Luận án tiến sĩ Nghiên cứu phát triển vắc xin viêm gan A bất hoạt trên dòng tế bào MRC5 ở quy mô phòng thí nghiệm (TT)

Bộ giáo dục và đào tạo Bộ quốc phòng
Học viện quân y



NGUYN TH VN QUNH



Nghiên cứu phát triển vắcxin viêm gan a bất hoạt
Trên dòng tế bào mrc5 ở quy mô phòng thí nghiệm

Chuyờn ngnh: Vi sinh y hc
Mó s: 62. 72. 01.15




Tóm tắt luận án tiến sĩ y học







Hà nội 2015

CÔNG TRÌNH HOÀN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y



Ngêi híng dÉn khoa häc:

1. GS. TSKH. Nguyễn Thu Vân.
2. TS. Đỗ Tuấn Đạt.

Phản biện 1: GS.TS. Nguyễn Đình Bảng

Phản biện 2: PGS.TS. Đinh Hữu Dung

Phản biện 3: PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai


Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án
cấp trường tại Học viện Quân y
Vào hồi : giờ ngày tháng năm 2015


Có thể tìm hiểu luận án tại:

1. Thư viện Quốc gia

2. Thư viện Học viện Quân y

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN
CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN


1. Nguyễn Thị Vân Quỳnh, Đỗ Thủy Ngân, Nguyễn Thu Vân, Đỗ Tuấn
Đạt (2013) ,“ Tính an toàn và sinh miễn dịch của vắc xin viêm gan A sản
xuất trên nuôi cấy tế bào MRC5 tại Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1”,
Tạp chí Y học Việt Nam, 408 (1), tr. 108-110.


2. Nguyễn Thị Vân Quỳnh (2014), “Xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu của
chủng vi rút viêm gan A HM175 trên nuôi cấy tế bào MRC5”, Tạp chí Y
học Việt Nam, 414 (2), tr. 28-30.






CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Desoxyribonucleic acid (Axít desoxyribonucleic)
ARN Ribonucleic acid (Axít ribonucleic)

CDC Centers of Diseases Control and Prevention
(Trung tâm dự phòng và kiểm soát bệnh – Mỹ)
ECACC The European Collection of Cell Cultures
(Ngân hàng tế bào châu Âu)
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
(Kỹ thuật miễn dịch gắn men)
FBS Fetal Bovine Serum (Huyết thanh bê bào thai)
HAV Hepatitis A virus (Vi rút viêm gan A)
MEM Minimum Essential Medium (môi trường tối thiểu)
MOI Multiplicity of Infection (Liều gây nhiễm)
MRC5 Medical Reseach Council (Tế bào lưỡng bội phổi người)
MSV Master seed virus (Chủng vi rút giống gốc)
p Passage (Đời cấy truyền)
PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)
PFU Plaque Forming Unit
SDS-PAGE Sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
(Điện di trên gel polyacrylamid)
VABIOTECH
Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1
VGA Viêm gan A
VXVGA Vắc xin viêm gan A
WSV Working seed virus (Chủng vi rút sản xuất)
WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm gan A (VGA) là bệnh truyền nhiễm thường gặp do vi rút viêm
gan A gây nên. Bệnh phổ biến trên toàn thế giới và có thể phát triển thành
dịch trong cộng đồng đặc biệt ở các nước đang phát triển. Việt Nam là
quốc gia nằm trong vùng lưu hành cao của vi rút VGA với hơn 90% dân
số phơi nhiễm với vi rút. Bệnh có thể dự phòng được bằng vắc xin.
Vắc xin viêm gan A (VXVGA) đã được sản xuất bởi một số nước
tiên tiến trên thế giới bằng công nghệ sử dụng tế bào MRC5 (MRC5- tế
bào lưỡng bội phổi người), với các ưu điểm:
- Tế bào MRC5 có nguồn gốc từ người nên sử dụng dòng tế bào này
để sản xuất vắc xin sẽ hạn chế các nguy cơ gây dị ứng cho người sử dụng
so với các dòng tế bào có nguồn gốc từ động vật.
- Sử dụng tế bào MRC5 để sản xuất vắc xin thì có thể chủ động và
dễ mở rộng quy mô sản xuất .
- Tế bào MRC5 có thể tạo thành hệ thống ngân hàng tế bào với sự
kiểm tra chất lượng đầy đủ và không có đặc tính sinh khối u.
- Tế bào MRC5 đã được cấp phép sản xuất nhiều loại vắc xin trên
TG với chất lượng tốt.
Việt Nam chưa sản xuất vắc xin viêm gan A trên MRC5, hơn nữa
việc chuyển giao công nghệ sản xuất vắc xin viêm gan A vào Việt Nam
còn khó khăn.
Để tiến tới tự lực sản xuất vắc xin viêm gan A trên tế bào MRC5 ở
Việt Nam nhằm nhằm giảm giá thành của vắc xin so với vắc xin nhập
ngoại và đáp ứng nhu cầu vắc xin phòng bệnh cho cộng đồng, đề tài:
“Nghiên cứu phát triển vắc xin viêm gan A bất hoạt trên dòng tế bào
MRC5 ở quy mô phòng thí nghiệm” được tiến hành với 3 mục tiêu :

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1. Thích ứng chủng vi rút viêm gan A HM 175 trên tế bào MRC5
để sản xuất vắc xin viêm gan A.
2. Xây dựng quy trình sản xuất vắc xin viêm gan A bất hoạt trên
nuôi cấy tế bào MRC5 quy mô phòng thí nghiệm.
2



3. Đánh giá chất lượng vắc xin viêm gan A trong quá trình sản
xuất và vắc xin thành phẩm.


CÁC ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1. Thích ứng và xác định được các đặc tính nhân lên của chủng trên
dòng tế bào MRC5 trong điều kiện tại Việt Nam.
2. Tạo được hệ thống chủng giống sản xuất VXVGA trên dòng tế
bào MRC5 đạt tiêu chuẩn chất lượng cho chủng giống vi rút sản
xuất vắc xin;
3. Xây dựng được quy trình gây nhiễm, nuôi cấy và thu hoạch vi rút
tối ưu để sản xuất vắc xin;
4. Sản xuất 03 loạt VXVGA trên tế bào MRC5 đạt tiêu chuẩn của
Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tiêu chuẩn cơ sở.
5. Quy trình sản xuất vắc xin hoàn thiện sẽ giúp Việt Nam có thể tự
chủ sản xuất VXVGA trên tế bào MRC5 trong nước, giảm giá
thành và chủ động trong dự phòng bệnh cho cộng đồng.

CẤU TRÚC LUẬN ÁN

Luận án gồm có 112

trang không kể phụ lục, gồm 4 chương, 24 bảng,
4 biểu đồ, 15 hình, 103 tài liệu tham khảo.
Bố cục luận án gồm:
 Đặt vấn đề 02 trang;
 Chương 1: Tổng quan tài liệu 30 trang;
 Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 24 trang;
 Chương 3: Kết quả nghiên cứu 25 trang;
 Chương 4: Bàn luận 27 trang;
 Kết luận 02 trang; Kiến nghị 01 trang; Danh mục các công trình
nghiên cứu có liên quan 01 trang.
 Tài liệu tham khảo (tổng số 103 tài liệu, 25 tài liệu tiếng Việt, 78
tài liệu tiếng Anh).

3



CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Những hiểu biết hiện nay về vi rút viêm gan A
* Đặc điểm sinh học của vi rút viêm gan A: Vi rút viêm gan A được
Feinstone phát hiện lần đầu tiên vào năm 1973 bằng phương pháp hiển vi
điện tử miễn dịch. Vi rút viêm gan A nhỏ, thuộc họ Picornaviridae, có lõi
là 1 sợi ARN đơn và capsid đối xứng hình khối với 4 protein cấu trúc
VP1, VP2, VP3, VP4. Vi rút VGA được phân loại thành 07 kiểu gen (từ I
đến VII). Hầu hết các chủng vi rút gây bệnh ở người thuộc kiểu gen I
(80%) và III. Vi rút VGA chỉ có 1 týp huyết thanh.
Vi rút VGA nhân lên trong tế bào chất của tế bào gan và giải phóng
theo cơ chế nẩy chồi. Vi rút VGA nhân lên chậm, kéo dài và sản lượng vi
rút thấp. Do đó, việc nhân nuôi vi rút để sản xuất vắc xin gặp nhiều khó

khăn. Cho đến năm 1995, vắc xin VGA bất hoạt đầu tiên mới được cấp
phép sử dụng trên người.
* Đặc điểm sinh bệnh học, dịch tễ viêm gan vi rút A :
Đường lây bệnh chủ yếu của vi rút VGA là đường phân – miệng. Sau
khi xâm nhập vào đường tiêu hóa, vi rút vào máu sau đó nhân lên ở tế bào
gan.
Trên thế giới : Tỷ lệ nhiễm vi rút VGA khác nhau ở các khu vực, dao
động từ 15-100% dân số và có liên quan chặt chẽ với tình trạng kinh tế, xã
hội và vệ sinh môi trường. Ước tính có khoảng 1,5 triệu người mắc VGA
cấp tính hàng năm và số lượng nhiễm trùng vi rút VGA thật sự có thể cao
hơn gấp 10 lần.
Việt Nam là nước có mức độ lưu hành cao của vi rút VGA. Tỷ lệ
nhiễm vi rút VGA trong cộng đồng là 97%, tỷ lệ nhiễm tăng dần theo tuổi,
từ 62% ở nhóm dưới 5 tuổi, tới gần 100% ở nhóm trên 10 tuổi.
Các biện pháp dự phòng : Để phòng chống bệnh VGA cần thực hiện
nhiều biện pháp đồng thời : vệ sinh an toàn thực phẩm, cung cấp nước
sạch, cải thiện môi trường sống, phát hiện sớm, cách ly và điều trị tích cực
bệnh nhân VGA. Phòng bệnh khẩn cấp bằng cách sử dụng Glubolin miễn
dịch. Tạo miễn dịch chủ động bằng vắc xin là biện pháp dự phòng có hiệu
quả làm giảm tỷ lệ mắc VGA trong cộng đồng, với thời gian bảo vệ kéo
dài.




4



1.2. Các loại vắc xin viêm gan A và quy trình sản xuất

Nghiên cứu phát triển VXVGA bắt đầu từ bước chọn chủng, xây
dựng quy trình nuôi cấy, quy trình tinh chế, bất hoạt và bổ sung tá chất,
chất bảo quản để tạo thành vắc xin.
Bảng 1.1: Các vắc xin viêm gan A bất hoạt được lưu hành
Vắc xin
(Hãng sản
xuất)
Loại
tế bào

Chủng
virut
Phương pháp cô
đặc và tinh khêt
Phương pháp
Bất hoạt
Tá chất Chất bảo
quản
HAVRIX,
TWINRIX
(GSK)
MRC5 HM175 Siêu lọc và sắc
ký lọc gel
Formallin
1/4000/37oC/
15 ngày
Al(OH)3 2-phenoxyl-
ethanol
AVAXIMTM
(Aventis

Pasteur)
MRC5 GBM Sắc ký trao đổi
ion va sắc ký
lọc gel
Formallin
1/4000/37oC/
14ngày
Al(OH)3 2-phenoxyl-
ethanol
EPAXAL
BERNA®
(Crucell )
MRC5 RG-SB - Formallin Visosom
e virus
cúm
H1N1
Kháng sinh

VAQTA®
(Merck)
MRC5 CR326 Tủa PEG và sắc
ký lỏng
Formallin
37oC/
5 ngày
Al(OH)3

2-phenoxyl-
ethanol
HAVAX

(VABIOTECH
, Việt Nam)
PMMK HM175 Siêu lọc & thẩm
tích
Formallin
37oC/
4ngày
Al(OH)3

2-phenoxyl-
ethanol
(VABIOTECH: Công ty Vắc xin và Sinh phẩm số 1)
Nuôi cấy thành công vi rút VGA trên tế bào mở ra sự phát triển các
VXVGA. Vắc xin VGA bất hoạt đầu tiên được cấp phép và sử dụng năm
1995 ở Mỹ. Hiện nay có 4 loại VXVGA bất hoạt được cấp phép đó là
Avaxim, Epaxal, Havrix,Vaqta - sản xuất từ nhân nuôi các chủng vi rút
viêm gan A (HAV) khác nhau trên MRC5, sau đó hỗn dịch vi rút thu
hoạch được cô đặc và tinh khiết rồi được bất hoạt bằng formallin bổ sung
chất bảo quản, tá dược và đóng lọ.
Đáng chú ý là 1 quy trình tinh chế vi rút viêm gan A có thể là sự phối
hợp của nhiều phương pháp tinh chế như phối hợp sắc ký trao đổi ion và
sắc ký lọc qua gel; hoặc cô đặc bằng tủa PEG kết hợp với sắc ký lỏng,
hoặc siêu lọc và sắc ký lọc gel hoặc cô đặc và tinh chế bằng siêu ly tâm
tùy theo “bí quyết” của nhà sản xuất VXVGA. Đa số các nghiên cứu về
VXVGA đều tập trung vào vắc xin bất hoạt vì tính an toàn cao của loại
vắc xin này.
5

VXVGA sống giảm độc lực với tên thương mại là MEVAX sản xuất từ
chủng H2 được sản xuất và sử dụng ở Trung Quốc.
* Phát triển VXVGA thường qua 4 bước cơ bản: Vi rút viêm gan A phải
trải qua quá trình thích ứng (chọn chủng) để có thể phát triển trên nuôi cấy
tế bào với lượng kháng nguyên đủ lớn để đưa vào sản xuất vắc xin và cuối
cùng là kiểm định chất lượng vắc xin. Đầu tiên vi rút cần phải trải qua quá
trình thích ứng với sự nhân lên trong nuôi cấy tế bào, với đặc điểm nhân
lên chậm, kéo dài kèm theo sản lượng vi rút thấp – là một trở ngại lớn
trong việc nhân nuôi vi rút viêm gan A cho sản xuất vắc xin. Mặt khác,
hiệu suất vi rút thu được phụ thuộc vào các điều kiện nuôi cấy như môi
trường, liều gây nhiễm, nhiệt độ và pH nuôi cấy. Do đó trong giai đoạn
thích ứng cần xác định được các điều kiện tối ưu để vi rút phát triển tốt
trên nuôi cấy tế bào.
Quy trình sản xuất VXVGA trên nuôi cấy tế bào bao gồm : Nhân nuôi tế
bào, gây nhiễm và nhân nuôi vi rút, cô đặc và tinh chế, bất hoạt vi rút và
pha vắc xin.
1.3. Các phương pháp kiểm tra chất lượng vắc xin viêm gan A
Kiểm tra chất lượng vắc xin là yêu cầu bắt buộc vì vắc xin khi đưa ra
sử dụng phải đảm bảo an toàn và có công hiệu bảo vệ. Việc kiểm định
chất lượng được thực hiện từ nguyên liệu nguồn, mỗi công đoạn của quá
trình sản xuất, ở bán thành phẩm và sản phẩm cuối cùng.
* Kiểm tra các nguyên liệu nguồn (tế bào, chủng giống vi rút) sử dụng
cho sản xuất vắc xin.
- Hệ thống ngân hàng tế bào bao gồm tế bào giống gốc và tế bào giống
sản xuất được kiểm tra chất lượng đầy đủ.
- Hệ chủng sản xuất vắc xin VGA (Chủng vi rút giống gốc -MSV và chủng
vi rút sản xuất -WSV) được lựa chọn, kiểm tra nhận dạng vi rút, hiệu giá
vi rút, các đặc tính di truyền sau khi thích ứng và tính sinh miễn dịch.
Ngoài các yêu cầu cơ bản của chủng giống như vô khuẩn, vô nấm, không
nhiễm Mycoplasma và các vi rút ngoại lai.

* Kiểm tra chất lượng vắc xin trong quá trình sản xuất
Kiểm tra chất lượng tế bào MRC5 trước khi cấy vi rút; kiểm tra các mẻ
gặt đơn; kiểm tra quá trình bất hoạt; kiểm tra bán thành phẩm
* Kiểm tra chất lượng vắc xin viêm gan A thành phẩm
- Các phương pháp kiểm tra sinh học: Kiểm tra vô khuẩn; kiểm tra an
toàn chung trên chuột nhắt và chuột lang; kiểm tra chất gây sốt; kiểm tra
công hiệu vắc xin VGA
6



- Các phương pháp kiểm tra hóa lý: Xác định pH, hàm lượng protein, hàm
lượng nhôm, hàm lượng formallin, 2-phenoxylethanol trong vắc xin.
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
- Chủng vi rút viêm gan A HM 175 (HAV HM175) do Trung tâm kiểm
soát bệnh tật Atlanta - Mỹ (CDC) cung cấp.
- Tế bào lưỡng bội phổi người MRC5, P19 (P – đời cấy truyền) do ngân
hàng tế bào châu Âu (ECACC-European Collection of Cell Cultures)
cung cấp. Tế bào thận khỉ thường trực Frhk-4 do CDC cung cấp.
- VXVGA mẫu chuẩn quốc gia iR/HA-02 do Viện Kiểm định Quốc gia
cung cấp. Động vật thí nghiệm, môi trường, hóa chất, sinh phẩm,
dụng cụ và trang thiết bị cần thiết để kiểm định chất lượng chủng giống,
nuôi cấy tế bào, cô đặc và tinh chế vi rút.
2.2. Phương pháp nghiên cứu: thử nghiệm phòng thí nghiệm.
Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Thích ứng và tạo chủng

Xây dựng quy trình sản xuất

Kiểm tra chất lượng

Chủng gốc
↓

Quy trình nuôi cấy tế bào
↓
- Vô khuẩn,
- Mycoplasma,
- Vi rút ngoại lai
Xác định khả năng nhân lên
và các điều kiện nuôi cấy tối
ưu của chủng gốc trên tế bào
MRC5
↓

Quy trình gây nhiễm vi rút

↓

Cấy truyền liên tiếp với các
điều kiện tối ưu đã xác định
↓
Nuôi cấy và thu hoạch vi
rút

↓
- Vô khuẩn
- Hiệu giá vi rút

Sản xuất chủng giống và
kiểm tra chất lượng
↓

Tinh sạch hỗn dịch vi rút
↓

- Hiệu giá vi rút


Sản xuất chủng sản xuất và
kiểm tra chất lượng

Bất hoạt vi rút
↓
- Kiểm tra bất hoạt
- Hàm lượng protein
- Vô khuẩn

Pha vắc xin
- Các thành phần hóa
học, vô khuẩn, chất gây
sốt, an toàn chung, công
hiệu.
7



2.2.1. Thích ứng vi rút viêm gan A HM175 trên tế bào MRC5
2.2.1.1. Xác định các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho HAV HM175 trên tế

bào MRC5 trong môi trường có huyết thanh
- Xác định sự nhân lên của vi rút trên tế bào MRC5 bằng kỹ thuật hiển vi
điện tử.
- Xác định các điều kiện nuôi cấy: như liều gây nhiễm, nhiệt độ
nuôi cấy, thời gian hấp phụ vi rút (với các thông số nghiên cứu
được xuất phát từ các nghiên cứu của các tác giả trên thế giới đã
công bố).Các thử nghiệm được tiến hành 03 lần để xác định độ lặp
lại. Tiêu chuẩn lựa chọn các điều kiện nuôi cấy thích hợp là dựa
trên hiệu giá vi rút (Lấy kết quả hiệu giá vi rút là thước đo để so
sánh và đánh giá các điều kiện nuôi cấy từ đó lựa chọn điều kiện
nuôi cấy thích hợp cho hiệu giá vi rút cao nhất trong các đk khảo
sát).
2.2.1.2. Cấy truyền thích ứng chủng HM175 trên tế bào MRC5
- Sử dụng phương pháp cấy truyền liên tiếp để thích ứng chủng trong các
điều kiện nuôi cấy thích hợp đã được xác định.
- Sử dụng vi rút thu hoạch ở thời điểm đạt hiệu giá cao nhất để cấy truyền
cho đời tiếp theo. Tiến hành cấy truyền liên tiếp đến khi hiệu giá vi rút đạt
10
6
– 10
8
(PFU/ml – đơn vị tạo đám hoại tử/ 1ml) và ổn định qua 3 đời cấy
truyền.
- Khi hiệu giá vi rút ở đời thứ n đạt trong khoảng 10
6
– 10
8
(PFU/ml), tiếp tục
cấy truyền 2 đời tiếp theo, nếu hiệu giá vẫn ổn định trong khoảng cho phép sẽ
lựa chọn đời thứ n làm MSV, đời thứ n+1 làm WSV.

- Điều kiện chọn chủng: chủng gốc giống (MSV), chủng sản xuất (WSV)
đạt từ 10
6
– 10
8
(PFU/ml).
2.2.1.3. Sản xuất và kiểm tra chất lượng chủng giống
*Sản xuất chủng gốc giống và chủng sản xuất
- Các bước sản xuất chủng tuân theo quy trình sản xuất chủng vi rút VGA
- đã được Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế cấp phép
để sản xuất VXVGA.
8



- Sản xuất MSV: Nuôi cấy chủng với liều gây nhiễm (MOI - Multiplicity
of Infection) và ở các điều kiện nuôi cấy thích hợp (đã xác định), thu
hoạch vi rút tại thời điểm đạt hiệu giá vi rút cao nhất, đông tan, ly tâm loại
bỏ tế bào, chia 1,5ml/ túyp, bảo quản chủng giống gốc ở -80
o
C.
- Sản xuất WSV: Tan băng chủng MSV, trộn đều, gây nhiễm với MOI
thích hợp trên tế bào MRC5. Quy trình nhân giống WSV tương tự như
nhân giống MSV.
* Kiểm tra chất lượng chủng giống: Theo hướng dẫn kiểm tra chất lượng
chủng giống vi rút VGA của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và Dược điển
châu Âu.
+ Nhận dạng:
- Phương pháp hiển vi điện tử: Nhận dạng vi rút trong tế bào MRC5
bằng kỹ thuật nhuộm âm bản cắt lát, soi hiển vi điện tử. Tiêu chuẩn chấp

thuận: Hình ảnh đặc trưng của vi rút hình cầu, kích thước 28 nm nằm
trong bào tương của tế bào.
- Phương pháp sinh học phân tử: Sử dụng phương pháp PCR (PCR- phản
ứng chuỗi polymerase) trực tiếp nhận dạng gen VP1, VP3. Dựa trên kết quả
so sánh với thang chuẩn, mẫu chứng dương, chứng âm để nhận định kết
quả. Tiêu chuẩn chấp nhận: Xuất hiện băng ADN có kích thước 248bp ở
các mẫu chủng MSV, WSV.
+ Kiểm tra vô khuẩn:
- Kiểm tra vi khuẩn, nấm: bằng phương pháp cấy trực tiếp trên môi
trường thioglycholate và soybean (Theo Phụ lục 15.7- Dược điển Việt
Nam 4).Tiêu chuẩn chấp thuận: Không có sự phát triển của vi khuẩn và
nấm sau 14 ngày theo dõi.
- Kiểm tra Mycoplasma bằng 2 phương pháp PCR và nuôi cấy. Tiêu
chuẩn chấp thuận: Không xuất hiện băng 270 bp và không có sự phát
triển của Mycoplasma trong môi trường nuôi cấy.
+ Kiểm tra hiệu giá vi rút và tính ổn định về hiệu giá bằng phương pháp
chuẩn độ hiệu giá vi rút trên tế bào Frhk4. Tiêu chuẩn chấp thuận: Hiệu
giá của chủng MSV và WSV đạt từ 10
6
-10
8
(PFU/ml).
+ Kiểm tra vi rút ngoại lai trên nuôi cấy tế bào (theo hướng dẫn của
WHO): Sử dụng 3 dòng tế bào Vero, PMMK, MRC5 để xác định vi rút
ngoại lai gây hủy hoại tế bào và hấp phụ hồng cầu trong hỗn dịch vi rút
9



giống. Tiêu chuẩn chấp thuận: Tế bào phát triển bình thường, không có sự

hủy hoại tế bào và không có vi rút hấp phụ hồng cầu.
+ Kiểm tra khả năng sinh miễn dịch: Tiêm 0,5 ml chủng HAV sống và đã
bất hoạt (bằng formallin nồng độ 1/2000, nhiệt độ 37
o
C/96 giờ) vào ổ
bụng chuột 11-13gam, theo lịch 0-1-2 tuần. Nhóm chứng tiêm VXVGA
mẫu chuẩn iRHA 02 (với hàm lượng protein các mẫu như nhau). Lấy máu
chuột trước khi tiêm (huyết thanh 1) và 5 tuần sau tiêm mũi thứ nhất
(huyết thanh 2). Xác định hiệu giá kháng thể đặc hiệu bằng thử nghiệm
ELISA. Tiêu chuẩn chấp thuận của nghiên cứu: Hàm lượng kháng thể
kháng vi rút viêm gan A (anti-HAV) ≥ 20 mIU/ml.
2.2.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vắc xin viêm gan A bất
hoạt trên nuôi cấy tế bào MRC5 quy mô phòng thí nghiệm
- Các quy trình nghiên cứu: quy trình nuôi cấy vi rút, quy trình thu hoạch
vi rút bao gồm: Xác định liều gây nhiễm vi rút tối ưu; Xác định môi
trường nuôi cấy vi rút không chứa huyết thanh tối ưu; pH tối ưu của môi
trường này; Xác định thời gian và số lần thu hoạch vi rút.
- Các quy trình kế thừa thành công của quy trình tinh sạch vi rút VGA
trong sản xuất Havax từ tế bào thận khỉ của Công ty Vắc xin và Sinh
phẩm số 1 bao gồm: quy trình ly tâm, cô đặc thẩm tích hỗn dịch vi rút; bất
hoạt vi rút và quy trình pha vắc xin.
* Nuôi cấy và chuẩn bị tế bào MRC5
Nuôi cấy và cấy truyền tế bào theo hướng dẫn của ECACC từ đời p26 đến
đời p32. Khi tế bào một lớp mọc kín 80% bề mặt nuôi cấy, tiến hành gây
nhiễm vi rút với điều kiện nuôi cấy tối ưu.
* Gây nhiễm, nuôi cấy và thu hoạch vi rút
Khảo sát các môi trường không chứa huyết thanh; liều gây nhiễm; thời
gian gặt và pH môi trường duy trì, để lựa chọn điều kiện nuôi cấy vi rút
tối ưu cho sản xuất vắc xin dựa trên việc so sánh hiệu giá vi rút thu được
sau nuôi cấy.

* Tinh sạch hỗn dịch vi rút
- Nước nổi tế bào ở các mẻ gặt đơn và sau đông tan lần thứ 3 được hộn
lại và ly tâm. Cặn tế bào thu được sau ly tâm được siêu âm theo 3 chu kỳ
và ly tâm để thu hoạch vi rút. Nước nổi sau ly tâm được cô đặc 20 lần
10



bằng hệ thống siêu lọc Pellicon cattset. Sau đó thẩm tích hỗn dịch vi rút
trong NaCl 8,5%.
- Kiểm tra trong quá trình sản xuất: Xác định hiệu giá vi rút sau cô đặc
bằng phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút trên tế bào.

* Bất hoạt vi rút bằng formallin ở nồng độ 1/2000/37
o
C trong 96 giờ.
Kiểm tra bất hoạt vi rút trên tế bào Frhk4 bằng phương pháp tạo đám hoại
tử (Lấy mẫu bất hoạt ở các thời điểm tại 0 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96
giờ sau bất hoạt). Tiêu chuẩn: Vi rút được bất hoạt hoàn toàn khi hiệu giá vi rút
bằng 0 PFU/ml.
* Pha vắc xin từ bán thành phẩm (sau quy trình bất hoạt - Bulk) dựa trên
hàm lượng protein (g/ml), sau đó bổ sung Tween20 1% (1/200), chất bảo
quản 2-phenoxylethanol (1/200), chất hấp phụ hydroxit nhôm (1/4) và môi
trường M199 vừa đủ.
2.2.3. Phương pháp kiểm tra chất lượng vắc xin viêm gan A trên nuôi cấy
tế bào MRC5 trong quá trình sản xuất và vắc xin thành phẩm
2.2.3.1. Kiểm tra chất lượng vắc xin trong quá trình sản xuất
* Kiểm tra chất lượng tế bào MRC5: Kiểm tra vô khuẩn; Kiểm tra
Mycoplasma; Kiểm tra các vi rút ngoại lai
* Kiểm tra hiệu giá vi rút : Bằng phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút

trên tế bào.
* Kiểm tra bất hoạt vi rút: (Theo thường quy kiểm tra bất hoạt vi rút VGA
tại VABIOTECH). Tiêu chuẩn chấp thuận: Vi rút được bất hoạt hoàn toàn
khi hiệu giá vi rút bằng 0 PFU/ml.
2.2.3.2. Kiểm tra chất lượng vắc xin thành phẩm
* Các phương pháp kiểm tra sinh học
+ Kiểm tra vô khuẩn bằng phương pháp cấy trực tiếp trên môi trường
Thioglycolate và Soybean (Theo dược điển Việt Nam 4). Tiêu chuẩn chấp
thuận: Không có sự phát triển của vi khuẩn và nấm.
+ Kiểm tra an toàn chung trên chuột nhắt và chuột lang (Theo phụ lục
15.11–Dược điển Việt Nam 4).Tiêu chuẩn chấp thuận: 100% chuột khoẻ
mạnh, tăng trọng và không có dấu hiệu bệnh lý.
11



+ Kiểm tra chất gây sốt (Theo phụ lục 15.12- Dược điển Việt Nam 4).
Tiêu chuẩn chấp thuận: Tổng nhiệt độ tăng của 3 thỏ sau 3 giờ theo dõi 
1,3
o
C. Tổng nhiệt độ tăng của từng thỏ <0,6
o
C.
+ Kiểm tra công hiệu vắc xin VGA (Theo dược điển châu Âu) thực hiện
theo thường quy của VABIOTECH. Tiêu chuẩn chấp thuận: công hiệu
tương quan của vắc xin thử so với vắc xin chuẩn  1.
* Các phương pháp kiểm tra hóa lý
+ Xác định pH bằng máy đo với điện cực thủy tinh. Tiêu chuẩn chấp
thuận: pH của VXVGA trong khoảng 5,5- 7,5.
+ Xác định hàm lượng protein tổng số theo phương pháp Lowry. Tiêu

chuẩn chấp thuận: Protein của VXVGA ≥ 50 µg/ml và ≤ 80µg/ml (tiêu
chuẩn cơ sở của nhà sản xuất).
+ Định lượng nhôm: Tiêu chuẩn chấp thuận: Hàm lượng nhôm trong
VXVGA ≤ 500µg/ml.
+ Định lượng formallin: Tiêu chuẩn chấp thuận: Hàm lượng formallin của
VXVGA ≤ 0,02 % .
+ Định lượng 2-phenoxylethanol trong VXVGA bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao(HPLC). Tiêu chuẩn chấp thuận: Hàm lượng 2-
phenoxylethanol của VXVGA ≤ 0,6%.
12



CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Kết quả thích ứng vi rút viêm gan A HM175 trên tế bào MRC5
3.1.1. Tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy cho HAV HM175 trên tế bào
MRC5 trong môi trường có huyết thanh
* Sự nhân lên của vi rút trên tế bào MRC5



Hình 3.1. Hình ảnh vi rút viêm gan A trong tế bào MRC5 trên kính
hiển vi điện tử
Hình ảnh đặc trưng của vi rút VGA: hình cầu, kích thước 28 nm (mũi tên)
nằm trong bào tương tế bào chứng minh vi rút VGA đã xâm nhập và nhân
lên trong tế bào.
* Liều gây nhiễm

Biểu đồ 3.1. Hiệu giá vi rút ở các liều gây nhiễm
Xuất phát từ các nghiên cứu của các tác giả trên thế giới đã công
bố. Chúng tôi khảo sát các liều gây nhiễm từ 0,005 đến 5 MOI qua 3
lần thử nghiệm. Lấy kết quả hiệu giá vi rút là thước đo để đánh giá
các liều gây nhiễm trên. Kết quả hiệu giá trung bình của vi rút VGA
đạt cao nhất ở cả 3 lần thử nghiệm với liều gây nhiễm 0,005 MOI
(biểu đồ 3.3), vì vậy liều gây nhiễm 0,005 MOI sẽ được lựa chọn cho
việc nghiên cứu các điều kiện tối ưu khác.

0.6
5
2
0
2
4
6
7 14 21
5 M OI
0,5 MOI
0,05 MOI
0,005 MOI
Hiệu giá vi rút (1.000.000
PFU/ml)
Thời gian sau gây nhiễm (ngày)
13



* Nhiệt độ nuôi cấy

8.5
4.5
2
2.5
0.7
0.4
0.0006
0.0015
0.0004
0
2
4
6
8
10
7 14 21
Thời gian sau gây nhiễm (ngày)
Hiệu giá vi rút (1.000.000 PFU/ml)
35oC
32oC
37oC

Biểu đồ 3.3. Hiệu giá vi rút theo nhiệt độ nuôi cấy
Sau khi xác định được liều gây nhiễm, thử nghiệm xác định nhiệt độ
nuôi cấy được tiến hành. Nhiệt độ nuôi cấy vi rút VGA trên tế bào MRC5
tham khảo từ các công trình nghiên cứu thường là từ 32
o
C- 35
o
C. Nhiệt độ

sử dụng trong nuôi cấy vi rút VGA chủng HM175 trên tế bào thận khỉ tại
Việt Nam là 37
o
C. Do đó, nghiên cứu này khảo sát các nhiệt độ nuôi cấy
là 32
o
C, 35
o
C và 37
o
C (biểu đồ 3.3). Qua cả 3 lần thử nghiệm, kết quả cho
thấy nhiệt độ 35
o
C cho hiệu giá vi rút VGA cao nhất. Chọn nhiệt độ nuôi
cấy tối ưu 35
o
C. Thời điểm đạt hiệu giá vi rút cao nhất là ngày thứ 14 sau
gây nhiễm.
3.1.2. Kết quả cấy truyền thích ứng
Bảng 3.2. Hiệu giá vi rút qua các đời cấy truyền

(ND: Hiệu giá vi rút <10
4
)
Bảng 3.1 là kết quả thích ứng vi rút khi áp dụng các điều kiện nuôi
cấy tối ưu đã xác định. Kết quả cho thấy hiệu giá vi rút ở P1, P2 là 10
7

PFU/ml, từ P3 hiệu giá giảm. Chọn chủng vi rút giống gốc P0, chủng sản
xuất trên MRC5 tại P1 và sản xuất vắc xin ở P2 để đạt được sản lượng vi

rút tốt cho sản xuất vắc xin.

Hiệu giá HAV ở các lần thử nghiệm (PFU/ml)

Đời cấy
truyền vi
rút (P)

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Hiệu giá
trung bình
(PFU/ml)
P0
P1
1,0x10
7

0,5x10
7

1,0x10
7

1,0x10
7

1,0x10
7

0,5x10
7

1,0x10
7

0,7x10
7
P2 1,0x10
7
2,0x10
7
1,5x10
7
1,5x10
7

P3 5x10
6
2,0x10
6
0,5x10
7
4,0x10
6
P4 0,5x10

6
0,5x10
6
1,0x10
6
0,7x10
6
P5 ND (<10
4
) 2,0x10
5
5,0 x10
5
-
14



3.1.3. Kết quả sản xuất chủng giống và kiểm tra chất lượng chủng giống
Tạo được hệ chủng giống (MSV và WSV) cho sản xuất VXVGA
trên tế bào MRC5. Số lượng và chất lượng của hệ chủng giống được trình
bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra chất lượng chủng giống
Chủng Thử nghiệm Tiêu chuẩn Kết quả
Nhận dạng
- Hiển vi điện tử.

- PCR

- Hình cầu, 28 nm

trong tế bào MRC5
- 248 bp- gen đặc hiệu HAV

- Trong tế bào MRC5 có
HAV hình cầu, 28 nm.
- 248 bp- gen đặc hiệu HAV
Vô khuẩn Không có vi khuẩn và nấm Không có vi khuẩn và nấm
Mycoplasma
- Nuôi cấy
- PCR

- Không có Mycoplasma
- Không có băng 270
bp của Mycoplasma

- Không có Mycoplasma
- Không có băng 270
bp của Mycoplasma
Hiệu giá vi rút 10
6
-10
8
(PFU/ml) 1x10
7
(PFU/ml)
Vi rút ngoại lai
trên 3 dòng tế bào
MRC5, Vero,
PMMK
- Không có vi rút ngoại

lai gây hủy hoại tế bào và
hấp phụ hồng cầu
- Không có vi rút ngoại
lai gây hủy hoại tế bào
và hấp phụ hồng cầu
Sinh miễn dịch - Tạo kháng thể ≥ 20
(mIU/ml)
- Tạo kháng thể ≥ 100
(mIU/ml) (100% chuột)






MSV
(300
ống)

Sequencing - Tương đồng với
chủng gốc HM175
- Tương đồng với
chủng gốc HM175
Nhận dạng
- Hiển vi điện tử.

- PCR

- Hình cầu, 28 nm
trong tế bào MRC5

- 248 bp- gen đặc hiệu HAV

- Trong tế bào MRC5 có
HAV hình cầu, 28 nm.
-248 bp- gen đặc hiệu HAV
Vô khuẩn Không có vi khuẩn và nấm Không có vi khuẩn và nấm
Mycoplasma
- Nuôi cấy
- PCR

- Không có Mycoplasma
- Không có băng 270
bp của Mycoplasma

- Không có Mycoplasma
- Không có băng 270
bp của Mycoplasma
Hiệu giá vi rút 10
6
-10
8
(PFU/ml) 1x10
7
(PFU/ml)
Vi rút ngoại lai
trên 03 dòng tế bào
MRC5, Vero,
PMMK
- Không có vi rút ngoại
lai gây hủy hoại tế bào

và hấp phụ hồng cầu
- Không có vi rút ngoại
lai gây hủy hoại tế bào
và hấp phụ hồng cầu
Sinh miễn dịch - Tạo kháng thể ≥ 20
(mIU/ml)
- Tạo kháng thể ≥ 100
(mIU/ml) (100% chuột)





WSV
(312
ống)

Giải trình tự gen - Tương đồng với
chủng gốc HM175
- Tương đồng với
chủng gốc HM175
Hiệu giá chủng MSV 1x10
7
và WSV 0,5 x10
7
PFU/ml, chủng đạt các
yêu cầu về nhận dạng, vô khuẩn, không có Mycoplasma và vi rút ngoại lai
theo hướng dẫn của WHO và Dược điển châu Âu.
15

3.2. Kết quả xây dựng quy trình sản xuất vắc xin viêm gan A bất hoạt
trên nuôi cấy tế bào MRC5 quy mô phòng thí nghiệm
3.2.1. Kết quả nuôi cấy và chuẩn bị tế bào MRC5
Hình thái tế bào ổn định qua 7 đời cấy chuyển từ đời p26 đến đời p32.
Gregersen J.P thích ứng vi rút VGA trên dòng tế bào MRC5 cho thấy hiệu giá
vi rút đạt cao ở đời tế bào p25 đến p38.

3.2.2. Kết quả gây nhiễm, nuôi cấy và thu hoạch vi rút
* Kết quả xác định môi trường nuôi cấy tối ưu
Bảng 3.8. Hiệu giá vi rút ở các môi trường duy trì


Hiệu giá vi rút trung bình ở các môi trường duy trì (PFU/ml)

Thời gian
sau gây
nhiễm
(ngày)

MEM

DMEM

LH3E

MEM-
hep

DMEM-
hep

LH3E –
hep
10 1,0 x 10
6
1,5 x 10
6

2,5 x 10
6

2,5 x 10
6
2,0 x 10
6
1,5 x 10
6

14 0,8 x 10
6
0,5 x 10
6

1,0 x 10
6

0,3 x 10
6

0,8 x 10
6
1,0 x 10
6

17 1,0 x 10
6
0,5 x 10
6

1,5 x 10
6

0,2 x 10
6
0,4 x 10
6
0,25 x 10
6

24 0,5 x 10
6
0,5 x 10
6

0,8 x 10
6

0,05 x 10
6

0,1 x 10
6
0,1 x 10
6

Trung bình 0,83 x10
6
0,75 x10
6
1,45 x10
6

0,76 x10
6
0,83 x10
6
0,71x10
6
LH3E: Lactalbumin hydrolyzate ; MEM: Minimum Essential Medium


DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium; Hep: Hepes Buffer
Sử dụng liều gây nhiễm 0,005 MOI để khảo sát 6 môi trường duy trì
không chứa huyết thanh. Kết quả cho thấy hiệu giá vi rút đạt cao nhất ở
môi trường LH3E (1,45 x10
6
PFU/ml). Hiệu giá vi rút VGA các ngày 10,
14, 17, 24 sau gây nhiễm đạt cao và ổn định qua 3 lần thử nghiệm. Chọn
môi trường LH3E để duy trì tế bào trong nhân nuôi vi rút cho sản xuất vắc
xin.

Môi trường duy trì tế bào sau khi gây nhiễm vi rút cũng là một vấn
đề cần bàn luận. Một số tác giả dùng MEM có 2-5% FBS (FBS-huyết
thanh bê bào thai) và trong quá trình tinh chế cần loại bỏ protein của FBS
để tránh các phản ứng phụ. Nghiên cứu này đã xác định được một môi
trường (LH3E) không chứa huyết thanh cho hiệu giá vi rút chấp nhận
được để đưa vào sản xuất. Môi trường không chứa huyết thanh sẽ có giá
thành thấp hơn, dễ tinh khiết vi rút hơn và hạn chế được các nguy cơ lây
nhiễm bởi các tác nhân vi sinh vật so với các môi trường duy trì tế bào có
huyết thanh. Như vậy sẽ tiết kiệm được nguyên liệu, giảm giá thành của
sản phẩm.
16



* Kết quả xác định liều gây nhiễm tối ưu ở môi trường không có huyết
thanh
Bảng 3.9. Hiệu giá vi rút ở các liều gây nhiễm khác nhau trên môi trường LH3E
Hiệu giá vi rút (PFU/ml) ở các liều gây nhiễm
Thời gian sau gây

Nhiễm (ngày)
0,5 MOI 0,1 MOI 0,05 MOI
1 10
5
6x10
4
2x10
4
2 5x10
5

2x10
5
2x10
5
3* 1,5x10
6
5x10
5
3x10
5
4 4 x10
5
2 x10
4
2 x10
4
5 8 x10
5
3 x10
5
2 x10
5

6 1,5 x10
6
0,5 x10
6
5 x10
5

7 3,5 x10
6
1,5 x10
6
5 x10
5

8 3 x10
6
2,5 x10
6
4 x10
5

9 3 x10
6
3 x10
6
0,5 x10
6

10** 5 x10
6

4,5 x10
6

2 x10
6

11 5 x10
4
ND

ND

12 2 x10
5
8 x10
5
1 x10
5

13 1,0 x10
6
1,5 x10
6
1,5 x10
5

14 0,5 x10
6
2 x10
6
1,5 x10
5

15 7 x10
5
2,5 x10

6
2 x10
5

16 0,5 x10
6
3 x10
6
0,3 x10
6

17** 0,5 x10
6

3 x10
6

1,5 x10
6

18 6 x10
4
ND

ND

19 3 x10
5
7 x10
4

7 x10
4

20 5 x10
5
1 x10
5
1 x10
5

21 8 x10
5
2 x10
5
0,5 x10
6

22 2 x10
5
2,5 x10
6
1 x10
6
23 2,5 x10
5
1,5 x10
6
1 x10
6

24 4 x10
5

1 x10
6

1 x10
6

Tổng hiệu giá
3 lần gặt
5,7 x 10
6
10,0 x 10
6
4,5 x 10
6

(ND): hiệu giá vi rút < 10
3

(*) Rửa tế bào bằng Hank’s, thay môi trường LH3E không chứa huyết thanh.
(**) Thay môi trường LH3E; Gặt vi rút các ngày thứ 10, 17 và 22 sau gây nhiễm vi rút.
Nhân nuôi vi rút trên MRC5 ở môi trường không có huyết thanh
LH3E, liều gây nhiễm 0,1MOI cho tổng hiệu giá vi rút cao nhất (10,0 x
10
6
PFU/ml) và thu được 3 mẻ gặt đơn đạt yêu cầu. Khoảng thời gian nuôi
cấy cho mỗi mẻ gặt đơn vi rút và thay môi trường để duy trì tế bào thích
hợp nhất vào ngày thứ 10, 17, 22 sau gây nhiễm và số lần thu hoạch tối đa

là 3 mẻ gặt đơn trong cả quá trình nuôi cấy. Các nghiên cứu của Frank
17



S.Leu, Douglas B.Sei cũng cho thấy liều gây nhiễm thích hợp cho sản
xuất vắc xin là 0,1 MOI.
* Kết quả xác định pH tối ưu
4.5
5
6 6
0.8
3.5
3
1.5
2
2.5
2
0.2
0
2
4
6
8
10
12
14
7,2 7,4 7,6 7,8
pH
Hiệu giá vi rút

1.000.000 (PFU/ml)
ngày 22
ngày 17
ngày 10

Biểu đồ 3.4. Hiệu giá vi rút trong môi trường LH3E với các pH khác nhau
Biểu đồ 3.4 cho thấy tổng hiệu giá vi rút thu được ở các điều kiện pH
7,4 và 7,6 đạt cao lần lượt là 10,5 x10
6
và 11,5 x10
6
PFU/ml. Do đó pH 7,4
– 7,6 sẽ được lựa chọn để nuôi cấy vi rút cho sản xuất VXVGA.
Từ các kết quả thử nghiệm về điều kiện nuôi cấy ở trên, một quy trình
nuôi cấy vi rút cho sản xuất tổng thể đã được xác định bao gồm: Liều gây
nhiễm tối ưu: 0,1 MOI; Môi trường duy trì không huyết thanh LH3E với
pH 7,4-7,6 ; Thời điểm gặt vi rút ở các ngày 10, 17 và 22 sau gây nhiễm.
Áp dụng các điều kiện nuôi cấy tối ưu trên 3 loạt nuôi cấy trong chai 1 lớp
(loạt 0109, 0209, 0309).
Bảng
3.10. Hiệu giá vi rút trên MRC5 ở môi trường không chứa huyết thanh
Hiệu giá vi rút (PFU/ml)
Thời gian sau
gây nhiễm
(ngày)
Loạt 0109 Loạt 0209 Loạt 0309
10 6,5 x10
6
1,0 x10
7

8,0 x10
6

17 4,0 x10
6
7,0 x10
6
5,0 x10
6

22 2,5 x10
6
3,0 x10
6
2,0 x10
6


Kết quả bảng 3.5: Hiệu giá vi rút cao, đạt 2x10
6
đến 10
7
(PFU/ml) ở
các mẻ gặt đơn, ổn định trên các loạt, đạt yêu cầu để đưa vào sản xuất vắc
xin. Đây là cơ sở để tiến hành nuôi cấy vi rút cho sản xuất thử nghiệm 03 loạt tiếp
theo trên quy mô lớn hơn (chai 3 lớp).


18

Qui trình sản xuất Vắc xin VGA trên nuôi cấy tế bào MRC5
Chủng gốc giống HAV – HM175 (MSV)

Chủng sản xuất HAV – HM175 (WSV)

1- Nuôi cấy tế bào MRC5 một lớp qua 6
cấy truyền từ p26 đến p32, tế bào kín 80%


2- Gây nhiễm HAV HM175 vào tế bào MRC5
MOI 0,1; ủ 35
0
C/2h/Hank
,
s, 15-20 phút láng 1 lần

3- Bỏ Hank
,
s, thêm MEM 2%FBS, ủ trong 3 ngày/35
0
C

4- Rửa tế bào bằng Hank
,
s, cho LH3E không serum
pH 7,4-7,6; Nuôi cấy ở 35
0
C

4.1- Ngày thứ 10, thu hoạch nước nổi 1, thay MT

4.2- Ngày thứ 17, thu hoạch nước nổi 2, thay MT

4.3- Ngày thứ 22, gặt lần 3

5- Đông tan 3 lần

6- Hộn nước nổi 1 +2+ gặt lần 3 sau đông tan
Ly tâm 7000 rpm-1h-4
0
C

7- Cô đặc, thẩm tích hỗn dịch vi rút bằng
màng 10KD; Siêu âm cặn tế bào tách vi rút

8- Bất hoạt vi rút
(Formalline nồng độ 1/2000/37
0
C)




9- Pha vắc xin
- Vô khuẩn
- Mycoplasma
- Vi rút ngoại lai
- Vi rút hấp phụ hồng cầu

- Vô khuẩn
- Hiệu giá vi rút
- Hiệu giá vi rút

- Kiểm tra bất hoạt
- Hàm lượng protein
- Vô khuẩn
- Vô khuẩn
- Công hiệu
- An toàn chung
- Chất gây sốt
- Các thành phần hóa học
19



3.3. Kết quả sản xuất thử nghiệm và kiểm tra chất lượng trong quá
trình sản xuất và vắc xin thành phẩm
Sử dụng các quy trình nuôi cấy tế bào, gây nhiễm nuôi cấy và thu
hoạch vi rút trên tế bào MRC5 được xây dựng trong đề tài này để sản xuất
03 loạt vắc xin VGA thử nghiệm. Dưới đây là các kết quả kiểm định trong
quá trình sản xuất và vắc xin thành phẩm.
3.3.1. Kết quả kiểm tra trong quá trình sản xuất
* Kết quả hiệu giá vi rút trên các loạt sản xuất thử nghiệm
Bảng 3.12. Hiệu giá vi rút của 3 loạt sản xuất thử nghiệm
Hiệu giá vi rút (PFU/ml)
Thời gian sau gây
nhiễm (ngày)
Loạt 0110 Loạt 0210 Loạt 0310
10 1,0 x10

7
6,5 x10
6
7,0 x10
6

17 2,0 x10
6
5,0 x10
6
4,5 x10
6

22 2,5 x10
6
3,0 x10
6
2,0 x10
6

Hiệu giá vi rút của các mẻ gặt đều đạt trên 10
6

PFU/ml và ổn định ở cả ba loạt.
* Kết quả tinh sạch hỗn dịch vi rút
Bảng 3.13. Kết quả kiểm tra hiệu giá sau cô đặc thẩm tích hỗn dịch vi rút
Chỉ số Loạt 0110 Loạt 0210 Loạt 0310
Hàm lượng vi rút
(PFU/ml)

7x10
7


8 x10
7


7x10
7

Thể tích (ml) 282 274 285
Sau cô đặc, hàm lượng vi rút tăng cao và ổn định về hiệu giá từ
7x10
7
– 8x10
7
PFU/ml.
* Kết quả bất hoạt vi rút
Kiểm tra các mẫu sau bất hoạt (0, 24, 48, 72 và 96 giờ) trên nuôi tế
bào và chuẩn độ hiệu giá vi rút của 03 loạt sản xuất thử nghiệm. Kết quả
cho thấy: Hiệu giá vi rút sau bất hoạt đều bằng 0 PFU/ml trên thử nghiệm
tạo đám hoại tử, chứng minh vi rút đã hoàn toàn bị bất hoạt. Để bất hoạt vi
rút VGA, các nhà sản xuất VXVGA đều sử dụng formalin. Cả 03 loạt sản
xuất thử nghiệm đều đạt yêu cầu về thử nghiệm bất hoạt.điều đó chứng tỏ
quy trình bất hoạt vi rút 1/2000 ở 37
o
C trong 96 giờ là đảm bảo an toàn.
* Kết quả pha vắc xin của các loạt sản xuất
Vắc xin được pha về hàm lượng protein 50 g/ml. Kết quả pha vắc xin

của 3 loạt sản xuất thử nghiệm : Loạt 0110 (loạt 1 năm 2010: 474 liều);
loạt 0210 (loạt 2 năm 2010: 480 liều) và loạt 0310 (loạt 3 năm 2010: 468
liều); Tổng số 1442 liều vắc xin.


20



3.3.2. Kết quả kiểm tra chất lượng vắc xin thành phẩm
* Kết quả kiểm tra vô khuẩn
Bảng
3.16. Kết quả thử nghiệm vô khuẩn 3 loạt vắc xin viêm gan A
Loạt vắc xin Kết quả vô khuẩn Kết luận
0110 Đạt
0210 Đạt
0310

Không phát hiện thấy vi khuẩn và
nấm sau 14 ngày theo dõi
Đạt
Tiêu chuẩn

Không có sự phát triển của vi khuẩn
và nấm sau 14 ngày theo dõi
Đạt
Cả 3 loạt vắc xin đều đạt yêu cầu sau thử nghiệm vô khuẩn theo tiêu
chuẩn của WHO. Thử nghiệm vô khuẩn là thử nghiệm cơ bản nhất trong
kiểm định vắc xin. Môi trường thioglycolat và soybean dùng trong thử
nghiệm vô khuẩn phát hiện được các vi khuẩn hiếu và kỵ khí (kể cả các vi

khuẩn khó tính) cũng như các loại nấm.

* Kết quả kiểm tra chất gây sốt
Bảng 3.17. Kết quả kiểm tra chất gây sốt trên thỏ của vắc xin viêm gan A

Thử nghiệm này để phát hiện có hay không tác nhân gây sốt trong vắc
xin. Theo WHO, thử nghiệm này có thể được thực hiện trên thỏ hoặc bằng
thuốc thử lysat. Thử nghiệm chất gây sốt trên thỏ được thực hiện dựa trên
nguyên tắc so sánh sự tăng thân nhiệt của hai nhóm thỏ trước và sau khi
tiêm vắc xin vào tĩnh mạch tai thỏ trong vòng 3 giờ. Nếu vắc xin không an
toàn, phản ứng đầu tiên là sốt và nhiệt độ thỏ được đo qua hậu môn trước
và sau khi tiêm 1, 2, 3 giờ. Tính tổng nhiệt độ tăng so với tiêu chuẩn để
đánh giá. Đây là phương pháp thử nghiệm thường dùng trong kiểm định
chất gây sốt được quy định tại Dược điển Việt Nam. Kết quả bảng 3.9
cho thấy tất cả 3 loạt vắc xin đạt yêu cầu về chất gây sốt ≤ 1,3
o
C.


Nhiệt độ tăng của từng thỏ

Loạt vắc xin
Thỏ 1 Thỏ 2 Thỏ 3

Tổng nhiệt

độ tăng

Kết
luận

Tiêu chuẩn < 0,6
o
C ≤ 1,3
o
C Đạt
0110 0 0,1 0 0,1 Đạt
0210 0 0 0,2 0,2 Đạt
0310 0 0 0 0 Đạt
21



* Kết quả kiểm tra an toàn trên động vật thực nghiệm
Kết quả về tính an toàn chung của VXVGA trên chuột nhắt trắng và
chuột lang được trình bày trong bảng 3.10, 3.11.
Bảng 3.18. Kết quả kiểm tra an toàn chung của vắc xin trên chuột nhắt
Loạt
vắcxin
Tình trạng chuột sau 7 ngày
theo dõi
Trung bình
tăng trọng (%)
Kết
luận
0110 5/5 Chuột khỏe mạnh lên cân,
không có dấu hiệu bệnh lý
151,7 Đạt
0210 5/5 Chuột khỏe mạnh lên cân,
không có dấu hiệu bệnh lý
110,6 Đạt

0310 5/5 Chuột khỏe mạnh lên cân,
không có dấu hiệu bệnh lý
110,5 Đạt
Tiêu chuẩn 100% khỏe mạnh, tăng trọng 100 Đạt


Bảng 3.19. Kết quả kiểm tra an toàn chung của vắc xin trên chuột lang
Loạt
vắcxin
Tình trạng chuột sau 7 ngày
theo dõi
Trung bình
tăng trọng (%)
Kết
luận
0110 2/2 Chuột khỏe mạnh lên cân,
không có dấu hiệu bệnh lý.
118,8 Đạt
0210 2/2 Chuột khỏe mạnh lên cân,
không có dấu hiệu bệnh lý.
117,0 Đạt
0310 2/2 Chuột khỏe mạnh lên cân,
không có dấu hiệu bệnh lý.
119,5 Đạt
Tiêu chuẩn 100% khỏe mạnh, tăng trọng 100 Đạt

Tất cả các chuột được thử nghiệm 3 loạt vắc xin đều khỏe mạnh và
tăng trọng từ 110,5% - 151,7%, đạt tiêu chuẩn chấp thuận của WHO. Cả 3
loạt vắc xin đạt yêu cầu về an toàn chung trên chuột và chất gây sốt trên
thỏ, cho thấy VXVGA đạt yêu cầu về tính an toàn khi kiểm tra trên động

vật thực nghiệm.