CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM

CHƯƠNG 1
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
VI SINH VẬT TRONG THỰC
PHẨM

CHƯƠNG 1
MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC
ĐỊNH
VI SINH VẬT


I. 1. HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG
PHÂN TÍCH VI SINH VẬT
-
Trong phân tích, kiểm nghiệm vi sinh vật, môi
trường cần cho việc tăng sinh, phân lập, phân
biệt, nhân giống, cấy chuyền, bảo quản, định
danh vi sinh vật…
-
Môi trường cần chứa đầy đủ các thành phần về
nguồn carbon, đạm, khoáng và vi lượng … và có
các điều kiện lý hóa thích hợp

* Theo nguồn gốc
- Tự nhiên
- Tổng hợp
- Bán tổng hợp
* Theo trạng thái vật lý
- Lỏng (Brothe)
- Rắn

- Bán lỏng (bán rắn)
PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VSV

PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VSV
* Theo mục đích
- Môi trường tiền tăng sinh
- Môi trường tăng sinh
- Môi trường chọn lọc
- Môi trường phân biệt
- Môi trường thử nghiệm sinh hóa

PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG
•
Môi trường tự pha chế
–
Chẩn bị nguyên liệu: Cân, đong thành phần
–
Pha chế: Hòa tan, bổ sung agar (môi
trường rắn)
–
Lọc
–
Điều chỉnh pH
–
Phân phối vào dụng cụ
–
Hấp khử trùng (121
0
C/30p)

•
Môi trường đông khô:
Được sử dụng phổ biến trong các phòng kiểm
nghiệm vi sinh
–
Cân lượng môi trường
–
Bổ sung nước (theo tỷ lệ), hòa tan
–
Phân phối vào dụng cụ chứa
–
Hấp khử trùng (121
0
C/15’)
Note: Thông thường môi trường được pha chế có
giá trị pH thích hợp, không cần phải hiệu chỉnh pH
sau khi được pha chế .

Vi khuẩn gram dương trên môi trường chọn
lọc CAN (Colistan Nalidixic Acid Agar )

S. epidermidis và S. aureus trên môi trường chọn lọc –
phân biệt Mannitol Salt Agar (MSA)

Môi trường kiểm tra khả năng sinh Indol
Môi trường kiểm tra khả năng lên men
Môi trường kiểm tra khả năng lên men
Dextrose (Glucose)
Dextrose (Glucose)

I.2. KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN
CHUYỂN MẪU VÀ BẢO QUẢN MẪU
THỰC PHẨM

Một kế hoạch lấy mẫu chi tiết cần có các yếu tố
sau: n, c, m, M
-
n: số mẫu thử
-
c: số mẫu được phép nằm trong khoảng lân cận
giới hạn (m ≤ c ≤ M)
-
m: khoảng chấp nhận (mật độ vi sinh <m)
-
M: khoảng không chấp nhận (mật độ vi sinh
>M; thông thường 10 x m ≤ M
KẾ HOẠCH LẤY MẪU THỰC
PHẨM

Ví dụ: Tiêu chuẩn về tổng số vsv trong sp trứng
được thanh trùng Pasteur: n=5, c=2, m= 5.10
4
,
M= 10
6
CFU/25g

- Kế hoạch 2 thuộc tính
- Chỉ nêu ra m
- Nếu tất cả các mẫu ≤m hoặc ≤c mẫu

trong n mẫu thử >m: Chấp nhận lô hàng
- Nếu >c mẫu trong số n mẫu thử >m: từ
chối lô hàng

- Kế hoạch 3 thuộc tính
- Đặt ra cả m và M
- Chỉ tiêu “m” thường phản ánh ngưỡng trên
của GMP
- Chỉ tiêu “M” đánh dấu giới hạn trên (nguy
hiểm/không chấp nhận.
- Nếu tất cả các mẫu ≤m hoặc ≤c mẫu trong
n mẫu thử nằm trong khoảng >m và ≤M: Chấp
nhận lô hàng
- Nếu >c mẫu trong n mẫu thử nằm trong
khoảng >m và ≤M Hoặc có một mẫu >M: Từ chối
lô hàng

- Lựa chọn kế hoạch lấy mẫu
- Kế hoạch 2 thuộc tính: Đối tượng vsv quan
tâm không được phép có trong thực phẩm;
- Kế hoạch 3 thuộc tính: Nếu cho thực phẩm
một số lượng nhất định vsv trong một đơn vị thể
tích.

Mẫu:
- Phải mang tính đại diện (nhiều thời điểm,
vi trí)
- Đ/v mẫu tp đã biết: sử dụng que bông vô
trùng quét 1 diện tích bề mặt nhất định or cắt
lát 2-3mm)

-
Tránh sự tạp nhiễm vi sinh vật ngoại lai
(chứa mẫu trong các bình bằng nhựa có nắp
vô trùng)
-
Ghi chú mẫu: thời gian, nhiệt độ, nơi lấy
mẫu, phương tiện vận chuyển, …
KẾ HOẠCH THU MẪU THỰC PHẨM

Nơi lấy
mẫu
Thời điểm lấy mẫu
Số lượng mẫu
cần lấy
1
Chỉ tiêu VSV
kiểm tra
Qui
mô

nhỏ
Qui
mô
vừa
Qui
mô
lớn
CSGM
trâu bò
Sau khi khám thịt, trước khi

đưa thân thịt đi tiêu thụ/sơ
chế hoặc trước khi làm
lạnh, mẫu được thu thập
trong vòng 30 phút.
1 -
3
4 -
6
7 -
12
- VKHK TS
-
Enterobacteriacea
e
- Salmonella
CSGM
lợn
Sau khi khám thịt, trước khi
đưa thân thịt đi tiêu thụ/sơ
chế hoặc trước khi làm
lạnh, mẫu được thu thập
trong vòng 30 phút.
1 -
3
4 -
6
7 -
12
- VKHK TS
-

Enterobacteriacea
e
- Salmonella
CSGM
cừu, dê,
chó,
ngựa
Sau khi khám thịt, trước khi
đưa thân thịt đi tiêu thụ/sơ
chế hoặc trước khi làm
lạnh, mẫu được thu thập
trong vòng 30 phút.
1- 3
4 -
6
7 -
12
- VKHK TS
-
Enterobacteriacea
e
- Salmonella
Phương pháp lấy mẫu thịt

Nơi lấy
mẫu
Thời điểm lấy mẫu
Số lượng mẫu
cần lấy
1

Chỉ tiêu VSV
kiểm tra
Qui
mô

nhỏ
Qui
mô
vừa
Qui
mô
lớn
CSGM
gia cầm
2
Sau khi đưa thân thịt đi
làm lạnh ít nhất 1,5 giờ
(cả trong kho làm lạnh
chúng hoặc sau khi treo
thân thịt lại trên dây) hoặc
trước khi đưa đi tiêu
thụ/sơ chế.
1 -
3
4 -
6
7 - 12
- VKHK TS
-
Enterobacteriacea

e
- Salmonella
- Campylobacter
Cơ sở
pha
lọc/sơ
chế
Sau khi lọc xương, bắt đầu
làm lạnh hoặc đông lạnh
tiếp theo, thu thập mẫu là
các miếng thịt pha lọc, thịt
sơ chế hoặc thịt xay trước
khi bao gói chân không
hoặc bao gói kín.
1 -
3
4 -
6
7 - 12
- VKHK TS
- E.coli
- Salmonella
- VSV khác khi
yêu cầu
Cơ sở
bảo quản
(Kho
lạnh)
Trong kho lạnh, tại thời
điểm bảo quản mẫu. Mẫu

lấy là thịt lạnh hoặc lạnh
đông tại 5 điểm: 4 góc và
1 giữa. Gộp lại là 1 mẫu.
Cho 1 kho lạnh
lấy 5 đơn vị mẫu
tại 5 vị trí.
- VKHK ưa lạnh
-
Enterobacteriacea
e
- Salmonella

Các sản phẩm lạnh đông:
- Lau cồn phía ngoài PE
- Đặt vào khay tráng men đã vô trùng
- Đưa vào buồng vô trùng để rã đông tự
nhiên (T
0
phòng); 2-5
0
C (18h); 45
0
C (15
phút)

Mẫu đồ hộp:
- Kiểm tra hộp có bị phồng, biến dạng, hở
…
- Lau chùi bằng cồn bên ngoài
- Đưa vào phòng vô trùng để kiểm

Các sp bao bì, nylon, thủy tinh …
- Kiểm tra độ kín của bao bì
- Lau cồn phía ngoài
- Đưa vào phòng vô trùng để kiểm

Trong quá trình vận chuyển:
- Mẫu phải được bảo quản ở -20
0
C cho đến khi
phân tích (0-4
0
C)
-
Mẫu phải xét nghiệm trong vòng 36h (6h)
-
Vi sinh vật có thể bị tổn thương nên trong
nhiều trường hợp cần giai đoạn tăng sinh.
VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẨU
THỰC PHẨM

- Giải đông mẫu trước khi phân tích
. Đk vô trùng (2-5
0
C trong 18h, 45
0
C
trong 15 phút kết hợp lắc bình chứa mẫu để tăng
tốc độ giải đông và đồng nhất nhiệt độ trong
mẫu)

- Đồng nhất mẫu
. Đk vô trùng, mẫu lỏng (lắc kỹ), mẫu
rắn (stomacher)
- Cân mẫu
. Đk vô trùng, sai số cho phép ± 0,1g
. Định tính: 10g; định lượng: 25g
CHUẨN BỊ MẪU THỰC PHẨM