thực hành sinh hóa định lượng protein

Bài 2: PROTIDE
Định lượng Protein bằng phương pháp MicroKjeldahl
I.Cơ sở lý thuyết
- Protein được tạo thành từ các nguyên tử C,H,O,N,S,P…
- Trong số nguyên tử này N chiếm tỉ lệ tương đối cao và khá ổn định (≈15÷17% khối
lượng phân tử protein ) trong thành phần của protein (động vật, thực vật, vi sinh vật ).
Tùy thuộc vào nguồn gốc protein động vật hay thực vật hay động vật, người ta sử
dụng các hệ số trung bình protein để tình khối lượng protein như sau: Hệ số protein
động vật là 6,25; thực vật là 5,96.
-Trường hợp đối với nguyên liệu có nhiều hợp chất N không phải protein, cần phải
xác định riêng N protein và N phi protein. Nhưng các phương pháp tách chiết protein
thường phức tạp gây hao hụt protein, bời vậy trong thực tế, người ta sử dumgj phương
pháp xác định N tổng số. N phi protein, sau đó xác định N protein bằng hiệu số giữa
N tổng số và N phi protein.
II. Nguyên tắc.
Protein được tạo thành từ các nguyên tố ,C,H,O,N,S,P trong đó N nguyên tố chiếm tỉ
lệ cao và tương đối ổn định, vì vậy người ta sẽ định lượng N.
Để định lượng N thì vô cơ hóa nguyên liệu sau đó xác đinh N
Bản chất của phương pháp: Dưới tác dụng của nhiệt độ cao và acid vô cơ đặc, nguyên
tố N trong thành phần của Protein được biến đổi thành NH
3
. Định lượng NH
3
bằng
dung dịch acid theo các bước:
Vô cơ hóa nguyên liệu:
Trang 1
Protein, polypeptit, peptone H
2
SO
4

(đ), (NH
4
)
2
SO
4
+ H
2
SO
4
đ,dư hoặc
các hợp chất chứa N + +

Cất đạm : đẩy khỏi muối (NH
4
)
2
SO
4
bằng một baze mạnh (ví dụ NaOH):
+ Ở bình cất:
(NH
4
)
2
SO
4
+ 2NaOH 2 OH +
+ Ở bình hứng : thu nhận bằng một acid mạnh H
2

SO
4
có nồng độ xác định :
2 OH + 2 (NH
4
)
2
SO
4
+ + 2 O
Chuẩn độ : dùng nồng độ NaOH có nồng độ chính xác để trung hòa hết acid H
2
SO4
dư:
H
2
SO
4
+ 2NaOH +
III. Nguyên liệu và hóa chất.
-Vật phẩm có chứa nitơ( nước mắm đậu hủ, các loại thực phẩm )
-H
2
SO
4
đậm đặc
-K
2
SO
4

tinh khiết
-CuSO
4
tinh khiết
-NaOH 30%: 150mg NaOH tinh thể đinh mức 500ml nước cất
-H
2
SO
4
0.1N: 2.79 ml H
2
SO
4
đậm đặc (d=1.84l)
-NaOH 0.1N
-Thuốc thử hỗn hợp
IV. Cách tiến hành
Gồm 3 giai đoạn:
Trang 2
Vô cơ hóa mẫu:
cân 200mg nguyên liệu cho vào bình Kjeldahl.
Thêm vào vài giọt nước cất + 10ml H
2
SO
4
đậm đặc
Cho 200mg chất xúc tác K2SO4/CuSO4 =10/1. Đậy kín bình để 30phút
Đặt bình Kjeldahl nghiêng 45
0
trên hệ thống bình đun Kjeldahl đun với nhiệt độ tăng

dần sau 30p đến dung dịch sôi đều (tránh >100
0
)
Dung dịch chuyển màu từ nâu sẫm-> nâu cánh gián -> vàng nhạt->trắng trong kết
thúc giai đoạn vô cơ hóa.
Giai đoạn cất đạm:
Tiến hành trên bộ cất đạm MicroKjeldahl.
Sử dụng hệ chuẩn H
2
SO
4
– NaOH
chuẩn bị nước bình đun: đổ nước cât 1 lần vào bình đun khi dung tích đạt 2/3 bình là
đủ.
Hình 1: giai đoạn đun
Bình hứng: cho vào bình tam giác 250ml: 10ml H
2
SO
4
0.1N + 3 giọt thuốc thử hỗn
hợp
Trang 3
Bình cất: cho vào bình 10ml dung dịch mẫu + 3 giọt thuốc thử + 20ml NaOH 30% 
dung dịch chuyển từ màu đỏ sang màu xanh lá mạ
Đóng khóa cất đạm trong 15phút, lôi cuốn khí NH
3
qua ống sinh hàn xuống bình
hứng, hạ bình hứng xuống cách đầu mút ống sinh hàn dùng quỳ tím thử dung dịch ở
đầu ống sinh hàn. Quỳ tím không đổi màu -> hoàn thành quá trình cất đạm
Rửa đầu ống sinh hàn với nước cất 2 lần

Hình 2 : giai đoạn cất đạm
Giai đoạn chuẩn độ:
chuẩn lượng dư H
2
SO
4
0.1N bằng NaOH 0.1N -> dung dịch chuyển màu tím đỏ->
xanh lá mạ-> quá trình kết thúc.
Trang 4
Hình 3: giai đoạn chuẩn độ
V. Báo cáo kết quả và giải thích kết quả
Tính kết quả
Cứ 1ml H
2
SO
4
0.1N tương đương với 1.4mg nitrogen. Từ đó ta có công thức tính hàm
lượng protein:
Trong đó:
P: hàm lượng protein co trong mẫu đem phân tích (%).
V
3
: số ml H
2
SO
4
0.1N trung hòa lượng NH
3
bị đẩy ra sau khi cất đạm(ml)
f: Hệ số điều chỉnh nồng độ kiềm N

2
/N
1
.
Trang 5
V
3
.1,4.f.V
V
C
.g
P =
100. F=
1.1,4.1.100.100.6,25
10.200
=43.75%
N
2
: Nồng độ đương lượng của kiềm
N
1
: Nồng độ đương lượng của H
2
SO
4
0.1N.
V: Số ml dung dich mẫu pha loãng.(100ml).
V
c
: Số ml dung dịch mẫu cất đạm.

g: Số mg nguyên liệu đem vô cơ hóa(200g).
F: Hệ số chuyển nitrogen thành protein
Giải thích kết quả:
Ta có: V
3
thu được =V
đầu
-V
chuẩn độ
(10-9=1ml) Đây là hàm lượng H
2
SO
4
phản ứng hết
với lượng NH
4
OH có trong mẫu
Hệ số chuyển đổi của protein động vật 6.25
Kết quả thu được 43,75% chứng tỏ hàm lượng protein thô trong mẫu chiếm khoảng
43,75%
VI. Trả lời câu hỏi:
1. tóm tắt quá trình định lượng protein bằng phương pháp Microkjeldalh
Vô cơ hóa nguyên liệu:
Protein, polypeptit, peptone H
2
SO
4
(đ), (NH
4
)

2
SO
4
+ H
2
SO
4
đ,dư hoặc
các hợp chất chứa N + +

-Cất đạm : đẩy khỏi muối (NH
4
)
2
SO
4
bằng NaOH:
+ Ở bình cất:
(NH
4
)
2
SO
4
+ 2NaOH 2 OH +
Trang 6
+ Ở bình hứng : thu nhận bằng một acid mạnh H
2
SO
4

có nồng độ xác định :
2 OH + 2 (NH
4
)
2
SO
4
+ + 2 O
-Chuẩn độ : dùng nồng độ NaOH có nồng độ chính xác để trung hòa hết acid H
2
SO4
dư:
H
2
SO
4
+ 2NaOH +
2. phương trình phản ứng xảy ra trong giai đoạn vô cơ hóa:
Protein, polypeptit, peptone H
2
SO
4
(đ), (NH
4
)
2
SO
4
+ H
2

SO
4
đ,dư
hoặc các hợp chất chứa N K2SO4/CuSO4 + +
Protein được tạo thành từ các nguyên tố ,C,H,O,N,S,P trong đó N nguyên tố chiếm
tỉ lệ cao. Nên sau quá trình vô cơ hóa sản phẩm chủ yếu sẽ là (NH
4
)
2
SO
4
, các thành
còn lại chiếm tỉ lệ thấp hơn là CO
2,
SO
2
vì trong phân tử protein có chứa C,O
3. phương trình phản ứng trong giai đoạn cất đạm:
-Cất đạm : đẩy NH
3
khỏi muối (NH
4
)
2
SO
4
bằng NaOH :
+ Ở bình cất:
(NH
4

)
2
SO
4
+ 2NaOH 2NH
4
OH +
+ Ở bình hứng : thu nhận NH
3
bằng một acid mạnh H
2
SO
4
có nồng độ xác định :
2 NH
4
OH + 2 H
2
SO
4
(NH
4
)
2
SO
4
+ H
2
SO
4

+ 2 O
Trang 7
4.Vai trò của thuốc thử:
thuốc thử dùng để xác định hàm lượng phản ứng của các chất bazơ và acid
giúp chúng ta nhận biết được phản ứng qua màu sắc, đã hoàn thành,hay từng giai
đoạn để xác định được chính xác hơn hàm lượng sử dụng.
5. Công thức tính
P: hàm lượng protein co trong mẫu đem phân tích (%).
V
3
: số ml H
2
SO
4
0.1N trung hòa lượng NH
3
bị đẩy ra sau khi cất đạm (ml)
f: Hệ số điều chỉnh nồng độ kiềm N
2
/N
1
. 0.1/0.1=1
N
2
: Nồng độ đương lượng của kiềm NaOH 0.1N
N
1
: Nồng độ đương lượng của H
2
SO

4
0.1N.
V: Số ml dung dich mẫu pha loãng.(100ml).
V
c
: Số ml dung dịch mẫu cất đạm:10ml
g: Số mg nguyên liệu đem vô cơ hóa (200g).
F: Hệ số chuyển nitrogen thành protein 6.25
6. Cấu tạo của bộ chưng cất đạm
Gồm 4 bộ phận chính:
-hệ thống bình đun
-bình xả
-bình cất
-ống sinh hàn
Trang 8
V
3
.1,4.f.V
V
C
.g
P =
100. F
7. Những lưu ý khi sử dụng bộ chưng cất đạm:
Nếu lượng dd H
2
SO
4
0.1N quá ít thì cho thêm một ít nước cất để tránh mất đạm.
Khi cho dd mẫu vào phiễu thì mở khóa từ từ cho dung dịch chảy xuống bình cất, tráng

lại phễu của bình cất bằng nước cất 2 lần. Đóng phễu.
Khi cho NaOH 30% phải giữ một ít nước trên phễu tránh ngăn NH
3
bốc ra.
Trang 9