Nghiên cứu sử dụng lectin để xác định kháng thể và kháng nguyên của một số bệnh ung thư thường gặp tt1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN





Trần Thị Phương Liên




NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG LECTIN ĐỂ XÁC ĐỊNH
KHÁNG THỂ VÀ KHÁNG NGUYÊN CỦA MỘT SỐ
BỆNH UNG THƯ THƯỜNG GẶP


Chuyên ngành: Hoá sinh học
Mã số: 62 42 30 15




LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. GS.TS. Đỗ Ngọc Liên
2. PGS. TS. Nguyễn Thị Chính




HÀ NỘI - 2008


LỜI CAM ĐOAN



Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ công trình nào khác.




Tác giả




Trần Thị Phương Liên

LỜI CẢM ƠN


Hoàn thành luận án này tôi xin gửi lời cảm ơn tới:

- GS.TS. Đỗ Ngọc Liên, người thầy đã tận tâm hướng dẫn tôi trong suốt quá trình
làm luận án.

- PGS.TS. Nguyễn Thị Chính, người đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi
trong thời gian học tập, làm việc.

- Các Thầy cô và các cán bộ trong Bộ môn Sinh lý Thực vật và Hoá sinh Trường
Đại học Khoa học Tự nhiên đã giúp đỡ cho tôi hoàn thành tốt luận án này.

- Phòng xét nghiệm Hoá sinh bệnh viện Quân đội Trung ương 108, bệnh viện E
Trung ương, viện Ung bướu Hà Nội, viện Huyết học và Truyền máu Trung ương,
bệnh viện Bạch Mai đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận án.

- Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
2 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt chương trình học.
- Gia đình, những người thân và bạn bè, đồng nghiệp luôn động viên, chia sẻ, giúp
đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu.

MỤC LỤC

Trang
CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. KHÁNG THỂ DỊCH THỂ 3
1.1.1. Khái niệm 3
1.1.2. Cấu trúc chung của các kháng thể 3
1.1.3. Chức năng sinh học của kháng thể 4
1.1.4. Lớp và các phân lớp của kháng thể 5
1.1.5. Biểu hiện bất thường của kháng thể trong bệnh lí 6
1.2. AFP và UNG THƯ 7
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu và sự biến đổi sinh lí của AFP huyết thanh 7
1.2.2. Tính không đồng nhất trong chuỗi đường của các loại AFP 8
1.2.3. Chức năng của AFP 9
1.2.4. Hàm lượng AFP huyết thanh ở bệnh gan mạn tính
và một số bệnh khác 10
1.3 LECTIN 11
1.3.1. Lược sử nghiên cứu lectin 11
1.3.2. Sự phân bố của lectin trong sinh giới 14
1.3.3. Một số tính chất lí hoá của lectin 15
1.3.4. Một số tính chất sinh học và miễn dịch của lectin 18
1.3.5. Ứng dụng của lectin 20
1.3.6. Vài nét về nghiên cứu lectin ở Việt Nam 24

Chương 2. NGUYÊN LIỆU và PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1. NGUYÊN LIỆU 26
2.1.1. Hạt mít 26
2.1.2. Hạt đậu 27
2.1.3. Huyết thanh, hồng cầu người 27
2.2. HOÁ CHẤT và THIẾT BỊ 28
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2.3.1. Xác định hoạt độ lectin 28
2.3.2. Xác định hàm lượng protein 29
2.3.3. Tinh chế lectin 30
2.3.4. Điều chế các cột sắc kí ái lực 31
2.3.5. Tinh chế kháng thể 32
2.3.6. Kỹ thuật ELISA 33
2.3.7. Kỹ thuật thẩm tách miễn dịch (Western blotting) 36
2.3.8. Kỹ thuật điện di 37
Chương 3. KẾT QUẢ và BÀN LUẬN 38
3.1. TINH CHẾ LECTIN JACALIN TỪ BA LOÀI MÍT (A. heterophyllus Lamk; A. chempeden
Gagn. và A. masticata Gagn.), LECTIN ConM TỪ HẠT ĐẬU DAO BIỂN (Canavalia maritima
Aublet) và LECTIN ConG TỪ HẠT ĐẬU GƯƠM (Canavalia gladiata Jacq D.C.) 38
3.1.1. Tinh chế lectin jacalin từ ba loài mít (A. heterophyllus Lamk;
A. chempeden Gagn. và A. masticata Gagn.) 38
3.1.2. Tinh chế lectin ConM từ hạt đậu dao biển (Canavalia maritima Aublet) 43
3.1.3. Tinh chế lectin ConG từ hạt đậu gươm (Canavalia gladiata Jacq D.C.) 50
3.2. BƯỚC ĐẦU SỬ DỤNG LECTIN MÍT ĐỂ TẠO BỘ SINH PHẨM XÁC ĐỊNH IgA
1
TỪ HUYẾT
THANH NGƯỜI 53
3.2.1. Tinh chế IgA
1

bằng cột Jacalin-Sepharose-4B tự chế tạo 54
3.2.2. Thiết kế bộ sinh phẩm định lượng IgA
1
bằng kỹ thuật LECTIN-ELISA 59
3.2.3. Định lượng IgA
1
trong HT người bằng kỹ thuật LECTIN-ELISA 68

3.3. BƯỚC ĐẦU SỬ DỤNG LECTIN ConM ĐỂ TẠO BỘ SINH PHẨM XÁC ĐỊNH IgG TỪ HUYẾT
THANH NGƯỜI 70


3.3.1. Nghiên cứu khả năng bắt giữ kháng thể IgG từ huyết thanh của ConM 70
3.3.2. Tinh chế kháng thể IgG từ huyết thanh người bằng cột
ConM-Sepharose-4B tự tạo 72
3.3.3. Thiết kế bộ sinh phẩm định lượng IgG từ huyết thanh bằng kỹ thuật
LECTIN- ELISA 77
3.3.4. Sử dụng lectin ConM xác định hàm lượng KT IgG bằng kỹ thuật
LECTIN-ELISA 85
3.4. ỨNG DỤNG LECTIN ConG TỪ HẠT ĐẬU GƯƠM (Canavalia gladiata Jacq D.C.) ĐỂ BẮT GIỮ,
PHÂN BIỆT CÁC LOẠI KHÁNG NGUYÊN AFP TỪ HUYẾT THANH NGƯỜI UNG THƯ
GAN, VIÊM GAN SIÊU VI TRÙNG VÀ THAI PHỤ 87
3.4.1. Nghiên cứu khả năng bắt giữ AFP của lectin ConG từ hạt đậu gươm
(Canavalia gladiata Jacq D.C.) 87
3.4.2. Nghiên cứu khả năng bắt giữ kháng thể trong huyết thanh của ConG
88
3.4.3. Sử dụng lectin ConG để nhận dạng các kháng nguyên AFP bệnh lí 89
3.5. BÀN LUẬN 91
KẾT LUẬN 96
ĐỀ NGHỊ 98

CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN 99
TÀI LIỆU THAM KHẢO 100
PHỤ LỤC 110











1
MỞ ĐẦU

Sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể người bình thường và của các bệnh nhân nhiễm trùng, đặc biệt là các bệnh
nhân ung thư rất đa dạng và phức tạp. Khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể được biểu hiện là sự tăng cường tổng
hợp kháng thể hoặc xuất hiện một số kháng nguyên chỉ thị bệnh đã được nhiều nhà khoa học Y học quan tâm
nghiên cứu. Mục đích của các nghiên cứu theo hướng này là xác định sự biểu hiện bất thường của một số kháng thể
và kháng nguyên chỉ thị bệnh nhằm chẩn đoán bệnh sớm, theo dõi điều trị giúp cho chữa bệnh kịp thời và hiệu quả.
Kháng thể bệnh lí xuất hiện trong đáp ứng miễn dịch thường là một lớp kháng thể riêng biệt hoặc các
kháng thể đã bị cải biến sau tổng hợp do bệnh lí như tăng cường hoặc thoái hoá khả năng glycosyl hoá (gắn
thêm hoặc loại bỏ các gốc đường), thậm chí có sự thay đổi thoái hoá cấu trúc phân tử kháng thể tạo mảnh
protein Bence-Johns chuỗi nhẹ như ở bệnh ung thư đa u tuỷ xương dòng tế bào B…Tất cả những thay đổi về
đáp ứng miễn dịch và hoá sinh cần phải được xét nghiệm bằng các kỹ thuật chẩn đoán đặc hiệu để phát hiện
sớm sự biểu hiện của bệnh.
Lectin, một dạng glycoprotein tự nhiên có mặt rất phổ biến ở nhiều nguồn tài nguyên sinh vật như động

vật, thực vật và vi sinh vật đã được các nhà khoa học phát hiện và nghiên cứu từ trên 100 năm nay (từ năm 1888).
Trong nhiều năm nghiên cứu, các nhà khoa học đã chứng minh rằng lectin có rất nhiều ứng dụng trong Y dược
học. Đặc biệt trong những năm cuối cùng của thể kỉ XX, người ta đã sử dụng sự tương tác đặc hiệu đường rất tinh
vi của lectin với các kháng thể và kháng nguyên (do bản chất hoá học của lectin là những protein liên kết đặc
hiệu với các gốc đường của nhiều loại kháng thể và kháng nguyên có cấu trúc đường riêng biệt) để nghiên cứu sự
biểu hiện của kháng thể, kháng nguyên trong đáp ứng miễn dịch.
Mục tiêu đề tài
Lựa chọn, tinh chế một số loại lectin từ thực vật tương tác đặc hiệu với kháng thể, kháng nguyên để xác
định sự biểu hiện của kháng thể IgA
1
, IgG và kháng nguyên AFP từ huyết thanh của người bình thường, một số
bệnh nhân: Ung thư vòm họng, đa u tuỷ xương, ung thư gan và viêm gan siêu vi trùng.
Nội dung của đề tài
1. Tinh chế lectin (jacalin) từ 3 loài mít (Artocarpus heterophyllus Lamk; Artocarpus masticata Gagn. và
Artocarpus champeden Gagn.) của Việt Nam và sử dụng jacalin để thiết kế bộ sinh phẩm định lượng kháng thể IgA
1

từ huyết thanh người.
2. Xây dựng quy trình, tinh chế lectin ConM, ConG từ 2 loại đậu (Canavalia maritima Aublet và
Canavalia gladiata Jacq D.C.) của Việt Nam để thiết kế bộ sinh phẩm định lượng kháng thể IgG từ huyết thanh
người, phân biệt kháng nguyên AFP (Alpha Feto Protein) từ huyết thanh bệnh nhân ung thư gan, viêm gan siêu vi
trùng và thai phụ.
Những đóng góp mới của luận án
1. Lần đầu tiên phát hiện ra lectin ConM từ hạt đậu dao biển Việt Nam (Canavalia maritima Aublet) có
khả năng bắt giữ bằng liên kết đặc hiệu với kháng thể IgG từ huyết thanh người.
2. Lần đầu tiên phát hiện ra lectin ConG từ hạt đậu gươm Việt Nam (Canavalia gladiata Jacq D.C.) có khả
năng liên kết và phân biệt được các loại kháng nguyên AFP từ huyết thanh bệnh nhân ung thư gan, viêm gan siêu
vi trùng và thai phụ.
3. Bước đầu nghiên cứu tạo hai bộ sinh phẩm để định lượng kháng thể IgA
1

, IgG từ huyết thanh người và
nghiên cứu điều kiện bảo quản bộ sinh phẩm trong thời gian 4 tháng vẫn cho giá trị sử dụng.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình tinh chế lectin ConM từ hạt đậu dao biển Việt Nam (Canavalia maritima
Aublet) và đặc tính liên kết đặc hiệu giữa lectin ConM với kháng thể IgG từ huyết thanh người.


2
2. Tinh chế lectin ConG từ hạt đậu gươm Việt Nam (Canavalia gladiata Jacq D.C.) và chứng minh được
các isolectin ConG liên kết, nhận biết riêng biệt 3 dạng kháng nguyên AFP của bệnh nhân ung thư gan, viêm gan
siêu vi trùng và của thai phụ.
3. Đã bước đầu thiết kế được 2 bộ sinh phẩm LECTIN-ELISA (Jacalin-ELISA và ConM-ELISA) để định
lượng kháng thể IgA
1
và IgG.
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. KHÁNG THỂ DỊCH THỂ VÀ KHÁNG THỂ BIẾN ĐỔI BỆNH LÍ
Trong quá trình đáp ứng miễn dịch của cơ thể, khi những tế bào bạch cầu lympho B tiếp xúc với kháng
nguyên sẽ sản xuất ra những kháng thể đặc hiệu hay globulin miễn dịch (Immuno globulin, viết tắt là Ig) chống lại
kháng nguyên ấy. Loại kháng thể thứ nhất được đổ vào dịch nội môi như dịch tuần hoàn máu và hệ bạch huyết, đó
là kháng thể dịch thể. Loại kháng thể thứ hai nằm ngay trên màng của những tế bào sinh ra nó, biến thành thụ thể
của tế bào B trưởng thành. Phản ứng kháng thể với kháng nguyên có tính đặc hiệu cao. Chức năng sinh học của
phân tử Ig trong hệ thống miễn dịch là nhận biết "cái lạ" được gọi chung là kháng nguyên ngoại lai, liên kết đặc
hiệu với kháng nguyên lạ, trung hoà và loại bỏ chúng khỏi cơ thể. Ở một số bệnh như nhiễm trùng hoặc ung thư
các kháng thể được tế bào B tiết ra có thể bị cải biến cấu trúc như gắn thêm hoặc loại bỏ một số gốc đường và
chính sự cải biến này đã được nhận biết đặc hiệu bởi một số lectin có nguồn gốc tự nhiên.
1.2. AFP VÀ UNG THƯ
Năm 1963, Abelev G.I. đã tìm thấy AFP ở chuột nhắt bị ung thư gan trong thực nghiệm. Một năm sau,
Tatarinov Y.S. tìm thấy AFP ở bệnh nhân ung thư gan và từ đó trở đi AFP trở thành kháng nguyên chỉ thị ung thư
đầu tiên được ứng dụng rộng rãi giúp chẩn đoán ung thư gan và viêm gan. AFP người là một glycoprotein có cấu

trúc phân tử là một chuỗi polypeptide khối lượng khoảng 70 kDa chứa 4% carbohydrate và thành phần đường
này có thể bị cải biến trong bệnh lí được nhận biết đặc hiệu bằng lectin.
1.3. LECTIN
Lectin, một dạng glycoprotein tự nhiên có mặt rất phổ biến ở nhiều nguồn tài nguyên sinh vật như động vật,
thực vật và vi sinh vật đã được các nhà khoa học phát hiện và nghiên cứu từ trên 100 năm nay (từ năm 1888). Đặc
biệt trong những năm cuối cùng của thể kỉ XX, người ta đã sử dụng sự tương tác đặc hiệu đường rất tinh vi của
lectin với các kháng thể và kháng nguyên để nghiên cứu sự biểu hiện của kháng thể, kháng nguyên.
Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Hạt mít
Các hạt từ quả mít dai (Artocarpus heterophyllus Lamk), mít chay nhung (mít dại) (Artocarpus masticata
Gagn.) và mít tố nữ (Artocarpus champeden Gagn.) được dùng là nguyên liệu để tách lectin.
2.1.2. Hạt đậu
Hạt đậu dao biển (Canavalia maritima Aublet), hạt đậu gươm (Canavalia gladiata Jacq D.C.) được dùng
để tách lectin ConM và ConG.
2.1.3. Huyết thanh, hồng cầu người
- Huyết thanh người bình thường do viện Huyết học và Truyền máu Trung ương cung cấp.
- Huyết thanh bệnh nhân đa u tuỷ xương đã được xác định là mắc bệnh do viện Huyết học và Truyền máu
Trung Ương cung cấp.
- Huyết thanh bệnh nhân ung thư gan, bệnh nhân viêm gan siêu vi trùng đã được xác định là mắc bệnh do
viện Quân đội Trung ương 108, bệnh viện E Trung ương và bệnh viện Ung bướu Hà Nội cung cấp.
- Huyết thanh bệnh nhân ung thư vòm họng đã được xác định là mắc bệnh do bệnh viện Bạch Mai cung
cấp.
- Huyết thanh thai phụ do bệnh viện E Trung ương cung cấp.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Sử dụng một số phương pháp Hoá sinh và Miễn dịch như: Định lượng protein theo Lowry, kỹ thuật đo quang
phổ, điện di gel polyacrylamide (SDS-PAGE), sắc kí, ELISA và thẩm tách miễn dịch (Western blotting).


3

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. TINH CHẾ LECTIN JACALIN TỪ BA LOÀI MÍT (A. heterophyllus Lamk; A. chempeden Gagn. và A. masticata Gagn.),
LECTIN ConM TỪ HẠT ĐẬU DAO BIỂN (Canavalia maritima Aublet) và LECTIN ConG TỪ HẠT ĐẬU GƯƠM (Canavalia
gladiata Jacq D.C.)
3.1.1. Tinh chế lectin jacalin từ ba loài mít (A. heterophyllus Lamk; A. chempeden Gagn. và A. masticata
Gagn.)
* Quy trình tinh chế lectin jacalin được hoàn thiện như sau:
Chúng tôi đã sử dụng một quy trình mới khi chỉ dùng một cột sắc kí trao đổi ion CM-cellulose và tiến hành
thí nghiệm trong điều kiện lựa chọn pH tối ưu: rửa cột bằng đệm PB pH 5,6 và giải hấp phụ bằng đệm PBS pH
8,0. Quy trình tinh chế lectin mít được hoàn thiện như sau:

* Đánh giá độ tinh sạch của chế phẩm
lectin jacalin











Kết quả cho thấy cả 3 loại jacalin
đều biểu hiện 2 băng: Một tiểu đơn vị
có khối lượng 14 kDa, còn tiểu đơn vị
kia có khối lượng 17 kDa.
3.1.2. Tinh chế lectin ConM từ hạt
đậu dao biển (C. maritima Aublet)

* Quy trình tinh chế lectin
ConM được hoàn thiện như sau:
* Đánh giá độ tinh sạch của chế phẩm
lectin ConM









Kết quả cho thấy chế phẩm lectin ConM
thể hiện 3 băng isolectin. Một băng chính lớn

Nạp cột
Rửa cột bằng đệm TBS pH7,4 có Mn
2+
và Ca
2+

Đẩy cột bằng đệm TBS 0,02M pH7,4 có Ca
2+
,
Mn
2+
3mM, Glucose 0,5M.
Thẩm tích loại đường.
Cột Sephadex G-75

Lectin ConM tinh sạch

Chiết xuất 3 lần bằng dung dịch đệm TBS pH7,4; có
Mn
2+
và Ca
2+
3mM. Khuấy từ mỗi lần 10 phút. Ly
tâm 8000 v/phút/20 phút. Thu dịch nổi

Bột hạt đậu dao biển
Dịch chiết thô

C
C
h
h
ú
ú


t
t
h
h
í
í
c
c

h
h
:
:


C
C
ộ
ộ
t
t


1
1
:
:


P
P
r
r
o
o
t
t
e
e

i
i
n
n


c
c
h
h
u
u
ẩ
ẩ
n
n




C
C
ộ
ộ
t
t


2
2

,
,


3
3
:
:


C
C
h
h
ế
ế


p
p
h
h
ẩ
ẩ
m
m


l
l

e
e
c
c
t
t
i
i
n
n


C
C
o
o
n
n
M
M


C
C
ộ
ộ
t
t

4
4
:
:


D
D
ị
ị
c
c
h
h


c
c
h
h
i
i
ế
ế
t
t


t
t

h
h
ô
ô






Hình 3.6. Điện di SDS-PAGE chế phẩm lectin ConM từ hạt đậu dao biển
Chú thích:
Cột 1. Protein chuẩn
Cột 2. Jacalin mít dai sau tinh chế
Cột 3. Jacalin mít tố nữ sau tinh chế
Cột 4. Jacalin mít dại sau tinh chế
Hình 3.3. Điện di SDS-PAGE đánh giá độ tinh sạch của các lectin mít
mít


- Tủa bằng (NH
4
)
2
SO
4
65% bão hoà.
- Li tâm 8000 v/p/15 phút, thu tủa, hoà tan tủa
bằng đệm PBS pH 7,4. Thẩm tích
- Chiết rút bằng đệm PBS 0,02M, pH7,4.

- Li tâm 8000 v/p/15 phút, lấy dịch nổi
Hạt mít nghiền khô
Dịch chiết thô
Chế phẩm lectin thô
Chế phẩm lectin jacalin
tinh sạch
- Rửa cột bằng đệm PB pH 5,6
- - - Giải hấp phụ bằng đệm PBS pH 8,0.
- Thu các phân đoạn đỉnh. Thẩm tích
Cột CM-cellulose
Nạp cột


4
nhất có khối lượng vào khoảng 33 kDa, một băng có khối lượng vào khoảng 23 kDa, băng nhỏ nhất có khối lượng
khoảng 18 kDa.
3.1.3. Tinh chế lectin ConG từ hạt đậu gươm (C. gladiata Jacq D.C.)
* Quy trình tinh chế lectin ConG được hoàn thiện như sau:

* Đánh giá độ tinh sạch của lectin ConG
Kết quả cho thấy lectin ConG cho
3 băng protein được coi là các isolectin,
trong đó có một băng chính đậm có khối
lượng phân tử vào khoảng 31kDa và hai
băng phụ có khối lượng vào khoảng 23
và 14 kDa.
3.2. BƯỚC ĐẦU SỬ DỤNG LECTIN MÍT ĐỂ
TẠO BỘ SINH PHẨM XÁC ĐỊNH IgA
1
TỪ
HUYẾT THANH NGƯỜI
3.2.1. Tinh chế kháng thể IgA
1

Sử dụng 50mg lectin mít dai tinh
sạch gắn với 5g gel Sepharose-4B đã
được hoạt hoá bằng CNBr. Nạp sản phẩm Jacalin-Sepharose-4B mới điều chế vào cột có kích thước 1,2cm x
8,0cm thu được cột Jacalin-Sepharose-4B. Sử dụng cột này để tinh chế kháng thể IgA
1
từ huyết thanh người.
* Quy trình tinh chế kháng thể IgA
1
được hoàn thiện như sau:
Chúng tôi sử dụng một quy trình mới: phản hấp phụ IgA
1
bằng glycine 0,2M pH 2,6; mỗi phân đoạn phản

hấp phụ được trung hoà bằng đệm Tris-HCl 0,75M pH 8,8.







Chú thích:
Cột 1,2: Lectin ConG tinh sạch
Cột 3: Protein chuẩn
Hình 3.10. Điện di SDS - PAGE chế phẩm lectin ConG

- Tủa bằng (NH
4
)
2
SO
4
70% bão hoà.
- Li tâm 8000 v/p/15 phút, thu tủa,
hoà tan tủa bằng đệm PBS pH 7,4. Thẩm tích
- Rửa cột bằng đệm PBS pH 7,4
- Giải hấp phụ bằng Glucose 0,2M
- Thu các phân đoạn đỉnh. Thẩm tích
Nạp cột
- Chiết rút bằng đệm PBS 0,02M, pH 7,4.
- Li tâm 8000 v/p/15 phút, lấy dịch nổi.
Hạt đậu gươm nghiền khô
Dịch chiết thô

Chế phẩm lectin thô
Lectin ConG tinh sạch
Cột Sephadex G- 75
Huyết thanh người
Dịch chứa các kháng thể
- Kết tủa bằng (NH
4
)
2
SO
4
45% bão hoà
- Li tâm 8000 v/p/15 phút, thu tủa, hoà tủa trong
đệm PBS. Thẩm tích
Cột Jacalin- Sepharose-4B
Nạp cột


5










* Xác định hàm lượng IgA

1
sau tinh chế bằng phương pháp Lowry
Hình 3.14. Biểu đồ về hàm lượng IgA
1
từ
huyết thanh người bình thường (HTBT),
bệnh nhân ung thư gan (HTUTG) và
bệnh nhân ung thư vòm họng
(HTUTVH) sau khi tinh chế
Kết quả ở hình 3.14. cho thấy hàm
lượng IgA
1
trong huyết thanh của người
bình thường trung bình là 3,6  0,54
mg/ml, dao động từ 2,52 đến 4,74 mg/ml.
Hàm lượng IgA
1
trong huyết thanh
bệnh nhân ung thư vòm họng dao động từ 4,75 đến 7,00 mg/ml; trung bình là 5,84  0,59 mg/ml, cao hơn khoảng 1,6 lần
so với người bình thường. Qua xử lí thống kê chúng tôi thấy rằng mức độ tăng này là có ý nghĩa (P = 2,08 x 10
-6
nhỏ
hơn nhiều so với 0,05).
Hàm lượng IgA
1
trong huyết thanh bệnh nhân ung thư gan dao động từ 7,29 đến 13,64 mg/ml; trung bình là
11,32  1,44mg/ml, cao hơn khoảng 3,14 lần so với người bình thường. Qua xử lí thống kê chúng tôi thấy rằng mức
độ tăng này là có ý nghĩa (P = 1,4 x 10
-7
nhỏ hơn nhiều so với 0,05).

* Đánh giá độ tinh sạch của chế phẩm IgA
1
tinh chế được bằng cột Jacalin-Sepharose-4B











Hình 3.15. Điện di SDS-PAGE đánh giá độ tinh sạch của chế phẩm IgA
1

Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy chế phẩm IgA
1
là tinh khiết cao, không có sự biểu hiện sai khác nào về
khối lượng phân tử của 2 chuỗi IgA
1
trong huyết thanh bệnh nhân ung thư gan và bệnh nhân ung thư vòm họng so với
người bình thường, đều có 2 băng protein băng có khối lượng phân tử khoảng 56kDa và một băng khoảng 23kDa,
tương ứng với chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của IgA
1
.
Chú thích:
Cột 1. Protein chuẩn
Cột 2. IgA

1
người bình thường
Cột 3. IgA
1
bệnh nhân ung thư gan
Cột 4, 5. IgA
1
bệnh nhân ung thư vòm
họng

- Rửa cột bằng đệm PBS pH 7,4.
- Giải hấp phụ bằng glycine 0,2M pH 2,6 có trung
hoà mỗi phân đoạn bằng Tris- HCl pH 8,8
- Thu các phân đoạn đỉnh
5.84
11.33
3.60
0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
14.00
HTUTVH (n=10) HTBT (n=10) HTUTG (n=10)
Hµm l-îng IgA
1
(mg/ml)
P<0.05

P<0.05


6
3.2.3. Bước đầu thiết kế bộ sinh phẩm định lượng IgA
1
bằng kỹ thuật Jacalin-ELISA
* Xây dựng đường chuẩn IgA
1

Hình 3.16. Đồ thị chuẩn IgA
1

Qua đồ thị thấy rằng, khi mật độ
quang thu được nằm trong khoảng từ
0,256 đến 0,499 thì đường chuẩn thực
nghiệm gần với đường lí thuyết. Như
vậy cần phải nghiên cứu thăm dò độ
pha loãng của huyết thanh sao cho kết
quả đo mật độ quang rơi vào trong
khoảng này thì mới tính được chính
xác hàm lượng IgA
1
trong quá trình
định lượng.
* Thăm dò độ pha loãng của huyết thanh và nồng độ jacalin gắn bản
Với cả 3 loại jacalin thì nồng độ pha loãng huyết thanh là 100 lần và nồng độ jacalin là 10 g/ 1 giếng cho kết
quả tốt nhất. Ở hai điều kiện trên kết quả mật độ quang học đo khả năng bắt giữ IgA
1
trung bình của lectin mít dại là

0,453; của mít dai là 0,451; của lectin mít tố nữ là 0,456. Như vậy khả năng bắt giữ IgA
1
của 3 loại jacalin này là
tương đương nhau.

* Quy trình tạo bộ sinh phẩm xác định IgA
1

- Bước 1 : Hoạt hoá giếng (Microplate, Nunc. Norway) bằng 100 l dung dịch glutaraldehyde 0,25% pha
trong đệm PBS 0,02M pH 7,4; ở 37
0
C; trong 3 giờ. Rửa 3 lần bằng đệm PBS pH 7,4. Làm khô.
- Bước 2. Gắn bản : Thêm vào mỗi giếng đã được hoạt hoá 50l jacalin tinh sạch trong đệm PBS pH 7,4 có
nồng độ 10g/giếng, bịt kín trong 2 giờ, ở 37
0
C.
- Bước 3. Phủ bản: Thêm vào mỗi giếng đã được gắn bản 250 l đệm blocking, bịt kín trong 2 giờ ; ở
37
0
C. Rửa 3 lần bằng đệm PBS pH 7,4. Làm khô.
- Bước 4 : Tráng giếng bằng dung dịch đệm PBS pH 7,4 có chứa glycerol 15%; 0,02% azit ở 37
0
C ; trong 2
giờ. Làm khô, bảo quản ở 4
0
C trong vòng 4 tháng.
Khi sử dụng, giếng được rửa lại bằng đệm PBS pH 7,4 để loại bỏ hết glycerol, làm khô. Thêm vào đó 50 l
huyết thanh cần phân tích, rồi tiếp tục tiến hành phản ứng ELISA.
* Xác định độ nhạy và mức độ tin cậy của kỹ thuật Jacalin-ELISA
Độ nhạy của kỹ thuật Jacalin - ELISA có thể xuống đến những nồng độ <1ng/ml. Điều đó cho phép thực

nghiệm có thể dùng những mẫu thử dưới 100l huyết thanh.
Để kiểm tra độ mức độ tin cậy của kỹ thuật Jacalin - ELISA, chúng tôi tiến hành định lượng kháng thể IgA
1

từ 40 mẫu huyết thanh bệnh nhân đa u tuỷ xương bằng hai kỹ thuật khác nhau là kỹ thuật Jacalin - ELISA do
chúng tôi tự thiết kế và bằng kỹ thuật đo độ đục, tại viện Huyết học và Truyền máu Trung Ương, trên máy
OLYMPUS AU640 của Nhật Bản. Kết quả qua xử lí thống kê tính được F = 0,011 < F
39.39
(0,05) = 3,9634, do đó
khẳng định hàm lượng IgA
1
trong huyết thanh khi định lượng bằng kỹ thuật Jacalin - ELISA và kỹ thuật đo độ
đục là tương đương nhau.
* Định lượng IgA
1
trong huyết thanh người bình thường và một số bệnh nhân ung thư bằng bộ sinh
phẩm Jacalin - ELISA
0.256
0.499
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Hµm l-îng IgA
1
ng/ml)
OD 490nm


7

Hình 3.20. Hàm lượng kháng thể IgA
1

trong huyết thanh người bình thường
(HTBT), bệnh nhân ung thư gan
(HTUTG), bệnh nhân ung thư vòm
họng (HTUTVH), bệnh nhân đa u tuỷ
xương (HTĐUTX)
Với 40 mẫu huyết thanh người bình
thường, hàm lượng kháng thể IgA
1
trung
bình là 3,46  0,66mg/ml. Hàm lượng
IgA
1
trung bình trong huyết thanh bệnh
nhân ung thư gan là 11,54  1,32 mg/ml,
cao hơn khoảng 3,33 lần so với người bình thường, mức độ tăng so với người bình thường là có ý nghĩa thống kê (p
= 4,4 x 10
-43
nhỏ hơn rất nhiều so với 0,05). Hàm lượng IgA
1

trung bình trong huyết thanh bệnh nhân ung thư vòm
họng là 5,53  0,46 mg/ml, cao hơn khoảng 1.59 lần so với người bình thường, mức độ tăng so với người bình
thường là có ý nghĩa thống kê (p= 4,73 x 10
-46
nhỏ hơn rất nhiều so với 0,05). Hàm lượng kháng thể IgA
1
trong
huyết thanh bệnh nhân đa u tuỷ xương là 0,31  0,07 mg/ml, dao động từ 0,18-0,47 mg/ml thấp hơn khoảng 11 lần
so với bình thường, mức độ giảm so với người bình thường là có ý nghĩa thống kê (p = 5,84 x 10
-46
nhỏ hơn rất
nhiều so với 0,05).
3.3. BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG LECTIN ConM ĐỂ TẠO BỘ SINH PHẨM XÁC ĐỊNH IgG TỪ HUYẾT THANH NGƯỜI
3.3.1. Nghiên cứu khả năng bắt giữ kháng thể từ huyết thanh của ConM
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng bắt giữ kháng thể của lectin ConM bằng kỹ thuật ConM - ELISA.
Kết quả thấy rằng lectin ConM chỉ liên kết với kháng thể IgG, không liên kết với các kháng thể khác trong huyết
thanh người.
3.3.2. Tinh chế kháng thể IgG từ huyết thanh người
Sử dụng 50mg lectin ConM tinh sạch gắn với 5g gel Sepharose-4B đã được hoạt hoá bằng CNBr. Nạp
sản phẩm ConM-Sepharose-4B mới điều chế vào cột có kích thước 1,2cm x 8,0cm thu được cột ConM-
Sepharose-4B. Sử dụng cột này để tinh chế kháng thể IgG từ huyết thanh người. Ngoài ra IgG còn được tinh
chế bằng cột chuẩn ProteinA-Sepharose-4B (hãng SIGMA- USA) để so sánh với cột ConM-Sepharose-4B tự tạo.
Chế phẩm IgG tinh sạch được sử dụng để xây dựng đồ thị chuẩn cho kỹ thuật ConM - ELISA.
* Quy trình tinh chế IgG được tối ưu như sau :
* Sắc kí cột ái lực
ConM-Sepharose-4B và
Protein A- Sepharose-4B
11.54
5.52
0.31

3.46
0
2
4
6
8
10
12
14
HT§UT(n=40) HTBT(n=40) HTUTVH (n=40) HTUTG (n=40)
Hµm l-îng IgA
1
(mg/ml)
P<0.05
P<0.05
P<0.05
- Rửa cột bằng đệm PBS pH 7,4.
- Phản hấp phụ bằng glycine 0,2M pH 2,6 có trung hoà
mỗi phân đoạn hứng bằng Tris- HCl 0,75M pH 8,8.
- Thu các phân đoạn đỉnh
Huyết thanh
Dịch chứa các Ig
- Kết tủa bằng (NH
4
)
2
SO
4
45% bão hoà
- Li tâm 8000 v/p/15 phút, thu tủa, hoà tủa trong

đệm PBS. Thẩm tích.
Cột ConM-Sepharose-4B
(Hoặc cột ProteinA-Sepharose-4B)
Nạp cột
Chế phẩm IgG tinh sạch
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
C¸c ph©n ®o¹n
OD (280nm)
ConM-SEPHAROSE-4B PROTEINA-SEPHAROSE-4B


8
Hình 3.25. Các phân đoạn IgG từ 2 cột sắc kí
Kết quả thấy rõ cả 2 cột sắc kí đều thu được 1 đỉnh. Mặc dù trong cùng một điều kiện rửa cột và giải hấp
phụ, nhưng với cột ConM-Sepharose-4B đỉnh thuộc phân đoạn thứ 4, còn với cột proteinA-Sepharose 4B đỉnh lại
thuộc phân đoạn thứ 3. Nguyên nhân có thể là do ái lực của IgG với ConM mạnh hơn ái lực của IgG với proteinA
vì vậy mà IgG ở cột ConM-Sepharose-4B bị đẩy ra chậm hơn.
* Tổng kết quá trình tinh chế IgG
Bảng 3.9. Tổng kết quá trình tinh chế kháng thể IgG
Số
mẫu
Cột ConM - Sepharose-4B

Cột ProteinA - Sepharose-4B
Hàm lượng
Protein (mg/ml)
Hàm lượng
IgG (mg/ml)
Hàm lượng
Protein (mg/ml)
Hàm lượng
IgG (mg/ml)
1
67,52
11,98
68,92
11,75
2
69,14
12,23
70,14
12,83
3
70,56
12,98
67,23
11,88
4
72,14
13,08
72,13
13,25
5

69,78
12,07
67,35
12,04
6
66,15
11,03
69,14
12,16
7
68,56
11,78
66,57
10,79
8
70,14
12,87
68,56
12,01
9
72,56
13,14
71,48
12,99
10
68,23
11,28
66,78
11,04
TB

69,47  3,57
12,24  0,51
68,83  3,38
12,07  0,56
Hàm lượng kháng thể IgG tinh chế được bằng 2 loại cột ConM-Sepharose-4B và ProteinA-Sepharose-4B là
tương đương nhau. Kết quả hàm lượng kháng thể IgG tinh chế được bằng cột ConM-Sepharose-4B trung bình là
12,24  0,51 mg/ml, dao động từ 11,03-13,14 mg/ml. Kết quả hàm lượng kháng thể IgG tinh chế được bằng cột
proteinA-Sepharose-4B trung bình là 12,07  0,56 mg/ml, dao động từ 10,79-12,99 mg/ml. Kết quả này phù hợp với
những thông số bình thường của người Việt Nam và phù hợp với tác giả Văn Đình Hoa và cộng sự khi họ sử
dụng bộ sinh phẩm xét nghiệm của nước ngoài. Điều này chứng tỏ hoàn toàn có thể dùng cột ConM-Sepharose-4B
để tinh chế kháng thể IgG từ huyết thanh người.
* Đánh giá mức độ tinh sạch của chế phẩm IgG được tinh chế bằng cột ConM -Sepharose-4B và Protein A-
Sepharose-4B








Kết quả thể hiện trên hình
3.26. cho thấy chế phẩm IgG thu
được từ cột chuẩn ProteinA-Sepharose-4B và ConM-Sepharose-4B tự tạo là hoàn toàn tinh sạch. Chỉ biểu hiện 2
băng tương ứng với chuỗi nặng (53kDa) và chuỗi nhẹ (25kDa) khi kiểm tra bằng kỹ thuật SDS-PAGE. Như vậy
dùng cột sắc kí lectin ConM cộng hợp Sepharose để tinh chế kháng thể IgG từ huyết thanh người là một phương
pháp mới, thu được chế phẩm IgG có độ tinh khiết cao, quy trình đơn giản, dễ thực hiện trong điều kiện của nước
ta. Kết quả này đã chứng minh rằng lectin ConM liên kết đặc hiệu với kháng thể IgG mà không hề liên kết với
thành phần nào khác trong huyết thanh người.
Hình 3.26. Điện di SDS-PAGE đánh giá độ tinh sạch của chế phẩm IgG

Chú thích:
Cột 1: Protein chuẩn.
Cột 2: IgG tinh chế bằng
cột ConM – Sepharose - 4B
Cột 3: IgG tinh chế bằng
cột ProteinA – Sepharose - 4B


9
3.3.3. Bước đầu thiết kế bộ sinh phẩm định lượng IgG từ huyết thanh bằng kỹ thuật ConM- ELISA
* Xây dựng đường chuẩn IgG
Kháng thể IgG sau khi tinh chế được dùng để xây dựng đồ thị tiêu chuẩn cho kỹ thuật xét nghiệm ConM-
ELISA.
Hình 3.27. Đồ thị chuẩn IgG
Kết quả cho thấy, khi mật độ
quang nằm trong khoảng từ 0,196 đến
0,689 kết quả thực nghiệm tương đương
với kết quả chuẩn theo lí thuyết.
* Thăm dò độ pha loãng của
huyết thanh và nồng độ ConM gắn
bản tối ưu
Qua thăm dò cho thấy độ pha loãng huyết thanh là 200 lần và nồng độ ConM gắn bản là 5 g/ 1 giếng cho
kết quả tốt nhất.
* Quy trình tạo bộ sinh phẩm xác định IgG

- Bước 1 : Hoạt hoá giếng (Microplate, Nunc. Norway) bằng 100 l dung dịch glutaraldehyde 0,25% pha
trong đệm TBS 0,02M pH 7,4; ở 37
0
C; trong 3 giờ. Rửa 3 lần bằng đệm TBS pH 7,4. Làm khô.
- Bước 2. Gắn bản : Thêm vào mỗi giếng đã được hoạt hoá 50l lectin ConM tinh sạch trong đệm TBS
pH 7,4 chứa 3mM Ca
2+
và Mn
2+
nồng độ 10g/giếng, bịt kín trong 2 giờ, ở 37
0
C.
- Bước 3. Phủ bản: Thêm vào mỗi giếng đã được gắn bản 250 l đệm Blocking, bịt kín trong 2 giờ ; ở
37
0
C. Rửa 3 lần bằng đệm TBS pH 7,4. Làm khô.
- Bước 4 : Tráng giếng bằng dung dịch đệm TBS pH 7,4 có chứa glycerol 15%; 0,02% azit ở 37
0
C ;
trong 2 giờ. Làm khô, bảo quản ở 4
0
C trong vòng 15 ngày.
Khi sử dụng, giếng được rửa lại bằng đệm TBS pH 7,4 để loại bỏ hết glycerol, làm khô. Thêm vào đó 50
l huyết thanh cần phân tích, rồi tiếp tục tiến hành phản ứng ELISA.
* Xác định độ nhạy và độ tin cậy của kỹ thuật ConM - ELISA trong xác định hàm lượng kháng thể
IgG
Độ nhạy của kỹ thuật ConM-ELISA có thể xuống đến những nồng độ <1ng/ml. Điều đó cho phép thực
nghiệm có thể dùng những mẫu thử dưới 100l huyết thanh.
Để kiểm tra độ mức độ tin cậy của kỹ thuật ConM-ELISA, chúng tôi tiến hành định lượng kháng thể IgG
từ 40 mẫu huyết thanh bệnh nhân đa u tuỷ xương bằng hai kỹ thuật khác nhau là kỹ thuật LECTIN-ELISA do

chúng tôi tự thiết kế và bằng kỹ thuật đo độ đục tại viện Huyết học và Truyền máu Trung Ương trên máy
OLYMPUS AU640. Kết quả qua xử lí thống kê tính được F = 0,000593 < F
39.39
(0,05) = 3,9634, do đó khẳng
định hàm lượng IgG trong huyết thanh khi định lượng bằng kỹ thuật ConM- ELISA và kỹ thuật đo độ đục là
tương đương nhau.

3.4.2. Sử dụng lectin ConM xác định hàm lượng kháng thể IgG bằng kỹ thuật ConM-ELISA
0.196
0.689
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Hµm l-îng IgG (ng/ml)
OD 490nm


10
Hình 3.31. Hàm lượng IgG trong
huyết thanh người bình thường
(HTBT), bệnh nhân ung thư gan
(HTUTG), bệnh nhân ung thư vòm
họng (HTUTVH), bệnh nhân đa u
tuỷ xương (HTĐUTX)
Với 40 mẫu huyết thanh người

bình thường hàm lượng kháng thể IgG
trung bình là 12,43  1,57 mg/ml.
Hàm lượng IgG trung bình trong
huyết thanh bệnh nhân đa u tuỷ xương
là 50,08  10,30 mg/ml, cao hơn
khoảng 4,02 lần so với huyết thanh người bình thường, mức độ tăng so với người bình thường là có ý nghĩa thống
kê (P=7,86 x 10
-21
nhỏ hơn rất nhiều so với 0,05). Với bệnh nhân ung thư gan hàm lượng IgG trung bình là 12,13
 1,57 mg/ml, không có sự biến động so với người bình thường. Với bệnh nhân ung thư vòm họng hàm lượng IgG
trung bình là 12,02  1,51mg/ml, không có sự biến động so với người bình thường.

3.4. ỨNG DỤNG LECTIN ConG TỪ HẠT ĐẬU GƯƠM (Canavalia gladiata Jacq D.C.) ĐỂ BẮT GIỮ, PHÂN BIỆT CÁC LOẠI
KHÁNG NGUYÊN AFP TỪ HUYẾT THANH BỆNH NHÂN UNG THƯ GAN, VIÊM GAN SIÊU VI TRÙNG VÀ THAI PHỤ
* Nghiên cứu khả năng bắt giữ AFP của ConG từ hạt đậu gươm (Canavalia gladiata Jacq D.C.)
Các thí nghiệm nghiên cứu khả năng bắt giữ AFP chuẩn cho kết quả dương tính, chứng tỏ rằng lectin
ConG có bắt giữ AFP.
* Nghiên cứu khả năng bắt
giữ kháng thể IgG trong huyết
thanh của ConG
Để chứng minh được khả năng
bắt giữ IgG của ConG, chúng tôi tiến
hành một quy trình thực nghiệm
trong đó có sử dụng 5 loại kháng thể
kháng 5 lớp Ig khác nhau của người.
Kết quả thu được đã chứng minh
rằng lectin ConG chỉ liên kết với
kháng thể IgG.

50.09
12.02
12.13
12.43
0.00
10.00
20.00
30.00
40.00
50.00
60.00
70.00
HTBT (n = 40) HTUTG(n =
40)
HTUTVH (n=
40)
HT§UT (n=40)
Hµm l-îng IgG (mg/ml)
HTĐUTX
HTBT
HTUTVH
HTUTG
p>0.05
p>0.05
P<0.05
Chú thích:

Cột 1. ConG bắt giữ AFP (màu nhạt
dần khi nồng độ AFP giảm dần)

Hình 3.33. ConG bắt giữ AFP


11







Hình 3.34. ConG bắt giữ IgG








* Sử dụng lectin ConG để nhận dạng các kháng nguyên AFP
ConG đã được sử dụng để nhận dạng các loại AFP từ huyết thanh bệnh nhân ung thư gan, viêm gan siêu vi
trùng và thai phụ bằng kỹ thuật Western Blotting. Kết quả cho thấy đã có sự phân biệt về khả năng bắt giữ của
ConG với 3 loại AFP trên (hình 3.35).

KẾT LUẬN
1. Lectin jacalin từ hạt của 3 loài mít (A. heterophylus Lamk, A. champeden Gagn., A. masticata Gagn.) đã được
tinh sạch bằng cột CM - Cellulose và độ sạch được kiểm tra bằng SDS-PAGE cho 2 băng protein có khối lượng 17kDa
và 14 kDa đối với cả 3 loại mít.
Hình 3.35. Lectin đậu gươm
ConG nhận dạng các kháng
nguyên AFP từ huyết thanh bệnh
nhân ung thư gan, viêm gan siêu
vi trùng và thai phụ
Chú thích:
Cột 1, 2. Lectin ConG bắt giữ IgG nên kết quả thu được dương tính.
Cột 3. Lectin ConG không tương tác với IgA
Cột 4. Lectin ConG không tương tác với IgM
Cột 5. Lectin ConG không tương tác với IgE
Cột 6. Lectin ConG không tương tác với IgD


Chú thích:
Cột 1,2,3: AFP của bệnh nhân ung
thư gan bắt giữ cả 3 băng 14kDa,

23kDa và 31 kDa của lectin ConG.
Cột 4,5,6: AFP của bệnh nhân viêm
gan siêu vi trùng bắt giữ 2 băng
14kDa và 23kDa của ConG.
Cột 7,8,9,10: AFP của thai phụ chỉ
bắt giữ 1 băng 14 kDa của ConG.

•


12
- Sử dụng lectin từ hạt mít dai (A. heterophyllus Lamk) cộng hợp với Sepharose - 4B để bắt giữ IgA
1
từ huyết
thanh của người. Kết quả cho thấy hàm lượng IgA
1
trung bình ở người bình thường là 3,46  0,66 mg/ml, ở bệnh nhân
ung thư gan là 11,54  1,32 mg/ml - tăng khoảng 3,33 lần so với người bình thường, ở bệnh nhân ung thư vòm họng là
5,52  0,46 mg/ml - tăng khoảng 1,59 lần so với người bình thường, ở bệnh nhân đa u tuỷ xương là 0,31  0,07 mg/ml
- thấp hơn khoảng 11 lần so với người bình thường.
2. Lectin ConM từ hạt đậu dao biển (Canavalia maritima Aublet), đã được tinh sạch bằng cột Sephadex G-75
và độ tinh sạch được kiểm tra bằng SDS-PAGE cho 3 băng protein có khối lượng 33kDa, 23kDa và 18 kDa.
- Đã chứng minh lectin ConM chỉ liên kết đặc hiệu với kháng thể IgG, không liên kết với các kháng thể khác và
các protein huyết thanh của người bằng kỹ thuật ELISA.
- Sử dụng lectin ConM tạo cột ái lực ConM-Sepharose-4B để tinh chế IgG. Chế phẩm IgG sau khi tinh chế cho
hai băng protein có khối lượng của chuỗi nặng 53kDa và chuỗi nhẹ 25kDa.
3. Đã sử dụng lectin ConM từ đậu dao biển (Canavalia maritima Aublet) để định lượng IgG từ huyết thanh
của người. Kết quả cho thấy hàm lượng IgG trung bình trong huyết thanh người bình thường là 12,43  1,57
mg/ml, ở bệnh nhân ung thư gan là 12,13  1,57 mg/ml - không biến động so với người bình thường, ở bệnh nhân
ung thư vòm họng là 12,02  1,51 mg/ml - không biến động so với người bình thường, ở bệnh nhân đa u tuỷ xương

là 50,08  10,03 mg/ml - tăng khoảng 4,02 lần so với người bình thường.
4. Lectin ConG từ hạt đậu gươm (Canavalia gladiata Jacq D.C.) đã được tinh sạch bằng cột Sephadex G - 75 và
độ tinh sạch được kiểm tra bằng SDS-PAGE cho 3 băng protein có khối lượng 31kDa, 23kDa và 14 kDa.
- Lectin ConG được sử dụng để nhận dạng các kháng nguyên AFP từ huyết thanh bệnh nhân ung thư gan, viêm
gan siêu vi trùng và thai phụ. Kết quả cho thấy, các AFP ở bệnh nhân ung thư gan được liên kết với cả 3 chuỗi 31kDa,
23kDa và 14 kDa của lectin ConG; các AFP ở bệnh nhân viêm gan siêu vi trùng liên kết với 2 chuỗi 14kDa và 23kDa
và AFP ở thai phụ chỉ liên kết với chuỗi 14kDa của lectin ConG.
ĐỀ NGHỊ
1. Cần tiếp tục nghiên cứu điều kiện bảo quản bộ sinh phẩm xét nghiệm kháng thể IgA
1
và IgG bằng kỹ
thuật LECTIN-ELISA.
2. Cần tiếp tục nghiên cứu với số lượng mẫu nhiều hơn nữa để có thể xác định được độ nhạy, độ đặc hiệu,
độ chính xác và xác định tỷ lệ % liên kết giữa các dạng AFP bệnh lí và AFP thai phụ đối với các isolectin ConG
giúp cho việc chẩn đoán bệnh chính xác.

13