Nghiên cứu đặc tính sinh học của một số chủng vi khuẩn liên kết hải miên (sponge)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI



ðÀO THỊ THIÊM



NGHIÊN CỨU ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ
CHỦNG VI KHUẨN LIÊN KẾT HẢI MIÊN (SPONGE)





LUẬN VĂN THẠC SĨ






HÀ NỘI – 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI


ðÀO THỊ THIÊM


NGHIÊN CỨU ðẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ
CHỦNG VI KHUẨN LIÊN KẾT HẢI MIÊN (SPONGE)



CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 60.42.02.01



NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. PHẠM VIỆT CƯỜNG
TS. NGUYỄN VĂN GIANG




HÀ NỘI – 2014

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan, kết quả và số liệu nghiên cứu trình bày trong luận

văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ trong việc thực hiện luận văn này
ñã ñược cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ
nguồn gốc.
Tác giả


ðào Thị Thiêm


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page ii

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thanh cảm ơn ñến thầy hướng dẫn PGS.TS.Phạm Việt
Cường, Viện trưởng Viện Khoa học Miền trung và TS.Nguyễn Văn Giang
trưởng Bộ môn vi sinh, khoa Công nghệ sinh học, trường Nông nghiệp Hà Nội,
người ñã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp ñỡ em, là ñộng lực giúp em trong
thời gian em làm ñề tài và hoàn thành luận văn này.
ðồng thời em cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Kim
Cúc, Th.S Vũ Thị Quyên cùng các cô, các anh chị, các bạn trong Phòng công
nghệ sinh học, Viện Hóa sinh biển, Viện khoa học Miền trung ñã giúp ñỡ em
rất nhiều trong thời gian em làm luận văn.
Em xin chân thàn cảm ơn các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học, Ban
quản lý ñào tạo sau ñại học cũng toàn thể các bạn trong lớp CNSHA K21
trường Nông nghiệp Hà Nội ñã giúp ñỡ và tạo ñiều kiện ñể em có thể hoàn
thành tốt khóa học này.
Qua ñây, em cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới gia ñình, bạn bè
ñã luôn ñộng viên em trong suốt thời gian học tập.

Tác giả


ðào Thị Thiêm

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page iii

MỤC LỤC

Lời cam ñoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục bảng v
Danh mục hình vi
PHẦN I: MỞ ðẦU 1
1.1 ðặt vấn ñề 1
1.2 Mục tiêu của ñề tài 2
1.3 Ý nghĩa của ñề tài 2
1.4 Nội dung nghiên cứu 2
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn liên kết hải miên 3
2.2 Vi khuẩn liên kết Hải miên biển 4
2.3 Các chủng thử hoạt tính ñối kháng của vi khuẩn liên kết Hải miên 8
2.3.1 Vi khuẩn Vibrio vulnificus (V.vulificus) 8
2.3.2 Vibrio parahaemolyticus (V.parahaemolyticus) 10
2.3.3 Pseudomonas 12
PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
3.1 Vật liệu 14
3.2 Hóa chất, thiết bị 14

3.3 Môi trường nghiên cứu 15
3.4 Phương pháp nghiên cứu 17
3.4.1 Phân lập vi khuẩn liên kết hải miên 17
3.4.2 ðánh giá hoạt tính ñối kháng Vibrio spp. 18
3.4.3 ðặc ñiểm sinh hóa 18
3.4.4 ðịnh danh một số chủng tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh học phân
tử Một số phương pháp sinh học phân tử 22

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page iv

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24
4.1 Phân lập vi khuẩn liên kết hải miên 24
4.2 Xác ñịnh hoạt tính ñối kháng vi khuẩn kiểm ñịnh của một số
chủng phân lập 28
4.3 Nghiên cứu một số ñặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng tuyển
chọn 32
4.3.1 Xác ñịnh Gram 32
4.3.2 Một số ñặc tính sinh hóa của các chủng tuyển chọn 33
4.4 ðịnh danh các chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng kỹ thuật giải
trình tự gen 16S rRNA 42
4.5 Kết quả phân tích trình tự 5 chủng vi khuẩn 46
4.5.1 Trình tự mẫu LC22b2 46
4.5.2 Trình tự mẫu LC22cs2 47
4.5.3 Trình tự mẫu LC22cs5 51
4.5.4 Trình tự mẫu LC22xv5 55
4.5.5 Trình tự LC22xv6 61
4.3.5 Các chủng ñã ñược ñịnh danh ra ñến loài 62
PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ðỀ XUẤT 63
5.1 Kết luận 63

5.2 ðề xuất 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO 64


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page v

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

4.1 Tổng số vi sinh vật ñược phân lập ñược trên 1gam mẫu Hải miên 24
4.2 Hoạt tính ức chế sinh trưởng nguồn bệnh vi khuẩn của một số
chủng phân lập 28
4.3 Hoạt tính ñối kháng của vi khuẩn phân lập từ nước biển bảo quản mẫu 30
4.4 Tổng hợp phản ứng sinh hóa của vi khuẩn liên kết 41
4.5 So sánh trình tự ñoạn gen của chủng LC22b2 với gen 16S rADN 47
4.6 So sánh trình tự ñoạn gen của chủng LC22cs2 với gen 16S rADN 48
4.7 So sánh trình tự ñoạn gen của chủng LC22cs5 với gen 16SrADN 52
4.8 So sánh trình tự ñoạn gen của chủng LC22xv5 với gen 16SrADN 56
4.9 So sánh trình tự ñoạn gen của chủng LC22xv6 với gen 16SrADN 62



Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page vi

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

2.1 Hải miên ñược lấy tại vùng biển Hải Vân- Sơn Chà 3
3.1 Các bước tiến hành nhuộm Gram 19
4.1 Hình ảnh vi khuẩn ñược phân lập và làm sạch trên môi trường
marine agar 2216 26
4.2 Thử hoạt tính ñối kháng của vi khuẩn 31
4.3 Ảnh nhuộm Gram các chủng vi khuẩn 32
4.4 Phản ứng thử catalase dương tính của chủng vi khuẩn 33
4.5 Phản ứng thử catalase âm tính 34
4.6. Thử khả năng sinh acetoin của vi khuẩn 34
4.7 Phản ứng lên men glucose kỵ khí 35
4.8 Kiểm tra khả năng sinh enzyme nitratase 36
4.9 Khả năng phát triển ở nồng ñộ muối 5% 37
4.10 Khả năng phát triển ở nồng ñộ muối 7% của vi khuẩn 37
4.11 Khả năng phát triển ở nồng ñộ muối 10% 38
4.12 Khả năng phân giải gelatin 39
4.13 Khả năng thủy phân tinh bột tan 39
4.14 Khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất của vi
khuẩn trong quá trình biến dưỡng. 40
4.15 Tách DNA tổng số 42
4.16 ðiện di ñồ sản phẩm PCR gene 16S DNA riboxom của các chủng 43
4.17 ðiện di ñồ plasmid tái tổ hợp của các chủng vi khuẩn 44
4.18 ðiện di ñồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp 45
4.19 Cây phân loại 60




Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 1

PHẦN I: MỞ ðẦU

1.1. ðặt vấn ñề
Các sản phẩm tự nhiên là nền tảng cho hơn 50% các loại thuốc tại Mỹ
và chủ yếu thu ñược bằng lên men vi sinh vật trên cạn. Nhưng việc khai thác
các nguồn trên cạn sẽ dần cạn kiệt, trong khi lượng các hợp chất hoạt tính
sinh học tách từ các nguồn tài nguyên biển khác nhau phong phú. Phần lớn
các sản phẩm biển tự nhiên ñược tách chiết từ ñộng vật không xương sống
như hải miên (sponge), ñộng vật có vỏ (tunicate), ñộng vật thân mềm
(mollusk) và bryozoans. Rất nhiều hợp chất có hoạt tính ñộc tế bào
(cytotoxic), kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus và chống viêm
Rất nhiều ñộng vật không xương sống biển, ñặc biệt là hải miên
(phylum Porifera) ñáng chú ý bởi tính ña dạng vô cùng, các chất trao ñổi thứ
cấp của chúng có tiềm năng trở thành các loại thuốc hiệu quả ñể chữa bệnh.
Các hợp chất từ Hải miên ñược cho rằng có hoạt tính chống ung thư, chống
nhiễm trùng và các hoạt tính sinh học khác, làm cho chúng trở thành các hợp
chất dẫn ñể ứng dụng trong y học và công nghệ sinh học. Hải miên có cộng
ñồng vi sinh vật cực kỳ ña dạng trong mô của chúng. Sự ña dạng này có thể
giải thích một phần bởi sự thay ñổi các ñiều kiện lý, hóa, sinh trong sponge,
có thể ảnh hưởng ñến sinh thái vi sinh vật và tiến hóa. Những nghiên cứu về
vi sinh vật liên ñới hải miên cho thấy vi sinh vật có thể chiếm ñến 50% thể
tích hải miên, và con số này lớn hơn 2-3 lần so với lượng vi khuẩn trong nước
biển (Wang 2006), và cộng ñồng này ñặc hiệu cho hải miên
Hải miên ñược biết là nguồn giàu các sản phẩm tự nhiên có giá trị như
polyketides, nonribosomal peptides, và alkaloids. Nhưng người ta tin rằng rất
nhiều sản phẩm của hải miên thực tế là do vi khuẩn liên kết hải miên sinh ra.
Có giả thuyết cho rằng vi khuẩn trong các cộng ñồng này tổng hợp rất nhiều
hợp chất hoạt tính sinh học liên ñới. Trong khi ñể nuôi ñộng vật không xương

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 2

sống ñể tổng hợp các sản phẩm tự nhiên nói chung cực kỳ ñắt ñỏ hoặc không
thực hiện ñược, nuôi cấy vi sinh vật có thể cung cấp hợp chất quan trọng rẻ và
số lượng lớn.
ðề tài: “Nghiên cứu ñặc tính sinh học của một số chủng vi khuẩn
liên kết Hải miên (Sponge)” nhằm ñánh giá sự ña dạng sinh học của vi
khuẩn liên kết hải miên và tìm kiếm chủng có hoạt tính sinh học và có tiềm
năng ứng dụng trong thực tế.
1.2. Mục tiêu của ñề tài
- ðánh giá ñược mức ñộ ña dạng và xác ñịnh ñặc tính sinh học của vi
khuẩn liên kết hải miên
- Phát hiện các chủng có hoạt tính ñối kháng nguồn bệnh vi khuẩn
trong nuôi trồng thủy sản
1.3. Ý nghĩa của ñề tài
Bước ñầu tiến hành nghiên cứu về hệ vi khuẩn liên kết hải miên biển
Việt Nam và từ ñó tiến tới khai thác nguồn dược liệu từ vi sinh vật biển nói
chung và vi khuẩn liên kết hải miên nói riêng.
1.4 Nội dung nghiên cứu
a. Phân lập vi khuẩn từ loài hải miên biển
b. Xác ñịnh khả năng ñối kháng một số chủng vi khuẩn gây bệnh
c. Nghiên cứu các ñặc ñiểm sinh lý sinh hóa của các chủng tuyển chọn
d. ðịnh danh các chủng tuyển chọn bằng phương pháp giải trình tự gen
16S rRNA

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 3

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn liên kết hải miên

Hình 2.1: Hải miên ñược lấy tại vùng biển Hải Vân- Sơn Chà
Hải miên (phylum Porifera) là những ñộng vật sống lâu và rất ổn ñịnh,
chúng ñã tồn tại 700-800 triệu năm với vận tốc sinh trưởng khác nhau cực kỳ
ở những nhóm khác nhau. Chúng là ñộng vật không xương sống ña bào, ăn
lọc sống bám chủ yếu vào nền biển, nhưng cũng có loài nước ngọt. Trong số
khoảng 15.000 loài hải miên, chỉ có khoảng 1% sống trong môi trường nước
ngọt. Hải miên không có mô thực sự, nhưng có các loại tế bào khác nhau với
các chức năng khác nhau và cùng nhau thực hiên các chức năng bình thường
của cơ thể.
Hải miên là “mỏ vàng” về khía cạnh ña dạng các chất trao ñổi thứ cấp
ñược phát hiện trong những năm gần ñây. Hải miên sản xuất các chất trao ñổi
thứ cấp ñể xua ñuổi và ngăn cản các loài ăn thịt, cạnh tranh không gian với
các loài không cuống khác và ñể liên lạc, chống lại sự nhiễm bệnh. Hải miên
có thể cung cấp những thuốc tiềm năng chống lại rất nhiều loại bệnh hiện

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 4

ñang lưu hành trên thế giới. Trong số 18.000 sản phẩm tự nhiên từ biển ñược
mô tả, hơn 30 % là từ hải miên (Koopmans et al., 2009; Niyaz 2012). Nhưng
nồng ñộ các chất hoạt tính sinh học trong mô hải miên rất thấp, ví dụ,
Lissodendorix sp. chứa khoảng 400µg/kg halichondrin B, ñiều ñó có nghĩa
cần phương pháp sản xuất bền vững. ðể phát triển kỹ thuật sản xuất bền vững
cần phải biết liệu hải miên hay các loài cộng sinh hay cả 2 chịu trách nhiệm
sản sinh ra các chất hoạt tính sinh học, và trong trường hợp hải miên là nhà
sản xuất thì tế bào nào chịu trách nhiệm. Vì hàm lượng các chất hoạt tính sinh
học trong hải miên thấp nên cần một lượng lớn sinh khối hải miên cho việc

tách chiết.
Hải miên là vật chủ của cộng ñồng vi sinh vật lớn và vai trò của những
vi sinh vật này thay ñổi theo nguồn dinh dưỡng và sự cộng sinh, hỗ sinh với
hải miên,là nguồn giàu các sản phẩm tự nhiên có giá trị như polyketides,
nonribosomal peptides, và alkaloids nhằm xua ñuổi và ngăn chặn ñộng vật ăn
thịt, tranh giành không gian với các loài không cuống (sessile) khác, ñể liên
lạc và bảo vệ không bị nhiễm bệnh. Rất nhiều hợp chất có hoạt tính ñộc tế bào
(cytotoxic), kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus và chống viêm.
Rất nhiều hải miên có cộng ñồng vi sinh vật cực kỳ ña dạng trong mô
của chúng. Sự ña dạng này có thể giải thích một phần bởi sự thay ñổi các ñiều
kiện lý, hóa, sinh trong hải miên, có thể ảnh hưởng ñến sinh thái vi sinh vật và
tiến hóa. Những nghiên cứu về vi sinh vật liên kết hải miên cho thấy vi sinh
vật có thể chiếm ñến 50% thể tích hải miên, và con số này lớn hơn 2-3 lần so
với lượng vi khuẩn trong nước biển (Wang 2006),và cộng ñồng này ñặc hiệu
cho hải miên.
2.2. Vi khuẩn liên kết Hải miên biển
Vi sinh vật sinh sống trong tất cả các hệ sinh thái biển, chúng rất ña
dạng và trao ñổi chất phức tạp. Vi sinh vật biển là các nhà sản xuất sinh khối
ñầu tiên trong ñại dương, thu nhận ánh sáng và cố ñịnh cacbon, và là những

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 5

recyclers dinh dưỡng ñầu tiên. Vi sinh vật biển cũng ñược biết tham gia vào
chu trình toàn cầu của các nguyên tố sinh học như nitơ, cacbon, oxy, photpho,
sắt, lưu huỳnh và các vi lượng. Những ñóng góp quí giá của chúng vào các
chu trình hóa ñịa sinh chưa ñược biết. Nhưng do tính linh hoạt của các khả
năng sinh hóa và sinh khối to lớn của chúng trong hệ sinh thái biển, chúng
ñược tin rằng là các thành phần chính chịu trách nhiệm cho việc duy trì các
chu trình này, giúp ổn ñịnh các hệ sinh thái.

Vi sinh vật liên kết với Hải miên và một số vật liệu biển khác có cả nội
bào và ngoại bào. Hiện nay, cộng ñồng vi sinh vật ở hải miên và hệ gen của
chúng chưa ñược hiểu rõ. Có giả thuyết cho rằng vi khuẩn trong các cộng
ñồng này tổng hợp rất nhiều hợp chất hoạt tính sinh học liên ñới (associated).
Người ta tin rằng rất nhiều sản phẩm của hải miên thực tế là do vi khuẩn liên
kết sinh ra. Ví dụ diketopiperazines của Tedania ignis ñược qui cho là sản
phẩm trao ñổi chất của Micrococcus sp liên kết với hải miên. Kháng sinh
polybrominated biphenyl ether tách từ hải miên Dysidea herbacea
(Demospongiae) thực tế do cyanobacterium Oscillatoria spongeliae nội cộng
sinh tạo ra. Vi khuẩn Salinispora phân lập từ hải miên P. clavata ñược nhận
dạng là nguồn kháng sinh rifamycin. Trong khi ñể nuôi ñộng vật không
xương sống ñể tổng hợp các sản phẩm tự nhiên nói chung cực kỳ ñắt ñỏ hoặc
không thực hiện ñược, nuôi cấy vi sinh vật có thể cung cấp hợp chất quan
trọng rẻ và số lượng lớn.[7,22,11]
Vi sinh vật biển như nguồn kháng sinh và kháng virus[25]: chủng
Acremonium furcatum có khả năng sinh các dẫn xuất của D-allo- và L-
isoleucine có hoạt tính ñối kháng B.subtilis, Staphylococcus aureus, E.coli và
Botrytis cynerea. Chủng vi khuẩn Marinomonas mediterranea phân lập từ
biển Mediterranean (ðịa Trung Hải) sinh kháng sinh marinocine có hoạt tính
ñối với 3 chủng nosocomial rất khó chữa trị bằng các loại kháng sinh thương

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 6

mại là Pseudomonas sp ceftazidime, Pseudomonas sp imipenemr và
Staphylococcus aureus meticillin.
Lysozyme có ở cả ñộng vật, thực vật và vi sinh vật có hoạt tính kháng
khuẩn và kháng virus. Lysozyme chiết từ chủng Bacillus sp S-12-86 từ biển
có khả năng phá màng tế bào Candida albicans và làm cho tế bào chất không
ñối xứng. Lysozyme này có hoạt tính với vi khuẩn gram (+), gram (-) và nấm.

Một hợp chất kháng khuẩn khác ñược tách từ vi sinh vật biển (Streptomyces
sp) là sisomicin, kháng Bacillus cereus và E.coli.
Vi sinh vật biển sinh biosurfactant và bioremediation[26]: vi sinh vật
biển ñược chứng minh có lợi nhiều mặt, trong ñó có biosurfactant. Các chủng vi
sinh vật sinh biosurfactant ñược chú ý, ñặc biệt cho bioremedation biển bị ô
nhiễm bởi dầu thô. Một số loài sinh tổng hợp biosurfactant là P.nautical. Các
thành phần chính gồm proteins, carbohydrates và lipids tỉ lệ 35:63:2, tương ứng.
Một chủng vi khuẩn biển nhiệt ñới Yarrowia lipolytica sinh emulsifier khi có
mặt alkanes hoặc dầu thô. Một số chủng khác như Alcaligenes sp.; Alcanivorax
borkumensis; Myroides sp. cũng có khả năng sinh biosurfactants khác nhau.
Bên cạnh ñó, vi sinh vật biển có khả năng oxy hóa các ion kim loại
nặng. Chủng Bacillus sp.SG-1 oxy hóa Coban và Manganese (Mn II). Mn (III,
IV) oxides ñược sản sinh bởi vi khuẩn oxy hóa Mn(II) là các chất oxy hóa
mạnh có khả năng oxy hóa các hóa chất vô cơ và hữu cơ.
Vi sinh vật biển là nhà sản xuất enzymes[27]: người ta tính rằng thị
trường thế giới cho enzyme công nghiệp tăng 10-15% hàng năm.
Công nghệ sinh học enzymes biển có thể cung cấp các chất xúc tác sinh học
mới với các tính chất chịu muối, chịu nhiệt, chịu áp suất (barophilicity), thích
nghi với lạnh (cold adaptivity) và dễ nuôi cấy qui mô lớn.
ðối với vi sinh vật công sinh nuôi cấy ñược, Li và cs (2006) phân lập
23 khuẩn tia từ Craniella australiensis sử dụng môi trường nước biển và dịch
chiết hải miên, trong ñó 11 chi Streptomyces riêng rẽ. Các chi Streptomyces,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 7

Pseudonocardia và Nocardia ñược phân lập từ hải miên biển Craniella
australiensis, Halichondria rugosa, Sponge sp. và Stelletta tenuis.
Hiện nay, cộng ñồng vi sinh vật ở hải miên và hệ gen của chúng chưa
ñược hiểu rõ. Bằng các phương pháp lai huỳnh quang in situ hoặc giải trình tự

gen 16S rRNA chỉ ra rằng, phần lớn hải miên có quần thể vi sinh vật giống
nhau (uniform), nhưng phức tạp về phát sinh loài (phylogenetically) và chúng
khác hoàn toàn với quần thể vi sinh vật của phiêu sinh vật (plankton) biển
hoặc bùn biển. Những nghiên cứu phân tử hải miên chỉ ra các loại vi sinh vật
liên kết hải miên trong ñó có các thành viên Proteobacteria, Firmicutes,
Bacteroidetes, Actinobacteria.
Dựa trên những nghiên cứu cộng ñồng vi sinh vật bằng các phương
pháp như Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), 16S rRNA gene
sequencing and Fluorescence In Situ Hybridization (FISH), người ta nhận
thấy cộng ñồng vi khuẩn liên kết với hải miên có tới hơn 25 phyla, trong ñó
có Proteobacteria, Nitrospira, Cyanobacteria, Bacteriodetes, Actinobacteria,
Chloroflexi, Planctomycetes, Acidobacteria, Poribacteria và Verrucomicrobia,
ngoài các thành viên của domain Archaea. Các quần thể vi sinh vật khác sống
trong hải miên là fungi và microalgae. Rất ít biết về virus trong hải miên,
mặc dù các hạt giống virus ñược phát hiện trong nhân tế bào của Aplysina
(Verongia) cavernicola. Có 2 con ñường ñể tạo nên vi khuẩn liên kết, một là
hấp thu vi khuẩn ñặc hiệu từ nước xung quanh khi nước ñi qua hải miên
trong quá trình ăn lọc và hai là truyền thẳng vi khuẩn liên ñới thông qua giao
tử (gametes) của hải miên bằng cách ñưa cả vi khuẩn vào noãn bào (oocytes)
hoặc ấu trùng (larvae) (Wang et al., 2006; Li et al., 2007).
Những năm gần ñây, các nhà khoa học của Việt Nam ñã tiến hành một
số nghiên cứu về sinh vật biển nhằm khai thác tiềm năng to lớn nguồn tài
nguyên thiên nhiên này. Năm 2007-2008, PGS TS Lại Thúy Hiền, Viện
CNSH, ñã phân lập ñược 11 chủng nấm men và 13 chủng vi khuẩn có khả

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 8

năng tạo các chất hoạt hóa bề mặt sinh học từ vùng biển Việt Nam và nghiên
cứu các ñặc tinh sinh học của chúng trong khuôn khổ ñề tài ñộc lập cấp Nhà

nước. ðề tài trong Chương trình khoa học trong ñiểm cấp Nhà nước
KC.09.09/06-10: Nghiên cứu sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học theo ñịnh
hướng kháng sinh, gây ñộc tế bào và chống ôxy hóa từ sinh vật biển nhằm tạo
các sản phẩm có giá trị dược dụng (2007-2008), do GS Châu Văn Minh chủ
trì ñã nghiên cứu một số sinh vật biển có chất kháng sinh, gây ñộc tế bào và
chống ôxy hóa và ñăng ký 3 thực phẩm chức năng tại Cục Vệ sinh an toàn
thực phẩm – Bộ Y tế.
Gần ñây người ta chú ý nhiều hơn ñến vi sinh vật liên kết hải miên ñể
tìm nguồn gốc ñích thực của các hợp chất hoạt tính sinh học và sự liên kết hải
miên với vi sinh vật.
Môi trường biển rất ña dạng và vi sinh vật biển phơi nhiễm áp suất,
nhiệt ñộ, ñộ mặn, dinh dưỡng cực ñoan. Những enzymes của những vi sinh
vật trong những môi trường như thế rõ ràng có những tính chất sinh lý và
sinh hóa ña dạng, cho phép quần thể vi sinh vật thích nghi và phát triển
mạnh trong các ñiều kiện cực ñoan ñó. Hiện nay những nghiên cứu về sinh
vật biển nói chung và vi sinh vật biển nói riêng còn là một lĩnh vực yếu và
thiếu ở Việt Nam. Vì vậy, ðề tài cung cấp những hiểu biết về ña dạng vi
khuẩn liên kết hải miên bằng phương pháp phân lập và ñịnh danh các
chủng phân lập trên các loại môi trường chọn lọc cho từng loại, hướng tới
tuyển chọn các chủng hữu ích có tiềm năng ứng dụng trong nghiên cứu các
hoạt chất có hoạt tính sinh học.
2.3 Các chủng thử hoạt tính ñối kháng của vi khuẩn liên kết Hải miên
2.3.1. Vi khuẩn Vibrio vulnificus (V.vulificus)
Khác với hầu hết các loại vi khuẩn, V. vulnificus là một loại vi khuẩn
hình dài có thể sống ở nước mặn. Nó là một sinh vật sống tự nhiên trong nước
biển, ñặc biệt ở những vùng có ñộ mặn thấp (0.5 ñến 2.0% muối), như: những

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 9

vùng gần bờ biển và các cửa sông, ở ñó, nước ngọt từ các dòng sông chảy về
hòa với nước mặn của biển mà thành. Vi khuẩn Vibrio vulnificus sinh ra là do
hậu quả của sự ô nhiễm hóa chất hoặc sinh học.
Vi khuẩn V. vulnificus thích sống ở môi trường ấm và sinh sản nhanh
trong nhiệt ñộ của nước từ 86°F ñến 95°F và với ñộ mặn khoảng chừng 0.5%
muối. Ở Mỹ, người ta tìm thấy vi khuẩn này nhiều nhất là ở Vịnh Mexico
(Gulf of Mexico) từ tháng 4 ñến tháng 10. Vi khuẩn này còn có ở các vùng
ven biển khác của nước Mỹ, nhưng mức ñộ ít hơn nhiều; nó cũng ñược phát
hiện có trong nước biển và trong các ñộng vật có vỏ ở các quốc gia khác.
Các Trung Tâm Phòng Chống Bệnh (the Centers for Disease Control
and Prevention) tường thuật rằng mỗi năm có khoảng 90 trường hợp bị nhiễm
vi khuẩn V. vulnificus ở Hoa Kỳ. Vi khuẩn thật sự chỉ gây bệnh nặng với
những người có hệ thống miễn dịch yếu hoặc người có tình trạng sức khỏe
không ñược tốt hay ñang có bệnh làm cho vi khuẩn có khả năng dễ gây
nhiễm ñộc và lan truyền nhanh khắp cơ thể của họ (bệnh nhiễm trùng máu).
Tổng số tỷ lệ tử vong vì bệnh nhiễm vi khuẩn V. vulnificus là 40%.
ðối với những người có sức khỏe tốt, vi khuẩn có thể gây nhiễm trùng
dạ dày nhẹ (như chóng mặt, ói, ñau dạ dày hoặc tiêu chảy) hoặc nhiễm trùng
da (cellulitis) nhưng các trường hợp này ít xảy ra và thường là không nặng.
Những tình trạng sau ñây làm cho người dễ bị nhiễm ñộc nặng:
•
Bệnh gan (từ viêm gan, xơ gan, chứng nghiện rượu, hoặc ung thư)
•
Bệnh tiểu ñường
•
Bệnh ung thư (bệnh bạch cầu, ung thư máu, ung thư hệ thống miễn
nhiễm)
•
Bệnh quá thừa chất sắt (hemochromatosis)
•

Bệnh hoa liễu (HIV/AIDS)
•
Dạ dày bị rối loạn (người ñã bị mỗ dạ dày, người ñang dùng thuốc là
giảm ñộ axit trong dạ dày)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 10

•
Các thứ bệnh khác, hoặc những trường hợp bị phương pháp trị liệu
làm yếu hệ thống miễn dịch (như hóa liệu pháp)
2.3.2. Vibrio parahaemolyticus (V.parahaemolyticus)
V.parahaemolyticuslà Gram âm, bao gồm các chủng có ñộc tố có khả
năng gây bệnh và các chủng không gây bệnh hoai tử gan tụy cấp tính AHPND
(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease). Dòng vi khuẩn gây bệnh
AHPND phát triển trong dạ dày tôm, chúng hình thành nên các màng sinh học
( biofilm) giúp bảo vệ chúng bởi tác dụng của các loại kháng sinh và các
phương pháp ñiều trị khác. V.parahaemolyticus có khả năng chịu ñựng với
các ñộ mặn, pH, nhiệt ñộ và dễ dàng ñeo bám trên các sinh vật phù du di
chuyển theo dòng chảy.
Chỉ có một số lượng nhỏ các chủng vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên
tôm nuôi. Phần lớn nó là mầm bệnh cơ hội, tức là chúng chỉ phát triển và
gây bệnh khi vật chủ bị stress hoặc yếu và không có khả năng chống lại
chúng. Chỉ có một số ít mầm bệnh vi khuẩn Vibrio là tác nhân gây bệnh
chính trên ñộng vật khỏe mạnh. Vi khuẩn Vibrio có ñộc tính cao có thể giết
chết tôm khi tiếp xúc với sự hiện diện rất ít của mầm bệnh hoặc khi tôm ăn
phải một lượng nhỏ vi khuẩn.
V.parahaemolyticus rất phổ biến trong môi trường ở các vùng cửa
sông, và một số ít hiện diện trong môi trường nước ngọt. Hầu hết chúng ñều
không có khả năng gây bệnh và thường vô hại khi ăn phải, tuy nhiên ñộc tố

phát sinh từ vi khuẩn này thường ñược tìm thấy trong các loài cá tự nhiên và
chúng là một trong những nguyên nhân gây ngộ ñộc khi ăn hải sản.
Các loài Vibrio cũng có thể lây lan từ bố mẹ và hậu ấu trùng. Ví dụ như
mầm bệnh gây nên AHPND hiện diện ở rất nhiều loài tôm và ở các giai ñoạn
phát triển khác nhau. ðiều này có thể giải thích tại sao chúng có thể dễ dàng
bùng phát, lây lan và vấn ñề tiêu diệt hoặc kiểm soát mầm bệnh này không hề
ñơn giản.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 11

Màng sinh học là tập hợp của các sinh vật bám trên một bề mặt. Ví dụ
như một mảnh vụn hữu cơ trên nền ñáy ao tôm hoặc bề mặt ñó là dạ dày tôm
như trường hợp của vi khuẩn gây bệnh AHPND. Màng sinh học giúp bảo vệ
các vi khuẩn chống lại kháng sinh và sự tấn công của các vi khuẩn cạnh tranh
khác có trong ao nuôi.
Sự hình thành các màng sinh học bắt ñầu khi vi khuẩn bám vào lớp
kitin trên bề mặt dạ dày tôm. Sau ñó, vi khuẩn tiết ra các chất hình thành lên
một lớp “keo” giúp cho chúng gắn chặt vào bề mặt dạ dày tôm. Khi ñã hình
thành các màng sinh học chắc chắn trên dạ dày tôm, các vi khuẩn bắt ñầu
nhân lên, màng là hợp chất exopolysaccharides sẽ hình thành và có tác dụng
bảo vệ vi khuẩn với tác dụng của các loại kháng sinh, chất khử trùng, các chất
chiết xuất từ thảo dược và các phương pháp ñiều trị khác, trong khi các hoạt
ñộng trao ñổi chất ở tế bào của chúng vẫn diễn ra bình thường.
Do tính chất phức tạp của Giống vi khuẩn Vibrio, làm cho việc kiểm
soát và khống chế mầm bệnh vi khuẩn gây bệnh EMS/AHPND trở nên rất
phức tạp và khó khăn. Vi khuẩn V. parahaemolyticus sản sinh ra ñộc tố nhưng
ñộc tố ñó không là nguyên nhân trực tiếp gây tổn hại ñến vật chủ. Hầu hết
mầm bệnh vi khuẩn Vibrio sau khi xâm nhập vào vật chủ chúng sẽ nhanh
chóng phát triển, gia tăng mật số ñể bảo vệ chính nó và cùng với sự phát triển

của vi khuẩn là sức khỏe của vật chủ yếu ñi và dẫn ñến cái chết. Dòng vi
khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh EMS/AHPND không tấn công và xâm
nhập vào máu của tôm thông qua các vết thương hoặc các cơ chế xâm nhập
khác. ðiều này giải thích lý do tại sao thuốc kháng sinh không thể ngăn chặn
các nhiễm trùng do EMS/AHPND gây nên. Nếu như kháng sinh không thể
tiếp xúc với mầm bệnh ở mức ñộ ñủ ñể ảnh hưởng ñến nó thì kháng sinh sẽ
không thể phát huy tác dụng. Mặc dù vẫn có nhiều trường hợp cần dùng ñến
kháng sinh trong việc ñiều trị bệnh trên tôm, dùng kháng sinh ñể trị bệnh
EMS/AHPND là một ví dụ rất ñiển hình về việc sử dụng kháng sinh không

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 12

hiệu quả. Ẩn mình trong cái vỏ bọc an toàn là màng bao sinh học (biofilm), vi
khuẩn V. parahaemolyticus - tác nhân gây bệnh EMS/AHPND ñược bảo vệ
trước các hóa chất về mặt lý thuyết là có thể tiêu diệt chúng. ðiều này sẽ ñặt
ra một thách thức rất lớn ñối với các cố gắng phát triển một phương pháp ñiều
trị EMS/AHPND.
2.3.3 Pseudomonas
Pseudomonas là một chi vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi
trường. Sự biến dưỡng dễ thay ñổi và linh ñộng của chúng làm cho chúng có
thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, ñất, trên cây và trong các
ñộng vật. Trong số những loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có
thể ñược sử dụng trong công nghệ sinh học.
ðặc ñiểm hình thái chung của Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình
que, di ñộng nhờ roi ở ñầu và không có bào tử.
Các ñặc ñiểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh
dưỡng, không quang hợp hoặc cố ñịnh nitrogen
Pseudomonas aeruginosa (ñại diện của Pseudomonas, hay còn gọi là
trực khuẩn mủ xanh) là một trong những vi khuẩn phổ biến gây bệnh ở ñộng

vật và con người. Nó ñược tìm thấy trong ñất, nước, hệ vi sinh vật trên da và
các môi trường nhân tạo. Vi khuẩn không chỉ phát triển trong môi trường
không khí bình thường, mà còn có thể sống trong môi trường có ít khí oxy, do
ñó có thể cư trú trong nhiều môi trường tự nhiên và nhân tạo. Vi khuẩn này
phát triển bằng rất nhiều các hợp chất hữu cơ; trong cơ thể, nhờ khả năng
thích ứng vi khuẩn cho nên nó lây nhiễm và phá hủy các mô của người bị suy
giảm hệ miễn dịch. Triệu chứng chung của việc lây nhiễm thông thường là
gây ra viêm nhiễm và nhiễm trùng huyết. Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các cơ
quan thiết yếu của cơ thể như phổi, ñường tiết niệu và thận sẽ gây ra những tử
vong cao; bởi vì vi khuẩn này phát triển tốt trên các bề mặt niêm mạc bên
trong cơ thể. Bên cậnh ñó, vi khuẩn này cũng ñược phát hiện trên các dụng cụ

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 13

y khoa bao gồm catheter, gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện và phòng mạch. ðây
cũng là nguyên nhân gây ra viêm chân lông.
2.3.1.4. Micrococcus.luteus (M.luteus)
M.luteus là cầu khuẩn Gram dương, sống trông ñất, nước, không khí
Micrococcus gây bệnh trên cá
M.luteus ñược gọi là một chất gây ô nhiễm ở những bệnh nhân bị bệnh
và có khả năng chống băng cách lmaf chậm quá trính trao ñổi chất lớn và cảm
ứng của các gên ñộc ñáo. ðó là một tỷ lệ G + C vi khuẩn cao

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 14

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Vật liệu

Mẫu Hải miên ñược thu thập từ biển Lăng Cô ( Huế), ñược lưu trữ tại
phòng Công nghệ sinh học, viện Hóa sinh biển ở -80°C
Trình tự mồi cho 16S rARN:Mồi xuôi: AGA GTT TGA TCA TGG
CTCA; Mồi ngược: AAG GAG GTG ATC CAG CC
3.2. Hóa chất, thiết bị
- Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn: agar, cao thịt, cao nấm
men, peptone, NaCl…
- Hóa chất sử dụng thử phản ứng sinh lý, sinh hóa của các chủng vi
khuẩn nghiên cứu: KNO3, glucose, KOH, anpha- naphton, ñỏ phenol,
lysozyme, KI, ZnCl2, tinh bột, Na3C6H5O4.2H2O…
- Hóa chất dùng trong sinh học phân tử:
- TE1:
+ 10 mM Tris–HCl
+ 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0
- ðệm lysis
+ 0.5 M NaCl
+ 100 mM EDTA
+ 10 mM Tris, pH 8.0
- Proteinase K 20mg/ml
- SDS 1%
- Phenol-chloroform (25-24)
- Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25-24-1)
- Isopropanol

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 15

- TE (H
2
O) vô trùng.

- Bộ hóa chất cho PCR: Taq polymerase, dNTPs, DNA Ladder, cặp
mồi, Buffer taq, cồn tuyệt ñối.
- bộ TA TOPO cloning kit
- bộ kit Quagen tach Plasmid
- Bộ kit thôi gel Quagen
- Agarose
- 50X TAE
- EthiroumBromid
- Máy móc thiết bị ñược sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm: Box
cấy Class II; tủ nuôi cấy (Sanyo, nhật); máy ly tâm 5415 C (Eppendorf, ðức);
Cân phân tích (Sartorius, ðức); máy ño pH Meter Delta 320 (Mettler Toledo,
Thụy sỹ).
- Các dụng cụ dùng cho nghiên cứu vi sinh thông thường như que cấy;
ñĩa pepri; bình tam giác; que ria của ðức.
3.3. Môi trường nghiên cứu
- Môi trường phân lập vi khuẩn (Marine Agar 2216) (g/l): Peptone 5.0, cao
nấm men 1.0, Citrate sắt -0.1, NaCl - 19.45, MgCl
2
.6H
2
O - 8.8, Na
2
SO
4
- 3.24,
CaCl
2
.2 H
2
O - 1.8, KCl - 0.55, NaHCO

3
- 16, KBr - 0.08, thạch - 20.0. Các
loại vi lượng (mg/l): SrCl
2
- 34.0, H
3
BO
3
- 22.0, Na
2
(SiO
2
)
n
O - 4.0, NaF -
2.4, NH
4
NO
3
- 1.6, Na
2
HPO
4
- 8.0. Ngoài ra còn một số hóa chất dùng trong
nuôi cấy vi sinh vật như NaCl 0.9%, nước biển nhân tạo.
- Nước biển nhân tạo có thành phần sau (g/l): MgSO
4
.7H
2
O - 3.50, NaHCO

3
-
0.11, MgCl
2
.6H
2
O -4.80, CaCl
2
.2 H
2
O - 1.60, KCl - 0.77, NaCl - 28.13.
- Môi trường TCBS ( Thiosulfate citrate bile salts succharose) (g/l): Cao men
5; Peptone 10; Sodium thiosulfate (Na
2
S
2
O
3
) 10; Sodium citrate (C
6
H
5

Na
3
O
7
) 10; Ox gall 5; Sodium cholate (C
24
H

39
O
5
Na) 3; Saccharose 20; NaCl

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 16

10; Ferric citrate (C
6
H
5
FeO
7
) 1; Bromothymol blue 0,04; Thymol blue 0,04;
Thạch 15

Môi trường thử hoạt tính sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn nghiên cứu
Môi trường thử khả năng sinh catalase
Cao thịt 10.36g Peptone 5.18g
pH 6.5-6.7 H
2
O 1000ml

Môi trường xác ñịnh khả năng khử nitrat
peptone 10g KNO3 10g
Cao thịt 1g NaCl 5g
H
2
O 1000ml pH 7.2±0.2

+Thuốc thử :
α-Naphthylamine (20%); sulfanilic acid
Môt trường xác ñịnh khả năng sinh acetoin (phản ứng Voges-
Prokauer (V-P))
Peptone 10g Cao thịt 1g
Glucose 5g NaCl 5g
H
2
O 1000ml pH 7.2±0.2
Thuốc thử: α-naphtol 5% (ñược pha trong cồn 90 ñộ, giữ ở tủ 4
o
C)
và KOH 40%
Môt trường lên men glucose kỵ khí.
Peptone 10g Glucose 10g
NaCl 5g Cao thịt 1g
ðỏ phenol 0.025g H
2
O 1000ml
pH 7.2±0.2


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp
Page 17

Môt trường xác ñịnh khả năng kháng NaCl 5,7,10%
Peptone 10g NaCl 70g
Cao thịt 1g H
2

O 1000ml
pH 7.2±0.2

Môi trường xác ñịnh khả năng thủy phân tinh bột tan
Peptone 5.16g NaCl 10.32g
Cao thịt 5.18g Agar 15.5g
Tinh bột tan 10-30g pH 7.2±0.2
Môi trường xác ñịnh khả năng phân giải Gelatin
Peptone

5g Gelatin 120g
H
2
O 1000ml 7.2÷7.4
Môi trường xác ñịnh khả năng ñồng hóa citrate
NH
4
H
2
PO
4
1g MgSO
4
.7H
2
O 0.2g
K
2
HPO
4

1g Na
3
C
6
H
5
O
4
.2H
2
O

23g
NaCl 5g Agar 20g
Bromthymolblue

20ml
Mỗi môi trường ở trên ñều ñược khử trùng ở 115
°
C trong 30 phút.

3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phân lập vi khuẩn liên kết hải miên
Mẫu hải miên ñược chuyển từ tủ -20
o
C sang hộp xốp có ñá, ñể rã ñông từ
từ. Cân 1 gram hải miên cho vào cối sứ, rửa qua bằng nước biển nhân tạo. Hải
miên sau khi rửa ñược bổ sung 1ml nước biển nhân tạo và nghiền nát. Lấy
100µl dịch nghiền hải miên cấy trải lên ñĩa Petri có môi trường Marine Agar
2216. Nuôi ở nhiệt ñộ 30

o
C. Sau 24 giờ nuôi cấy, chọn các khuẩn lạc ñặc
trưng, riêng rẽ, làm sạch lại trên môi trường phân lập, cấy trải ở các nồng ñộ
từ cao ñến thấp và giữ giống cho những nghiên cứu tiếp theo.