Nghiên cứu sử dụng lectin để xác định kháng thể và kháng nguyên của một số bệnh ung thư thường gặp

CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN

AFP Alpha-Feto-Protein
ConG Lectin được tinh chế từ
hạt đậu gươm (Canavalia gladiata Jacq D.C.)
ConM Lectin được tinh chế từ
hạt đậu dao biển (Canavalia maritima Aublet)
DOT - BLOT Kỹ thuật chuyển đốm (vết thấm) miễn dịch
ELISA (Enzyme- Linked -
Immunosorbent - Assay) Xét nghiệm miễn dịch hấp phụ liên kết enzyme
Gal Galactose
Gal-NAc N-Acetylgalactosamine
Glc-NAc N-Acetylglucosamine
HAA Hoạt độ ngưng kết hồng cầu
HL Hàm lượng
HĐR Hoạt độ riêng
HĐTS Hoạt độ tổng số
HT Huyết thanh
HTBT Huyết thanh người bình thường
HTUTG Huyết thanh bệnh nhân ung thư gan
HTĐUTX Huyết thanh bệnh nhân đa u tuỷ xương
HTUTVH Huyết thanh bệnh nhân ung thư vòm họng
Jacalin Lectin được tinh chế từ hạt mít
KN Kháng nguyên
KT Kháng thể
LECTIN-ELISA Kỹ thuật ELISA sử dụng lectin
làm kháng nguyên gắn bản.
OD (optical density) Mật độ quang học
PBS (Phosphate-Buffered-Saline) Đệm Phosphate muối

POD Peroxidase
RIA (Radio Immuno Assay) Xét nghiệm miễn dịch phóng xạ
TBS (Tris-Buffered-Saline) Đệm Tris muối
SDS - PAGE Điện di trên gel Polyacrylamide có Sodium
Dodecyl Sulfate



DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 1.1. Một số đặc tính cơ bản của 5 lớp kháng thể người 6
Bảng 3.1. Tinh chế lectin mít từ 10g bột hạt mít 42
Bảng 3.2. Hoạt độ ngưng kết hồng cầu của 50l dịch chiết thô ConM trong các
loại đệm khác nhau 43
Bảng 3.3. Hoạt độ ngưng kết hồng cầu của 50l dịch lectin ConM thô khi kết tủa
bằng các chất khác nhau 44
Bảng 3.4. Tinh chế lectin ConM từ 10g bột hạt đậu dao biển 48
Bảng 3.5. Tinh chế lectin ConG từ 10g bột hạt đậu gươm 52
Bảng 3.6. Tinh chế IgA
1
từ huyết thanh người bình thường
và bệnh nhân ung thư 57
Bảng 3.7. Xác định độ nhạy của kỹ thuật LECTIN-ELISA
trong định lượng IgA
1
65
Hình 3.8. Hàm lượng IgA
1
từ HT của 40 bệnh nhân đa u tuỷ

xương bằng 2 kỹ thuật LECTIN-ELISA và kỹ thuật đo độ đục 67
Bảng 3.9. Tổng kết các mẫu có kết quả hàm lượng IgA
1
trùng lặp và sai khác khi
sử dụng hai kỹ thuật định lượng LECTIN-ELISA và đo độ đục 67
Bảng 3.10. Tinh chế kháng thể IgG từ huyết thanh người bình thường bằng cột
ConM-Sepharose-4B và cột ProteinA-Sepharose-4B 75
Bảng 3.11. Xác định độ nhạy của kỹ thuật LECTIN-ELISA
trong định lượng IgG 82
Hình 3.12. Hàm lượng IgG từ HT của 40 bệnh nhân đa u tuỷ
xương bằng 2 kỹ thuật LECTIN-ELISA và kỹ thuật đo độ đục 84


Bảng 3.13. Tổng kết các mẫu có hàm lượng IgG trùng lặp và sai khác khi sử dụng
hai kỹ thuật định lượng LECTIN-ELISA và đo độ đục 84
DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 1.1. Cấu tạo chung của kháng thể 4
Hình 1.2. Cấu trúc đường phân tử AFP ở bệnh nhân ung thư gan 8
Hình 1.3. Cấu trúc đường phân tử AFP ở bệnh nhân viêm gan mạn tính 8
Hình 1.4. Cấu trúc đường phân tử AFP ở bệnh nhân ung thư túi noãn hoàng 8
Hình 1.5. Cấu trúc đường phân tử AFP ở thai phụ 9
Hình 1.6. Cấu trúc chuỗi đường của IgA
2
21
Hình 1.7. Cấu trúc chuỗi đường của IgA
1
21
Hình 1.8. Cấu trúc không gian của ConM 22

Hình 1.9. Cấu trúc chuỗi đường của IgG 24
Hình 2.1. Quả mít dai (Artocarpus heterophyllus Lamk) 26
Hình 2.2. Quả mít tố nữ (Artocarpus champeden Gagn.) 26
Hình 2.3. Quả mít dại (Artocarpus masticata Gagn.) 26
Hình 2.4. Hạt và quả đậu dao biển (Canavalia maritima Aublet) 27
Hình 2.5. Hạt và quả đậu gươm (Canavalia gladiata Jacq D.C.) 27
Hình 3.1. Quy trình tinh chế lectin mít 39
Hình 3.2. Các phân đoạn lectin mít từ cột sắc kí CM-cellulose 40
Hình 3.3. Điện di SDS - PAGE đánh giá độ tinh sạch của 3 loại jacalin
tinh chế từ các hạt mít 41
Hình 3.4. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của lectin ConM 45
Hình 3.5. Các phân đoạn lectin ConM từ cột sắc kí Sephadex-G75 46
Hình 3.6. Điện di SDS - PAGE đánh giá độ tinh sạch của lectin ConM 47


Hình 3.7. Quy trình tinh chế lectin ConM từ
hạt đậu dao biển (Canavalia maritima Aublet) 49

Hình 3.8. Quy trình tinh chế lectin ConG
từ hạt đậu gươm (Canavalia gladiata Jacq D.C.) 50
Hình 3.9. Các phân đoạn lectin ConG từ cột sắc kí Sephadex G-75 51
Hình 3.10. Điện di SDS-PAGE đánh giá độ tinh sạch của lectin ConG 51
Hình 3.11. Sơ đồ tạo cột Jacalin-Sepharose-4B 53
Hình 3.12. Quy trình tinh chế IgA
1
54
Hình 3.13. Các phân đoạn IgA
1
từ huyết thanh người bình thường và bệnh nhân
ung thư bằng cột sắc kí Jacalin-Sepharose-4B 55

Hình 3.14. Hàm lượng IgA
1
từ HTBT, HTUTG, HTUTVH sau tinh chế 56
Hình 3.15. Điện di SDS - PAGE đánh giá độ tinh sạch của chế phẩm IgA
1
58
Hình 3.16. Đồ thị chuẩn IgA
1
59
Hình 3.17. So sánh khả năng bắt giữ IgA
1
của 3 loại lectin mít và thăm
dò độ pha loãng của huyết thanh, nồng độ jacalin gắn bản 61
Hình 3.18. Hiệu suất bắt giữ IgA
1
của bộ sinh phẩm xét nghiệm LECTIN-ELISA
theo thời gian bảo quản ở 4
0
C 63
Hình 3.19. Đường biểu diễn sự thay đổi hấp phụ quang theo nồng độ IgA
1
trong
vùng dưới 3,5ng/ml bằng kỹ thuật LECTIN-ELISA 66
Hình 3.20. Hàm lượng kháng thể IgA
1
trong HTBT và bệnh nhân
ung thư khi định lượng bằng kỹ thuật LECTIN-ELISA 68
Hình 3.21. Kết quả bắt giữ IgG của lectin đậu dao biển ConM 71
Hình 3.22. Sơ đồ tạo cột ConM-Sepharose-4B 72
Hình 3.23. Quy trình tinh chế IgG 73

Hình 3.24. Các phân đoạn IgG từ cột sắc kí ConM-Sepharose-4B
và cột ProteinA-Sepharose-4B 74


Hình 3.25. Điện di SDS - PAGE đánh giá độ tinh sạch của chế phẩm IgG 76
Hình 3.26. Đồ thị chuẩn IgG 77
Hình 3.27. Thăm dò độ pha loãng của HT và nồng độ ConM gắn bản 78

Hình 3.28. Hiệu suất bắt giữ IgG của bộ sinh phẩm xét nghiệm LECTIN-ELISA
theo thời gian bảo quản ở 4
0
C 80
Hình 3.29. Đường biểu diễn sự thay đổi hấp phụ quang theo nồng độ IgG
trong vùng dưới 3,5ng/ml bằng kỹ thuật LECTIN-ELISA 83
Hình 3.30. Hàm lượng IgG trong HTBT và bệnh lí
khi định lượng bằng kỹ thuật LECTIN-ELISA 85
Hình 3.31. ConG bắt giữ AFP 87
Hình 3.32. ConG bắt giữ IgG 88
Hình 3.33. Lectin đậu gươm ConG nhận dạng các kháng nguyên AFP từ huyết
thanh bệnh nhân ung thư gan, viêm gan siêu vi trùng và thai phụ 90

MỤC LỤC

Trang
CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. KHÁNG THỂ DỊCH THỂ 3
1.1.1. Khái niệm 3
1.1.2. Cấu trúc chung của các kháng thể 3
1.1.3. Chức năng sinh học của kháng thể 4
1.1.4. Lớp và các phân lớp của kháng thể 5
1.1.5. Biểu hiện bất thường của kháng thể trong bệnh lí 6
1.2. AFP và UNG THƯ 7
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu và sự biến đổi sinh lí của AFP huyết thanh 7
1.2.2. Tính không đồng nhất trong chuỗi đường của các loại AFP 8
1.2.3. Chức năng của AFP 9
1.2.4. Hàm lượng AFP huyết thanh ở bệnh gan mạn tính
và một số bệnh khác 10
1.3 LECTIN 11

1.3.1. Lược sử nghiên cứu lectin 11
1.3.2. Sự phân bố của lectin trong sinh giới 14
1.3.3. Một số tính chất lí hoá của lectin 15
1.3.4. Một số tính chất sinh học và miễn dịch của lectin 18
1.3.5. Ứng dụng của lectin 20
1.3.6. Vài nét về nghiên cứu lectin ở Việt Nam 24

Chương 2. NGUYÊN LIỆU và PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26


2.1. NGUYÊN LIỆU 26
2.1.1. Hạt mít 26
2.1.2. Hạt đậu 27
2.1.3. Huyết thanh, hồng cầu người 27
2.2. HOÁ CHẤT và THIẾT BỊ 28
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2.3.1. Xác định hoạt độ lectin 28
2.3.2. Xác định hàm lượng protein 29
2.3.3. Tinh chế lectin 30
2.3.4. Điều chế các cột sắc kí ái lực 31
2.3.5. Tinh chế kháng thể 32
2.3.6. Kỹ thuật ELISA 33
2.3.7. Kỹ thuật thẩm tách miễn dịch (Western blotting) 36
2.3.8. Kỹ thuật điện di 37
Chương 3. KẾT QUẢ và BÀN LUẬN 38
3.1. TINH CHẾ LECTIN JACALIN TỪ BA LOÀI MÍT (A. heterophyllus Lamk; A. chempeden
Gagn. và A. masticata Gagn.), LECTIN ConM TỪ HẠT ĐẬU DAO BIỂN (Canavalia maritima
Aublet) và LECTIN ConG TỪ HẠT ĐẬU GƯƠM (Canavalia gladiata Jacq D.C.) 38
3.1.1. Tinh chế lectin jacalin từ ba loài mít (A. heterophyllus Lamk;
A. chempeden Gagn. và A. masticata Gagn.) 38

3.1.2. Tinh chế lectin ConM từ hạt đậu dao biển (Canavalia maritima Aublet) 43
3.1.3. Tinh chế lectin ConG từ hạt đậu gươm (Canavalia gladiata Jacq D.C.) 50
3.2. BƯỚC ĐẦU SỬ DỤNG LECTIN MÍT ĐỂ TẠO BỘ SINH PHẨM XÁC ĐỊNH IgA
1
TỪ HUYẾT
THANH NGƯỜI 53
3.2.1. Tinh chế IgA
1
bằng cột Jacalin-Sepharose-4B tự chế tạo 54
3.2.2. Thiết kế bộ sinh phẩm định lượng IgA
1
bằng kỹ thuật LECTIN-ELISA 59
3.2.3. Định lượng IgA
1
trong HT người bằng kỹ thuật LECTIN-ELISA 68

3.3. BƯỚC ĐẦU SỬ DỤNG LECTIN ConM ĐỂ TẠO BỘ SINH PHẨM XÁC ĐỊNH IgG TỪ HUYẾT
THANH NGƯỜI 70


3.3.1. Nghiên cứu khả năng bắt giữ kháng thể IgG từ huyết thanh của ConM 70
3.3.2. Tinh chế kháng thể IgG từ huyết thanh người bằng cột
ConM-Sepharose-4B tự tạo 72
3.3.3. Thiết kế bộ sinh phẩm định lượng IgG từ huyết thanh bằng kỹ thuật
LECTIN- ELISA 77
3.3.4. Sử dụng lectin ConM xác định hàm lượng KT IgG bằng kỹ thuật
LECTIN-ELISA 85
3.4. ỨNG DỤNG LECTIN ConG TỪ HẠT ĐẬU GƯƠM (Canavalia gladiata Jacq D.C.) ĐỂ BẮT GIỮ,
PHÂN BIỆT CÁC LOẠI KHÁNG NGUYÊN AFP TỪ HUYẾT THANH NGƯỜI UNG THƯ
GAN, VIÊM GAN SIÊU VI TRÙNG VÀ THAI PHỤ 87

3.4.1. Nghiên cứu khả năng bắt giữ AFP của lectin ConG từ hạt đậu gươm
(Canavalia gladiata Jacq D.C.) 87
3.4.2. Nghiên cứu khả năng bắt giữ kháng thể trong huyết thanh của ConG
88
3.4.3. Sử dụng lectin ConG để nhận dạng các kháng nguyên AFP bệnh lí 89
3.5. BÀN LUẬN 91
KẾT LUẬN 96
ĐỀ NGHỊ 98
CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN 99
TÀI LIỆU THAM KHẢO 100
PHỤ LỤC 110











MỞ ĐẦU

Sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể người bình thường và của các bệnh nhân
nhiễm trùng, đặc biệt là các bệnh nhân ung thư rất đa dạng và phức tạp. Khả năng đáp
ứng miễn dịch của cơ thể được biểu hiện là sự tăng cường tổng hợp kháng thể hoặc
xuất hiện một số kháng nguyên chỉ thị bệnh đã được nhiều nhà khoa học Y học quan
tâm nghiên cứu. Mục đích của các nghiên cứu theo hướng này là xác định sự biểu

hiện bất thường của một số kháng thể và kháng nguyên chỉ thị bệnh nhằm chẩn đoán
bệnh sớm, theo dõi điều trị giúp cho chữa bệnh kịp thời và hiệu quả.
Có rất nhiều phương pháp và kỹ thuật xét nghiệm được sử dụng để nghiên
cứu sự thay đổi đáp ứng đó như: ELISA, RIA, DOT-BLOT, Western BLOT, các
kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch sử dụng kháng thể đặc hiệu nhận biết các kháng
nguyên bệnh hoặc nhận biết các kháng thể bệnh lí xuất hiện, Kháng thể bệnh lí
xuất hiện trong đáp ứng miễn dịch thường là một lớp kháng thể riêng biệt biểu
hiện bất thường về số lượng và chất lượng, chẳng hạn các kháng thể đã bị cải
biến sau tổng hợp như thoái hoá hoặc tăng khả năng glycosyl hoá (loại bỏ hoặc
gắn thêm các gốc đường), thậm chí có sự thay đổi thoái hoá đứt gãy cấu trúc hoá
học protein của phân tử (như mảnh peptide Bence-Jones chuỗi nhẹ ở bệnh ung
thư đa u tuỷ xương dòng tế bào B)…Tất cả những thay đổi về đáp ứng miễn dịch
và hoá sinh cần phải được phân tích chính xác và bằng những kỹ thuật xét
nghiệm đặc hiệu để phát hiện sớm sự biểu hiện của bệnh.
Lectin, một dạng glycoprotein tự nhiên có mặt rất phổ biến ở nhiều nguồn tài
nguyên sinh vật như động vật, thực vật và vi sinh vật đã được các nhà khoa học phát
hiện và nghiên cứu từ trên 100 năm nay (từ năm 1888). Trong nhiều năm nghiên
cứu, các nhà khoa học đã chứng minh lectin có rất nhiều ứng dụng trong Y dược
học. Đặc biệt trong những năm cuối cùng của thể kỉ XX, người ta đã sử dụng sự
tương tác đặc hiệu rất tinh vi của lectin với các kháng thể và kháng nguyên (do bản
chất hoá học của lectin là những protein liên kết đặc hiệu với các gốc đường của
nhiều loại kháng thể và kháng nguyên có cấu trúc đường riêng biệt) để nghiên cứu
sự biểu hiện của kháng thể, kháng nguyên trong đáp ứng miễn dịch.


Mục tiêu đề tài
Lựa chọn, tinh chế một số loại lectin từ thực vật tương tác đặc hiệu với
kháng thể, kháng nguyên để xác định sự biểu hiện của kháng thể IgA
1
, IgG và

kháng nguyên AFP từ huyết thanh của người bình thường, một số bệnh nhân: Ung
thư vòm họng, đa u tuỷ xương, ung thư gan và viêm gan siêu vi trùng.
Nội dung của đề tài
1. Tinh chế lectin (jacalin) từ 3 loài mít (Artocarpus heterophyllus Lamk;
Artocarpus masticata Gagn. và Artocarpus champeden Gagn.) của Việt Nam và sử
dụng jacalin để thiết kế bộ sinh phẩm định lượng kháng thể IgA
1
từ huyết thanh
người.
2. Xây dựng quy trình, tinh chế lectin ConM, ConG từ 2 loài đậu (Canavalia
maritima Aublet và Canavalia gladiata Jacq D.C.) của Việt Nam để thiết kế bộ sinh
phẩm định lượng kháng thể IgG từ huyết thanh người, phân biệt kháng nguyên AFP
(Alpha Feto Protein) của bệnh nhân ung thư gan, viêm gan siêu vi trùng và thai phụ.
Những đóng góp mới của luận án
1. Lần đầu tiên phát hiện ra lectin ConM từ hạt đậu dao biển Việt Nam
(Canavalia maritima Aublet) có khả năng bắt giữ đặc hiệu với kháng thể IgG từ
huyết thanh người.
2. Lần đầu tiên phát hiện ra lectin ConG từ hạt đậu gươm Việt Nam (Canavalia
gladiata Jacq D.C.) có khả năng bắt giữ và phân biệt được các loại kháng nguyên
AFP từ huyết thanh bệnh nhân ung thư gan, viêm gan siêu vi trùng và thai phụ.
3. Bước đầu nghiên cứu tạo hai bộ sinh phẩm để định lượng kháng thể IgA
1
,
IgG từ huyết thanh người và nghiên cứu điều kiện bảo quản bộ sinh phẩm trong thời
gian 4 tháng vẫn cho giá trị sử dụng.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình tinh chế lectin ConM từ hạt đậu dao biển
Việt Nam (Canavalia maritima Aublet) và đặc tính liên kết đặc hiệu giữa lectin
ConM với kháng thể IgG từ huyết thanh người.
2. Tinh chế lectin ConG từ hạt đậu gươm Việt Nam (Canavalia gladiata Jacq

D.C.) và chứng minh được các isolectin ConG nhận biết riêng biệt 3 dạng kháng
nguyên AFP của bệnh nhân ung thư gan, viêm gan siêu vi trùng và của thai phụ.
3. Đã bước đầu thiết kế được 2 bộ sinh phẩm LECTIN-ELISA (Jacalin-ELISA
và ConM-ELISA) để định lượng kháng thể IgA
1
và IgG.



Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. KHÁNG THỂ DỊCH THỂ
1.1.1. Khái niệm
Trong quá trình đáp ứng miễn dịch của cơ thể, khi những tế bào bạch cầu của hệ
miễn dịch nhận thông tin được tiếp xúc với kháng nguyên (KN) sẽ sản xuất ra những
chất đặc hiệu chống lại KN ấy. Những chất đó được gọi là kháng thể (KT), hay
globulin miễn dịch (Immuno globulin, viết tắt là Ig). Loại KT thứ nhất được đổ vào
dịch nội môi, đó là KT dịch thể, loại KT này do tế bào plasma dạng biệt hoá sau cùng
của tế bào B sản xuất. Loại KT thứ hai nằm ngay trên màng của những tế bào B sinh
ra nó, đó là KT màng tế bào và đóng vai trò thụ thể của những tế bào này. Phản ứng
kháng thể với kháng nguyên có tính đặc hiệu hoá học cao. Ở người có 5 lớp kháng
thể là IgG, IgA, IgM, IgD và IgE [1].
Hàm lượng các lớp kháng thể trong hệ thống dịch thể của cơ thể phụ thuộc
vào trạng thái sinh lí, tuổi, giới tính, điều kiện địa lí. Ngoài ra còn có một số mối
quan hệ về số lượng và chất lượng của các KT đối với sự biểu hiện bệnh lí như: Một
số bệnh ung thư, nhiễm trùng và một số bệnh tự miễn. Trong huyết thanh, thành
phần kháng thể chiếm khoảng 20% tổng lượng protein. Ngày nay nhờ những tiến bộ
trong lĩnh vực sinh học phân tử, người ta đã hiểu ngày càng sâu và đầy đủ về cấu
trúc, chức năng của các phân tử KT [15],[35].
1.1.2. Cấu trúc chung của các kháng thể
Tất cả các KT đều có bản chất là glycoprotein, mỗi phân tử đều có 2 chuỗi nhẹ

và 2 chuỗi nặng [36].
* Hai chuỗi nhẹ (ngắn) kí hiệu là chuỗi L (light chain) có khối lượng phân tử
khoảng 25-28 kDa, mỗi chuỗi có khoảng 221- 312 amino acid. Chuỗi L gồm 2 loại
là  hoặc .
Chuỗi nhẹ được hình thành từ hai vùng khu vực là khu vực không
biến đổi (C hoặc C ) và khu vực dễ biến đổi (V và V):
- Vùng không biến đổi có các gốc amino acid từ vị trí 108 đến tận cùng C, rất
ít thay đổi về thành phần và trật tự sắp xếp các amino acid.
- Vùng biến đổi có thứ tự amino acid từ vị trí 107 đến tận cùng N của chuỗi
polypeptide.


* Hai chuỗi nặng (dài) được kí hiệu là chuỗi H (heavy chain), mang tính chất
đặc trưng riêng của từng lớp KT. Khối lượng phân tử khoảng 50-57 kDa, mỗi chuỗi
chứa 440 - 460 amino acid. Chuỗi nặng gồm khu vực N tận cùng dễ biến đổi (V
H
)
và 3 khu vực không biến đổi C
H
(đối với IgD, IgG và IgA) hoặc 4 khu vực không
biến đổi (đối với IgM và IgE). Khu vực không biến đổi của chuỗi nặng kí hiệu là
C
H
. Mỗi một khu vực biến đổi gồm 3 vùng siêu biến (hypervariable), còn gọi là các
vùng xác định bổ sung (CDR). Các paratop được hình thành từ những vị trí đặt kề
nhau trong khoảng không của các vùng siêu biến được tách biệt nhau bằng hai vùng
bảo thủ hơn (hoặc các vùng khuôn). Vùng nằm giữa hai khu vực CH
1
và CH
2

của
chuỗi H được gọi là vùng khớp hay vùng bản lề, đảm bảo cho tính mềm dẻo của các
phân tử KT, đồng thời hai cánh tay (VL, CL,VH, CH
1
) của phân tử có thể di động
trong không gian.

Các chuỗi nặng của KT luôn luôn được kết hợp với các gốc đường ở các vị trí
khác nhau. Nhìn chung, các gốc đường kết hợp với KT là các oligosaccharide có
chứa một hoặc nhiều gốc sialic acid. Ở cùng một chuỗi nặng có thể có sự khác nhau
về kiểu kết hợp với các gốc đường, từ đó sẽ tạo ra mức độ bổ sung cho tính chất
khác biệt phân tử của các KT. Chẳng hạn, cấu trúc đường của IgG khác với IgA và
IgD, cấu trúc đường của phân lớp IgA
1
khác với IgA
2
. Sự thay đổi bất thường của
các gốc đường này sẽ gây ra một số bệnh tự miễn (autoimmune disease) hoặc biểu
hiện của bệnh ung thư [15],[47],[71].
1.1.3. Chức năng sinh học của kháng thể
Hình 1.1. Cấu tạo chung của kháng thể.



Chức năng sinh học của phân tử KT trong hệ thống miễn dịch là nhận biết "cái
lạ" được gọi chung là kháng nguyên ngoại lai và tác động lên "cái lạ" đó[67].
Vùng V là vị trí của phân tử KT làm nhiệm vụ nhận biết "cái lạ" còn vùng C
làm nhiệm vụ tương tác với các phân tử, tế bào khác để hoàn thành một cách có
hiệu quả việc loại trừ yếu tố lạ.
1.1.3.1. Chức năng nhận biết kháng nguyên

Chức năng nhận biết của kháng thể được thực hiện thông qua việc phân tử KT
kết hợp đặc hiệu với nhóm quyết định kháng nguyên (epitop). Vị trí kết hợp nằm ở
vùng V của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, đầu tận cùng - NH
2
. Ở đó chuỗi polypeptide
được gấp lại và tạo ra cấu trúc nếp gấp, trong đó có những đoạn tương đối ổn định
xen giữa những vòng cực kì thay đổi. Những vòng này cụm sát lại gần nhau ở đầu
mút (tận cùng N) tạo ra một cái túi trong đó các phân tử nhỏ của nhóm quyết định
kháng nguyên có thể lọt khít vào.
Nhờ khả năng kết hợp đặc hiệu mà KT có thể tác động trực tiếp lên KN, ví dụ
như trường hợp trung hoà độc tố hoà tan do vi khuẩn tiết ra. Bằng cách kết hợp với
các quyết định KN nằm trong hoặc gần vị trí hoạt động của độc tố, các phân tử KT
phong bế phản ứng của độc tố với cơ thể. Sự kết hợp kháng thể với các quyết định
kháng nguyên sẽ làm thay đổi cấu hình không gian của độc tố, làm thay đổi hoạt tính
và độc tố không thể bám vào tế bào của tổ chức đích. Tác dụng trực tiếp cũng có thể
xảy ra khi 2 cánh tay Fab của phân tử KT tạo ra mạng lưới ngưng kết đối với vi
khuẩn, kí sinh trùng,… nhờ đó hạn chế khả năng gây bệnh của chúng.
1.1.3.2. Chức năng sinh học có hiệu quả thứ phát của kháng thể
Các chức năng sinh học có hiệu quả khác của KT được xem như chức năng
thứ phát, vì nó xảy ra sau khi domain V kết hợp đặc hiệu với KN. Các chức năng
này được thực hiện thông qua trung gian mảnh Fc của phân tử KT.
+ Chức năng hoạt hoá bổ thể: KT kết hợp đặc hiệu với KN hình thành phức
hợp KN- KT. Việc kết hợp với kháng nguyên đã làm thay đổi cấu hình không gian
của phân tử KT và bộc lộ vị trí kết hợp bổ thể. Khả năng hoạt hoá bổ thể chỉ có ở
IgG và IgM, nhưng không phải tất cả đều như nhau mà phụ thuộc vào cấu trúc của
mỗi loại.
+ Tương tác với các tế bào khác:
Phần Fc của KT có khả năng gắn vào thụ thể (receptor) trên bề mặt một số tế
bào như tế bào mast, bạch cầu ái kiềm, các đại thực bào và bạch cầu trung tính.

Phần Fab của KT để nhận biết, kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên lạ, trên cơ sở
đó kháng nguyên bị bao vây, khu trú lại.
1.1.4. Lớp và các phân lớp của kháng thể
Căn cứ vào đặc điểm cấu tạo phân tử của các chuỗi nặng người ta phân ra làm 5
lớp KT: Chuỗi nặng gamma () cho IgG, chuỗi nặng alpha () cho IgA, chuỗi nặng
muy () cho IgM, chuỗi nặng delta () cho IgD, chuỗi nặng epsilon () cho IgE.
Bảng 1.1. Một số đặc tính cơ bản của 5 lớp kháng thể người[15]
Các
KT
Các
lớp
phụ
Khối
lượng
phân tử
(kDa)
Nồng độ
trong huyết
thanh
(mg/100ml)
Chức năng sinh học
IgG
IgG
1

IgG
2

IgG

3

IgG
4
150-170
800-1700
Nhận biết virus, vi khuẩn độc tố.
Hoạt hoá bổ thể.
Liên kết với thụ thể
Qua màng nhau thai.
IgM

970, dạng
pentame
.
♂: 50-250
♀: 60-270
XuÊt hiÖn ®Çu tiªn sau khi kÝch thÝch KN.
Ng-ng kÕt hång cÇu, vi khuÈn, virus.
Liªn kÕt víi KN, ho¹t ho¸ bæ thÓ.
IgA
IgA
1

IgA
2
160
320 (dạng
dimer)
♂: 100-400

♀: 85-450
Chống lại vi khuẩn, virus, nguyên sinh
động vật nhờ có mặt ở tuyến nhầy.
Hoạt hoá bổ thể theo con đường xen kẽ.
Tham gia vào opsonin hoá khi phản ứng
với thụ thể
IgD

175
<10
Chủ yếu tìm thấy ở tế bào B, có thể khi tiếp
xúc với KN, truyền tín hiệu hoạt hoá tế bào B
IgE

190
<0,03
Tham gia phản ứng viêm dị ứng, quá mẫn
khi liên kết với tế bào mast.

1.1.5. Biểu hiện bất thường của kháng thể trong bệnh lí
+ Biểu hiện bất thường thứ nhất là: Hàm lượng KT đơn dòng trong huyết
thanh tăng lên nhanh chóng ở nhiều bệnh ung thư. Các KT đơn dòng biểu hiện
thường là IgG và IgM, nhưng cũng có thể là IgA (ví dụ bệnh đa u tuỷ xương dòng
IgA, bệnh ung thư cổ tử cung). Đôi khi sự tăng các KT đơn dòng cũng được thấy


đối với các lớp kháng thể IgD và IgE, nhưng rất hiếm. Đối với các dưới lớp IgG thì
các đơn dòng tăng ưu thế là IgG
1
> IgG

2
> IgG
3
> IgG
4
.
Biểu hiện tăng đơn dòng của các KT còn thấy rõ ở tính bất thường trong cấu
trúc của kháng thể. Đó là sự tổng hợp quá mức các mảnh protein chuỗi nhẹ dạng
dimer là protein Bence-Jones (BJP), có thể phát hiện được dễ dàng trong điện di lớp
mỏng agarose [15],[28].
+ Biểu hiện bất thường thứ hai là: Sự thay đổi cấu trúc đường của phân tử KT.
Việc nghiên cứu cấu trúc phân tử KT trong bệnh ung thư (tăng sinh miễn dịch) cho
phép hiểu được sự thay đổi cấu trúc đường của các đơn vị dòng IgA và IgG. Bệnh
biểu hiện rõ nhất là chuỗi nặng  (của IgA) đơn dòng có mức độ kết hợp đường rất
cao (glycosylation), nghĩa là ở chuỗi nặng được gắn thêm các gốc đường. Hậu quả
của bệnh chuỗi nặng của IgA trong bệnh đa u tuỷ xương đã tạo ra sự đóng cặn
nhiều chuỗi nặng ở tiểu cầu thận, gây tổn thương thận nghiêm trọng. Sự thay đổi cấu
trúc đường của một số IgA, IgG làm biến đổi đặc tính ái lực hoá học của kháng thể
đối với một số hoạt chất tự nhiên, đặc biệt là các lectin có nguồn gốc từ động vật hoặc
thực vật. Đó là những nghiên cứu của Allen A.C. và các cộng sự [41] về sự thay đổi
cấu trúc đường của phân tử KT IgA
1
trong bệnh viêm cầu thận.
Sự thay đổi cấu trúc đường của các IgG trong bệnh đa u tuỷ xương cũng đã
được chứng minh. Trên phân tử IgG của bệnh nhân đa u tuỷ xương có gắn thêm 2
phân tử đường trên chuỗi nặng, nhưng thiếu hụt sialic acid và không có nhóm Glc-
NAc-1. Sự biến đổi các chuỗi đường này xảy ra ở protein Bence-Jones (BJP), bắt
nguồn từ phân tử IgG và ở cả các chuỗi nặng của IgA trong một số bệnh ung thư [41].
Như vậy, những biểu hiện của các kháng thể đơn dòng cũng có thể được sử
dụng để theo dõi tình trạng bệnh ung thư bằng các loại lectin gây ngưng kết đặc

hiệu đường đối với chúng, giúp cho việc phân biệt các loại bệnh ung thư khác nhau
cũng như các bệnh truyền nhiễm khác.
1.2. AFP VÀ UNG THƯ
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu và sự biến đổi sinh lí của AFP huyết thanh
Năm 1963, Abelev G.I.[38] tìm thấy AFP ở chuột nhắt bị ung thư gan trong
thực nghiệm. Một năm sau, Tatarinov Y.S.[97] lần đầu tiên tìm thấy AFP ở bệnh
nhân ung thư gan và từ đó trở đi AFP trở thành một dấu ấn ung thư đầu tiên được
ứng dụng rộng rãi giúp chẩn đoán ung thư gan. AFP người là một glycoprotein có


cấu trúc phân tử là một chuỗi polypeptide khối lượng phân tử vào khoảng 70 kDa
và chứa 4% carbohydrate.
Phân tử AFP là một chuỗi polypeptide gồm 550 amino acid, tạo thành 3
domain. Dựa vào KT đơn dòng người ta đã phát hiện trong phân tử AFP có 7
epitop, ngoài ra AFP còn mang những epitop là các oligosaccharide liên kết với
chuỗi polypeptide trong phân tử AFP. Những epitop loại này được phát
hiện bởi khả năng liên kết đặc hiệu của nó với các loại lectin như Lens hoặc ConA.

1.2.2. Tính không đồng nhất trong chuỗi đường của các loại AFP
Cuối thập kỷ 80 của thế kỷ XX, thông qua các kỹ thuật như: Điện di gel tinh bột,
điện di gel thạch, sắc kí, điện di AFP ái lực với lectin và thấm ái lực KT, người ta đã
tìm thấy sự khác nhau về thành phần carbohydrate trong phân tử AFP và đó chính là
tính không đồng nhất trong phân tử AFP[70]. Sự có mặt và sự thay đổi các thành phần
carbohydrate, mà cụ thể là sự thay đổi của các nhóm Fucose và N-Acetylglucosamine
trong phân tử AFP sẽ quyết định tới ái lực của nó với lectin (hình 1.2; 1.3; 1.4). Trong
khi đó AFP của thai phụ phần cấu trúc đường khác hẳn so với AFP bệnh lí, ở chúng
luôn có mặt các gốc NeuAc (hình 1.5). Ở những tình trạng bệnh gan khác nhau, sự
chuyển biến từ bệnh gan lành tính (viêm gan mạn, xơ gan ) sang bệnh ung thư gan ác
tính có liên quan chặt chẽ tới biến đổi cấu trúc đường của phân tử AFP và có ảnh
hưởng tới ái lực của AFP với lectin trong kỹ thuật điện di. Sau đây là một số dạng cấu

trúc đường của AFP:












Gal 
1

4GlcNAc
1

2Man
1

Gal 
1

4GlcNAc
1

2Man
1

Man
1

4GlcNAc
1

4GlcNA
1

Asn
Fu
1

Hình 1.2. Cấu trúc đường phân tử AFP ở bệnh nhân ung thư gan[70]
Gal 
1

4GlcNAc
1

2Man
1

Gal 
1

4GlcNAc
1

2Man
1

Man
1

4GlcNAc
1

4GlcNA
1

Asn
Hình 1.3. Cấu trúcđường phân tử AFP ở bệnh nhân viêm gan mạn
tính[70]





1.2.3. Chức năng của AFP
Cho tới nay chức năng của AFP chưa được biết đầy đủ, tuy nhiên có nhiều giả
thuyết cho vấn đề này:
- AFP có chức năng vận chuyển như một protein tải hoặc duy trì áp lực keo
trong huyết thanh bào thai giống như albumin ở cơ thể trưởng thành.
- AFP tham gia vận chuyển các acid béo nhiều liên kết đôi trong tế bào ung
thư cơ vân chuột cống. Đây là một yếu tố quan trọng trong chuyển hoá của bào thai
và trong một số bệnh lý, đặc biệt là ung thư.
- Người ta cũng đã phát hiện thấy chức năng gắn và vận chuyển của AFP đối
với một số cấu tử gắn (ligand) như flavonoid, steroid, phenylbutazone…[78].

- AFP có khả năng gắn kết với một số phân tử sinh học như bilirubin, hormone
thyroid, đặc biệt là AFP người có hoạt tính kháng estrogen. Điều này cho phép giải
thích vai trò bảo vệ bào thai trong việc phát triển tế bào gan ở thời kì bào thai của động
vật bậc cao do AFP phong bế tác dụng của estrogen có nguồn gốc từ mẹ[48],[49].
- Một số tác giả cho thấy AFP có vai trò ức chế một số đáp ứng miễn dịch in
vitro: AFP phân lập từ nước ối của chuột nhắt có khả năng ức chế phản ứng chuyển
Man
1

4GlcNAc
1

4GlcNA
1

Asn
Hình 1.5. Cấu trúc đường phân tử AFP ở thai phụ[102]
GlcNAc1
NeuAc
2

Galc
1

2Man
1

4GlcNAc
1

NeuAc
2

Galc
1

2Man
1

4GlcNAc
1

Man
1

4GlcNAc
1

4GlcNA
1

Asn
NeuAc
2

Galc
1

2Man
1

4GlcNAc
1

NeuAc
2

Galc
1

2Man
1

4GlcNAc
1

Gal 
1

4GlcNAc
1

2Man
1

Gal 
1

4GlcNAc
1

2Man
1

Man
1

4GlcNAc
1

4GlcNA
1

Asn
Hình 1.4. Cấu trúc đường phân tử AFP ở bệnh nhân ung thư túi noãn hoàng [103]
GlcNAc1


dạng tế bào lympho gây ra bởi các chất kích thích phân bào in vitro, hoặc do nuôi
cấy hỗn hợp lympho bào từ 2 cơ thể khác nhau cũng như ức chế đáp ứng tạo KT lần
1 và lần 2 [94],[97].
1.2.4. Hàm lượng AFP huyết thanh ở bệnh gan mạn tính và một số bệnh khác
AFP trong ung thư là một vấn đề hấp dẫn nhiều nhà nghiên cứu. Lúc đầu
người ta chỉ tập trung vào mức độ thay đổi hàm lượng AFP của huyết thanh. Nhưng
về sau, nhờ tạo các mô hình ung thư thực nghiệm trong nuôi cấy tế bào ung thư in
vitro người ta đã hiểu biết thêm về AFP và sự tồn tại của receptor AFP trên tế bào
ung thư.
Ở Việt Nam, nồng độ AFP của người trưởng thành khoẻ mạnh là
2,871,97ng/ml. Trong điều kiện sinh lí bình thường thì nồng độ AFP ở nam giới cao
hơn nữ giới và cũng tăng dần theo tuổi nhưng không nhiều[13].

Năm 1964, Tatarinov và cộng sự đã phát hiện thấy AFP tăng cao trong huyết
thanh bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan, từ đó ở nhiều nước trên thế giới người
ta đã sử dụng xét nghiệm AFP huyết thanh để chẩn đoán, theo dõi kết quả điều trị
và tiên lượng cho bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan. Đặc biệt phương pháp này
có giá trị để chẩn đoán sàng lọc sớm bệnh ung thư biểu mô tế bào gan khi các triệu
chứng lâm sàng chưa biểu hiện đầy đủ và rõ ràng [5],[13],[99].
AFP không chỉ tăng trong ung thư gan, mà còn tăng trong một số bệnh ung thư
khác như: Ung thư buồng trứng, tinh hoàn, dạ dày, đại tràng, phổi. Tuy nhiên vai trò
của AFP ở các bệnh ung thư ngoài gan chưa được nghiên cứu đầy đủ[39].
AFP huyết thanh không chỉ tăng trong ung thư gan mà còn tăng nhẹ trong các
bệnh gan mạn tính. Các công trình nghiên cứu trên thế giới cũng như ở Việt Nam
đều cho thấy nồng độ AFP huyết thanh ở bệnh nhân ung thư gan tăng cao một cách
đáng kể.
Nồng độ AFP huyết thanh tỷ lệ thuận với kích thước của khối u. Nồng độ này
giảm dần khi kích thước của khối u nhỏ đi. Nomura và cộng sự [83] đã xác định
nồng độ AFP huyết thanh của 606 bệnh nhân ung thư gan với các kích thước khối u
khác nhau, kết quả cho thấy với kích thước khối u nhỏ hơn 3 cm thì độ nhạy AFP
chỉ còn là 59,6%. Tuy nhiên vẫn có khoảng 6,4 % bệnh nhân với khối u nhỏ (dưới 2
cm) mà nồng độ AFP huyết thanh vẫn cao (từ 1000-5000ng/ml). Nhiều tác giả cũng
đã nghiên cứu về mối liên quan giữa nồng độ AFP huyết thanh với độ biệt hoá của
tế bào gan. Kết quả cho thấy nồng độ AFP huyết thanh trong các trường hợp ung


thư gan có độ biệt hóa tế bào thấp (Poorly differentiated HCC) và độ biệt hoá vừa
(Moderate differentiated HCC) tăng cao hơn so với ung thư gan có độ biệt hoá cao
(Well differentiated HCC). Mặt khác ở bệnh nhân ung thư gan có kích thước khối u
nhỏ (nhỏ hơn 2 cm) thường lại có độ biệt hoá cao. Do vậy trong việc tiên lượng
bệnh mức độ biệt hoá của các tế bào quan trọng hơn kích thước khối u ung thư gan.
Thời gian sống của những bệnh nhân ung thư gan có nồng độ AFP huyết thanh
tăng cao thường là ngắn hơn so với bệnh nhân có nồng độ AFP huyết thanh thấp.

Nomura F. và cộng sự [83] còn thấy rằng nồng độ AFP huyết thanh ở bệnh nhân
ung thư gan có kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B [HBsAg(+)] cao hơn so với
nồng độ AFP huyết thanh ở bệnh nhân ung thư gan không có kháng nguyên bề mặt
virus viêm gan B [HBsAg(-)].
Nhiều tác giả đã đề cập đến vai trò của AFP huyết thanh trong việc chẩn đoán,
theo dõi và tiên lượng kết quả điều trị (phẫu thuật, hoá chất ) ở bệnh nhân bị ung thư
gan [13], [81]. Sau khi điều trị, nếu nồng độ AFP huyết thanh giảm xuống hoặc trở về
bình thường chứng tỏ việc điều trị có kết quả. Ngược lại nếu nồng độ AFP huyết
thanh không giảm hoặc lại tăng cao hơn trước khi điều trị thì chứng tỏ điều trị không
có hiệu quả. Trường hợp sau điều trị nồng độ AFP huyết thanh đang giảm thấp nhưng
sau đó tăng cao, chứng tỏ là ung thư tái phát. Tuy nhiên, hiện tượng này không hoàn
toàn đúng với mọi trường hợp. Hiện nay đã có marker liên kết lectin đặc hiệu hơn
(AFP- L3) để kiểm tra thực trạng trong trường hợp này [98],[99],[100],[102].
Giá trị của xét nghiệm AFP huyết thanh trong việc phát hiện sớm ung thư gan
ở các bệnh nhân viêm gan mạn tính, đặc biệt là các bệnh nhân có nồng độ AFP
huyết thanh tăng cao cũng được nhiều tác giả nghiên cứu[9].
Tóm lại: AFP huyết thanh là một dấu ấn ung thư hữu ích giúp chẩn đoán ung
thư gan. Tuy nhiên, điều đáng chú ý nhất là vẫn có một số bệnh nhân ung thư gan
có AFP không tăng (<20ng/ml) và trong giai đoạn đầu ung thư gan (khi khối u còn
nhỏ) hàm lượng AFP huyết thanh thấp hoặc không tăng. Những đặc điểm này của
AFP đã hạn chế khả năng chẩn đoán chính xác, làm giảm độ nhạy cũng như độ đặc
hiệu trong chẩn đoán ung thư gan.
Vì vậy nếu chỉ dựa vào việc định lượng AFP huyết thanh (kể cả thêm siêu âm)
thì sẽ cho hiệu quả thấp trong việc chẩn đoán sớm bệnh ung thư gan. Do đó cần
phải kết hợp với những kỹ thuật xét nghiệm khác cùng với AFP huyết thanh [68].
1.3. LECTIN


1.3.1. Lược sử nghiên cứu lectin
Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học

(bioactive compounds) từ các cơ thể sinh vật như các chất có hoạt tính kháng sinh,
các hormone, các độc tố có ứng dụng trong thực tiễn, các enzyme và các chất kìm
hãm enzyme từ nguồn động thực vật và vi sinh vật v.v… phát triển rất mạnh. Lectin,
một chất có hoạt tính sinh học được phát hiện từ hơn một thế kỷ nay (từ năm 1888)
đã và đang được nghiên cứu mạnh mẽ, sâu sắc về cấu trúc và chức năng của chúng.
Vậy lectin là gì? Tại sao các nhà Sinh học và Y học lại đặc biệt quan tâm đến
chúng?
Vào những năm 1887 và 1888 tại phòng thí nghiệm Kobert của trường Đại
học Dorpat, trên đối tượng là cây thầu dầu (Ricinus communis L.), Stillmark[69] đã
chiết xuất được chất có khả năng ngưng kết tế bào hồng cầu người, làm mất chức
năng vận chuyển oxy của chúng. Đó là một chất độc và ông gọi là ricin. Khi công
trình được công bố, ricin được đông đảo các nhà Sinh học và Y học đặc biệt quan
tâm[72]. Sau đó cũng chính nhà khoa học Stillmark lại tìm thấy một hợp chất có
tính chất tương tự như ricin, cũng là một độc tố được chiết từ hạt cây Croton tiglium
L. và ông gọi là crotin.
Năm 1891, một nhà khoa học khác là Hellin[72] cũng đã tách được một độc tố
khác trong hạt của cây cam thảo dây (Abrus precatorius L.) có khả năng làm ngưng
kết tế bào hồng cầu người, đó là abrin. Các độc tố ricin, crotin và abrin có nguồn gốc
thực vật đã thu hút sự chú ý đặc biệt của nhiều nhà khoa học cuối thế kỷ XIX.
Trong hai năm 1897 và 1898 một số nghiên cứu đã chuyển sang đối tượng là
các loài động vật. Người mở đầu hướng nghiên cứu này Edfstrand [72] và ông đã
chỉ ra rằng trong các tế bào mô thuần khiết của một số loài động vật có xương sống
cũng có những chất có đặc tính độc tố tương tự như ricin, chúng làm ngưng kết tế
bào hồng cầu của một số loài động vật: Bò, lợn, cá vược v.v….[72],[50].
Đầu thế kỷ XX, các hợp chất có tính chất đặc biệt làm ngưng kết tế bào hồng
cầu của người và một số loài động vật được phát hiện ngày một nhiều trong giới
sinh vật từ virus đến con người [72],[80].
Bên cạnh những nghiên cứu về sự tương tác của các chất kiểu ricin với tế bào
hồng cầu người theo nhóm máu, Landsteiner cùng với Raubischeck đã nghiên cứu
bản chất của các độc tố có nguồn gốc thực vật nói trên. Bằng thực nghiệm đầy tính

thuyết phục hai ông đã chỉ ra rằng: Các chất làm ngưng kết hồng cầu người và động
vật tan trong nước, bị kết tủa bởi acetone, alcohol và có thể xác định bằng phản ứng


Biure và phản ứng Xantoprotein (là các phản ứng đặc trưng của protein và các
amino acid vòng) [69]. Kể từ đó các chất độc tố kiểu ricin được thừa nhận có bản
chất protein.
Thoạt đầu các nhà khoa học nhận thấy, sự ngưng kết tế bào hồng cầu của các
độc tố trên là mang tính chọn lọc. Vì vậy Krupe [72] đã xem các chất này là KT tự
nhiên và gọi là “protein nhận biết đặc biệt”. Cũng chính năm đó, nhà khoa học
Boyd dựa trên đặc tính ngưng kết chọn lọc của các loại protein này đã gọi chúng là
“Lectin”. Thuật ngữ này xuất phát từ chữ Latin “Lectus” là động từ quá khứ của
“Legere” nghĩa là chọn lọc. Mặc dù sau này các nhà khoa học nhận thấy số lượng
các lectin có khả năng ngưng kết tế bào hồng cầu đặc hiệu nhóm máu là rất ít,
chiếm khoảng 25% tổng số các dạng lectin, song thuật ngữ này vẫn được dùng như
một thuật ngữ khoa học[72].
Trong 2 thập kỷ, từ 1950 đến 1970 ngoài các công trình khoa học mang tính
điều tra về sự phân bố của lectin, phần lớn các nhà khoa học đều tập trung vào việc
tinh chế lectin để xác định cấu tạo phân tử của chúng (cấu trúc bậc I và cấu trúc
không gian của phân tử)[54],[55]. Cùng với điều đó các nhà khoa học đồng thời
nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến hoạt tính của lectin, trên cơ sở đó tìm
cách ứng dụng lectin vào đời sống của con người. Các công trình trong thời kỳ này
được công bố khá nhiều từ 1954 đến 1965[72]. Giá trị khoa học quan trọng bậc nhất
của các công trình ở giai đoạn này là sự hoàn thiện dần qui trình tinh chế lectin. Vì
bản chất của lectin là protein và glycoprotein nên thoạt đầu quá trình tinh chế lectin
dựa trên nguyên tắc phân lập và tinh chế protein. Phương pháp được dùng chủ yếu
là sắc ký qua cột. Song lectin có khả năng tương tác đặc hiệu với đường, tức là
chúng có khả năng liên kết với một số loại đường như D-glucosamine, D-galactose,
D-mannose v.v… nên các nhà khoa học đã ứng dụng tính chất này vào quá trình
tinh chế lectin bằng sắc ký ái lực. Đây là phương pháp tinh chế lectin rất hiệu quả,

cho chế phẩm có độ tinh khiết cao. Phương pháp này hiện nay đang được sử dụng
rộng rãi tại các phòng thí nghiệm sinh học và y học của nhiều quốc gia.
Sự hoàn thiện dần phương pháp tinh chế đã đẩy nhanh tiến độ nghiên cứu
lectin từ những năm 1970 trở lại đây. Một trong những đặc tính hóa sinh quan trọng
của lectin là khả năng tương tác với các loại đường đặc biệt là các mono và
disaccharide[45]. Từ đặc điểm này khi đưa ra khái niệm về lectin, Goldstein đã viết:
"Lectin là protein và glycoprotein có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng
cầu"[104].


Khái niệm này đã nêu bật được bản chất hoá học của lectin và hai đặc tính hoá
sinh đặc trưng của chúng. Khái niệm này cũng đồng nhất với định nghĩa về lectin
mà Houston và Doyle đã đưa ra năm 1982: “ Lectin là protein tương tác đặc hiệu
đường, đặc tính cơ bản của nó là khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu”.
Các công trình khoa học công bố ngày một nhiều hơn, đa dạng hơn và sâu sắc
hơn như[72]: Liener, Kraus, Lis và Sharon, Goldstein và Etzler v.v… (Nghiên cứu
lectin có nguồn gốc thực vật bậc cao). Barondes, Olden và Parent, Yeaton,
Monsigny, Cohen v.v… (Nghiên cứu lectin có nguồn gốc động vật). Các dạng
lectin có nguồn gốc từ các loài nấm nhầy cũng đã được công bố: Công trình của
Rosie, Barondes và Haywood v.v… lectin có nguồn gốc từ cơ thể người cũng được
công bố vào thời gian này: Chilads và Feizy, Franklin, Powell và Whitmy,
Monsigny.
Gần đây, Pineau, Aucouturier, Brugier [86] đã công bố một số dạng lectin từ
các loài mít có khả năng kích thích phân chia tế bào lympho T-CD
4
+
ở người. Theo
Marrink, Sleijfer, Koops, lectin ConA tương tác rất đặc hiệu với -Fetoprotein là
dấu hiệu chẩn đoán bệnh ung thư gan và viêm gan[77],[79].
Theo các nhà khoa học Pháp, lectin từ hạt mít (Artocarpus heterophyllus

Lamk) có khả năng tương tác đặc hiệu với phân tử glycoprotein CD
4
ở bề mặt tế
bào lympho T-CD
4
+
của người, là phân tử kết hợp đặc hiệu với virus HIV trong pha
đầu tiên của sự nhiễm bệnh suy giảm miễn dịch (AIDS). Từ đó quá trình nhiễm
virus HIV có thể bị kìm hãm, hạn chế khả năng mắc bệnh[87].
Rosamaria B.R. và cộng sự [89] đã sử dụng kháng thể đơn dòng gắn bản để
nhận dạng vi khuẩn E. histolytica và E. dispar gây bệnh lị bằng kỹ thuật ELISA dựa
trên khả năng liên kết đặc hiệu của kháng thể với một số gốc đường galactose hay N-
acetyl D-galactosamine của lectin trên bề mặt của 2 loại vi khuẩn này.
Việc phát hiện ra ricin đến nay đã trên 100 năm. Trong khoảng thời gian đó
các nhà khoa học từ nhiều nước khác nhau trên thế giới đã phát hiện và tinh chế
được nhiều dạng lectin khác nhau có nguồn gốc từ các cơ thể động vật, thực vật, vi
sinh vật và cả cơ thể người. Song tất cả các nhà khoa học đều thừa nhận rằng người
chính thức mở đầu lịch sử nghiên cứu lectin là Stillmark và ricin được xem như là
lectin đầu tiên được phát hiện. Năm 1888 đã đi vào lịch sử sinh học như một mốc
đáng ghi nhớ, mở đầu cho một thời kỳ mới - thời kỳ nghiên cứu và ứng dụng lectin
phục vụ đời sống con người.
1.3.2. Sự phân bố của lectin trong sinh giới


Lectin được phân bố rộng trong sinh giới từ thực vật, động vật, đến vi sinh vật.
Allen và Brillantine [72] đã tiến hành điều tra 2663 loài thực vật thì có hơn 700 loài
ngưng kết hồng cầu nhóm máu A, B, O; trong đó cây họ Đậu chiếm nhiều nhất tới
trên 600 loài. Ngoài ra, lectin còn được tìm thấy ở họ Lan (Orchidaceae), họ Trinh
nữ (Mimosaceae), họ Thuỷ tiên (Amaryllidaceae), họ Hoà thảo (Poaceae), họ Dâu
tằm (Moraceae). Lectin có mặt rất nhiều ở thực vật bậc cao, nhưng đối với thực vật

bậc thấp thì người ta mới tìm thấy ở một số loài nấm (Fungi), địa y (Lichenes) và
tảo (Algae) [56],[63].
Các công trình khảo sát lectin ở động vật phát triển khá sớm. Lectin được tìm
thấy đầu tiên ở sam biển Châu Mỹ (Limulus polyphemus), sau đó là một số loài
sam biển Châu Á (Tachypleus tridentatus Leach)… thuộc ngành Giáp xác, Nhuyễn
thể hai mảnh vỏ, một số loài thuộc lớp Cá xương (Osteoithyes), lớp Lưỡng cư
(Amphibia), lớp Bò sát (Reptilia), lớp Chim (Aves) và lớp Thú (Mammalia). Đặc
biệt trong một số mô và cơ quan của người như mô cơ, tim, phổi và tế bào của hệ
miễn dịch cũng có lectin [63],[75].
Virus và vi khuẩn cũng có chứa lectin[91]. Hirst [72] đã phát hiện có một loài
virus có chứa hoạt chất làm ngưng kết tế bào hồng cầu gà con. Ofek phát hiện thấy
trên bề mặt vi khuẩn E.coli có chứa một hoạt chất giống lectin. Các nghiên cứu của
Gilboa Gabber cũng đã chứng minh ở trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas
aeruginosa) có hai loại lectin là PAI và PAII [57].
1.3.3. Một số tính chất lí hoá của lectin
1.3.3.1. Khối lượng phân tử lectin
Các phương pháp sàng lọc phân tử, điện di trên gel polyacrylamide, siêu ly
tâm đã cho thấy khối lượng phân tử của lectin rất khác nhau, dao động từ vài nghìn
Dalton đến vài trăm nghìn Dalton. Lectin thực vật có khối lượng phân tử vào
khoảng 55 - 120 kDa, còn ở động vật thì lớn hơn nhiều đến vài trăm kDa như lectin
của sam biển Châu Á (Tachypleus tridentatus Leach) là 700kDa[31],[32],[65].
1.3.3.2. Cấu tạo phân tử của lectin
Bản chất của lectin là protein [85], trong đó phần lớn là glycoprotein. Thành
phần carbohydrate tìm thấy trong lectin bao gồm các đường mannose, glucose,
galactose. Ngoài ra còn có Sialic acid (NANA) là dẫn xuất N - acetyl Neuramic
acid, thường nằm ở phần cuối oligosaccharide của các glycoprotein tan trong nước.
Thành phần protein gồm một hay nhiều chuỗi polypeptide kết hợp với nhau nhờ
liên kết cộng hoá trị. Mỗi loại lectin có chứa các thành phần amino acid khác nhau

nhưng phổ biến nhất là: Aspartic, serine, arginine và threonine. Các amino acid này
chiếm tới 30% toàn bộ phân tử lectin. Trong đó, các amino acid chứa lưu huỳnh như
cystein, methionine chỉ chứa một tỷ lệ thấp hoặc hầu như không có mặt trong lectin.
Có khá nhiều công trình khoa học đã chỉ ra rằng một số phân tử lectin được
cấu tạo từ một mạch polypeptide còn đa số các dạng lectin đã được nghiên cứu có
cấu tạo từ hai mạch polypeptide trở lên. Mỗi mạch polypeptide tạo thành 1 tiểu đơn
vị (subunit), các tiểu đơn vị này có khối lượng phân tử giống nhau hoặc khác nhau
[96].
Năm 1995, Peuman và Van Dame [85] đã đưa ra một số khái niệm mới về cấu
trúc liên quan đến chức năng của lectin do những tiến bộ trong việc tách dòng phân
tử các lectin và những protein có quan hệ với lectin. Dựa vào cấu trúc phân tử và
biểu hiện hoạt tính sinh học có thể phân chia lectin làm 3 loại:
- Merolectin có khối lượng phân tử tương đối nhỏ và chỉ có một trung tâm
liên kết với đường, không có hoạt tính ngưng kết tế bào và không gây kết tủa các
hợp chất liên hợp đường (glycoconjugates). Thuộc về loại này là một số protein của
các cây họ Lan (Orchidaceae).
- Hololectin có chứa ít nhất hai trung tâm liên kết với đường, làm ngưng kết
tế bào và gây kết tủa do tương tác với nhiều chất cộng hợp đường. Đó chính là các
lectin quen thuộc đã được nghiên cứu nhiều nhất, dễ phát hiện nhất vì khả năng gây
ngưng kết tế bào của chúng và thường được gọi là haemagglutinin.
- Chimerolectin là những phân tử trong đó có ít nhất một vị trí liên kết với
đường và có một vùng chức năng sinh học khác (có thể là chức năng xúc tác sinh
học). Thuộc về loại này là protein kìm hãm ribosom typ 2 (RIP, Type 2) ở hạt thầu
dầu (Ricinus communis L.,) và hạt cây Abrus precatorius L. bao gồm hai chuỗi
polypeptide : Chuỗi A có hoạt tính xúc tác ARN-N-glycosidase, có tác động loại đi
phân tử purin trên ARN của hạt riboxom gây bất hoạt riboxom và làm ngừng tổng
hợp protein; chuỗi B có hoạt tính ngưng kết tế bào, và liên kết đặc hiệu với
galactose, liên kết với màng tế bào để tạo điều kiện cho chuỗi A thâm nhập gây độc
cho tế bào đích. Hai chuỗi A và B của RIP 2 nối với nhau bằng các liên kết disulfide
và các liên kết cộng hoá trị khác. Tuy nhiên theo quan niệm của Peuman và Van

Dame chuỗi B ở phần lớn các phân tử RIP 2 đã được nghiên cứu chỉ có trung tâm
liên kết carbohydrate(trừ ricin và abrin) nên chúng không có hoạt tính lectin như các
hololectin [85]. Như vậy, theo hai ông, chỉ có hololectin mới được coi là một lectin


thực sự, còn ricin và abrin tuy có hai trung tâm liên kết đường và có hoạt tính xúc
tác ARN-N-glycosidase chỉ là một ngoại lệ của lectin.
Bất kỳ một dạng lectin nào dù có cấu trúc bậc I hoặc có cấu trúc không gian
phức tạp đều chứa trung tâm hoạt động, đó là trung tâm liên kết carbohydrate, chính
trung tâm này quyết định hoạt độ lectin. Nếu như ở enzyme, trung tâm hoạt động
của chúng là các gốc amino acid hoặc phần phi protein (các coenzyme) thì ở hầu hết
các lectin trung tâm hoạt động của chúng là do một số gốc amino acid như tyrosine,
serine, threonine, tryptophan v.v….có khả năng liên kết mạnh với các gốc đường
tạo nên.
Trong phân tử lectin còn có các ion kim loại, hay gặp nhất là Ca
2+
và Mn
2+
.
Các ion này không trực tiếp tham gia vào trung tâm liên kết lectin - saccharide
nhưng lại rất cần cho sự tương tác giữa lectin và các gốc đường, chúng có ảnh
hưởng tới cấu trúc không gian của phân tử lectin và trung tâm liên kết saccharide.
Vậy mỗi phân tử lectin chứa bao nhiêu trung tâm hoạt động? Các nhà khoa
học đã khẳng định, mỗi phân tử lectin phải có từ 2 trung tâm hoạt động trở lên. Do
đó lectin là phân tử có cấu trúc đa trị (polyvalent).
Khi một trong các trung tâm hoạt động bị biến đổi thì sự tương tác giữa các
trung tâm này không xảy ra, điểm tiếp nhận không hình thành và phân tử lectin mất
hoạt tính[61]. Phân tử lectin từ hạt đậu tương (Glycine max L.) có hai trung tâm
hoạt động, phân tử lectin từ loài Lotus tetragonolobus L. có từ 2 – 4 trung tâm hoạt
động, còn phân tử lectin từ ốc sên (Helix pomatia) có đến 6 trung tâm hoạt động.

Có thể nói rằng, các trung tâm hoạt động trong phân tử lectin có cấu trúc giống
nhau hoặc khác nhau. Với những phân tử lectin mà các trung tâm hoạt động cấu tạo
giống nhau thì chúng chỉ làm ngưng kết một hoặc một vài dạng tế bào, điều đó làm
cho lectin có tính đặc hiệu nhóm máu cao. Các dạng lectin có chứa các trung tâm
hoạt động khác nhau thì hoạt tính đa dạng hơn, các lectin này thường không đặc
hiệu nhóm máu, đây là dạng lectin rất phổ biến trong tự nhiên.
Về cơ chế hoạt động của lectin, các nhà khoa học đều đã thống nhất như sau:
Các trung tâm hoạt động của các phân tử lectin đều có khả năng liên kết các
gốc đường trong các thụ thể tiếp nhận (receptor) trên bề mặt màng tế bào. Các liên
kết glycoside được hình thành giữa các receptor trên bề mặt màng tế bào với các