Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh enzyme cellulase trong đất trồng trọt khu vực xuân hoà, phúc yên, vĩnh phúc

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN



ĐINH THỊ THOA



PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG
XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME
CELLULASE TRONG ĐẤT TRỒNG TRỌT KHU VỰC
XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

HÀ NỘI, 2014
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN



ĐINH THỊ THOA



PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG
XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME
CELLULASE TRONG ĐẤT TRỒNG TRỌT KHU VỰC
XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
PGS. TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG








HÀ NỘI, 2014

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung
đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa
Sinh- KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giúp đỡ.
Tôi chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, Ban
chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN, đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn
thành đề tài.
Tôi xin cảm ơn thầy cô và bạn bè đã động viên, tạo mọi điều kiện giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài.
Lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin dành cho gia đình và những ngƣời thân yêu đã
động viên và giúp đỡ tôi.

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2014
Sinh viên


Đinh Thị Thoa

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết
quả nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày trong luận văn là trung thực và không
trùng với công trình của các tác giả khác.

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2014
Sinh viên

Đinh Thị Thoa













CÁC TỪ VIẾT TẮT

ADN : Acid DeoxyriboNucleic
ADP : Acid Diaminopimelic
ARN : Acid RiboNucleic

CMC : Cacboxyl Methyl Cellulose
CFU : Colony Forming Unit
Gr
+
: Gram dƣơng
ISP : International Streptomyces Project
HSCC : Hệ sợi cơ chất
HSKS : Hệ sợi khí sinh
m : meso
Nxb : Nhà xuất bản
PG : PeptidoGlycan
rARN : Riboxom Acid RiboNucleic
VSV : Vi sinh vật












DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Công thức hóa học của cellulose 15
Hình 1.2. Mô hình Fringed fibrillar và mô hình chuỗi gập 15
Hình 2.3. Bản đồ khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên,Vĩnh Phúc 22

Hình 3.4. Khuẩn lạc của một số VSV……………………………………….28
Hình 3.5. Khuẩn lạc xạ khuẩn phân lập từ đất trồng trọt khu vực Xuân
Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 29
Hình 3.6. Một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất trồng trọt khu vực
Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 30
Hình 3.7. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ các chủng xạ khuẩn phân theo nhóm
màu 33
Hình 3.8. Sắc tố tan của một số chủng xạ khuẩn phân lập 34
Hình 3.9. Hoạt tính cellulase của một số chủng xạ khuẩn phân lập 39
Hình 3.10. Đặc điểm màu sắc, sắc tố tan và hình dạng cuống sinh bào tử, bào
tử của chủng xạ khuẩn X3………………………………………42
Hình 3.11. Đặc điểm màu sắc, sắc tố tan và hình dạng cuống sinh bào tử, bào
tử của chủng xạ khuẩn X5…………………………………….42
Hình 3.12. Đặc điểm màu sắc, sắc tố tan và hình dạng cuống sinh bào tử, bào
tử của chủng xạ khuẩn X11……………………………………43

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Các chủng xạ khuẩn phân lập từ đất trồng trọt khu vực
Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc……………………………… 27
Bảng 3.2. Đặc điểm khuẩn lạc của một số VSV 28
Bảng 3.3. Đặc điểm khuẩn lạc của 20 chủng xạ khuẩn phân lập từ đất
trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 32
Bảng 3.4. Số lƣợng và sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu 33
Bảng 3.5. Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trƣờng chứa CMC 36
Bảng 3.6. Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trƣờng chứa BG 37
Bảng 3.7. Hoạt tính cellulase của các chủng xạ khuẩn đã phân lập 38

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài 1
2. Mục đích nghiên cứu 2
3. Nhiệm vụ nghiên cứu 2
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 2
5. Phƣơng pháp nghiên cứu 2
6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn…………………………………………… 3
7. Những đóng góp mới của đề tài 3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn 4

1.1.1. Một số phƣơng pháp trong phân loại xạ khuẩn 4
1.1.1.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy 5
1.1.1.2. Đặc điểm hóa phân loại( Chemotaxonomy) 6
1.1.1.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 7
1.1.1.4. Phân loại số (Numerical taxonomy) 7
1.1.1.5. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces 8
1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 9
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 9
1.1.2.2. Cấu tạo của xạ khuẩn 11
1.1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn 12
1.1.3. Vai trò của xạ khuẩn 14
1.2. Cellulose và cellulase 14
1.2.1. Cellulose 14
1.2.2. Hệ thống enzyme cellulase 16
1.2.3. Cơ chế phân giải cellulose 17
1.3. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh cellulase ở Việt Nam và trên thế
giới…………………………………………………………………… 18
1.3.1. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh cellulase trên thế giới………… 18
1.3.2. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn sinh cellulase ở Việt Nam………….19
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… 20
2.1. Vật liệu và vi sinh vật 20
2.1.1. Vi sinh vật 20
2.1.2. Hóa chất , thiết bị 20
2.2. Môi trƣờng 21
2.2.1. Môi trƣờng phân lập xạ khuẩn 21
2.2.2. Môi trƣờng bảo quản và giữ giống 21
2.2.3. Môi trƣờng thử hoạt tính enzyme 21
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 22
2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu 22
2.3.2. Phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski 23

2.3.3. Phƣơng pháp bảo quản chủng giống 23
2.3.4. Phƣơng pháp quan sát hình thái xạ khuẩn 23
2.3.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn 24
2.3.6. Phƣơng pháp xác định hoạt tính cellulase của xạ khuẩn 24
2.3.7. Phƣơng pháp thống kê và xử lý kết quả 25
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26
3.1. Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn sinh enzyme cellulase từ đất trồng trọt
khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 26
3.1.1. Phân lập xạ khuẩn từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh
Phúc 26
3.1.1.1. Đặc điểm khuẩn lạc 26
3.1.1.2. Đặc điểm hệ sợi 31
3.1.2. Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn sinh enzyme cellulase trong đất
trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc…………………35
3.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái cuống sinh bào tử, bào tử của các
chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn 40
3.2.1. Cuống sinh bào tử và bào tử của xạ khuẩn 40
3.2.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái cuống sinh bào tử, bào tử của 3
chủng xạ khuẩn X3, X5, X11 41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cellulose là thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào thực
vật. Đó là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp. Việc phân huỷ
cellulose bằng các tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hƣởng đến
tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp. Enzyme cellulase là nhóm

enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết β-1,4-0-glycoside trong phân
tử cellulose, olygosaccharide, disaccharide và một số cơ chất tƣơng tự khác.
Hiện nay, việc sử dụng các enzyme nhƣ cellulase trong một số ngành công
nghiệp nhƣ: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc,
công nghiệp giấy, sản xuất dung môi hữu cơ và đặc biệt trong xử lý rác thải
hữu cơ là vấn đề đang đƣợc con ngƣời đặc biệt quan tâm.
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh đƣợc enzyme cellulase có nhiều khả
năng và triển vọng giải quyết vấn đề nêu trên trong giám định và xử lý ô
nhiễm môi trƣờng. Chúng có thể hoạt động trên chất thải khó xử lý, làm thay
đổi đặc tính của chất thải và đƣa chúng về dạng dễ xử lý hoặc chuyển thành
các sản phẩm có giá trị hơn. Enzyme cellulase đƣợc sinh tổng hợp bởi nhiều
loài khác nhau nhƣ: các loài xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm mốc, nấm men và động
vật nguyên sinh. Ngoài ra, cellulase còn có ở các loài sinh vật khác nhƣ thực
vật và động vật.Trong số các nhóm vi sinh vật nêu trên thì xạ khuẩn phân giải
cellulose là một trong những đối tƣợng đã và đang đƣợc các nhà khoa học đặc
biệt quan tâm.
Xạ khuẩn trong đất là một trong các nhóm sinh vật đất có số lƣợng lớn.
Chúng chiếm tới 10 - 70 % số tế bào vi sinh vật trong đất. Ở môi trƣờng trung
tính xạ khuẩn phát triển mạnh nhất trong đất giàu hữu cơ và thông thoáng. Xạ
khuẩn có vai trò phân giải chất hữu cơ và nhất là phân giải đƣờng tan trong
nƣớc, hemicellulose và cellulose. Xạ khuẩn tham gia vào quá trình hình thành
2

các acid mùn. Một vài loài xạ khuẩn có khả năng cố định nitơ tự do từ khí trời
khi cộng sinh với thực vật thuộc bộ đậu. Xạ khuẩn là vi sinh vật tạo ra kháng
sinh chủ yếu (tới 80 % chất kháng sinh) vì thế trong đất có nhiều xạ khuẩn
cây trồng ít bị bệnh hơn.
Phƣờng Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc có diện tích tự nhiên là 423,9
ha, trong đó đất diện tích đất trồng trọt khá lớn. Do vậy, việc khảo sát các
chủng xạ khuẩn trong đất trồng trọt có khả năng phân hủy cellulose cao là

việc có ý nghĩa hết sức quan trọng trong việc cải tạo đất và bảo vệ môi
trƣờng. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi chọn đề tài: “Phân lập và
tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh enzyme cellulase trong
đất trồng trọt khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc”.
2. Mục đích nghiên cứu
Tuyển chọn đƣợc một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải
cellulose cao góp phần tăng độ phì nhiêu của đất trồng trọt khu vực Xuân
Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
3.1. Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn sinh enzyme cellulase từ đất trồng trọt khu
vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc
3.2. Nghiên cứu đặc điểm hình thái cuống sinh bào tử, bào tử của các chủng
xạ khuẩn đã tuyển chọn
4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong đất trồng trọt
tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc.
5. Phƣơng pháp nghiên cứu
5.1. Phƣơng pháp lấy mẫu
5.2. Phƣơng pháp phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski
5.3. Phƣơng pháp bảo quản chủng giống
3

5.4. Phƣơng pháp quan sát hình thái xạ khuẩn
5.5. Phƣơng pháp xác định hoạt tính cellulase của xạ khuẩn
5.6. Phƣơng pháp thống kê và xử lý kết quả
6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
6.1. Ý nghĩa khoa học
Các nghiên cứu về xạ khuẩn góp phần đem lại cho con ngƣời những hiểu
biết về đời sống tự nhiên của vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng.
Đề tài cho phép hiểu rõ hơn vai trò của xạ khuẩn trong môi trƣờng đất, khả

năng phân giải cellulose của xạ khuẩn. Từ đó tạo cơ sở khoa học cho các
phƣơng thức canh tác ( cày xới, cải tạo đất, bón phân ) theo hƣớng lợi
dụng vi sinh vật phân giải cellulose tăng cƣờng các quá trình phân giải hợp
chất hữu cơ để làm giàu dinh dƣỡng cho đất, tăng năng suất cây trồng.
6.2. Ý nghĩa thực tiễn
Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase cao, ứng dụng
các chủng xạ khuẩn này vào đời sống (trong chăn nuôi, môi trƣờng). Từ
các chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase cao này có thể tạo ra các chế
phẩm vi sinh vật phục vụ cho việc xử lý rác thải (ủ rác sinh hoạt), chế biến
thức ăn gia súc probiotin, chế biến phân bón vi sinh
7. Những đóng góp mới của đề tài
Qua nghiên cứu, chúng tôi đã tuyển chọn đƣợc 3 chủng xạ khuẩn X3,
X5, X11 có khả năng sinh enzyme cellulase cao trong đất trồng trọt tại khu
vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc.





4


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng
có trong đất, nƣớc, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi
khuẩn, nấm mốc không phát triển đƣợc. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc
vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác của thảm thực vật.

Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 – 2.400.000
mầm xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số VSV [22]. Sự phân bố của xạ khuẩn
còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trƣờng. Chúng có nhiều trong các lớp đất
trung tính và kiềm yếu hoặc acid yếu 6,8 - 7,5. Xạ khuẩn có rất ít trong lớp
đất kiềm hoặc acid và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lƣợng xạ
khuẩn cũng thay đổi theo thời gian trong năm.
Xạ khuẩn tham gia tích cực vào quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất
trong đất, nƣớc, dùng để sản xuất nhiều enzyme nhƣ protease, amylase,
cellulase… một số acid amin và acid hữu cơ. Một số xạ khuẩn có thể gây
bệnh cho ngƣời, động vật [5].
1.1.1. Một số phương pháp trong phân loại xạ khuẩn
Cùng với sự phát triển mạnh của sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh
học … nên việc định tên một chủng xạ khuẩn đƣợc tiến hành tƣơng đối nhanh
chóng và chính xác với nhiều phƣơng pháp nhƣ phân loại số, nghiên cứu
chủng loại phát sinh… Song ngƣời ta vẫn chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình
thái, nuôi cấy đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử.
5

1.1.1.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy
Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những thông tin
quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Để làm cho các chủng xạ khuẩn cần định
loại biểu hiện đầy đủ các đặc điểm, ngƣời ta thƣờng xuyên nuôi cấy chúng
trên môi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian
nhất định. Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh và ghi lại những đặc điểm hình
thái và nuôi cấy của xạ khuẩn, đặc biệt là cơ quan mang bào tử, hình dạng và
bề mặt bào tử. Dựa vào đặc điểm hình thái, ngƣời ta chia xạ khuẩn thành 4
nhóm chính:
Nhóm 1: Gồm các xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt, sinh sản bằng bào tử và phân
hóa thành HSKS và HSCC.
Nhóm 2: Gồm các xạ khuẩn có bào tử nang, hệ sợi phân chia theo hƣớng

vuông góc với nhau tạo thành các cấu trúc tƣơng tự nang bào tử.
Nhóm 3: Gồm các xạ khuẩn có dạng Nocardia, sinh sản bằng cách phân đốt hệ
sợi.
Nhóm 4: Gồm các xạ khuẩn có dạng Corynebacter và dạng cầu, tế bào có hình
chữ V,T thƣờng không có hệ sợi.
Dựa vào nghiên cứu các xạ khuẩn trên các môi trƣờng khác nhau, ngƣời ta
chia hình chuỗi bào tử thành 6 kiểu:
+ Kiểu S (Spira): chuỗi bào tử xoắn.
+ Kiểu SRA (Spira Rectinaculum Apertum): chuỗi bào tử xoắn có dạng móc
câu hay xoắn không hoàn toàn.
+ Kiểu SRF (Spira Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử xoắn, cong đến thẳng.
+ Kiểu RA (Rectinaculum Apertum): chuỗi bào tử có móc có khóa.
+ Kiểu RA – RF (Rectinaculum Apertum - Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử có
móc hay xoắn không hoàn toàn.
+ Kiểu RF (Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử thẳng lƣợn sóng.
6

Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là những dữ
liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên, nhƣ ta đã biết xạ khuẩn
rất không bền vững về mặt di truyền, thƣờng xuyên xảy ra sự sắp xếp lại
trong trong phân tử ADN. Trong cùng một loài có thể biểu hiện khác nhau về
hình thái hay những loài khác nhau có thể giống nhau về mặt hình thái. Vì
vậy, để phân loại đƣợc chính xác, ngày nay ngƣời ta cần nghiên cứu thêm các
chỉ tiêu khác bổ sung nhƣ đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học hay sinh
học phân tử [23].
1.1.1.2. Đặc điểm hóa phân loại( Chemotaxonomy)
Đặc điểm hóa phân loại đƣợc sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong vòng
20 năm trở lại đây. Đây là phƣơng pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc
định tính và định lƣợng thành phần hóa học của tế bào VSV.
Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau:

Type thành phần tế bào dựa trên cơ sở phân tích acid amin trong thành
phần pettide và đƣờng trong thành phần tế bào hay các polysaccaride gắn vào
thành tế bào.
Type peptidoglycan (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu
trúc của mạch tetrapeptide của PG cầu nối peptide và các liên kết giữa các
mắt xích của PG.
Acid mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi
Nocardia, Rhodococus, Mycobacterium và Cornebacter. Đây là đặc điểm
phân loại cơ bản cho các chi đó.
Acid béo thƣờng đƣợc sử dụng trong phân loại là acid béo bão hòa
mạch thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso và enteiso metyl
hóa ở nguyên tử cacbon thứ 10. Sự có mặt của acid 10 – metylloctade canoit
(acid tubereulostearinoic) là đặc điểm để phân loại đến chi [8].
7

Phospholipid có 5 type (P
I
, P
II
, P
III
, P
IV
, P
V
) có thành phần đặc trƣng, có ý
nghĩa cho phân loại xạ khuẩn.
Trong phân loại xạ khuẩn thì type thành tế bào là đặc điểm quan trọng
nhất. Khi muốn đƣa một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó,
ngƣời ta không thể nào không xác định thành tế bào.

1.1.1.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Để phân loại xạ khuẩn đến loài, ngƣời ta sử dụng hàng loạt các đặc
điểm sinh lý, sinh hóa khác nhau nhƣ khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và
nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trƣởng, khả năng biến đổi các chất khác
nhau nhờ hệ thống enzyme. Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ƣu, khả
năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trƣờng, mối quan hệ với chất kìm
hãm sinh trƣởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với
chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi
chất đặc trƣng khác của xạ khuẩn.
1.1.1.4. Phân loại số (Numerical taxonomy)
Để phát hiện những loài mới trên cơ sở sự khác nhau về đặc điểm sinh
lý, sinh hóa ngƣời ta còn sử dụng các kết quả dựa trên phân loại số. Phƣơng
pháp này dƣạ trên sự đánh giá về số lƣợng mức độ giống nhau giữa các VSV
theo một số lớn các đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh
hóa.
Để so sánh các chủng xạ khuẩn với nhau, ngƣời ta căn cứ vào hệ số
giống nhau (hệ số S – Similarity) có 2 công thức tính hệ số S hay đƣợc sử
dụng.
Công thức của Sokal và Michener (S
SM
)
S
SM (AB)
= (N
s +
+ N
s-
)* 100/ (N
s +
+ N

s-
+ N
d
)

Trong đó: S
SM (AB)
: Mức độ giống nhau giữa hai cá thể A, B (%).
N
s +
: Số các tính trạng giống nhau.
8

N
d
: Số các tính trạng khác nhau.
N
s-
: Số các tính trạng đối lập nhau.
Công thức của Jacard (S
J
)
S
J(AB)
= N
s
* 100/ (N
s
+ N
d

)
Trong đó: S
J(AB)
: mức độ giống nhau giữa hai chủng A, B (%).
N
s
: Tổng số các đặc điểm dương tính (giống nhau) của hai chủng so sánh.
N
d
: Tổng số các đặc điểm khác nhau (tổng số các đặc điểm dương tính của
chủng này và âm tính của chủng kia).
Kết quả của phân loại số là vẽ đƣợc sơ đồ phân nhánh (kiểu “rễ cây”)
của các thông số. Dựa vào sơ đồ này những chủng giống nhau nhiều nhất
đƣợc xếp vào một nhóm. Bằng phân loại số ngƣời ta chia xạ khuẩn chi
Streptomyces thành 2 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13 cụm với những đại diện
nhất định [24].
1.1.1.5. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces
Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao đƣợc Waksman và
Hernici đặt tên năm 1943 [22]. Đây là chi có số lƣợng loài đƣợc mô tả lớn
nhất. Các đại diện chi này có HSKS và HSCC phát triển phân nhánh. Đƣờng
kính sợi xạ khuẩn khoảng 1 - 10 µm, khuẩn lạc thƣờng không lớn có đƣờng
kính khoảng 1 – 5 mm. Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất. Bề
mặt khuẩn lạc thƣờng đƣợc phủ bởi KTKS dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi
khi có kỵ nƣớc.
Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử, trên đầu sợi
khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử. Cuống sinh bào tử có
những hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lƣợn sóng, xoắn, có móc, vòng…
Bào tử đƣợc hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phƣơng pháp phân
đoạn và cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình
nhăn… tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trƣờng nuôi cấy.

9

Thƣờng trên môi trƣờng có nguồn đạm vô cơ và glucose, các bào tử
biểu hiện các đặc điểm rất rõ. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng
rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi
khi nuôi cấy trên môi trƣờng khác nhau. Vì vậy, Ủy ban Quốc tế về phân loại
xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi trƣờng và phƣơng pháp chung để phân loại
nhóm VSV này.
Các loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn
Gr
+
, hiếu khí, dị dƣỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ƣu thƣờng là 25 - 30
o
C,
pH tối ƣu 6,5 – 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp
hơn (xạ khuẩn ƣa nhiệt và ƣa lạnh).
Bên cạnh các đặc điểm hình thái, nuôi cấy trên xạ khuẩn thuộc chi này còn có
đặc điểm hóa phân loại sau:
Type thành tế bào: Type I dạng L- ADP và glixin
Type Peptidoglycan
Axit béo: mạch thẳng bão hòa, đồng phân nhánh 15 - 17 C với số lƣợng ít và
số lƣợng lớn các axit phân nhánh 16 Ciso và 15 - 17 Canteiso
Dạng menaquinon: MK-9 (H
6
) hoặc MK-9 (H
9
)
Dạng photpholipit : P
II

Không có axit mycolic [10].
Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lƣợng lớn các chất kháng
sinh ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thƣ, virus và nguyên sinh động
vật. Cho đến nay để xác định cho thành phần loài của chi Streptomyces, các
nhà phân loại đã sử dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại khác
nhau [22].
1.1.2. Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

10

* Khuẩn lạc
Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh
mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Hệ
sợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đƣờng kính thay đổi trong khoảng
0,2 – 1,0 µm đến 2,0 – 3,0 µm, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [7],[10].
Kích thƣớc và khối lƣợng hệ sợi thƣờng không ổn định và phụ thuộc vào
điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Kích thƣớc của hệ sợi xạ khuẩn là một trong
những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc
vì hệ sợi của nấm mốc có đƣờng kính rất lớn, thay đổi từ 5 – 50 µm, dễ quan
sát bằng mắt thƣờng.
Khuẩn lạc của xạ khuẩn thƣờng chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng
nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ,
da cam, vàng, nâu, xám, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh.
Kích thƣớc và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tùy vào loài và tùy vào
điều kiện nuôi cấy nhƣ thành phần môi trƣờng, nhiệt độ, độ ẩm… Đƣờng kính
mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 – 2 nm nhƣng cũng có khuẩn lạc đạt tới đƣờng
kính 1 cm hoặc lớn hơn. Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bền
chặt, lớp trong tƣơng đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong.
Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản

phẩm trong quá trình trao đổi chất nhƣ: chất kháng sinh, độc tố, enzyme,
vitamin, acid hữu cơ có thể đƣợc tích lũy trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn
hay đƣợc tiết ra trong môi trƣờng.
* Khuẩn ty
Trên môi trƣờng đặc biệt, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại:
một loại cắm sâu vào trong môi trƣờng gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất
substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dƣỡng. Một loại phát triển
11

trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty sinh khí aerial mycelium)
với chức năng chủ yếu là sinh sản.
Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhƣng cũng có loại (nhƣ chi
Sporichthya) lại chỉ có hệ sợi khí sinh. Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh
sản vừa làm nhiệm vụ dinh dƣỡng.
1.1.2.2. Cấu tạo của xạ khuẩn
Xạ khuấn có cấu trúc tế bào tƣơng tự nhƣ vi khuẩn Gr
+
, toàn bộ cơ thể
chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất,
nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập.
Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lƣới, dày 10 – 20 nm có tác
dụng duy trì hình dạng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp:
lớp ngoài cùng dày 60 - 120A
o
, khi già có thể đạt tới 150 – 200A
o
, lớp giữa rắn
chắc, dày khoảng 50A
o
, lớp trong dày khoảng 50A

o
. các lớp này chủ yếu cấu
tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N – axetyl glucozamin liên kết
với N – axetyl muramic bởi các liên kết glucoside. Khi xử lý bằng lyzozyme,
các liên kết 1,4 glucoside bị cắt đứt, thành tế bào bị phá hủy tạo thành thể sinh
chất (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá hủy khi xử lý tế bào hỗn hợp este
chlorofom và các dung môi hòa tan lipid khác. Nguyên nhân là do lớp ngoài
cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipid (thành HSKS có nhiều lipid hơn so với
HSCC) khác với nấm. Thành tế bào xạ khuẩn không chứa cellulose và kittin
nhƣng chứa nhiều enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận
chuyển các chất qua màng tế bào [19], [20].
Căn cứ vào thành phần hóa học, thành tế bào xạ khuẩn đƣợc chia thành
4 nhóm chính [4], [6].
Nhóm I: thành phần chính của thành tế bào là acid L- 2,6 diaminopimelic (L –
ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này.
12

Nhóm II: thành phần chính của thành tế bào là acid meso – 2,6 –
diaminopimelic (m – ADP) và glyxin.
Nhóm III: thành phần chính của thành tế bào là acid meso – 2,6 –
diaminopimelic.
Nhóm IV: thành phần chính của thành tế bào là acid meso – 2,6 –
diaminopimelic, arabinose và galactose.
Dƣới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm đƣợc cấu tạo
chủ yếu bởi 2 thành phần là phospholipid và protein. Chúng có vai trò đặc
biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử
của xạ khuẩn.
Điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote ở chỗ
chúng có tỷ lệ Gr
+

C rất cao trong ADN, thƣờng lớn hơn 55%, trong đó ở vi
khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 – 45% [8].
Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gr
+
nên ngoài yếu tố di truyền trong nhiễm
sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng có thể tự nhân
lên, đƣợc Lederberg gọi là plasmid. Các plasmid đem lại cho tế bào nhiều đặc
tính chọn lọc quý giá nhƣ có thêm khả năng phân giải một số hợp chất, chống
chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển gene, sản xuất
chất kháng sinh trong đất và môi trƣờng tuyển chọn [2].
Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dƣỡng, nguồn cacbon chúng thƣờng dùng
là đƣờng, tinh bột, rƣợu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hữu cơ là
protein, pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối
amon… Khả năng đồng hóa các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác
nhau là khác nhau.
1.1.2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn
Xạ khuẩn là một nhóm cơ thể dị dƣỡng, chúng sử dụng đƣờng, rƣợu,
acid hữu cơ, lipid, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác làm nguồn cacbon.
13

Còn nitrat, nitrit, muối amon, ure, pepton, cao thịt… để làm nguồn nitơ. Các
loài khác nhau thì cách hấp thụ các hợp chất này là khác nhau. Phần lớn xạ
khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, ƣa ẩm, nhiệt độ cho sinh trƣởng và phát triển là
25 – 30
0
C. Đa số xạ khuẩn phát triển tốt trong môi trƣờng có pH là 6,8 – 7,
một số ít có khả năng phát triển tốt trong môi trƣờng kiềm [17].
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gr
+
, đặc biệt khác với các sinh vật khác

của nhóm nhân sơ có tỉ lệ (G+X) cao (trên 70%), trong khi đó vi khuẩn khá
thấp (25 - 45%). Một trong những đặc điểm đáng lƣu ý của xạ khuẩn là chúng
không bền vững về mặt di truyền và thƣờng xảy ra sự sắp xếp lại trong phân
tử ADN. Điều này gây ra tính đa dạng của hình thái, tính chất sinh lý, sinh
hóa của xạ khuẩn (khả năng đồng hóa nguồn cacbon, nitơ, hoạt tính kháng
sinh, tính kháng thuốc, khả năng phân giải cellulose…) [17].
Đặc điểm sinh lý của xạ khuẩn Streptomyces
Chi Streptomyces có số lƣợng loài mô tả lớn nhất, chi này có HSKS,
HSCC phát triển và phân nhánh, khuẩn lạc thƣờng không lớn, đƣờng kính
khuẩn lạc từ 1 – 5 mm. Khuẩn lạc chắc dạng da, mọc đâm sâu vào cơ chất, bề
mặt khuẩn lạc thƣờng đƣợc phủ bởi HSKS dạng nhung, dày hơn HSCC và đôi
khi không thấm nƣớc. Chuỗi bào tử đƣợc tạo thành trên cuống sinh bào tử,
chúng có thể thẳng, lƣợn sóng hoặc xoắn. Bề mặt bào tử có thể nhẵn, xù xì, có
lông hoặc có gai. Xạ khuẩn có khả năng tạo thành các loại sắc tố khác nhau,
sắc tố này có thể nhuộm màu HSKS, HSCC, đôi khi nhuộm màu môi trƣờng.
Các loài thuộc chi Streptomyces có cấu tạo thành giống thành của vi khuẩn
Gr
+
, là vi sinh vật hiếu khí, dị dƣỡng. Nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu là từ 25 -
30
o
C, pH tối ƣu là 6,5 – 8. Một số loài có thể sinh trƣởng ở nhiệt độ cao hơn
hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ƣa nhiệt và xạ khuẩn ƣa ẩm).
14

1.1.3. Vai trò của xạ khuẩn
Xạ khuẩn có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành đất và tạo độ
phì nhiêu cho đất. Chúng đảm nhận nhiều chức năng khác nhau trong việc
làm màu mỡ cho đất bằng cách tham gia tích cực vào các quá trình chuyển
hóa và phân giải nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp và bền vững nhƣ cellulose,

mùn, kitin, keratin, lignin [10].
Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì
có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [8]. Trong đó có trên 15% có nguồn gốc từ
các xạ khuẩn hiếm nhƣ Actinomadura, Micromonospora, Actinoplanes,,
Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có
giá trị đang dùng trong y học, thú y học, bảo vệ thực vật nhƣ gentamycin,
tobramycin, vancomycin, rosamycin, tetraxycline Bên cạnh đó trong quá
trình trao đổi chất, xạ khuẩn có thể sản sinh ra nhiều chất hữu cơ. Trong đó,
điển hình là các enzyme ngoại bào (cellulase, protease ), vitamin nhóm B
(B
1
, B
2
, B
5
,B
6,
B
12
), một số acid hữu cơ (acid lactate, acid acetate ) [10].
Ngày nay xạ khuẩn còn đƣợc ứng dụng rộng rãi trong ngành công
nghiệp lên men, chế tạo các sản phẩm enzyme, ứng dụng các chế phẩm này
vào đời sống do một số xạ khuẩn có khả năng sinh ra nhiều enzyme ngoại bào
nhƣ protease, amylase, kitinase Một số khác còn có khả năng tạo thành
chất kích thích sinh trƣởng cho thực vật.
1.2. Cellulose và cellulase
1.2.1. Cellulose
Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (C
6
H

10
O
5
)
n
và là
thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, gồm nhiều cellobiose liên kết
với nhau, 4-O-(β-D-Glucopyranosyl)-D-glucopyranose (Hình 1.1). Cellulose
cũng là hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng
15

hợp đƣợc khoảng 10
11
tấn cellulose (trong gỗ, cellulose chiếm khoảng 50% và
trong bông chiếm khoảng 90%).


Hình 1.1. Công thức hóa học của cellulose
Các mạch cellulose đƣợc liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên
kết Van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định
hình. Trong vùng tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau,
vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng nhƣ hóa chất. Ngƣợc lại, trong
vùng vô định hình, cellulose liên kết không chặt với nhau nên dễ bị tấn. Có
hai mô hình cấu trúc của cellulose đã đƣợc đƣa ra nhằm mô tả vùng tinh thể
và vô định hình nhƣ hình 1.2.

Hình 1.2. Mô hình Fringed fibrillar và mô hình chuỗi gập
Trong mô hình Fringed Fibrillar: phân tử cellulose đƣợc kéo thẳng và
định hƣớng theo chiều sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500 A
0

và xếp xen kẽ
với vùng vô định hình.