Nhân dòng, biểu hiện và nghiên cứu một số tính chất của protease từ HIV 1 tại việt nam

1












TRƢƠ
̀
NG ĐA
̣
I HO
̣
C KHOA HO
̣
C TƢ
̣
NHIÊN




Nguyễn Thị Hồng Loan

NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU
MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ HIV-1
TẠI VIỆT NAM






LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH HỌC



2
MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài
Virus gây suy gim min dch  i (Human immunodeficiency virus -
HIV) là nguyên nhân chính gây ra hi chng suy gim min dch mc phi  i
(AIDS) và là mt trong s nhng virus gây bnh nghiêm trng nht hin nay. HIV
bii liên tc v cu trúc và h  kháng li các thuu tr và gây ra t l
t vong cao. K t khi xut hin (t ng 60 trii
trên hành tinh b nhing 25 trit do các bnh
n AIDS 
(UNAIDS, 2010). Theo các tài li
b, có ít nht hai type -1) và HIV type 2
(HIV-2), n-1 là nguyên nhân chính gây ra AIDS  i trên toàn th gii.

Trong chu trình sng ca HIV-1, 3 enzyme reverse transriptase, integrase và
protease có vai trò quan trng không th thi       
thành virus hoàn chnh. Vì vy, các cht c ch cc nghiên
cu, sn xu u tr cho bnh nhân nhiu tr c
gi là liu pháp dùng thuc chng retrovirus (antiretroviral drug therapy, gi tt là
ART). Trong s 3 enzyme nói trên, protc mã hóa bi gen pol ca virus có
cht các -
              
-
t sinh sn nhanh ca HIV  1, có
khong 10 triu ht virus m c to ra mi ngày và t l sai sót rt cao ca
enzyme reverse transriptase (1/10.000 base) 
  thu tr. Khi có ART, các chng
t bin kháng thuc chn lc và tr thành ch (Hoffmann và
tp th, 2007),  (PI) 

                 

3
-

Hin nay, trên th gi   u công trình nghiên c  sn xut
protease ca HIV-1 (c gi tt là protease HIV-1)  c t cho thy
protease HIV-1 không d c biu hin trong t bào vt ch c tính gây
c t c sau biu hing thp, trong mt
s ng hp ch có th phát hic bn dch vi các quy
trình biu hin, tinh sch gm nhic rt phc tp. Mt khác, các nghiên cu
u sn xut protease HIV-1 phân lp t phân nhóm B là phân nhóm HIV ph bin
gây bnh  M, Australia c Tây Âu. Trong khi, phn lng hp
nhim HIV-1 trên th gii và  Vit Nam không thuc phân nhóm B. Nhng nghiên

cu gy s khác nhau v cu trúc ca protease phân nhóm B so vi
các phân nhóm khác dn hiu qu u tr thuc c ch protease (PI) và m
kháng thuc có th khác nhau. 
--


 
 
công (Hoffmann 
-1 có vai
 
 Vit Nam, protease HIV-1 t các bnh nhân Vit Nam là v còn ít
c nghiên cu. Các nghiên cu ch yu tnh nhóm virus gây
bnh ch yu  i Vit Nam và tìm ra mt s t bin liên quan kháng thuc.
c biu nào v biu hin protease HIV-1 phân lp t các bnh
i Vit Nam.
“Nhân dòng, biểu
hiện và nghiên cứu một số tính chất của protease từ HIV-1 tại Việt Nam” 
ch phm protease HIV-1 tái t hp s dng cho mc và phát

4
trin các cht c ch s nhân lên ca HIV, t phát trin thuc
u tr HIV/AIDS.
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
- Phát hin mt s t bin trong gen mã hóa protease HIV-1  i Vit Nam.
- Thit lp quy trình hiu qu cho vic biu hin gen mã hóa protease HIV-1
 vi khun E. coli và tinh sch protease HIV-1 tái t hp  dng có hot tính.
- Nghiên cu mt s tính cht protease HIV-1 và tìm hiu tác dng ca mt
s cht c ch   tìm kim và phát trin các PI mi có th ng dng trong
u tr HIV/AIDS.

3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài
Đối tượng nghiên cứu của đề tài:
Gen mã hóa protease HIV-1 t huyt thanh các bnh nhân nhim HIV-1 ti
Bnh vin Bnh Nhi
Nội dung nghiên cứu của đề tài:
- Tinh sch RNA ca HIV-1 và tng hp cDNA ca mt s mu HIV-1 t
các bnh nhân nhim HIV-1 ti Vit Nam.
- Nhân bc trình t gen mã hóa protease HIV-1 ca các mu
virus phân l sai khác v trình t gen mã hóa protease HIV-1 gia các
ng bnh nhân nhim HIV-1 so vi trình t ng trên th gii.
- Thit k h thu kin biu hin gen mã hóa cho
protease HIV-1  E. coli.
- Xây dng quy trình tinh sch protease HIV-1 tái t hp.
- Nghiên cu mt s a protease HIV-1 tái t hc.
- Tìm hiu tác dng c ch ca mt s hp cht tng hp và t nhiên lên
protease HIV-1 tái t hp.
4. Địa điểm thực hiện đề tài
Các nghiên cu ca luc thc hin ch yu ti Phòng Thí nghim
trm Công ngh i hc Khoa hc T i
hc Quc gia Hà Ni.
5. Đóng góp mới của đề tài

5
- Công trình nghiên cu có tính h thng t vic nhân bn, nhân dòng và
biu hin  E. coli gen mã hóa protease HIV-1 tái t hp thuc chng CRF01_AE
ca Vit Nam; thit l tinh sch protease HIV-1
vi hiu sut thu nhi các nghiên cu trên th gii.
- u tiên phát hin thy tác dng c ch protease HIV-1 bi
axit asiatic, 8-hydroxyquinoline và menadione.
6. Ứng dụng thực tiễn của đề tài

- Cách thc biu hin gen mã hóa protease HIV-1 và tinh sch protease tái
t hp to ra trong công trình nghiên cu này có th d dàng c áp d
sn xut mt s protease tái t hp khó tan và ch c hiu vi mt s ct
nhnh.
- Ch phm protease HIV-1 t cho vic tìm kim và phát trin
các PI m có th ng du tr bnh nhân HIV/AIDS.








CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HIV-1
1.1.1. HIV-1 nguyên nhân của AIDS
Virus gây suy gim min dch  i (HIV) lc Montagnier
và tp th  Vin Pasteur Paris phân li tên gu là virus
liên quan ti viêm hch (LAV) c y ban Quc t thng
nht gi tên HIV (Greene, 2007). Cùng thc mt
virus mi  t tên là HIVc ca HIV-type 1. Hai
lou làm suy gim h thng min dch ca ngt tên chung là
HIV. Mc dù HIV-type 2 có mt s m ging vi HIV- cách thc

6
truyn bnh, các hình thc nhim bu tr i
nhim HIV-type 2 ít phát sinh bi nhim HIV-type 1 và HIV-type 2
thy ch yu  các vùng ca Châu Phi (Hoffmann và tp th, 2007). Vì vy, HIV-
type 1 (HIV-nh AIDS.

HIV thuc h retrovirus, là h ng vt. HIV-1 có
3 nhóm chính là M (main), N (new), và O (outlier). Có ti 90% s lây nhim HIV
trên toàn th gii thuc ký hiu bng các
ch cái A-D, F-H, J, K và nhiu dng tái t hp khác c gi tt là các phân nhóm
CRF (circulating recombinant forms). S khác nhau gia phân nhóm này vi phân
nhóm khác là  trình t axit amin ca protein v và có th t quá 30%. Phân
nhóm B ph bin  M, Tây Âu và Australia; trong khi các phân nhóm không phi
nhóm B li phân b  n c
phn ln nhi b nhing. S ng ca virus có th thy 
vùng Sahara (châu Phi).  Vi-1
phân lp t các bnh nhân nhim HIV-1 ch yu thuc nhóm CRF01_AE, bên cnh
t s ít các phân nhóm B, C và các dng tái t hp khác (UNAIDS, 2010;
Nguyen và tp th, 2003; Ishizaki và tp th, 2009; Phan và tp th, 2010).
Phn ln vic nghiên c tìm ra thuu tr bu
da trên phân nhóm B. Tuy nhiên g ng v trình t axit amin gia các
ng nghiên cu quan trng kháng
thuc PI (Bandaranayake và tp th, 2008).
1.1.2.Tình hình nhiễm HIV-1
i dt thách thc to li vi tin trình
phát trin xã hi. Sau 3 thp k phát hi  u tiên là   c phát trin,
ng trên toàn th gic bit  khu vc
châu n nay va HIV hay thuc cha tr c hiu.
Theo   HIV/AIDS     (UNAIDS, 2010), n
cu i nhing trên th gii
 l hin nhim HIV/AIDc tính cao gp 3 l
c tính khong 33,3 tri

7
b ng nhim mi là 2,6 trii và có khong
1,8 triu b

      -       
1990;    
 . T
30/9/2010 80.631 tr/AIDS. 

  ( 2009; UNAIDS, Vietnam)
 
 

Theo phân tích ca các chuyên gia, tng s i nhim HIV còn sng vn
p t qu cng ch yu: S i mi nhim HIV
u vn cao và do kt qu tích cc ca các liu tr
kháng virus làm gim s i t vong, kéo dài s si bnh.
1.1.3. Sinh bệnh học của nhiễm HIV-1
1.1.3.1. Cấu trúc hình thể của HIV-1
Trên kính hin t, HIV-1 và HIV-2 có cu trúc gng nhau
hoàn toàn. Chúng ch khác nhau  khng ca c
tr. C HIV-1 và HIV-u nhân bn trong t u gây bnh 
i, mc dù m suy gim min dch do HIV-2 gây ra (Hoffmann và
tp th, 2007).
HIV-c khong 120 nm, dng cu (hình 1.1). V ngoài ca virus là
lp lipid kép vi nhiu protein gc ký hin là Env. Protein Env có
phn chc to thành t 3 phân t glycoprotein có khng phân t là 120 kDa
(gp120) và phc to thành bi 3 phân t gp41 gn vi nhau to thành các
phân t p v ngoài ca virus; gp160 có th c phát hin trong
huych huyt ca bnh nhân HIV. Trong quá trình ny chi,
virus có th gn thêm các protein t màng ca t bào vt ch vào lp lipoprotein ca
virus, ví d các protein HLA lp I và II, hoc các protein k-1 giúp
virus gn vào t c gn vào mt trong ca màng lipoprotein.

8
Lõi có dng hình tr c bao bc bi lp capsid to thành t 2.000 bn sao ca
protein p24 (Hare, 2006; Hoffmann và tp th, 2007).










Hình 1.1. Cấu trúc của một hạt HIV-1 (Hoffmann và tp th, 2007)
1.1.3.2. Tổ chức hệ gen của virus
H gen ca HIV-1 nm trong phn lõi ca virus và bao gm hai si RNA (+)
i si có chiu dài khong 9,8 kb và có 9 gen mã hóa cho 15 protein khác
nhau (hình 1.2). So vi các virus khác thuc h retrovirus thì h gen ca HIV-1
phc ti si RNA có 3 gen cu trúc là gag, pol và env;  gag
  group-antig    pol  pol  env là
env). C a b gen retrovirus -gag-pol-env-
long terminal rn lu cùng) là
u ca b gen virus, ni vi DNA t bào vt ch sau khi tích hp và không mã
hóa cho bt c protein nào ca virus. Các gen gag và env mã hóa cho nucleocapsid
và glycoprotein ca màng virus; gen pol mã hóa cho 3 enzyme: reverse
transcriptase, integrase và protease. Ngoài ra, HIV-1 còn có 6 gen (vif, vpu, vpr, tat,
rev và nef)  vùng RNA 9 kb (Hoffmann và tp th, 2007).


9

Hình 1.2. Cấu tạo hệ gen của HIV-1 (Hoffmann và tập thể, 2007)

Hình 1.2. Cấu tạo hệ gen của HIV-1 (Hoffmann và tp th, 2007)
1.1.3.3. Chu trình nhân bản của nhiễm HIV-1
Quá trình nhim HIV-1 ca t bào vt ch bu bng vic gn mt phn
virus lên b mt ca t c bu khi protein b
mt v gp120 gn vào th th trên b mt t ng hp th th là
CD4 có  t bào lympho T hoc có  mt s t i thc bào, bch cu
 bào lympho B. Các t bào này có vai trò rt quan trng trong h
thng min dch c  ; chúng nhn di  ng và ng các t bào
lympho tn công và tiêu dit vi sinh vt l   . S liên k u tiên ca
gp120 v l ra v trí khác ct vng
th thng là th th chemokine CXCR4 hoc CCR5. Ti gp41
qua th th gn vào màng t -1 ci b lp v lipid
t liu di truyn RNA ca nó cùng vi reverse transcriptase vào
t bào cht ca t bào vt ch. Nh reverse transcriptase, si RNA cc
tng hp thành si DNA b sung (cDNA). Si RNA ca virus kt hp cDNA thành
chui RNA/DNA  chui lai này chuyn thành 2 si DNA xon mch th
chuyn thành DNA xon d bào và nh
enzyme integrase, DNA kép ca viruc chèn vào DNA nhim sc th ca t bào
chc hp thành (hay gi là tin virus, phân bit nó vi dng virion)
có th tn ti  trng thái tim tàng trong nhiu gi hoc nhic khi tr
thành dng hong mà có th không biu hin bnh (Hare, 2006).

10
Quá trình sao chép h gen cc thc hii s u khin phc
tp ca mt s protein, bao gm Tat và các yu t sao chép DNA ca t bào.
Chính vic gn vt cht di truyn ca virus vào h i cu trúc
gen ca t bào vt ch. DNA ca virus s ch th cho t bào sn xut ra RNA ca

virus nh c nhân lên, các protein ca
c tng hp nh ribosome ca t bào vt ch, chúng di chuyn ra
mi ni cht hoc màng t bào, tip theo là quá trình ny chi to thành các
virion nm trên màng hoc tách ra khi t bào chi gn vào các
t bào lympho T khác. S vn chuyn RNA cc sao chép ra khi
nhân ph thuc vào mt s nhân t ca virus và vt ch 
c vn chuyi dng vt liu di truyn cho các virion mi
hay có th c ni tng phn hoc toàn b nhm tng hp nên nhng protein
khác nhau ca virus (Hare, 2006; Hoffmann và tp th, 2007).












Hình 1.3. Chu kỳ sống của HIV-1 (Weiss, 2001)
Các t bào lympho T CD4
+
b nhim có th b git trc tip khi mng
lc sn sinh và ny chi t b mt, phá v màng t bào hoc khi các
protein và axit amin ca virus có mt bên trong t bào, cn tr s hong ca b
máy t bào. Mt khác, các t bào lympho T CD4
+
b nhim có th ng

Bản sao DNA
của HIV

11
t cht (cha t bào b ri lon do HIV-1 gây
u nghiên cu cho thy rng HIV-y các t bào
ting thành chúng có các chn dc hi
th mt kh a là làm gim kh o v  ca h thng
min dch.  nhim HIV cho thy c min dch th dch và min dch t
u kháng lng li ca t bào có s tham gia ca t bào
lympho T CD8
+
và CD4
+
làm trung gian kìm hãm s nhân lên ca HIV-1 trc tip
bng cách nhn din, git các t bào b nhim và không trc tip bng cách sn sinh
các nhân t kháng chemokine ca virus. Trong th do h
thng min dch  c sn sinh khi có mt các kháng nguyên ca virus. Tuy
 chng li s tn công ca h thng min dch
bng cách bic thoát ra khi s bt gi. Vì v
(hay h thng min dch) không th c s tin trin ca bnh và cui
cùng HIV-1 phá hy h thng min dch (Feinberg, 1996; Hare, 2006).
1.1.3.4. Diễn biến của quá trình nhiễm HIV-1
S lây nhim HIV-u gi là quá trình nhing t 3-6
tu, các ht virus gây nhii bnh
st nh, có du hiu  cm cúm y triu chng gì, s ng
t bào T CD4
+
gim. Tin tim n lâm sàng kéo dài t n 10
 n này, quá trình nhân lên ca virus và s ng t bào lympho T

CD4
+
n ti các hong ca h min dch, kh 
virus ci bi bnh l
này virus vn có kh n bnh. Kho virus trong
 cho ti lúc cht, các kháng th kháng virus gim dn, giai
n này gi ln cui bnh thy m
nhim khui gy yu, các vi sinh vu kin tn công.
c bit, mt s b b, lao, tiêu chy kéo dài, sút cân, dùng kháng
sinh không khi, chân tay xut hin các nt nhim, da và niêm mc bu xut
hin bi bnh cht dn (





, 2001; Hoffmann và tp th, 2007).

12
1.1.4. Phƣơng pháp điều trị HIV/AIDS
Trong phòng chng nhim HIV-1, phát tri    
truyn thng gp rt nhit s i gian  bnh
ca HIV-ng xuyên xt bin  vùng gen mã hóa cho kháng nguyên,
m HIV-ng vt và tn sum HIV-1 cao.
Ngui nhim HIV-1 mun kéo dài cuc sng ch ng duy nht là ung
thuc c ch s sao chép và nhân lên ca HIV-1.
n nay, viiu tr HIV/AIDS phc tp, tn kém và ch giúp kéo dài
s sng mà không cha khc bnh. Các thuu tr HIV/AIDS có th ng
 hiu bit v quá trình nhim và nhân lên ca
HIV trong t bào (hình 1.4)  c ch quá trình ny chi, c ch quá trình hòa

màng và xâm nhp ca HIV-1 và ph bin nht là liu pháp dùng thuc kháng
retroc áp dng t nhm thuc c ch enzyme
reverse transcriptase, protease và integrase (Hoffmann và tp th, 2007).








Hình 1.4. Các thuốc chống HIV và đích tác dụng (Hoffmann và tp th,
2007)

Các chất tương tự nucleoside (NRTI) ức chế enzyme reverse transcriptase:
  c ch    c trin khai.   ng ca
NRTI là reverse transcriptase ca HIV-1. Chúng ch có khác bit nh  phân t
ribose so vi các nucleosng vì vy có th thay th v trí ca nucleoside
 cnh tranh. Khi các thu DNA
c tng hp, thì quá trình kéo dài chui ca DNA s b ngng li. Nhóm

13
thuc này gm zidovudine (AZT), lamivudine, didanosine, zalcitabine, stavudine và
abacavir. Mt thuc mc dùng phi hp vi ít nht 2
thuu tr c HIV-1 và viêm gan B. Tuy vy, u tr kéo dài các
thuc nucleoside có th gây nhiu tác dng : nhic thn kinh, sinh nhiu


 . Mu ri lon phân b m
c cho là do u tr bng thuc c ch c ra có nhiu ri lon

v chuy  c bit là teo m) hi     c tính ca thuc
nucleoside. Có l n c ch hot ng ca ty th do hong
cha ty th cn nucleoside. Quá trình chuyn hoá c
trng này b ri lon do vic s dng phn s thoái hoá ca
ty th. Các thuc khác nhau có th c vi ty th  m khác nhau (Gal






, 2002).
Thuốc ức chế virus xâm nhập: Các thuc này c ch hay cn tr s xâm nhp
ca HIV vào t bào vt ch. c ch yu giúp HIV-1 xâm nhp vào t bào
CD4: HIV-1 gn vào th th ca t bào CD4, gn vng th th và hòa nhp
virus vi t bào. Mc này u có th b c ch. Tt c các nhóm thuc c th
c c ch gng th th và c ch hòa màng hin nay
c gi chung là thuc c ch xâm nhp. Thuc
clà enfuvirtide (T-20) t ra c ch ngay c nhng chng HIV-1
kháng thuc mnh nht. Tuy nhiên, bu tr T-20 có s  l v
bnh lý hch và viêm phi do vi khun (Trottier và tp th, 2005).
HIV/AIDS còn có th  u tr bng thu u hòa min d 
Alpha-interferon, interleukin 2, loprinasine vi tác dng kh o
v các h min dch. Ngoài ra, bnh nhân HIV/AIDS còn có th u tr vi
mt s thuc phòng nga bi.
Du vy, bc tranh phòng chn ht sc m
m, nhiu bnh nhân nhim bnh t gia nh vong. Chính vì vy,
s  i ca các thuc c ch protease và thuc c ch enzyme reverse
transcriptase không phi nucleosu k nguyên
tr liu kháng retrovirus hiu lc cao (Highly Active Anti-Retroviral Therapy-

14
HAART) và to ra nhng tin b t bc v gim t l mc và t vong do HIV-1
m rõ rt các nhii và khi u.
Các chất ức chế protease (PI): t có tác dng cn tr s nhân
lên ca HIV-1  n mui ca virus, khin cho HIV-1 b
ri lon cu trúc và không có kh ng gây nhim. Tuy nhiên, bu tr
bng phi ung nhiu ln thuc trong mu tr kéo dài gây ra
mt s tác dng ph ng gnh d dày, rut, gim chi
lon lipid máu, lon nhp tim (Nolan, 2003; Anson và tp th, 2005). 
c hn ch vi s i ca các PI mc biu th
bng cách thêm ch c. Ving có th hiu qu trên
nhng chng virus kháng thuc nh vào vi thuc trong huyt
m gu tr ng, ít nht  nhng bnh
u tr ART bi hàng rào kháng thuc cao. Theo nhiu chuyên gia,
bnh nhân có tng virus cao cn phng ngay t khi bt u
u tr. Tuy nhiên, lm dn ri lon lipid máu và các
tác dng ph khác nng n (Van der Valk và Reiss, 2003). Dù vy, PI vn là
mt thành phn quan trng và không th thiu ca HAART. Các thuc trong nhóm
gm saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir, amprenavir, lopinavir và atazanavir.
Thuc PI tiêu biu là atazanavir (Reyataz ) là PI ung 1 ngày 1 ln duy nht vi
li th không h          dng t 
2004 (





, 2004). Thuc có tác dng dung np tt và hiu lc kháng
virus mc cp phép s dng cho các bnh nu tr ART. Hin nay,

anh tranh v dành v c kê nhiu nht.
Lopinavir c cu tiên và duy nht có
mt li     lopinavir lên trên 100 ln. Lopinavir/r có
hàng rào kháng thuc rt cao, ct 6-t bin kháng thuc thì mi
 gây tht bi trong u tr (





, 2002).
Các chất ức chế reverse transcriptase không nucleoside (NNRTI): ging vi
các NRTI   ng ca chúng là enzyme reverse transcriptase. Tuy vy,
NNRTI gn trc tip và không cnh tranh vi enzyme  v trí gn sát vn
các nucleoside. Kt qu là làm phong b hoàn toàn v trí gn các cht hot hóa

15
enzyme reverse transcriptase, làm gi   quá trình tng hp axit nucleic.
Nhóm thuc này gm: nevirapine (viramuneTM), efavirenz (sustiva 
. Tuy nhiên, bu tr bng NNRTI
có c không ch rt cao mà còn có th xut hin khá nhanh. Mt
khi y ra kháng thuc thì h kháng vi c nhóm thuc này. Ch cn mt
t bin  v trí gn k t bi loi b toàn b c nhóm thuc.
Nt biu tr tip tc bng NNRTI, bi l kh
t bin kháng NNRTI li không b ging
ng ht bin kháng PI hay NRTI. Mc dù có nhng v n
c, rt nhiu nghiên cu cho thy NNRTI có hiu qu rt tt
nu phi hp cùng vi các thuc NRTI. Các d liu v min dch h
virus hc  nhng b     u tr ART cho thy các thuc
u lu không mut tri

các thuc PI (





, 2003). Lin và dung np thuc tt
giúp nevirapine và efavirenz tr thành thành phn quan trng ca HAART và thm
t tri các PI. Va qua, nhiu nghiên cu ngng minh rng nu
m bc ch c virus thì hoàn toàn có th chuyn t u tr bng PI sang
NNRTI và s di hiu lc ti tip tc dùng các
thuc PI (Hoffmann và tp th, 2007).
  u tr cho bnh nhân HIV/AIDS, các thu  c
dùng phi h u qu và hn ch tác dng ph.
ác mô hình tính toán toán hc cho thy thi gian c ch
hoàn toàn HIV-i gian này các nhà khoa hng các t
bào mang virus có l t ht và cha tr hoàn toàn ti-1 là có th. Tuy
nhiên, các nghiên cu gy, HIV-1 vn còn tn ti tim tàng  nhiu t
bào thm chí sau mt thi gian dài b c ch, không ai có th bit các t bào mang
virus tim tàng này sc bao lâu và dù còn mng rt nh thì HIV-1 vn
có th bùng phát tr li ngay sau khi ngng u tr. Thng gn nht
 xóa sch các t bào mang HIV-y HIV-1 không th cha
khi trong thi gian ngn (Si





, 2003). Bên c, các thuc c
ch HIV-1 phi ung nhiu lu tr kéo dài dn các tác dng ph (bnh

16
d ng rut, ri loi lipid máu, lon nhp tim ). V này có
th c gii quyt bng cách s dng n cht c ch protease cao hoc to ra
các cht c ch mi có hiu lc cao. Mt khác, HIV-1 nhân lên nhanh và enzyme
reverse transcriptase phiên mã vi t l sai sót khá cao nên t t bin HIV-1
ln và HIV-1 luôn to ra các chng mi dn s i trong cu trúc và giúp
cho HIV có kh c và dn tht bu
tr HIV-1 bng ART.
Du vy, dù HIV-1 là mt tác nhân gây bnh truyn nhim rt nguy him vi
nhng bii phc tp, các nhà khoa hc vng nghiên c
tìm ra thuc mi, hiu qu chng HIV và hi vng ra hiu qu
u tr bng ART và HAART s khác hoàn toàn.
1.2. PROTEASE HIV-1 VÀ ỨNG DỤNG
Trong chu trình tái bn ca HIV-1, protease là enzyme có tác dng phân ct
các polyprotein tin thân gag và gag-pol thành nhng protein cu trúc và ch
ng thành ca virus. Khi c ch hot tính ca protease hoc gây
t bin trên gen mã hóa cho protease, các ht virus v
 to thành virus hoàn chnh nên chúng không có kh 
xâm nhim vào t bào vt ch (





, 1989). Vi vai trò c bit quan
try, protease HIV-c nhiu nhóm các nhà khoa hc trên th gii
quan tâm nghiên cu.
1.2.1. Cấu tạo protease HIV-1
Có nhiu cách phân loi protease, da vào v trí ct trên chui polypeptide,

 c chia thành hai nhóm chính: exopeptidase và endopeptidase.
Exopeptidase ct liên kt peptide  gu N hou C c
endopeptidase ct liên kt peptide ni chui. Da vào cu trúc c
mt trong trung tâm ho ng, protease l c chia thành bn nhóm chính:
protease serine, protease aspartyl, protease cysteine và protease cha kim loi, tip
i tip tc phân chia thành nhiu h khác nhau da vào trình t
axit amin (





, 1998). Da vào cách phân lo-1
là mt protease aspartyl (có cha Asp trong trung tâm hong).

17
p th phòng thí nghim Merck u tiên mô t
cu trúc tinh th ca protease HIV-1. T n nay, nhiu protease HIV-1 khác
c nghiên cu v chc hit và v trí gn ca các
cht c ch. Cu trúc ca mt s phc hp protease HIV-1 kháng thuc vi các
cht c ch c hic làm sáng t (





, 2000). Protease
HIV- c mã hóa bi h gen ca HIV-1 và là mt protease aspartyl, h
retropepsin A
2

 c to ra khi HIV nhim vào t bào ch. Protease HIV-1 là
mt dimer, mi monomer ging ht nhau có khng phân t (KLPT) 11 kDa
gm 99 axit amin  c sp xp g    i xng. Mi mt
monomer to thành cu trúc các phin gp np vi m n xon ngn
gu C (Tie, 2006).
c ch ra  hình 1.5u N ca protease HIV-1 vi các axit amin 1-4
hình thành nên chua là phn bên ngoài ca b mt phin g
9-15 hình thành chub qua mt vòng quay, tip tn chuc t thúc
v trí b ba hong (Asp25-Thr26-Gly27). Tip theo cu trúc vòng ca v trí hot
ng là chud gm các axit amin t 3035. Mt cu trúc vòng rng (axit amin
3642) liên kt vi chua’ hình thành bi các axit amin 4349. Các axit amin
5266 và 69-78 lt hình thành nên chub’ và chuc’. Sau mt cu trúc
vòng to ra bi các axit amin 7982, mt chui ngn d’ (các axit amin 8385) dn
trc tin mn xoh (các axit amin 86n xon h theo sau bi
mt chui q thng tn cùng bu C (các axit amin 9599) hình thành nên phn
bên trong ca b mt nh phân. Bn chu lõi t chc thành phi
a tt c các protease aspartyl. Các axit amin 44-57 trong mi tiu
phn hình thành nên mm mt cp chuc nhau (a’ và
mt phn ca b’) (

, 1998; Tie, 2006).
Cu to protease HIV-1 còn có th c chia thành ba vùng (domain) chính:
vùng cui hom 4
phn cui ca phic axit amin 1-4 và 95-99 ca mi monomer), vòng
quay quanh axit amin 4-9 và chui xon (axit amin 86-94 ca mi monomer). Vùng
này có vai trò thit yu trong hình thành cu trúc dimer và  nh hot tính
protease HIV-1. Cu trúc dimer s c hình thành nh n

18
gia 4 si ca phin  t các gc axit amin 1-4 (vùng N u cùng N), 96-99 (vùng

C tn cùng) và các gc axit amin trong trung tâm hong 24-a
các g8n s nh
ca dimer. S gn thêm cht c ch hot s a s nh
ca cu trúc dimer. Vùng lõi gm 4 phu s-32 và 63-85
ca mi monomer) có vai trò quan trng trong nh dimer và hot tính. B ba
xúc tác Asp25-Thr26-Gly27 có tính bo th trên mm trong cu
trúc cm các axit amin t 33-43 và 44-63 bao quanh
trung tâm hong. Phu ca vùng này giàu Gly to nên tính mm do ca
vùng cn thit cho vic gt, gii phóng sn phm có vai trò quan tri
vi hot tính ca enzyme. Nt bin xut hin  v th làm gim mnh
hot tính ca enzyme (

, 1998; Tie, 2006).










Hình 1.5. Mô hình cấu trúc của protease HIV-1 (Tie, 2006)
A: Cu trúc bc hai ca protease vi cht c ch (hot), B: Cu trúc ca
protease khi có/không có cht c ch  th hin protease khi liên kt
vi cht c ch t) và màu xanh th hin protease khi không có cht c ch 
cht)

Trung tâm hong ca protease cha b ba Asp25-Thr26-Gly27 nm ti

mt phân gii cc làm nh nh mi các liên kt hydro ging
vi các enzyme  sinh vt nhân chun. Mi liên kt hydro này khá vng chc


19
(hình 1.6) to nên s  nh ca trung tâm ho ng c   i
u có mt b ba Asp-Thr-Gly vi v 
   Asp cn thit cho c cu trúc và hot tính xúc
tác ca protease.








Hình 1.6. Cấu trúc kẹp trong trung tâm hoạt động của protease HIV-1
(

, 1998)
Nhóm cacboxyl ca Asp25 to liên kt hydro vi NH ca Gly27. Nhóm 
OH ca Thr to liên kt hydro vi din, liên kt gia NH ca
Thr (màu xanh) vi gc ) ca gc Asp
Bên c   ba Gly86-Arg87-Asn88 ca protease HIV-   t
vùng bo th c hình thành cu trúc dimer. Các v trí
liên kt gm S3  yu hình thành bi các axit amin 8, 23-30, 32,
45-50, 53, 56, 76, 80-82 và 84. Các v trí 1-3, 5-9, 23-27, 29, 47-52, 54, 67, 81, 87
và 90-99 góp phn liên h gia b mt dimer. Các cht c ch hot liên kt
gia hai tiu phn bng liên kt hydro i v trí hot

ng gm hai b p xut hoc
các cht c ch và hong trong sut quá trình xúc tác cùng vi vic liên k
chi tr khi trung tâm hong. Có mt phân t c gi li
hình thành nên cu ni gia nhóm CO  liên kt P2-a cht c ch và nhóm 
NH- cNH-   c này rt cn thit cho hot tính
thy phân ca protease và có th b thay th bi mt nhóm carbonyl có trong cht
c ch thích h

20
Ceccherini-Silberstein và tp th (2u v m bo th
ca protease HIV-1 khi có mng mt các cht c ch protease t kt
qu gii trình t gen mã hóa protease HIV-1 ca 475 bc và
639 bnh nhân có s dng PI. Kt qu phân tích trên các bnh nhân không dùng
thuc cho thy 68 trong s 99 axit amin có m bo th cao (chim 69%). Các
tác gi  ra 5 vùng khá bo th ca protease  các bnh nhân này và hu ht
u là các vùng có ch N u cùng (P1-P9), vùng C tn
cùng (G94-F99), vùng trung tâm ho ng (E21-   -V56) và
vùng G78- axit amin ca protease HIV-1 phân lp t các
bnh nhân s dng thuc c ch protease li có s , ch yu do các
t bin kháng thuc c ch protease. Có 45 trong s 99 axit amin th hin tính bo
th (chim 45% so vi 69%  các bnh nhân không s dng thua, khi
so sánh vi các bnh nhân không s dng thuc, các vùng N u cùng và vùng C
tn cùng là khá bo th thay th C95 vi xác sung t 0,6%
n 2,7%. Tt c các vùng bo th ln khác (E21-V32, P44-V56, G78-
bo th  th là D25-D29, G49-G52, G78-P81 và G86-R87.
n nay, hu ht các nghiên cu v cu trúc protease HIV- u ca
 theo 






(2008) thì s khác nhau v
trình t axit amin gia các phân nhóm HIV-1 g
quan tr kháng thuc  protease HIV-1. Các tác gi này 
nh cu trúc ca protease HIV-1 phân nhóm CRF01_AE và so sánh vi phân nhóm
B. Bng cách sp xp các nguyên t C chng lên nhau, các tác gi cho thy có s
 ng cao gia cu trúc ca protease HIV-1 phân nhóm B vi phân nhóm
 lch ch có 0,37 A
o
. Tuy nhiên, trong cu trúc ca protease HIV-1
phân nhóm CRF01_AE có s sp xp li t gc axit amin 33-39 và gn vùng lõi
(gc axit amin 16-22). S khác nhau v cu trúc  c trên hai monomer. Chui bên
ngc i chui bên ca
n li g
sánh vi chui bên Met36 trong cu trúc protease phân nhóm B. Phn cong ca
ng v  y s hình thành liên kt hydro gia C0 ca
Asp35 và NH
2
- c        ng vào

21
vùng lõi. So vi chung ra ngoài vùng
hòa tan, cho phép oxy ca H
2
O hình thành liên kt hydro vi NH- ca Arg57. V trí
chui bên Arg57 cho phép hydro ca NH
2
to liên kt hydro vi CO- ca Met36.
Chui bên Arg57 cn to bt c i

y s u trúc
cht ch   u to protease HIV-1 phân nhóm CRF01_AE so vi phân
nhóm B, d   c hiu và hiu qu xúc tác ca protease phân nhóm
CRF01_AE tha, s nh xy ra bên
trong nhc xem n ái lc gn vi
m kháng thuc vi mt s cht c ch nhnh so vi protease phân nhóm B.
1.2.2. Hoạt tính phân cắt cơ chất của protease HIV-1
Protease HIV-1 có hot tính phân ct các polyprotein tin thân gag và gag-
pol ca virus. Nó ct tt c các v trí dành cho proteolytic trên các protein ca virus,
ngoi tr liên kt gia gp120 và gp41 là ca convertase furin hoc protease ging
furin (furin-like protease) ca t bào ch. Trung tâm xúc tác chính ca protease bao
gm b ba Asp25, Thr26 và Gly27; nt bin xy ra ti Asp25 s dn mt
hot tính ca protease HIV-1. Protease HIV-t tính t ct xy ra sau
khi protein gag-pol hình thành dimer hóao phép gii phóng chính nó ra
khi polyprotein tin thân. Hot tính ca protease HIV-1 là tuyi cn thit cho
quá trình hình thành virus hoàn chnh dn vai trò quan trng ca protease trong
liu pháp dùng thuc chng HIV-1. Mt trong các cht c ch hot tính protease
HIV-c phát hin sm nht là pepstatin A - cht c ch protease aspartyl  làm
mt hot tính ca protease HIV-1 dn to ra các chng virus không hoàn chnh
và không có kh m vào t bào ch (Seelmeier và tp th, 1988).
 xúc tác ca protease HIV-ng t vi các protease aspartyl. C
th, protease s dng mt phân t H
2
O ho gn vi carbonyl trên liên kt
amide ct. S hot hóa phân t H
2
O c bi c hai nhóm -carboxy
aspartyl ti trung tâm hong (

, 2003). Du vy, c xúc tác ca

protease HIV-1 vn còn là v gây nhiu tranh cãi. Các protease c
các protease HIV-1 rt khác nhau v cu trúc bc ba và bc bn khi so sánh vi
protease ca t bào hay các protease ging pepsin khác. Protease HIV-1 có hot tính

22
xúc tác khi  dng dimer vi mt phn Asp xúc tác và mt ph mi ti
v, còn protease ging pepsin hoi mt phn Asp xúc
tác t mt trong hai khu vc ca mt. Nhìn chung, phn ng là
xúc tác axit-m c i v to np gp c
cht) và hóa hc (hình thành và tách ra cu trúc t din trung gian). Không ging
    protease cysteine, protease HIV-1 không có liên k ng
hóa tr gia acyl-c hình thành trong sut quá trình này. Hiu
qu ca quá trình ct ph thuc vào trình t axit amin ccht (Tie, 2006).
Trình t các v trí ct ca protease HIV-1 trên protein gag và gag-c
th hin  bng 1.1. Ti v c k c ln chi
th ng xut hin t
  yu xut hin  P1. Các gc phân c  c nh
ng xut hin   P3 tr ng là glutamine
hoc các gng là axit amin nh. V trí ca
protease HIV-1 là liên kt Aro-Proc Trp.

Bảng 1.1. Trình tự các vị trí cắt của protease HIV-1 trên protein gag và gag-pol
(Tie, 2006)
Các v trí ct
P4
P3
P2
P1




Trên protein gag
MA-CA
Ser
Gln
Asn
Tyr
Pro
Ile
Val
CA-p2
Ala
Arg
Val
Leu
Ala
Glu
Ala
p2-NC
Ala
Thr
Ile
Met
Met
Gln
Arg
NC-p1
Arg
Gln
Ala

Asn
Phe
Leu
Gly
p1-p6
Pro
Gln
Asn
Phe
Leu
Gln
Ser
Trên p6
Lys
Glu
Leu
Tyr
Pro
Leu
Thr
Trên protein pol
TFP-p6
pol

Asp
Leu
Ala
Phe
Leu
Gln

Gly
p6
pol
- PR
Ser
Phe
Asn
Phe
Pro
Gln
Ile
PR-RT
Thr
Leu
Asn
Phe
Pro
Ile
Ser
p66-p51
Ala
Glu
Thr
Phe
Tyr
Val
Asp

23
RT-IN

Arg
Lys
Ile
Leu
Phe
Leu
Asp
p th u hic  vi khun E. coli gen
protease HIV-1 to ra protease có hot tính t ct. Kt qu gii trình t axit amin
cho thy trình t u N ca protease hoàn toàn trùng vi trình t phân cc gi
nh Pro-Gln-Ile-Thr-Leu. Quá trình t ct t polyprotein ti to protease
 trong các t bào nhim HIV-1.
1.2.3. Các phƣơng pháp xác định hoa
̣
t độ protease HIV-1
Vì protease HIV-1 không thng nên vic xác
nh ho ca protease phi da trên các trình t ct ca protease HIV- tng
ht phù hp. Tùy vào cht hóa hc khác nhau gn vi chu
cht s  thích hp, mt s k thum:
i) c ký lng cao áp (HPLC) vt sinh màu tng hp
có v trí c c hiu cho protease HIV-1, sn phm c   ng bng
n nhiu thi gian, không thích hp khi làm vi nhiu
mu và không liên tc (

, 1993).
h k vt peptide có liên kc hiu ca
protease HIV-1 và hp th c i tc sóng nhnh trong vùng t ngoi.
i tác dng ca protease, liên kt b c  hp th gim dn tc
i gian (






, 1989; 





, 1990). Da
trên nguyên tp th ng hp 11 peptide da trên
trình t ng vi v trí phân ct ca liên kt gia p17 và p24 trên
 phân tích ho protease HIV-t này có gc P1 là
norleucine (Nle), Met, Phe hoc Tyr và gc thay th bng 4-NO
2
-
phenylalanine (Nph). Liên kt P1-p th ci trong dc sóng 284-324
nm, khi b ct s mt tính cht cho  hp th gim dn theo thi gian trên máy
quang phc thc hin nhanh, không tiêu tn thi gian, liên tc và
cho s li chính xác.
iii) Quang ph hunh quang s dt gn hunh quang. 
Taylor và tp th  ng h  t phát hunh quang (DABCYLS-
SerGlnAsnTyrProIleValGln-EDANS     protease HIV- i v 
chu, s phát hunh quang cc dp tt bi s chuy
n DABCYLS. Khi phân ct xy ra trên chui peptide ti liên kt Tyr-Pro

24
làm DABCYLS tách dn khi EDANS; m gii phóng EDANS th hin qua
 hunh quang n ánh m hong c

pháp này tin hành nhanh, d  nh c hiu 
dng quang ph ng vt tng hp 
hii nht hi nh ho protease HIV-1.
Hin nay, trên th ng có rt nhit tng hp sn c
 nh hot tính ca protease HIV-1 bng quang ph k và HPLC. Hãng
Anaspec (M) có kit protease HIV-      nh ho 
protease HIV-1 bng quang ph hunh quang. Ngoài ra, hãng còn có hai loi kit
c sóng kích thích và phát ra trong vùng nhìn thy thun tin cho xác
nh ho protease HIV-1.
1.2.4. Chức năng sinh học của protease HIV-1
Protease có vai trò quan trng trong quá trình nhân lên ca HIV-1. Protease
HIV-1 ct các chui polyprotein (gag, gag-pol) thành các protein cu trúc và chc
n thit cho virus hoàn chnh. C th, protease HIV-1 nhn bit và ct các
liên kt khác nhau trên polypeptide gag  to thành các protein cu trúc: matrix
P17 (MA), capsid p24 (CA), nucleocapsid p7 (NC) có vai trò trong quá trình lp ráp
nh hình thái ca lp v ng thành cùng vi 3 protein nh (p6, p2
     ; thy phân polypeptide gag-pol to thành 3 enzyme:
protease, reverse transcriptase và integrase cn thit cho quá trình sao chép ca HIV
(





, 1989; 

 , 1998). Các thí nghim in vitro vi
protease HIV-1 tinh snh enzyme có kh t polypeptide gag
tin thân. Hình 1.7 th hin các v trí ct ca protease HIV-1 trên các polyprotein
gag và gag-pol.

Mc dù, các t bào  ng v
không có kh t các polyprotein gag, gag-c hiu ca protease
HIV-1 là gag, gag-pol và không phng ca các protease  ng vt
c li, protease HIV-1 không nhng ct các polyprotein ca chính nó mà
còn thy phân rt nhiu protein ca vt ch B-cell lymphoma 2 
 u hòa apoptosis), procaspase 8 (





, 2008). Vic xác
c hiu ca protease HIV-1 cho phép hot  ca enzyme.

25












Khi c ch hot tính ca protease HIV-1 hot bin trên gen mã hóa
protease HIV-1, virus không th  to thành virion hoàn chnh; vì vy,
chúng không có kh m vào t bào vt ch (






, 1989).
Ngoài quá trình lây nhim, protease HIV-      
trình phát sinh bnh. Khi vào t i, protease HIV-c và ct nhiu
protein ca vt ch. C th, protease HIV-1 ct procaspase 8 không hot hóa
thành caspase 8 hot hóa dn ct Bid thành tBid làm ri lon quá trình thy
phân, to ra nhng ri lon trong ty th và kích thích kh m qua màng ty
th ph thuc Bax/Bak. Kt qu làm ty th gii phóng cytochrome c và phân
mnh nhân. Hing này ch phát hin thy  các t bào lympho T CD4 và
dn ch thuc vào kích thích ca caspase
8. Các nghiên cnh rng s dng các cht c ch protease có th
 n hi ng ch     protease HIV-1 gây nên
(



 

, 2008).
1.2.5. Nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch protease HIV-1
Do kháng nguyên HIV-1 bii liên tc dn tht bi trong sn xut
vaccine nên bnh nhân nhim HIV-1 mun duy trì cuc sng ch ng duy
nht là dùng thuc. Protease có vai trò không th thiu trong chu trình sng ca
Hình 1.7. Các vị trí cắt của protease HIV-1 trên polyprotein gag và gag-pol
(


, 1998)