luận văn công nghệ thực phẩm Xác định hoạt tính một số enzyme ngoại bào của vi khuẩn Lactic phân lập từ các sản phẩm lên men truyền thống tại Hà Nội

ĐẶT VẤN ĐỀ
Tinh bột, protein và cellulose là các sản phẩm tự nhiên có vai trò quan
trọng, có nhiều ứng dụng trong sản xuất và trong đời sống con người. Trong chế
biến tinh bột, cellulose, protein, mục đích của các nhà máy hay các cơ sở sản
xuất chế biến là chuyển hóa chúng từ các hợp chất có phân tử lượng cao hệ số
hấp thu kém, giá trị thương phẩm thấp thành các sản phẩm mới có hệ số hấp thu
cao hơn, có giá trị thương phẩm cao, có khả năng ứng dụng rộng rãi vào nhiều
ngành công nghiệp chế biến liên quan khác. Công đoạn quan trọng nhất để đạt
được mục đích này là thuỷ phõn chỳng thành những hợp chất đơn giản, đó là các
đường đơn, các axit amin. Tinh bột, cellulose, protein được thủy phân là nhờ vào
ba nhóm enzyme chủ yếu là amylase, cellulase và protease, tuy nhiên trên thực tế
việc tách chiết các enzyme này từ những nguồn nguyên liệu tương ứng là rất khó
khăn và hiệu xuất thu được là không cao, vi dụ như amylase được tách chiết từ
mầm của các loại ngũ cốc, cellulase được tách chiết từ dịch chiết dạ dày bò hay
trong hạt ngũ cốc nảy mầm, còn protease cũng được tách chiết từ thực vật hay
động vật (đu đủ, dạ dày bờ,…) [2].
Chúng ta thấy rằng hai nguồn nguyên liệu thực vật và động vật không thể
dùng để sản xuất các chế phẩm enzyme với quy mô công nghiệp bởi một số
nhược điểm như; chu kỳ sinh trưởng của chúng dài, hai nguồn nguyên liệu này
khó cải tạo. Trong khi đó cả ba loại enzyme trên đều được sản sinh bởi tế bào vi
sinh vật, nguồn enzyme ở vi sinh vật vô cùng phong phú và có ở hầu hết cỏc
nhúm vi sinh vật như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, [3].
Có thể nói vi sinh vật là nguồn tài nguyên phong phú, thích hợp nhất để
sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp và đời sống. So với

enzyme được tách chiết từ động vật, thực vật, enzyme được tách chiết từ vi sinh
vật thể hiện nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo, cũng như khắc phục
được những khó khăn và hạn chế ở trên [3].
Tuy nhiên, các nghiên cứu và ứng dụng mới chỉ tập trung vào đối tượng
chính là nấm men và vi khuẩn Bacillus mà chưa nghiên cứu đến vi khuẩn lactic,
dựa trên những hiểu biết về vi khuẩn lactic thì đây là một nguồn thu enzyme từ

vi sinh vật rất có ưu thế khi ứng dụng vào lên men, bởi lẽ vi khuẩn lactic là vi
khuẩn sinh axit lactic nên có khả năng sinh trưởng bình thường trên môi trường
có pH thấp, như vậy trong điều kiện môi trường axit cao hiệu suất lên men nhờ
vi khuẩn lactic vẫn cao và đảm bảo chất lượng sản phẩm lên men. Những ưu
điểm này của vi khuẩn lactic sẽ rất có lợi cho các ngành sản xuất thực phẩm và
đồ uống lên men như sản xuất bia, rượu từ hạt ngũ cốc hay trong việc sản xuất
các chế phẩm dùng trong chăn nuôi.
Xuất phát từ thực tế trên và tiềm năng sẵn có trong nước, đồng thời để
phát hiện và lưu giữ những chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học quý,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định hoạt tính một số enzyme ngoại
bào của vi khuẩn Lactic phân lập từ các sản phẩm lên men truyền thống tại
Hà Nụ̣i”.
2

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Tổng quan về vi khuẩn lactic
1.1.1. Lịch sử phát hiện
Qua nhiều thế kỷ, các nhà khoa học trên thế giới đã dần dần khám phá ra
những bí ẩn về vi khuẩn lactic.
Năm 1780, nhà bác học Thụy Điển Schaele lần đầu tiờn đó tỏch được axit
lactic từ sữa bò lên men chua.
Năm 1857, Louis Pasteur đã chứng minh rằng sữa chua là hoạt động của
một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic.
Đầu thế kỷ 20, Metchenikoff làm việc tại Viện Paster Paris đã bắt đầu
nghiên cứu và ông phát hiện việc sử dụng sữa chua có tác dụng tốt tới sức khỏe
con người. Ông chứng minh cơ sở này qua việc quan sát các nông dân vùng
Bungari sử dụng một lượng lớn sữa chua đã có thể sống lâu, ụng đó phân lập
được vi khuẩn này và gọi tên là “vi khuẩn Bungari”. Loài vi khuẩn trên sau này
được xác định là Lactobacillus delbrueckki, đó là một trong số những vi khuẩn

sử dụng trong sản xuất sữa chua [17].
Ngày nay, những hiểu biết về vi khuẩn lactic đó khỏ đầy đủ. Vi khuẩn
lactic là nhóm vi khuẩn sinh axit lactic phổ biến, và nó có khả năng sinh ra các
enzyme, vitamin, chất kích thích sinh trưởng và các chất có khả năng ức chế
hoặc tiêu diệt nhóm vi sinh vật gây bệnh, điều đó giúp cho chúng có khả năng
tồn tại và sinh trưởng tốt trên nhiều loại nguyên liệu khi đem lên men. Loại cơ
chất mà vi khuẩn lactic có thể chuyển hóa rất phong phú, có thể là protein,
cellulose, glucose hay tinh bột nhờ vào hệ enzyme phong phú. Vì vậy ba hoạt
tính sinh amylase, cellulase, protease của vi khuẩn lactic là một tiêu chuẩn quan
3

trọng để tuyển chọn ra các chủng vi khuẩn lactic có những đặc tính sinh học
mong muốn sử dụng trong các quá trình lên men. Đây là hướng nghiên cứu rất
có triển vọng để nhằm phát hiện và ứng dụng những nguồn enzyme mới trong tự
nhiên làm tăng hiệu suất lên men trong sản xuất các sản phẩm lên men, từ đó
giúp giảm bớt tác hại của các chất hóa học và giảm giá thành sản phẩm.
1.1.2. Phân loại vi khuẩn lactic
1.1.2.1. Phân loại vi khuẩn lactic theo Orla-Jensen
Orla-Jensen đã phân loại vi khuẩn lactic dựa vào những đặc điểm hình thái
học (cầu khuẩn hoặc trực khuẩn), kiểu lên men, khả năng phát triển ở các nhiệt
độ khác nhau, mức độ sử dụng đường. Ông xếp chúng thành bốn giống:
Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus [17]. Ngày nay người
ta bổ sung thêm một giống nữa là Bifidobacterium có hình dạng biến đổi.
INCLUDEPICTURE
" \*
4

MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE
" />nmr/streptococcus20pneumoniae.jpg" \* MERGEFORMATINET
Hình 1.1: Một số hình ảnh về vi khuẩn lactic

- Lactobacillus: Trực khuẩn, kích thước từ 0,7-1,1àm đến 3-8àm có thể xếp
đôi, chuỗi hoặc đứng riêng rẽ. Nhiệt độ tối ưu là 30 - 45
o
C. Lên men được đường
galactose, glucose, fructose…Gồm có ba nhóm với ba loài đặc trưng: L.
bulgaricus, L. brevis, L. casei.
- Leuconostoc: Cầu khuẩn, có hình ovan hoặc hình trứng đường kính từ 0,5-0,8àm
và chiều dài khoảng 1,6àm. Lên men đường dextran, trioza, sản phẩm tạo thành là axit
D-lactic, etanol, CO
2
. Có 2 loài đặc trưng là L. mensenteroides và L. lactic.
5

- Pediococus: Trực khuẩn, tồn tại dưới dạng bát cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn. Lên
men đường glucose theo con đường EMP, axit tạo thành có dạng DL, D(-) hay
D(+). Có ba loài đặc trưng là P. acidilactici, P. dextranicum, P. halophilus.
- Streptococus và Lactococus: Cầu khuẩn, đường kính khoảng 0,5-1,0àm, sắp
xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc thành chuỗi dài xếp đôi. Có khả năng lên men đường
hexoza thành axit lactic và các loại đường khỏc. Cú ba loài đặc trưng được sử
dụng trong sữa: S. lactic, S. cremoris, S. thermophilus.
- Bifidobacterium: Trực khuẩn, gram dương, không chuyển động, không bào
tử. Phát triển ở nhiệt độ tối ưu từ 36 - 38
O
, pH tối ưu 6,5 - 7. Có khả năng lên
men lactoza sản phẩm tạo thành là axit lactic và axit axetic [18].
1.1.2.2. Phân loại vi khuẩn lactic dựa vào quá trình lên men
Lên men lactic là một trong những quá trình sinh hoá phổ biến trong thiên
nhiên, đó là quá trình chuyển hoỏ cỏc chất gluxit thành axit lactic nhờ hoạt động
sống trực tiếp của hệ vi sinh vật lactic.
Trong thiên nhiên vi khuẩn lactic tồn tại dưới hai dạng:

• Nhóm vi khuẩn lactic đồng hình: có khả năng phân huỷ đường đơn giản và tạo
nên axit lactic, đây là quá trình lên men lactic đồng hình.
C
6
H
12
O
6
→ 2CH
3
CH(OH)COOH + 22,5 Kcalo
Do hệ enzyme trong những vi sinh vật khác nhau thường khác nhau nên
cơ chế hoá học của quá trình lên men lactic ở các giống vi sinh vật thường không
giống nhau.
Ở vi khuẩn lactic đồng hình sự chuyển hoá đường thành axit lactic đi theo
con đường lên men rượu đến giai đoạn tạo axit pyruvic, axit này được khử hai
nguyên tử hidro nhờ hoạt động của lacticodehydrogenase để trở thành axit lactic.
6

CH
3
COCOOH + 2H CH
3
CHOHCOOH
• Nhóm vi khuẩn lactic dị hình: tạo ra quá trình lên men phức tạp hơn, gọi là lên
men lactic dị hình, chúng tạo nên trong môi trường ngoài axit lactic còn có nhiều
sản phẩm phụ: axit axetic, rượu etylic, CO
2
, H
2

, một số chất thơm như diacetyl
este.
C
6
H
12
O
6
→CH
3
CHOHCOOH +COOHCH
2
CH
2
COOH +CH
3
COOH + CH
3
CH
2
OH + CO
2
+ H
2
Số lượng các sản phẩm phụ này hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh
vật, môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh. Nói chung axit lactic
thường chiếm 40% lượng đường đó phõn huỷ, axit succinic gần 20%, rượu etylic
khoảng 10% và cỏc khớ vào khoảng 20%. Đôi khi lượng khí ít hơn và thay vào
đó là lượng axit formic.
Lên men lactic cần có sự lên men đồng thời của vi khuẩn lactic đồng hình

và dị hình. Vì quá trình lên men dị hình ngoài việc tạo thành axit lactic còn tạo
các sản phẩm phụ như axit và rượu sinh ra este có mùi thơm làm cho sản phẩm
có hương vị đặc trưng [14].
1.1.3. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic
Trong sinh giới có khoảng 400 – 500 chi vi khuẩn được biết đến, trong đó
đó cú 13 chi được biết đến là vi khuẩn lactic (xem bảng 1.1).
Bảng 1.1: Các chi và số loài của vi khuẩn lactic được biết đến.
Chi Loài Chi Loài
1. Lactobacillus 75 8. Lactococcus 8
7

2. Carnobacterium 6 9. Vagococcus 2
3. Lactosphaera 1 10. Leuconostos 10
4. Atopobium 3 11. Onenococcus 1
5. Weissella 7 12. Pediococcus 7
6. Streptococus 50 13. Tetragenococcus 2
7. Enterococcus 19
Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn sinh axit lactic phổ biến trong tự nhiên,
loại cơ chất mà vi khuẩn lactic tham gia chuyển hoá rất phong phú từ tinh bột,
cellulose, protein, vì vậy vi khuẩn lactic đã được phân lập từ rất nhiều nguồn
mẫu khác nhau từ thịt chua, cỏ ủ chua,
Nhìn chung vi khuẩn lactic cú cỏc đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hóa
như sau:
- Thuộc vi khuẩn Gram dương.
- Không sinh bào tử, không có khả năng di động.
- Hình dạng tế bào có thể là hình cầu như Streptococcus, Lactococcus,
Leuconostos, Pediococcus, hoặc hình que như Lactobacillus). Người ta phân
biệt chúng bằng khả năng lên men đồng hình hay dị hình.
- Phản ứng âm tính với catalase (đây là dấu hiệu của vi khuẩn kỵ khí).
- Có khả năng lên men đường để tạo axit lactic.

- Cấu tạo tế bào cũng mang đầy đủ cấu trúc của một tế bào nhân thật (thành tế
bào, màng tế bào, tế bào chất, thể nhân, ).
- Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về dinh dưỡng cũng khác nhau.
Chúng không những cần cung cấp đủ các chất dinh dưỡng: cacbon, nito, muối
khoáng mà còn cần các chất kích thích sinh trưởng [12, 13].
8

1.1.4. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến vi khuẩn latic
1.1.4.1. Ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng
Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phỏt
trỉờn cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu
suất thu hồi lớn nhất và giá thành rẻ. Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ
ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn ảnh
hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này.
 Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Vi khuẩn lactic sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon, từ các hexose
(glucose, fructose, manose, galactose), các đường đôi (saccarose, lactose,
maltose) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin).
Glucose ở dạng D- glucose, là loại monosaccarit hấp thụ dễ dàng nhất.
Chúng được vi sinh vật sử dụng đầu tiên rồi mới đến các loại khó chuyển hoá
hơn. Vì vậy trong quá trình sản xuất người ta thường đưa về loại đường này cho
vi sinh vật dễ sử dụng.
Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là monosaccrit và
disaccarit. Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng
cấu trúc tế bào và sinh ra các axit hữu cơ như axit citric, malic, pyruvic, fumaric,
axetic… Một vài loài vi khuẩn lactic lên men dị hình phân lập từ các sản phẩm
thực phẩm, có thể sử dụng các axit gluconic và galacturonic tạo thành CO
2
, axit
axetic và axit lactic. Trong quá trình lên men các cơ chất chứa cacbon, vi khuẩn

lactic có thể sử dụng cả các axit amin như axit glutamic, arginin, tirozin làm
nguồn cung cấp năng lượng. Khi đó tạo ra quá trình đề cacboxyl và tạo ra CO
2
.
Các loại vi khuẩn khác nhau đòi hỏi nguồn cacbon khác nhau. Một số loài vi
khuẩn lactic có thể sử dụng được dextrin và tinh bột. Sự phát triển của vi khuẩn
9

lactic với mỗi loại đường khác nhau sẽ tạo ra các tế bào có đặc điểm hình thái và
sinh lý khác nhau, vì vậy cũng sẽ có khả năng chống chịu khác nhau trước những
áp lực của các quá trình xử lý sau này [15, 16].
 Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Mỗi loài vi khuẩn khác nhau lại có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau. Phần
lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có
chứa nitơ nờn chỳng đòi hỏi nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Để sinh trưởng
và phát triển bình thường, ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các axit amin, vi khuẩn
lactic còn cần những hợp chất hữu cơ chứa nitơ như các sản phẩm thuỷ phân
protein từ lactanbumin, casein, pepton, peptit, dịch nấm men thuỷ phân, dịch
chiết thịt, trypton…Đõy cũng là nguồn nitơ thường xuyên được sử dụng để
chuẩn bị môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp ta cần nghiên
cứu những nguồn nitơ thích hợp để sản xuất giúp giảm giá thành sản phẩm mà
nâng cao được hiệu quả sản xuất. Trong đó dịch nấm men thuỷ phân được sử
dụng khá nhiều [15, 16].
 Ảnh hưởng của các muối vô cơ và chất kích thích sinh trưởng
Các muối vô cơ và các chất khoáng chỉ với lượng rất nhỏ nhưng lại có ảnh
hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Chẳng hạn đối với
Lactobacillus, Mn
2+
, Mg
2+

, Fe
2+
làm tăng cường sự phát triển của vi khuẩn lactic,
hay Ca
2+
tham gia vào cấu trúc protease thuỷ phân một số protein là nguồn dinh
dưỡng nuôi tế bào. Nhìn chung mangan và magie là những chất đúng cỏc vai trò
chủ yếu như: tham gia cấu trúc và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme,
giải độc cho tế bào khỏi sự có mặt của oxy, ổn định cấu trúc tế bào.
Các chất chứa axit béo có mặt trong môi trường cũng có ảnh hưởng không
nhỏ đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Chúng không những
kích thích sinh trưởng mà còn đóng vai trò trong quá trình lạnh đông sau này. Ví
10

dụ Tween 80 sẽ làm thay đổi một số axit béo trong tế bào vi khuẩn lactic, sự thay
đổi này ảnh hưởng đến khả năng chịu lạnh và khả năng chống chịu muối mặn
của vi khuẩn lactic [15, 16].
1.1.4.2. Ảnh hưởng của pH
Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sản sinh ra axit làm pH môi trường
giảm, khi pH môi trường giảm đến một mức nào đó nó sẽ ức chế chính sự phát
triển của vi khuẩn lactic. Vì vậy trong quá trình nuôi người ta phải luôn điều
chỉnh pH về khoảng tối thích cho vi khuẩn phát triển. Mỗi một loài vi khuẩn
lactic có một khoảng pH tối thích khác nhau, dao động trong khoảng 4,5-6,5,
nhưng cũng có một số chủng có thể phát triển ở pH=9,6 và một số hoạt động ở
pH=3,2 như Lactobacillus fermentum có thể chịu được pH=3 [17].
1.1.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi
khuẩn. Nhiệt độ ảnh hưởng đến các phản ứng enzyme của tế bào vi sinh vật.
Nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzyme, làm
đình trệ các phản ứng trao đổi chất và do đó ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng

và phát triển của vi khuẩn. Ví dụ vi khuẩn Lactobacillus fermentum là loài ưa
ấm, phát triển tốt ở nhiệt độ 37
0
C [16].
1.1.2. Những ứng dụng của vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là
trong các ngành công nghiệp như: công nghiệp chế biến sữa, công nghiệp sản
xuất axit lactic, công nghiệp chế biến, bảo quản rau quả và trong chế biến thức
ăn gia súc.
11

Trong công nghiệp chế biến sữa, vi khuẩn lactic đóng vai trò quyết định và
tạo hương vị cho sản phẩm. Chúng được sử dụng để chế biến nhiều loại sữa
chua, phomat,… Các chủng vi khuẩn lên men lactic để sản xuất sữa chua như
Streptococcus, S. cremoris, và một số loại sinh hương. Sữa được làm chín tạo
thành phomat nhờ một số chủng vi khuẩn như: Streptococcus, S. cremoris,
Lactococcus casei, L. helventicum. Để sản xuất bơ, nguyên liệu váng sữa được
cấy là Streptococcus lactic, S. cremoris, Leuconostoc cremoris. Ngoài ra cũn cú
cỏc chủng vi khuẩn khác sinh hương tốt như: Streptococcus citrovorus, S.
parcitrovorus, S. diacetylactic [13].
Trong công nghiệp sản xuất bánh mỳ, vi khuẩn lactic có tác dụng làm cho
bột chua và làm nở bột bánh mỳ.
Từ những năm 1894, vi khuẩn lactic đã được ứng dụng để sản xuất axit
lactic phục vụ cho các ngành công nghiệp thuộc da, vải sợi, dược phẩm.
Ngày nay, hơn một nửa sản phẩm axit lactic trên thế giới được sử dụng
trong công nghiệp thực phẩm, khoảng một phần năm là sử dụng Stearoyl -2-
lactylate trong sản xuất công nghiệp, còn lại sử dụng ở công nghiệp dược và một
số ngành kỹ thuật khác. Axit lactic được bổ sung vào nước chiết quả, nước
chanh, nước cam,… dùng trong công nghiệp đồ hộp, thịt cá, rau quả.
Vi khuẩn lactic còn được sử dụng làm vi khuẩn chỉ định trong nhiều

phương pháp xác định vitamin và axit amin, dựa trên nguyên lý là khi sinh
trưởng vi khuẩn này bắt buộc phải có một số axit amin hoặc vitamin riêng biệt.
Do tính nhạy cảm với những axit amin và vitamin đú nờn một số vi khuẩn lactic
được dùng để phân tích các chất này trong các môi trường khác nhau.
Vi khuẩn lactic còn được ứng dụng trong việc bảo vệ sức khỏe con người,
tăng cường tính miễn dịch, làm giảm lượng cholesterol trong máu, chống ung
thư và tăng cường cạnh tranh với vi sinh vật gây hại.
12

Ngoài ra vi khuẩn lactic còn có khả năng sinh bacterioxin, có thể ức chế các
vi khuẩn Gram dương. Nhờ đặc tính quý giá này mà vi khuẩn lactic được sử
dụng rất hiệu quả trong việc bảo quản thực phẩm để kéo dài thời hạn sử dụng.
Trong lĩnh vực chăn nuôi, vi khuẩn lactic cũng có một vai trò quan trọng,
nó được dùng để ủ chua thức ăn cho gia súc nhờ sự lên men lactic làm nâng cao
chất lượng thức ăn, giảm tỷ lệ hư hỏng, làm giàu thêm một số hoạt chất có lợi
cho quá trình sống của vi sinh vật. Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến
trong các trang trại chăn nuôi. Phương pháp này dựa vào sự chuyển hóa đường
có sẵn trong nguyên liệu của vi khuẩn lactic [9, 14].
1.2. Enzyme ngoại bào của vi khuẩn lactic
1.2.1. Khái niệm enzyme ngoại bào
Enzyme ngoại bào là những enzyme được tạo ra trong tế bào vi sinh vật
sau đó tiết vào môi trường trong quá trình nuôi cấy tế bào, để thực hiện chức
năng cụ thể phục vụ cho các hoạt động sống của vi sinh vật [1].
1.2.2. Đặc điểm – tính chất
Nếu như để thu nhận các enzyme nội bào thì công việc trước tiên là phải
phá vỡ tế bào để thu lấy dịch chiết mô hoặc tế bào có chứa enzyme. Còn đối với
các enzyme ngoại bào thỡ chúng được tiết vào môi trường nuôi cấy nên không
cần phải dựng cỏc biện pháp để phá vỡ tế bào, mà chỉ cần tinh sạch chúng từ môi
trường nuôi cấy, mặt khác các biện pháp phá vỡ tế bào thường rất khó khăn và
phức tạp như dùng siêu âm, dùng enzyme, máy nén sốc nhiệt, nghiền với thủy

tinh, … nhưng các phương pháp này cũng ảnh hưởng một phần đến hoạt tính của
enzyme [1].
Enzyme ngoại bào chủ yếu là enzyme thuỷ phân khử những khoáng chất
có trọng lượng phân tử cao vào những khối xây dựng của chúng bằng cách tạo
13

những phân tử ngậm nước. Điều này giúp phóng thích những phân tử nhỏ hơn,
có thể được vận chuyển vào tế bào và tiờu hoỏ [3].
Các enzyme ngoại bào tham gia thuỷ phõn cỏc hợp chất hữu cơ phổ biến,
đó là thuỷ phân tinh bột, thuỷ phân lipid, thuỷ phân casein, thuỷ phân gelatin.
1.2.2. Một số enzyme ngoại bào (amylase, cellulase,protease) của vi khuẩn
lactic
1.2.2.1. Amylase
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến có vai trò chuyển hóa tinh bột đã
hồ hóa, thậm chí cả tinh bột sống. Dựa trên tính chất và cách tác dụng lên tinh
bột mà phân biệt amylase thành α – amylase, β – amylase, glucoamylase, và
oligo 1- 6 glucozitase.
Hình 1.2: Cấu trúc không gian phân tử α – amylase
Amylase phân hủy tinh bột giải phóng ra glucose ở dạng α – amutanmer
nên được gọi là α - amylase. α - amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần
axit amin khác nhau, mỗi loại α - amylase có một tổ hợp axit amin đặc hiệu
riêng. α – amylase là một protein giàu thyrosine, tryptophan, axit glutamic và
aspartic. Nó có khả năng phân cắt các liên kết α – 1,4- glucozit nằm ở phía bên
trong phân tử cơ chất một cách ngẫu nhiên, không theo trật tự. Liên kết α – 1,6 –
14

glucozit không bị thủy phân sẽ kìm tỏa các mối liên kết α – 1,4- glucozit gần nó
làm cho α - amylase không được tác dụng, vì thế với amylopectin thì sản phẩm
tạo ra là các dextrin chứa cả liên kết α – 1,4 và α – 1,6 – glucozit [ ]. Điều kiện
tối ưu cho sự hoạt động của α – amylase từ các nguồn khác nhau thường không

giống nhau. Những khác biệt về tính chất (nhiệt độ, pH tối thích, mức độ thủy
phân) của α – amylase từ các nguồn khác nhau đang mở ra nhiều khả năng to lớn
cho việc ứng dụng chúng một cách thích hợp và đầy hiệu quả ở các giai đoạn
khác nhau trong quá trình lên men [6].
β – Amylase phân giải 100% amylose thành mantose, phân giải 55%
amylopectin thành mantose. Mantose tạo thành có cấu hình β, do vậy enzyme
này được gọi là β – amylase. β – Amylase xúc tác thủy phân liờn kết 1,4 –
glycozit trong tinh bột, glycogen và polysaccarit đồng loại, phân cắt tuần tự gốc
glucose từ đầu không khử mạch. β – amylase hầu như không thủy phân hạt tinh
bột nguyên vẹn mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột [6].
Glucoamylase là một exoenzyme, thủy phân liên kết α – 1,4 glycozit trong
phân tử polysaccarit tách tuần tự từng gốc glucose một khỏi đầu không khử của
mạch. Nó cũng thủy phân liên kết α– 1,6 glucozit và α– 1,3 glucozit chịu ảnh
hưởng của kích cỡ cấu trúc phân tử và các liên kết kế bờn.Tại cỏc điểm phân
nhánh tốc độ thủy phân chậm hơn. Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn
toàn tinh bột, amylopectin, dextrin cuối, izomantra và mantose tới glucose.
Oligo – 1,6 glucozitase thủy phân các liên kết α – 1,6 glycozit trong
izomantose, trong các dextrin tới hạn có khả năng chuyển hóa chất này tới đường
lên men được. Oligo – 1,6 glucozitase thủy phân mạnh hơn α, β – amylase.
* Ứng dụng của amylase
15

Ngày nay với sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật cũng như công nghệ sinh
học, amylase được sản xuất với lượng lớn và ứng dụng rộng rãi vào công nghiệp
lên men, y học và nhiều lĩnh vực liên quan khác. Cụ thể là:
Trong chăn nuôi: Kết hợp giữa các chủng vi sinh vật có hoạt tính amylase
mạnh với nhau và từ đó sản xuất ra các chế phẩm dùng để ủ thức ăn chăn nuôi
cho gia súc rất giàu dinh dưỡng giúp tăng năng suất trong chăn nuôi mà giá
thành lại không cao, nước ta đã ứng dụng rộng rãi phương pháp này vào các trại
chăn nuôi bò sữa, trại chăn nuôi lợn và thu được hiệu quả kinh tế cao.

Trong công nghiệp rượu cồn: Nhiều năm gần đây chế phẩm α – amylase
đã hoàn toàn thay thế malt trong sản xuất rượu, cồn và kết quả đem lại là tiết
kiệm được hàng chục tấn lúa mạch có chất lượng, tăng năng suất rượu, thời gian
sản xuất chế phẩm được rút ngắn, giảm chi phí cho sản xuất và tiết kiệm điện
năng.
Trong công nghiệp bia: Nguyên liệu chính trong quy trình sản xuất bia là
malt đại mạch, trong những trường hợp malt không đảm bảo chất lượng thì hiện
nay ở nhiều nước trên thế giới người ta thay thế 25 – 50% malt bằng các nguyên
liệu thay thế (nguyên liệu phi malt) đó là các hạt chưa nảy mầm như đại mạch
loại hai, loại ba, ngụ…trong trường hợp này người ta phải bổ sung chế phẩm
amylase để có được chất lượng dịch lên men được đảm bảo [8].
Trong sản xuất bánh mỳ: Nếu thêm vào bột nhào 0,002-0,003g chế phẩm
amylase sẽ làm cho hương vị, màu sắc, thể tích riêng và độ xốp của bánh mỳ
tăng lên một cách rõ rệt.
Trong công nghiệp dệt: Chế phẩm amylase được dùng để rũ hồ vải trước
khi nhuộm, rũ hồ bằng enzyme không những nhanh, không hại vải, độ mao dẫn
tốt mà còn đảm bảo vệ sinh do đó tăng được năng suất lao động.
16

Trong y học: Dùng α – amylase sản xuất glucose tiêm hoặc bổ trợ cho bữa
ăn của bệnh nhân khi cơ thể bị yếu.
1.2.2.2. Cellulase
Cellulase là một hệ enzyme cảm ứng thuỷ phân cellulose tạo thành sản
phẩm cuối cùng là glucose. Hệ cellulase gồm ít nhất ba loại chính:
- Endoglucanase thuỷ phân liên kết β-1,4-glucoside bên trong mạch
cellulose tại vùng vô định hình một cách ngẫu nhiên, tạo ra các
oligosaccharide có độ dài khác nhau và các điểm cuối mạch mới [18,
19, 20].
- Exoglucanase thủy phân từ đầu mạch cellulose tạo thành các sản phẩm
chính là cellobiose hoặc glucose. Có hai loại exoglucanase

(cellobiohydrolase – CBH), một loại thuỷ phân từ đầu khử, một loại
thuỷ phân từ đầu không khử [18, 19, 20].
- β- glucosidase thủy phân cellodextrin và cellobiose thành glucose [18,
19, 20].
Cấu trúc chung của hầu hết các cellulase là cấu trúc module. Cấu trúc này
thường bao gồm: module xúc tác (catalytic module) và module liên kết với
carbohydrate (carbohydrate binding module – CBM) [18]. CBM gắn với bề
mặt cellulose, làm cho module xúc tác gần với cơ chất. Sự có mặt của CBM
đặc biệt quan trọng với việc khởi đầu cũng như toàn bộ quá trình hoạt động
của exoglucanase. CBM còn có khả năng “búc” cỏc sợi cellulose khỏi cấu trúc
vi sợi do đó làm tăng tốc quỏ trỡnh thuỷ phân [118]. Các enzyme trong hệ
cellulase không hoạt động riêng lẻ mà kết hợp với nhau để thuỷ phân cellulose
một cách hiệu quả nhất.
17

Hình 1.3: Cấu trúc không gian của phân tử cellulase
 Ứng dụng của cellulase
Cellulase có rất nhiều ứng dụng trong đời sống, cũng như trong công
nghiệp chế biến. Chế phẩm cellulase thường dùng để:
- Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc.
Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật.
- Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dựng nú
để tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực
phẩm thực vật.
Trong sản xuất bia: Dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong
đó có cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho
tác động của protease và đường hóa.
Trong sản xuất agar-agar: Tác dụng của chế phẩm cellulase sẽ làm tăng
chất lượng agar-agar hơn so với phương pháp dùng axit để phá vỡ thành tế bào.
Đặt biệt là việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật đem

thủy phân, dùng làm thức ăn gia súc và công nghệ lên men.
18

Sử dụng cellulase để phá vỡ thành tế bào để tạo tế bào trần (protoplast),
có ý nghĩa rất lớn trong việc tiến hành các kỹ thuật chuyển nạp gen: dung hợp tế
bào trần tạo tế bào lai mang đặc điểm của cả tế bào bố và tế bào mẹ.
1.2.2.3. Protease
Protease (peptit – hidrolase 3.4) là tên gọi chung cho nhóm enzyme xúc
tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử
protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin, pepton hoặc di-
tripepton. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phõn liờn kết este
và vận chuyển axit amin [17].
Hình 1.4: Cấu trúc không gian của phân tử Protease
* Các loại protease:
Protease được phân loại dựa trên các đặc điểm riêng của chúng cũng
như cấu tạo trung tâm hoạt động enzyme, hiện tại được chia làm hai loại
endopeptidase và exopeptidase.
19

 Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được chia làm
hai loại:
Aminopeptidase: xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết peptid ở đầu N
của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một axit amin, một dipeptid hoặc một
tripeptid.
Cacboxypeptidase: xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết peptid ở đầu C của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một axit amin, hoặc một dipeptid.
 Dựa vào động học của cơ chế xúc tác endopeptidase được chia ra làm
bốn nhóm:
Serine proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc Serine
trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng trong hoạt động xúc

tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotripsin và subtilisin.
Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính
đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
Cysteine proteinase: là những proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm
hoạt động. Các cysteine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng pH trung tính
và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
Aspartic acid proteinase: hầu hết các aspartic proteinase đều thuộc nhóm
pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiờu hoỏ như pepsin, chymosin,
rennin,… các aspartic proteinase có chứa các cacboxyl trong trung tâm hoạt
động và thường hoạt động mạnh ở vùng pH trung tính.
Metallo proteinase: Các metallo proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng
pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA [18].
 Ngoài ra protease còn được phân loại theo cách đơn giản hơn thành
ba nhóm:
20

- Protease acid: pH 2 – 4
- Protease trung tính: 7 – 8
- Protease kiềm: 9 – 11
* Ứng dụng của protease
Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công
nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp, …
[18].
Trong công nghiệp chế biến thịt: Protease được dùng làm mềm thịt nhờ
sự thuỷ phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềm
thích hợp. Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: nếu dùng axit để thuỷ phân
sẽ mất đi hoàn toàn các axit amin chứa lưu huỳnh, nếu dùng kiềm để thuỷ
phân sẽ bị rexamic hoá (chuyển dạng L sang dạng D làm giảm giá trị sinh học
của axit amin). Ưu điểm của việc thuỷ phân protease bởi enzyme là bảo toàn
được vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫm

màu dịch thuỷ phân.
Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm, thời gian chế biến
thường dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc vào rất nhiều địa
phương, phương pháp gài nén nguyên liệu cỏ. Nờn hiện nay quy trình sản xuất
nước mắm đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme vi sinh vật để
rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm.
Trong công nghiệp sữa: Protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ
hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Trong công nghiệp sản xuất bánh mỳ, bánh
quy, … protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ
xốp và nở tốt hơn.
21

Trong sản xuất bia: Chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc
làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc.
Trong công nghiệp da: Protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thuỷ
phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da
bị cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo
nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da.
Trong công nghiệp dệt: Protease được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ
nhân tạo (các sợi nhân tạo được bằng các dung dịch casein, gelatin) để sợi được
bóng, dễ nhuộm. Protease có tác dụng thuỷ phân lớp protein serisin đã làm dính
bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các sợi tơ tằm, do đó làm giảm
lượng hoá chất để tẩy trắng.
Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác
như: điều chế dịch đạm thuỷ phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong
thực phẩm, và sản xuất một số thức ăn kiêng.
CHƯƠNG 2
MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh

axit lactic và enzyme ngoại bào (amylase, cellulase và protease) cao.
22

2.2. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic từ các nguồn mẫu là
nước bún ủ chua, nước dưa muối, cà muối, nem chua thu thập tại Hà Nội;
- Xác định hoạt tính một số enzyme ngoại bào (amylase, cellulase và
protease) của các chủng vi khuẩn lactic đã tuyển chọn;
- Xác định một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào, đặc điểm
sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn lactic đã tuyển chọn được;
- Xác định một số nhân tố (nguồn cacbon, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy)
ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng đã tuyển
chọn;
- Xác định tên loài các chủng vi khuẩn lactic sinh enzyme ngoại bào cao đã
được tuyển chọn.
2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Vật liệu
2.3.1.1. Nguồn mẫu chứa vi sinh vật
Nguồn mẫu là từ nước bún ủ chua, nước dưa muối, cà muối và nem chua
được thu thập ở các chợ và một số gia đình làm bún thủ công tại Hà Nội.
2.3.1.2. Hóa chất
Các hóa chất được sử dụng nhiều trong nghiên cứu là những hóa chất hiện
có ở phòng Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (VTCC) do Việt Nam, Nhật Bản và
Trung Quốc sản xuất như cao thịt, cao nấm men, peptone, glucose, …
2.3.1.3. Dụng cụ
- Tủ cấy (Box laminar PII) – Đức
23

- Tủ ấm Memmert – Đức
- Tủ lạnh

- Tủ sấy
- Máy lắc ổn nhiệt
- Máy ly tâm Sigma – Mỹ
- Kính hiển vi điện tử Axio
- Kính lúp 3D
- Nồi hấp khử trùng Lequenx – Pháp
- Máy đo pH Accument – Mỹ
- Cân điện tử AL300 – Mỹ
Ngoài ra còn có rất nhiều dụng cụ phục vụ công tác nghiên cứu làm thí
nghiệm khác như hộp lồng (đĩa petri), ống nghiệm, pipet, bình tam giác với đủ
các dung tích khác nhau, đèn cồn, que cấy, que gạt,…
2.3.1.4. Môi trường dùng trong nghiên cứu
Môi trường MRS (g/l) dùng cho giai đoạn phân lập và nuôi cấy vi khuẩn
lactic.
Thạch - 15,0 g; Glucose - 20,0 g; CaCO
3
- 5,0 g; Cao thịt - 10,0 g; Cao
men - 5,0 g; Pepton - 10,0 g; Tween 80 - 1,0 ml; K
2
HPO
4
- 2,0g; CH
3
COONa
-5,0 g; Triamoniumcitrat - 2,0 g; MgSO
4
.7H
2
O - 0,58g; MnSO
4

.4H
2
O - 0,28 g;
H
2
O - 1000,0ml. pH = 7, khử trùng ở 121
o
C/ 15 phút
Khi nuôi cấy vi khuẩn lactic với mục đích thu sinh khối hoặc thu nhận các
enzyme ngoại bào, axit lactic thì sử dụng môi trường MRS ở dạng dịch thể
không bổ sung thạch và CaCO
3
.
24

Môi trường nuôi cấy xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hóa:
Các môi trường dùng cho bước xác định hoạt tính của các enzyme ngoại
bào (amylase, cellulose, protease) của vi khuẩn lactic.
Môi trường tinh bột (g/l) để xác định hoạt tính amylase.
Thạch - 17,0 g; Tinh bột tan - 1,0 g; H
2
O - 1000,0 ml; pH = 7, khử trùng ở
121
O
C/ 15 phút.
Môi trường CMC (g/l) để xác định hoạt tính cellulase.
Thạch - 17,0 g; CMC (carboxymethyl cellulose) - 1,0 g; H
2
O - 1000,0 ml;
pH = 7, khử trùng ở 121

O
C/ 15 phút.
Môi trường Casein (g/l) để xác định hoạt tính protease.
Thạch - 17,0 g; Casein không thủy phõn - 1,0 g;H
2
O - 1000,0 ml; pH = 7,
khử trùng ở 121
O
C/ 15 phút.
Chú ý: Với môi trường có chứa cơ chất là casein, phải hòa tan casein
trong dung dịch NaOH 0,1N đến khi casein tan hoàn toàn, sau đó chỉnh pH
môi trường bằng 7.
Môi trường thạch thường (g/l) dùng cho bước kiểm tra hoạt tính kháng
khuẩn của vi khuẩn lactic.
Thạch - 15,0 g; Pepton - 5,0 g; NaCl - 1,0 g; Cao thịt - 2,0 g;H
2
O - 1000,0
ml; pH = 7, khử trùng ở 121
O
C/ 15 phút.
2.3.2. Phương pháp tiến hành thí nghiệm
2.3.2.1. Phân lập và thuần khiết giống
 Phân lập
25