì về một khía cạnh thực tiễn nào đó, ốc bươu
vàng lại là động vật có lợi. Ốc bươu vàng là nguồn thức ăn có hiệu quả kinh tế
cao đối với chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ hải sản; đặc biệt là nuôi tôm, vì
chúng có hàm lượng dinh dưỡng và can-xi rất cao.
Về mặt hóa sinh học, ốc bươu vàng là nguồn nguyên liệu tự nhiên rất
giàu Acetylcholinesterase (AChE). AChE là một enzyme đóng vai trò rất
quan trọng trong vận truyền tín hiệu của hệ thần kinh động vật. Trung tâm
hoạt động của AChE có các nhóm chức và cấu trúc không gian phù hợp với
các hợp chất phospho hữu cơ nên rất dễ kết hợp với các chất này và mất hoạt
tính rất nhanh. Nắm được tính chất này, người ta đã sản xuất các chất ức chế
AChE là phospho hữu cơ làm chất độc hóa học vô cùng nguy hiểm sử dụng
trong chiến tranh như Tabun, Cyclosarin, Sarin, Soman, VX cũng như làm
thuốc bảo vệ thực vật sử dụng trong sản xuất nông nghiệp.
Sau khi sử dụng, chất độc hóa học sẽ tồn dư lại trong môi trường đất,
nước, trong các sản phẩm nông nghiệp (thực phẩm, rau, củ, quả v.v…).
Chúng là những chất vô cùng độc hại đối với môi trường sinh thái, ảnh hưởng
nghiêm trọng tới sức khỏe con người, động vật và còn có thể là những tác

2
nhân gây nhiều bệnh nguy hiểm, trong đó có bệnh ung thư. Vì vậy, việc phân
tích phát hiện nhanh các chất độc hóa học là rất cần thiết, đặc biệt ngày nay
các chất độc này được người dân sử dụng tràn lan.
Dựa trên tính chất của chất ức chế, chúng ta có thể nghiên cứu sử dụng
enzyme AChE làm phương tiện phân tích, phát hiện nhanh các chất độc hóa
học phospho hữu cơ. Kế thừa các thành quả nghiên cứu về ốc bươu vàng của
những nhà khoa học trên thế giới, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu tinh sạch, tính chất đặc trưng và ứng dụng của
Acetylcholinesterase từ ốc bươu vàng”.
Mục đích chính của đề tài là tận dụng nguồn nguyên liệu dồi dào trong
nước; nghiên cứu, khai thác, ứng dụng AChE làm phương tiện phát hiện nhanh
một số loại thuốc trừ sâu phospho hữu cơ tồn dư trong lương thực, thực phẩm.
Với mục đích nêu trên, đề tài của chúng tôi không những có ý nghĩa về
khoa học và thực tiễn mà còn có ý nghĩa về mặt kinh tế, sử dụng hợp lý tài
nguyên; đặc biệt là đáp ứng nhu cầu nâng cao hiệu quả bảo vệ môi trường
sinh thái.
Để đạt được mục tiêu nêu trên chúng tôi tiến hành thực hiện các nội
dung chính sau:
1. Tìm hiểu các đặc điểm sinh học của ốc bươu vàng, đặc biệt là
enzyme AChE từ đối tượng này.
2. Khảo sát các điều kiện sinh thái, môi trường sống ảnh hưởng đến
khả năng sinh AChE của ốc bươu vàng.
3. Nghiên cứu tinh sạch và các tính chất đặc trưng của AChE từ ốc
bươu vàng.
4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại chất độc hóa học tới hoạt độ
của AChE từ ốc bươu vàng.
5. Nghiên cứu sử dụng AChE để xây dựng phương pháp phát hiện
nhanh một số loại thuốc trừ sâu phospho hữu cơ tồn dư trong lương thực, thực
phẩm.


3
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Ốc bƣơu vàng.
Ốc bươu vàng có tên khoa học là Pomacea canaliculata thuộc họ
Pilidae, lớp chân bụng (Gastropoda), ngành thân mềm (Mollusca), có nguồn

gốc từ Trung và Nam Mỹ [15, 24].
Ốc trưởng thành có kích thước lớn, dạng mập tròn gồm đầu, thân và
chân. Đầu có hai đôi xúc tu (một đôi dài và một đôi ngắn), thân nằm trên
chân, là một khối xoắn ẩn kín trong vỏ; chân rộng, hình đĩa, màu trắng kem
nằm ở phía bụng, mặt lưng của chân có nắp vỏ che đậy, đầu và chân thường
thò ra ngoài vỏ khi di chuyển. Toàn bộ cơ thể ốc nằm trong lớp vỏ. Con đực
có nắp miệng hơi nhô gợn sóng, con cái có nắp miệng bằng phẳng hơi lõm
xuống. Sau khi thụ tinh xong, ốc bươu vàng thường đẻ trứng vào chiều tối.
Khi đẻ, ốc leo lên giá thể cao trên mặt nước, trứng có màu hồng bám thành
chùm trên giá thể và mỗi lần đẻ có khoảng 150 - 500 trứng (1 chùm); sau
khoảng 12 - 15 ngày thì trứng nở và nở hết trong 2 - 7 ngày. Tỉ lệ nở khoảng
70%, tỉ lệ sống sau 10 ngày tuổi khoảng 80%. Tuổi thành thục sớm (khoảng
100 ngày sau khi nở), thời gian tái phát dục ngắn, khoảng 3 ngày. Tuổi thọ 2 -
3 năm. Trong quần đàn, tỉ lệ con đực/cái khoảng 1/4.
Ốc bươu vàng là loài có tốc độ sinh sản rất nhanh, kích thước của
buồng trứng phản ánh kích thước cơ thể của con cái. Có nghĩa là nếu số lượng
trứng nhiều, buồng trứng lớn thì kích thước của con cái lớn [54]. Kích thước cơ
thể ốc cũng phản ánh điều kiện môi trường sống như là: mật độ cá thể, nguồn
thức ăn.
Tốc độ sinh trưởng, phát triển của ốc bươu vàng nhanh hay chậm tuỳ
thuộc vào từng loại thức ăn và môi trường sinh sống. Điều kiện sinh thái, khí

4
hậu, hệ thống kênh mương và lưu lượng nước của từng khu vực khác nhau
cũng dẫn đến tỉ lệ con đực/cái có sự thay đổi. Kết quả nghiên cứu này hoàn
toàn phù hợp với báo cáo kết quả nghiên cứu của Banpavichit [24].

Hình 1.1: Ốc bươu vàng
1.1.1. Tác hại và lợi ích của ốc bƣơu vàng.
1.1.1.1. Tác hại của ốc bƣơu vàng.

Trong tự nhiên, ốc bươu vàng có rất ít kẻ thù kiểm soát được chúng.
Hiện nay, ốc bươu vàng đang là loài sinh vật phá hại nguy hiểm và gây nên
những tổn thất nặng nề cho người nông dân trồng lúa trên thế giới cũng như các
nước ở châu Á [48, 166], trong đó có Việt Nam.
Ốc bươu vàng cắn ngang cây lúa non hoặc chồi lúa từ ngay sau khi sạ
cho đến lúc lúa được 21 ngày tuổi. Ốc hoạt động chủ yếu vào ban đêm. Dấu
hiệu dễ nhận biết lúa bị ốc phá hại là những đoạn thân, lá lúa nổi trên mặt
nước và những chỗ nước cạn có thể thấy rõ cây lúa bị cắn mất ngọn.


5

Hình 1.2: Trứng ốc có mặt khắp nơi
1.1.1.2. Lợi ích của ốc bƣơu vàng.
Bên cạnh tác hại phá hoại mùa màng thì về một khía cạnh thực tiễn nào
đó, ốc bươu vàng không những có giá trị khoa học mà còn là một nguồn thức ăn
có giá trị kinh tế cho chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản [154]. Nghêu, sò, ốc,
hến nói chung và ốc bươu vàng nói riêng là loại thức ăn giàu đạm (37%), trong
đó có nhiều amino acide thiết yếu, khoáng chất nên thường xuyên được dùng
làm thức ăn bổ sung cung cấp đạm, các chất khoáng cho gia cầm, gia súc.
Bảng 1.1: Một số amino acide trong protein ốc bươu vàng [36]
STT
Amino acide
Hàm lƣợng
(%/100g thịt ốc khô)
1
Arginine
13,82
2
Histidine

5,08
3
Isoleucine
8,19
4
Leucine
15,20
5
Lysine
4,18
6
Methionine
3,48
7
Phenylalanine
7,1
8
Threonine
9,00
9
Valine
9,23

6
Để giải quyết phần nào nạn ốc bươu vàng phá hại lúa và hoa màu, các
địa phương cần khuyến khích nông dân bắt ốc về chế biến thành thức ăn chăn
nuôi gia súc, gia cầm, bởi ốc và trứng ốc bươu vàng có hàm lượng dinh
dưỡng và can-xi rất cao.
1.1.2. Các biện pháp diệt ốc bƣơu vàng.
Tháng 10 năm 2004, hội thảo Quốc tế mở rộng bàn về các biện pháp

khống chế, quản lý và diệt ốc bươu vàng được tổ chức tại Đài Loan. Hội thảo
đã đưa ra 20 phương pháp; trong đó có các phương pháp hoá học, vật lý, cơ
học, sinh học và phương pháp tổng hợp. Sau đây, chúng tôi xin giới thiệu khái
quát một số phương pháp: Bẫy bắt và thu gom ốc, dùng muối khoáng để diệt
ốc bươu vàng, dùng chế phẩm thảo mộc để diệt ốc bươu vàng, dùng thuốc trừ
sâu. Ngoài các phương pháp trên, chúng ta còn thấy tại một số vùng đã có các
cách diệt ốc bươu vàng khác nhau: Song chắn, nhiệt độ, sốc điện, thuỷ nông,
thu nhặt bằng tay, cạnh tranh sinh học, nuôi gia cầm và thuỷ cầm, v.v.
1.1.3. Các biện pháp diệt ốc bƣơu vàng ở Việt Nam.
Để loại trừ ốc bươu vàng, người nông dân Việt Nam chủ yếu dùng các
biện pháp thủ công như bắt bằng tay, giăng lưới…(hầu như đã thành “nghề”
của người nông dân). Ngoài các biện pháp nêu trên, chế phẩm sản xuất từ
thảo mộc cũng được sử dụng để diệt ốc bươu vàng [156]. Tại Việt Nam, hệ
thực vật nhiệt đới vô cùng phong phú và đa dạng, trong đó gồm rất nhiều loài
chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Do đó, chúng ta có thể khai thác
những loại cây có độc tính diệt trừ ốc bươu vàng như cây sở, cây chẩu và cây
thàn mát dùng làm nguyên liệu đáp ứng cho việc sản xuất các chế phẩm diệt
ốc có hiệu lực cao, không gây độc hại tới môi trường với số lượng lớn.


7
1.2. Acetylcholinesterase (AChE).
1.2.1. Giới thiệu chung về Acetylcholinesterase (AChE).
AChE được phát hiện trong nhiều cơ thể sinh vật từ bậc thấp tới bậc
cao như nhuyễn thể, nghêu, sò, ốc, cá, ngan, vịt, thỏ, chuột, ngựa, bò…và ở
người [97, 117, 118].
Trong cơ thể, AChE không chỉ có ở các mô thần kinh mà còn có ở trong
hồng cầu và các mô khác: mô cơ, huyết thanh, …[21, 87, 148].
Trên thế giới, AChE được nghiên cứu từ rất sớm [95, 161]. Ban đầu,
enzyme này được tách chiết từ một số loài cá điện như cá đuối điện

Pomatoschistus microps [97], Torpedo marmorata [28, 116], cá chình điện
Electrophorus electricus và có rất ít công trình nghiên cứu về AChE tách chiết từ
ốc bươu vàng.
Ngày nay, người ta còn phát hiện thấy: AChE trong Cầu gai với trọng
lượng phân tử 3×10
5
Da được xác định bằng phương pháp sắc ký trên cột
Sepharose CL - 6B thu được enzyme sạch với hoạt tính rất cao, gấp tới 14.600
lần so với hoạt tính của dịch chiết đồng thể [76, 79].



Hình 1.3: Cầu gai

8
AChE bị ức chế khi nồng độ cơ chất vượt quá nồng độ sinh lý tế bào
một vài milimol còn butyrylcholinesterase thì độ nhạy kém hơn.
Ở Việt Nam, AChE bắt đầu được nghiên cứu từ năm 1960. Trường Đại
học Y khoa Hà Nội, Học viện Quân y 103 đã nghiên cứu enzyme này trong
máu để chẩn đoán một số bệnh về gan và nhiễm độc thuốc trừ sâu. Một số tác
giả của Viện Bảo vệ Thực vật đã tiến hành nghiên cứu và ứng dụng AChE
vào việc xây dựng phương pháp chẩn đoán nhanh dư lượng thuốc bảo vệ thực
vật trong rau quả. Tuy nhiên, việc nghiên cứu AChE ở nước ta còn gặp rất
nhiều khó khăn do hạn chế về trang thiết bị máy móc, dụng cụ thí nghiệm
cũng như cơ sở hạ tầng của các trung tâm nghiên cứu, vì vậy chưa có nhiều
công trình mang tính hệ thống.
1.2.1.1. Phân loại.
Trong hệ thống phân loại, AChE được xếp vào nhóm các enzyme xúc tác
phản ứng thủy phân ester carboxyl (EC 3.1.1 Carboxylic Ester Hydrolases) thuộc
lớp các enzyme thủy phân Hydrolase. AChE có ký hiệu phân loại là EC 3.1.1.7.

Phản ứng đặc hiệu của AChE là thủy phân acetylcholine tạo thành choline
và acetate với tốc độ 25.000 phân tử acetylcholine trong 1 giây:
Acetylcholine + H
2
O = choline + acetate
Enzyme này có tên phân loại là acetylcholine acetylhydrolase và các
tên khác như: choline esterase I, cholinesterase, acetylthiocholinesterase,
acetylcholine hydrolase.
Trong nghiên cứu cholinesterase của các mô khác nhau, người ta phát
hiện thấy còn một enzyme nữa, tuy thủy phân cơ chất khác acylcholine nhưng
cũng cho sản phẩm là choline. Để phân biệt, người ta gọi enzyme AChE thủy
phân acetylcholine là “cholinesterase thật”. Enzyme thứ hai thủy phân
acylcholine, được gọi là “cholinesterase giả” [129] với phản ứng đặc hiệu:

9
Acylcholine + H
2
O = choline + carboxylate
“Cholinesterase giả” thường được gọi là Butyrylcholinesterase với ký
hiệu EC 3.1.1.8. Ngoài tên phân loại là acylcholine acylhydrolase, enzyme
này còn có các tên khác như: anticholineesterase, benzoylcholinesterase, non-
specific cholinesterase, propionylcholinesterase.
“Cholinesterase thật” có trong hồng cầu và mô não, thủy phân
acetylcholine và acetyl--metylcholine một cách dễ dàng nhưng không thủy
phân được benzoylcholine. Trong khi đó, “Cholinesterase giả” tìm thấy trong
gan, ruột, tim và máu có hoạt tính rất thấp hoặc không có hoạt tính đối với
acetyl--metylcholine nhưng thủy phân benzoylcholine và acetylcholine một
cách rất dễ dàng.
AChE - “Cholinesterase thật” và Butyrylcholinesterase - “Cholinesterase
giả” liên quan chặt chẽ đến độc tính của thuốc trừ sâu phospho hữu cơ.

1.2.1.2. Cấu trúc trung tâm hoạt động của AChE.
Qua các kết quả nghiên cứu AChE cho thấy: bản chất của AChE là một
phân tử protein thuần tuý có cấu trúc bậc 4, trên bề mặt có các trung tâm hoạt
động đóng vai trò xúc tác [124, 132].
 Trung tâm hoạt động của AChE
Qua kết quả nghiên cứu về cơ chế xúc tác của AChE đối với cơ chất, đã
chứng minh rằng ở trung tâm hoạt động của AChE có nhóm anion đóng vai
trò quan trọng trong tác dụng xúc tác của enzyme không chỉ thực hiện chức
năng “cố định” cơ chất khi tương tác với “đầu” cation của cơ chất
acetylcholine mà tương tác này còn làm biến đổi cấu trúc protein trong vùng
trung tâm hoạt động theo hướng tạo điều kiện cho sự tạo thành các liên kết
khác với phân tử cơ chất cần thiết cho hiệu ứng xúc tác.

10
Khi nghiên cứu, các nhà khoa học đã chứng minh được rằng nếu trong
trung tâm hoạt động của AChE có một nhóm anion thì điện tích bằng -1 còn
nếu có 2 nhóm thì điện tích bằng -2.
Phần thứ hai trong trung tâm hoạt động của AChE là phần esterase.
Chức năng chủ yếu của phần này là thủy phân acetylcholine. Phần esterase
được cấu tạo không những bởi các amino acide mạch nhánh trong mạch
polypeptide xếp gần nhau mà còn do sự bố trí gần xa của các nhóm tạo thành
cấu trúc bậc 2 hoặc 3. Sở dĩ, hoạt tính của enzyme mất đi hoặc bị giảm có lẽ
do sự thay đổi cấu trúc bậc 2 hoặc 3 này.
Trong trung tâm hoạt động này có mặt các gốc serin, histidin và
tyrosin. Sự sắp xếp chính xác của các gốc này thì chưa rõ, nhưng chi tiết là
tyrosin và serin đặt rất xa nhau trong mạch polypeptide. Bộ ba xúc tác trong
trung tâm hoạt động của enzyme là Glutamat ở vị trí 334 (Glu
334
), Histidin ở
vị trí 447 (His

447
) và Serin ở vị trí 203 (Ser
203
). Ba acide amin này liên kết với
nhau bằng liên kết hydrogen. Túi acyl là Phenylalanin ở vị trí 295 (Phe
295
) và
Phenylalanin ở vị trí 297 (Phe
297
). Phần phụ choline là Tryptophan ở vị trí 86
(Trp
86
), Glutamat ở vị trí 202 (Glu
202
) và Tyrosin ở vị trí 337 (Tyr
337
). Phần
trung tâm là Triptophan ở vị trí 286 (Trp
286
), Tyrosin ở vị trí 72 (Tyr
72
),
Tyrosin ở vị trí 124 (Tyr
124
) và Aspactat ở vị trí 74 (Asp
74
), Tyrosin ở vị trí
341 và 449 (Tyr
341
, Tyr

449
) có thể làm ổn định một số cấu tử. Sau đây là cấu
tạo không gian ba chiều và công thức hoá học của một số nhóm tạo thành
trung tâm hoạt động của enzyme.

11

Hình 1.4: Mô phỏng cấu trúc bậc 4 của AChE
Trong phần esterase, còn có nhóm phân tử của các gốc amino acide cho
proton và nhóm nhận proton. Các nhóm này có thể là hydroxyl của tyrosin và
nhóm imidazol của histidin. Phân tử cholinesterase có trục đối xứng nhất định,
nó có thể chuyển từ trạng thái này sang trạng thái khác khi phản ứng với cơ chất,
chất hoạt hoá hay chất ức chế theo nguyên lý cảm biến trung tâm xúc tác [25].
Sự phù hợp không gian giữa các nhóm chức trong trung tâm hoạt động
của AChE với các nhóm của phân tử cơ chất acetylcholine (Acetylcholine là
cơ chất đặc hiệu của AChE) được thể hiện ở hình 1.5.



N
CH
3
CH
3
CH
2
H
3
C C
H

H
O C
H
O


Hình 1.5: Sự phù hợp không gian giữa các nhóm chức của
trung tâm hoạt động với các nhóm của phân tử cơ chất acetylcholine
(-)
Phần anion
Phần esterase
. .
. .
H O - H

12
N
+
CH
3
H
3
C
CH
3
CH
2
CH
2
O C

O
CH
3

Hình 1.6: Công thức hoá học của Acetylcholine
 Cơ chế xúc tác của AChE
Trung tâm hoạt động của enzyme này chứa hai phần với những nhóm
chức khác nhau đảm nhiệm các chức năng khác nhau trong quá trình xúc tác
thủy phân acetylcholine:
* Phần anion tích điện âm: có nhóm COO
-
nơi mà N
+
của cơ chất được
gắn vào theo liên kết tĩnh điện.
* Phần esterase có các gốc Ser, Tyr, His với chức năng xúc tác thủy
phân là nơi hoạt động chính của AChE.
Để chuẩn bị cho quá trình thủy phân: Phần N
+
của cơ chất acetylcholine
được gắn vào phần anion có COO
-
tích điện. Phần -CH
2
-O-C-O-CH
3
của cơ chất
được gắn vào phần esterase cùng phân tử nước để thực hiện xúc tác thủy phân.
Trong quá trình phản ứng, proton được phân ly từ nhóm phenol của Tyr
sẽ kết hợp với oxy trong nhóm rượu của choline, nhờ đó sinh ra điện tích

dương tại C của nhóm acetyl trong cơ chất. Carbon này sẽ bị hút bởi oxy tích
điện âm của nhóm rượu đã phân ly của Ser trong trung tâm hoạt động. Liên
kết giữa C và O bị đứt ra và acetyl được giải phóng sẽ phản ứng với Ser ở
dạng trung gian tạm thời acetylserin. Proton bắn ra từ Ser được hút tới oxy
tích điện âm của nhóm phenol phân ly từ tyrosin, nhóm hydroxyl được hình
thành cùng với sự phục hồi trạng thái ban đầu của tyrosin trong trung tâm
hoạt động.
Sự thủy phân được bắt đầu chính bằng sự phân ly của phân tử H
2
O: H
+

được hút tới nitơ của nhóm imidazol của His; nhóm OH
-
được tự do và tấn

13
công liên kết ester được hình thành tạm thời của acetylserin. Quá trình này giải
phóng phân tử acide acetic. H
+
vốn liên kết tạm thời với nitơ của imidazol được
giải phóng và gắn trở lại O
-
của Ser. Trạng thái ban đầu của tất cả ba gốc amino
acide trong trung tâm hoạt động được phục hồi. Choline và acide acetic được
giải phóng ra khỏi trung tâm bởi khoảng cách giữa các gốc chức năng đó. Sự
thuỷ phân acetylcholine được diễn ra từ phản ứng liên hợp của tất cả các
nhóm chức năng ở vị trí xúc tác trong trung tâm hoạt động. Tiến trình phản
ứng chịu ảnh hưởng bởi khoảng cách giữa các gốc amino acide chứa các
nhóm chức năng đó.

Các nghiên cứu cũng đã đưa ra kết luận: phản ứng diễn ra một cách
bình thường nếu nhóm imidazol nằm cách nhóm COO
-
của acetyl 0,5 nm và
nếu gốc tyrosin nằm cách Ser 0,25 nm.
 Tính chất xúc tác của AChE
Trung tâm esterase có nhóm chức hydroxylnucleophil của Ser, nhóm
này được hoạt hoá bởi imidazol của histidin nhờ một liên kết cầu hydro. Vị trí
anion mang một điện tích âm gây ra bởi nhóm carboxyl của acide aspartat
nằm cạnh Ser.
Trong cấu trúc của acetylcholine, nguyên tử N tích điện dương. Nguyên
tử carbon thuộc nhóm carbonyl xích lại gần trung tâm esterase của AChE làm
xuất hiện những điều kiện thuận lợi cho tác dụng nucleophil của nhóm
hydroxyl thuộc gốc Ser vào nhóm carbonyl của acetylcholine, đồng thời
nguyên tử N tích điện dương tương tác với gốc oxy mang điện âm của gốc
glutamyl. Hai tương tác đồng thời này co kéo liên kết ester C-O ở giữa phân
tử acetylcholine trong môi trường có nước dẫn tới phản ứng thủy phân
acetylcholine thành choline và acide acetic.

14
NH
3
C
CH
3
CH
2
CH
2
O C CH

3
O
OH
Serin
HO C
O
+
CH
3
NH
3
C CH
2
CH
2
OH
CH
3
Choline
Acetic acid
Acetylcholine
Actylcholinesterase

Hình 1.7: Mô hình trạng thái trung gian tương tác giữa chất dẫn truyền
thần kinh acetylcholine với enzyme AChE làm lỏng lẻo liên kết C-O dẫn
đến thủy phân acetylcholine thành choline và acide acetic
1.2.2. Vai trò của AChE trong hoạt động thần kinh.
AChE giữ vai trò quan trọng đặc biệt trong hoạt động thần kinh, đó là
“Thủy phân acetylcholine”. Mặc dù, acetylcholine đã được các nhà khoa học
tổng hợp từ năm 1867 nhưng đến năm 1914, Henry Hallett Dale mới phát

hiện tác động của nó đối với tế bào màng tim và vai trò của nó trong hoạt
động thần kinh [161].
Acetylcholine là vật liệu truyền tín hiệu thần kinh của hệ thần kinh
ngoại biên và hệ thần kinh trung ương ở nhiều cơ thể trong đó có cơ thể
người. Acetylcholine được tổng hợp chủ yếu trong các nơron từ choline và
acetyl-CoA do enzyme choline acetyltransferase xúc tác cho quá trình này.
Trong khớp thần kinh, acetylcholine làm nhiệm vụ mang tín hiệu thần
kinh giữa hai nơron, đó là nơron truyền và nơron nhận. Tác dụng truyền dẫn
của acetylcholine chỉ được phép phát huy hiệu lực trong một thời gian rất
ngắn (khoảng 10
-3
giây), vì vậy màng tế bào phải nhanh chóng hồi phục để
tiếp nhận xung mới.


15


Hình 1.8: Khớp thần kinh - cấu trúc truyền xung thần kinh
Acetylcholine nằm trong các túi ở axon, chờ khi nhận được các xung
thần kinh thì chuyển vào vùng đệm của khớp để truyền cho bộ phận nhận nằm
ngay trên mặt của dendrite làm nhiệm vụ gửi những thông điệp chuyển mệnh
lệnh hoạt động cho các cơ bắp. Sau một thời gian ngắn (khoảng 10
-3
giây), khi
acetylcholine đã hoàn thành nhiệm vụ, enzyme AChE đã nằm sẵn trong vùng
đệm của khớp chịu trách nhiệm làm mất tác dụng của acetylcholine và nhanh
chóng tách chúng ra khỏi hệ thống thần kinh bằng cách phá vỡ để giải phóng
choline và acetat [124]. Đấy là nhiệm vụ quan trọng của AChE. Nếu AChE bị
ức chế, thì chúng không phá vỡ được vật liệu truyền tín hiệu thần kinh

acetylcholine. Nếu acetylcholine này không bị phá vỡ thì chúng liên tục
truyền tín hiệu làm cho các cơ bắp không thể nghỉ, co thắt liên tục dẫn đến liệt
và các vấn đề sinh lý bất lợi khác. Ngược lại, nếu AChE có hoạt tính quá

16
mạnh thì luôn luôn phá vỡ các acetylcholine trước khi hoàn thành nhiệm vụ.
Do đó, các tín hiệu thần kinh không kịp truyền đi từ axon làm cho dendrit não
bộ không nhận được tín hiệu, não bộ không ghi nhận được gì, do đó gây nên
“Bệnh lãng quên” Alzheimer hay “Mất trí nhớ” [103, 127, 133, 139].
1.2.3. Cơ chế ức chế AChE.
Khi phospho hữu cơ tiến gần tới trung tâm hoạt động của enzyme AChE
thì liên kết P-R
3
của chúng mang điện tích dương sẽ có xu hướng nhanh chóng
tiến tới oxy của gốc Ser dư điện tích âm của phần ester hình thành tương tác P -
O. Trong khi đó thì gốc R
L
có xu hướng nhanh chóng tiến tới phần ion âm của
trung tâm hoạt động của enzyme tạo nên trạng thái trung gian. Sự co kéo trong
trạng thái trung gian hoạt động làm lỏng lẻo liên kết P- R
L
dẫn đến phá vỡ liên
kết này và hình thành liên kết vững chắc giữa phospho hữu cơ và oxy của nhóm
Ser (P-O) đồng thời giải phóng gốc R
L
-O Như vậy, phospho hữu cơ hoàn toàn
che lấp phần ester của trung tâm hoạt động của AChE dẫn đến enzyme mất hoạt
tính [45, 144].
P
OR

2
R
3
O
O
R
L
HO
Serin
Acetylcholinesterase

Hình 1.9: Phospho

của chất độc dư điện tích dương có xu hướng
nhanh chóng tiến tới oxy của gốc Ser dư điện tích âm [144].
δ
+
Phospho

của chất độc dư điện tích dương.
δ
–
Oxy của gốc Ser dư điện tích âm.
Chất độc thần kinh
δ
+

δ
-

17


O
Serin
P
OR
2
R
3
O
R
L
H
Acetylcholinesterase

Hình 1.10: Mô hình trạng thái trung gian tương tác giữa chất độc
hóa học thần kinh với enzyme AChE làm đứt gãy liên kết P…R
L


Acetylcholinesterase
P
OR
2
R
3
O
O

Serin
H
+
R
L
O
-

Hình 1.11: Hình thành liên kết vững chắc giữa phospho và oxy
của nhóm P-O làm mất hoạt tính AChE
Bẻ gãy liên kết
Có thể tương tác nếu R
L
phù hợp với
kích thước và điện tích
hoặc H
2
O

18
Sau khi hình thành liên kết vững chắc P-O làm trung tâm hoạt động của
AChE mất hoạt tính, thủy phân liên kết P-O có thể làm enzyme có hoạt tính trở
lại. Trong 2 khả năng thủy phân thì khả năng thủy phân liên kết P-O sẽ cắt
được phần che lấp ester làm trung tâm hoạt động của AChE có hoạt tính trở lại.


Acetylcholinesterase
P
OR
2

R
3
O
O
Serin
R
2
O
R
L
OH

Hình 1.12: Thủy phân liên kết P-O cắt phần che lấp ester làm tái lập
trung tâm hoạt động của AChE, có hoạt tính trở lại
Acetylcholinesterase
P
O
Serin
HO R
3
O
R
L
OH
R
2
OH

Hình 1.13: Thủy phân liên kết R
2

O-P tạo thành R
L
OH và R
2
OH
không cắt phần che lấp ester trong trung tâm hoạt động của AChE,
enzyme không có hoạt tính trở lại
Nếu H
2
O cộng vào đây thì
có hiện tượng thuỷ phân
Nếu H
2
O cộng vào đây
thì có hiện tượng lão hóa
Liên kết rất bền,
không thể thuỷ phân
được