Phân lập, tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh từ vùng rễ cây rau dệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2




NGUYỄN THỊ VI




PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ
CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG
SINH TỪ VÙNG RỄ CÂY RAU DỆU



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học


HÀ NỘI, 2014




BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2

NGUYỄN THỊ VI


PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ
CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG
SINH TỪ VÙNG RỄ CÂY RAU DỆU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
TS. DƢƠNG MINH LAM



HÀ NỘI, 2014

LỜI CẢM ƠN



Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Dƣơng Minh Lam đã tận tình
giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài này.
Xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh học, Khoa
Sinh – KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giúp đỡ tôi.
Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, Ban chủ
nhiệm khoa Sinh – KTNN, Bộ môn Vi sinh vật học đã tạo điều kiện cho tôi

đƣợc học tập và hoàn thành đề tài này.
Tôi xin cảm ơn thầy cô và bạn bè đã động viên, tạo mọi điều kiện giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình làm đề tài.
Lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin dành cho gia đình và những ngƣời thân
yêu của tôi đã động viên giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này.


Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Nguyễn Thị Vi






LỜI CAM ĐOAN


Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả
nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực và không
trùng với kết quả của các tác giả khác.


Tác giả

Nguyễn Thị Vi

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
1. Đặt vấn đề 1
2. Mục tiêu 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn 2
5. Điểm mới của đề tài 3
CHƢƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Giới thiệu về cây rau dệu 4
1.1.1. Một số tên của cây rau dệu 4
1.1.2. Phân loại khoa học 4
1.1.3. Phân bố 4
1.1.4. Mô tả đặc điểm 5
1.1.5. Thành phần hóa học 5
1.1.6. Công dụng của rau dệu 5
1.2. Giới thiệu về xạ khuẩn 6
1.2.1. Sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 6
1.2.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 6
1.2.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn 8
1.2.4. Cấu tạo của xạ khuẩn 9
1.2.5. Vai trò của xạ khuẩn 11
1.3. Các phƣơng pháp phân loại xạ khuẩn hiện đại 11
1.3.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy 12
1.3.2. Đặc điểm hóa phân loại 13
1.3.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 14
1.3.4. Phân loại số 14

1.4. Chất kháng sinh từ xạ khuẩn 16
1.4.1. Lƣợc sử nghiên cứu chất kháng sinh 16


1.4.2. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn 18
1.4.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 19
1.5. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn ở Việt Nam 21
CHƢƠNG 2.NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
2.1. Nguyên liệu 23
2.1.1. Mẫu cây 23
2.1.2. Mẫu đất 23
2.1.3. Vi sinh vật kiểm định 23
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 23
2.2.1. Hóa chất 23
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị 23
2.3. Môi trƣờng 24
2.3.1. Môi trƣờng phân lập, bảo quản và giữ giống xạ khuẩn 24
2.3.2. Môi trƣờng thử hoạt tính kháng sinh 24
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 24
2.4.1.Phƣơng pháp thu mẫu và xử lí mẫu vật 24
2.4.2. Phân lập tuyển chon xạ khuẩn 25
2.4.3. Phƣơng pháp bảo quản chủng giống 25
2.4.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 26
2.4.5. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng sinh 27
2.4.6. Phƣơng pháp thống kê và xử lý kết quả bằng toán học 28
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29
3.1.Phân lập xạ khuẩn từ vùng rễ cây rau dệukhu vực Xuân Hòa, Phúc Yên,
Vĩnh Phúc 29
3.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc 31
3.3. Xác định khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn 34

3.4. Đặc điểm hình thái và sắc tố tan của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40


1. Kết luận 40
2. Kiến nghị 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO 41




DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

VSV : Vi sinh vật
XK : Xạ khuẩn
VSVKĐ : Vi sinh vật kiểm định
ISP : International Streptomyces Project
CKS : Chất kháng sinh
HTKS : Hoạt tính kháng sinh
HSCC : Hệ sợi cơ chất
HSKS : Hệ sợi khí sinh
PG : PeptidoGlycan
AND : Deoxyribonucleic Acid
CFU : Colony Forming Unit
ADP : Diaminopimelic Acid
Gr
+
: Gram dƣơng
Gr
-

: Gram âm










DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc từ vùng rễ cây rau dệu 29
Bảng 3.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc 32
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ
khuẩnphân lập đƣợc từ vùng rễ cây rau dệu ở khu vực Xuân Hòa,
Phúc Yên, Vĩnh Phúc. 35
Bảng 3.4. Kết quả thống kê hoạt tính kháng sinh các chủng xạ khuẩn phân lập
từ vùng rễ cây rau dệu 35









DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1. Một số chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc từ vùng rễ cây rau dệu 31
Hình 3.2. Khuẩn lạc của một số chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc 33
Hình 3.3. Hình ảnh thử hoạt tính kháng sinh của một số chủng xạ khuẩn
nghiên cứu 37
Hình 3.4. Hình ảnh bào tử và cuống sinh bào tửcủa các chủng xạ khuẩn
nghiên cứu 38
Hình 3.5. Hình ảnh sắc tố tan của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu 39





1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Sức khỏe luôn là một trong những vấn đề đƣợc chú trọng nhất trong
mỗi quốc gia. Trong lịch sử phát triển lâu đời, loài ngƣời đã biết sử dụng các
sinh vật và đặc biệt là thực vật trong đời sống để chữa trị các vết thƣơng cho
mình, mặc dù hoàn toàn không biết về bản chất hóa học của các chất có trong
đó. Những loại thực vật đƣợc sử dụng phổ biến hàng nghìn năm thời Hy Lạp
cổ đại nhƣ Quế, Chanh, Cúc, Bạc Hà… trong đó có cây rau Dệu.
Nghiên cứu vi sinh ra đời muộn hơn nhiều so với các nghiên cứu và
ứng dụng thực vật. Tới dầu thế kỉ XX kháng sinh mới đƣợc phát hiện, bản
chất kháng sinh đƣợc khám phá. Từ đó, lĩnh vực nghiên cứu kháng sinh nở rộ,
đạt nhiều thành tựu và tiếp tục cho đến ngày nay.
Ngay sau khi các chất kháng sinh đƣợc tìm thấy trong tự nhiên, các nhà
hóa học đã tích cực tham gia vào nghiên cứu chất kháng sinh. Các nhà nghiên
cứu tổng hợp các chất kháng sinh có cấu trúc giống nhƣ kháng sinh có nguồn

gốc thiên nhiên hoặc cải biến các kháng sinh tự nhiên để nâng cao hiệu quả
chữa bệnh. Một số kháng sinh bán tổng hợp hiện có nhƣ penicillin,
amoxicillin, ampicillin, methicillin… Hiện nay có 4 thế hệ kháng sinh
cephalosporin bán tổng hợp, dựa trên cephalosporin tự nhiên do nấm
Cephalosporium chrysogenum sinh ra.
Một trong những đặc điểm quan trọng nhất và đang đƣợc quan tâm nhiều
nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh. Cho tới nay
khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có tới 80% là do
xạ khuẩn sinh ra. Trong số các xạ khuẩn đƣợc nghiên cứu, 2 chi xạ khuẩn sinh
kháng sinh đƣợc đánh giá cao cả về số lƣợng và chất lƣợng kháng sinh đó là
chi Micromonospora và chi Streptomyces. ChiMicromonospora sản sinh
nhiều kháng sinh quý có giá trị dƣợc liệu cao nhƣ: gentamycin, neomycin,
verdamycin… còn chi Streptomyces là chi xạ khuẩn đƣợc biết đến nhiều nhất
2

bởi khả năng sinh kháng sinh của chúng và thƣờng đƣợc gọi là các “ nhà máy
sản xuất kháng sinh”. Kháng sinh do xạ khuẩn nói chung và từ Streptomyces
nói riêng có hoạt phổ rất rộng, có tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn và đặc
biệt một số loại kháng sinh đƣợc sử dụng trong điều trị bệnh ung thƣ và kháng
virus. Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa
nhiều hợp chất trong đất, nƣớc. Dùng để sản xuất nhiều enzyme nhƣ proteaza,
amylaza, xenluloza… một số axit amin và axit hữu cơ. Một số xạ khuẩn có
thể gây bệnh cho ngƣời, động vật.
Xuất phát từ những lí do trên, từ xu hƣớng nghiên cứu trên thế giới hiện
nay và cũng nhƣ để góp phần khai thác nguồn VSV vô cùng phong phú ở
vùng rễ cây rau dệu khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc, tôi thực hiện
đề tài: “Phân lập, tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh từ
vùng rễ cây rau dệu”.
2. Mục tiêu
Phân lập, tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh từ vùng rễ

cây rau dệu có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tế.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân lập và thuần chủng các chủng xạ khuẩn phân lập từ vùng rễ cây rau
dệu khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc.
3.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc.
3.3. Xác định khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn.
3.4. Đặc điểm hình thái và sắc tố tan của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu.
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn
Ý nghĩa lí luận:
Góp phần đem lại cho con ngƣời những hiểu biết về đời sống tự nhiên
của vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng. Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật
phân bố rộng rãi trong đất. Chúng tham gia tích cực vào các quá trình phân
giải các hợp chất hữu cơ trong đất nhƣ xenluloza, tinh bột… góp phần khép
3

kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Nhiều loài xạ khuẩn có khả năng
sinh chất kháng sinh đƣợc ứng dụng trong công nghệ sản xuất kháng sinh
mới. Đề tài cho phép hiểu rõ hơn về vai trò của xạ khuẩn trong môi trƣờng
đất, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn.
Ý nghĩa thực tiễn:
Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao để tạo ra
các chế phẩm thuốc kháng sinh phục vụ cho chữa bệnh.
5. Điểm mới của đề tài
Đã phân lập đƣợc 2 chủng xạ khuẩntừ vùng rễ cây rau dệu có khả năng
sinh kháng sinh mạnh.

4

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây rau dệu
1.1.1. Một số tên của cây rau dệu
Tên gọi khác: rau diệu, dệu không cuống, rau diếp bò.
Tên Tiếng Anh: sessile joyweed , dwarf copperleaf.
Tên khoa học: Alternanthera sessilis.
Tên đồng nghĩa: A. repens, A. Glabra, Gomphrena sessilis.

1.1.2. Phân loại khoa học
Bộ (ordo): Cẩm chƣớng (Caryophyllales)
Họ (familia): Dền (Amaranthaceae)
Phân họ (subfamilia): Phân họ rau dệu (Gomphrenoides)
Chi (genus): Alternanthera
1.1.3. Phân bố
Rau dệu hiện diện khắp nơi trên thế giới.
Rau dệu thích sống nơi đất ẩm, dọc theo mƣơng, đất bỏ hoang. Cây
mọc nơi đất ẩm bờ hồ, đầm lầy, kênh mƣơng thủy lợi

5

1.1.4. Mô tả đặc điểm
Cây rau dệu phát tán bằng hạt hoặc bằng cách chia nhánh. Nhiều nhánh
phủ thành đốt bò trên mặt đất.
- Thân: là loại cây thân thảo thấp, thân thƣờng màu tím hoặc tím rất
nhạt khi mọc dƣới tán cây khác. Cây mọc bò lan trên đất dài tới 5m, nên còn
có tên gọi là diếp bò, trên thân mang những đoạn cành 40 - 50cm. Những
cành sát mặt đất thì rễ mọc ra từ các đốt và cứ thế vƣơn dài ra. Cây mọc đa

niên, yếu, tròn, dầy, lóng trơn mang hai hàng lông trắng đối diện.
- Rễ: rễ có nhiều cấp, mọc cạn.
-Lá: có phiến đơn, mọc đối, có hoặc không có cuống lá 1,5 - 5mm,
phiến lá hình mũi mác nhọn 2 đầu, dài 4 - 6cm, rộng 1 - 2cm, mép nguyên,
phiến lá hơi nhám.
- Hoa: phát hoa mọc thành chùm ở nách lá, phiến hoa trắng, lƣỡng tính,
không cuống, 1 gân, tiểu nhụy thụ 3 xen với tiểu nhụy lép dạng phiến lõm.
Hoa trổ vào tháng 11 và 12, đậu quả vào tháng 6 đến tháng riêng.
- Quả: quả bế, hình tim ngƣợc hay dạng thấu kính.
- Hạt: quả chứa một hạt màu nâu.
1.1.5. Thành phần hóa học
Rau dệu có chứa nƣớc; protein; chất béo, carbohydrate; chất xơ; Ca; P;
Sắt; vitamin C…
Ngoài ra còn có các chất có hoạt tính sinh học cao nhƣ: alpha và bêta
tocophenols; Stigmasterol; Betasitosterol…
1.1.6. Công dụng của rau dệu
Rau dệu đƣợc dùng làm rau ; làm thức ăn chăn nuôi ; làm thuốc trong
điều trị các bệnh nhƣ: những căn bệnh về cảm giác, da, tiêu chảy, khó tiêu,
bệnh trĩ, gan và sốt, lợi sữa, lợi mật và hạ nhiệt… đặc biệt nó có khả năng
kháng khuẩn (ức chế những đột biến các chủng vi trùng salmonella
typhimurium), ức chế các tiền chất gây ung thƣ (ức chế sự hình thành của
6

chất nitrosodiethanolamine là chất gây bệnh ung thƣ mạnh từ môi trƣờng do
tiền chất triethanolamine gây ra).
1.2. Giới thiệu về xạ khuẩn
1.2.1. Sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên
Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân
bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nƣớc, rác, phân chuồng,
bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển

đƣợc. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức
độ canh tác và thảm thực vật.
Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 – 2.400.000
mầm xạ khuẩn, chiếm 9 – 45% tổng số vi sinh vật [14].
Tuy nhiên tùy vùng đất khác nhau trên thế giới mà có sự biến đổi lớn về
số lƣợng xạ khuẩn trong đất, số lƣợng xạ khuẩn ở nam bán cầu bao giờ cũng
cao hơn bắc bán cầu. Ngoài ra số lƣợng xạ khuẩn trong đất còn phụ thuộc vào
mức độ canh tác, độ phì nhiêu của đất, mức độ che phủ của thực vật… Đất
giàu dinh dƣỡng hữu cơ, khoáng thì có nhiều xạ khuẩn hơn so với đất nghèo
dinh dƣỡng. Trong 1g đất canh tác có thể phân lập đƣợc 5.000.000 CFU/g xạ
khuẩn. Đất vùng sa mạc khô nóng, nghèo sinh dƣỡng có số lƣợng xạ khuẩn ít
hơn, dao dộng trong khoảng 10.000 – 100.000 CFU/g.
Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trƣờng,
chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 –
7,5. Đồng thời số lƣợng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong
năm. Do đó khi lấy mẫu đất nghiên cứu cần phải chú ý tới các điều kiện nhƣ
thành phần lớp đất, sinh cảnh, thời điểm lấy mẫu, độ ẩm, nhiệt độ…
1.2.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
* Khuẩn lạc
Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh
và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống sinh bào tử). Hệ thống sợi xạ khuẩn
7

mảnh hơn của nấm mốc với đƣờng kính thay đổi trong khoảng 0,2 – 1µm,
chiều dài có thể đạt tới một vài cm [5].
Khuẩn lạc của xạ khuẩn thƣờng rắn chắc, xù xì, có thể có dạng da, dạng
phấn, dạng nhung, dạng vôi phụ thuộc vào kích thƣớc của bào tử. Trƣờng hợp
không có HSKS khuẩn lạc thƣờng có dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có
màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng… tùy thuộc vào loài và
điều kiện ngoại cảnh.

Kích thƣớc và hình dạng khuẩn lạc có thể thay đổi tùy loài và điều kiện
nuôi cấy nhƣ thành phần môi trƣờng, nhiệt độ, độ ẩm… Đƣờng kính mỗi
khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 – 2mm nhƣng cũng có khuẩn lạc đạt tới đƣờng kính
1cm hoặc lớn hơn. Khuẩn lạc thƣờng có dạng phóng xạ (vì thế mà gọi là xạ
khuẩn). Một số có dạng những vòng tròn đồng tâm cách nhau một khoảng
nhất định. Nguyên nhân của những vòng tròn đồng tâm là do xạ khuẩn sinh ra
chất ức chế sinh trƣởng. Khi sợi mọc qua vùng này chúng sinh trƣởng yếu đi,
qua đƣợc vùng cơ chất ức chế chúng lại sinh trƣởng mạnh thành vòng tiếp
theo, vòng này lại sinh ra chất ức chế sinh trƣởng sát với nó khiến khuẩn ty
phát triển yếu đi. Cứ nhƣ thế tạo thành các vòng tròn đồng tâm [7].
Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tƣơng
đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng
sinh học khác nhau. Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất nhƣ: CKS,
độc tố, enzyme, vitamin, axit hữu cơ… có thể đƣợc tích lũy trong sinh khối tế
bào xạ khuẩn hay đƣợc tiết ra trong môi trƣờng.
*Khuẩn ty
Trên môi trƣờng đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một
loại phát triển trên bề mặt môi trƣờng tạo thành bề mặt của khuẩn lạc xạ
khuẩn, từ đây phát sinh ra bào tử gọi là HSKS (khuẩn ty khí sinh – aerial
mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dƣỡng. Sợi cơ chất sinh ra sắc tố
8

thấm vào môi trƣờng, sắc tố này thƣờng có màu sắc khác với màu sắc của
HSKS. Đây cũng là đăc điểm phân loại xạ khuẩn quan trọng.
Một số xạ khuẩn không có HSKS mà chỉ có HSCC, loại sợi này cho bề
mặt xạ khuẩn nhẵn và khó tách ra khỏi môi trƣờng khi cấy truyền. Loại chỉ có
sợi khí sinh thì ngƣợc lại, rất dễ tách toàn bộ khuẩn lạc ra khỏi môi trƣờng.
Khi nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trƣờng dịch thể, xạ khuẩn có thể mọc
thành dạng màng, hay dạng vòng trên thành bình nuôi cấy, trên bề mặt môi
trƣờng hay thành dạng bọt kết tủa kiểu vi khuẩn. Khi nuôi cấy chìm trên máy

lắc hoặc nồi lên men khuấy đảo thì xạ khuẩn phát triển thành dạng sợi bông
hoặc cặn xốp. Nhƣng thƣờng gặp hơn cả là xạ khuẩn phát triển thành những
quả cầu nhỏ chứa đầy môi trƣờng, kích thƣớc từ 0,1 đến 2 – 3mm [6].
1.2.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn
Bào tử xạ khuẩn đƣợc hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty
khí sinh - gọi là cuống sinh bào tử. Đó là cơ quan sinh sản đặc trƣng cho xạ
khuẩn. Trên mỗi cuống sinh bào tử mang 30-100 bào tử, đôi khi có thể mang
tới 200 bào tử, nhƣng cũng có khi chỉ mang một bào tử hoặc hai bào tử. Hình
thái cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất trong phân
loại xạ khuẩn.
Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lƣợn sóng (RF),
dạng xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có
hình móc câu (RA). Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của
cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thƣờng có hình trụ,
ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành
dạng lông [11].
Bào tử xạ khuẩn đƣợc bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu
protein với độ dày khoảng 300 - 400A
0
gồm có 3 lớp, các lớp này giúp cho
bào tử tránh đƣợc những ảnh hƣởng bất lợi của ngoại cảnh nhƣ: nhiệt độ, độ
ẩm, pH… Hình dạng, kích thƣớc chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là
9

những tính trạng tƣơng đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong
phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên những tính trạng này cũng có thể có những
thay đổi nhất định khi nuôi cấy trên môi trƣờng có nguồn nitơ khác nhau [13].
Muốn kích thích sự hình thành bào tử trƣớc hết phải kích thích sự sinh
trƣởng của khuẩn ty khí sinh. Nếu môi trƣờng giàu dinh dƣỡng quá thì quá
trình sinh bào tử thƣờng bị kìm hãm. Trong nhiều trƣờng hợp khi kích thích

sự hình thành bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp CKS giảm đi.
1.2.4. Cấu tạo của xạ khuẩn
Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tƣơng tự nhƣ vi khuẩn Gram dƣơng, toàn
bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng
sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập.
Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng sợi, dày 10 – 20nm có tác dụng
duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp: lớp
ngoài cùng dày khoảng 60 - 120A
0
, khi già có thể đạt tới 150 - 200A
0
, lớp
giữa rắn chắc, dày khoảng 50A
0
, lớp trong dày khoảng 50A
0
. Các lớp này chủ
yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N - acetylglucozamin
liên kết với N - acetyl muramic bởi các liên kết 1,4 – β glucozit. Khi xử lý
bằng lyzozyme, các liên kết 1,4 - β glucozit bị cắt đứt, thành tế bào bị phá huỷ
tạo thành thể sinh chất (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ khi xử lý tế
bào với hỗn hợp este chlorofom và các dung môi hoà tan lipid khác. Nguyên
nhân là do lớp ngoài cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipid (thành HSKS có
nhiều lipid hơn so với HSCC) khác với nấm. Thành tế bào xạ khuẩn không
chứa xenllulose và kitin nhƣng chứa nhiều enzyme tham gia vào quá trình
trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào [12].
Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn đƣợc chia thành 4
nhóm chính [12], [5].
Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6
diaminopimelic (L - ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này.

10

Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -
diaminopimelic (m - ADP) và glyxin.
Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -
diaminopimelic.
Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 -
diaminopimelic, đƣờng arbinose và galactose.
Dƣới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50nm đƣợc cấu
tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipid và protein. Chúng có vai
trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành
bào tử của xạ khuẩn.
Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với
tế bào vi khuẩn. Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa mezoxom
và các thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate: hình cầu, bắt màu với thuốc
nhuộm sudan III và các hạt polysaccharide bắt màu với dung dịch lugol).
Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote ở
chỗ chúng có tỷ lệ G + C rất cao trong AND, thƣờng lớn hơn 50%, trong khi
đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 – 45% [9].
Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram dƣơng nên ngoài yếu tố di truyền
trong nhiễm sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng có
thể tự nhân lên và đƣợc Lederberg gọi là plasmid. Các plasmid đem lại cho tế
bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá nhƣ có thêm khả năng phân giải một số
hợp chất, chống chịu với nhiệt độ bấtlợi, chống chịu với các kháng sinh,
chuyển gene, sản xuất các chất kháng sinh trong đất và môi trƣờng tuyển chọn
[3].
Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dƣỡng, nguồn cacbon chúng thƣờng dùng
là đƣờng, tinh bột, rƣợu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hữu cơ là
protein, pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vôcơ là nitrat, muối
11

amôn… Khả năng đồng hoá các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác
nhau là khác nhau.
1.2.5. Vai trò của xạ khuẩn
Xạ khuẩn có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành đất và tạo độ
phì nhiêu cho đất. Chúng đảm nhận nhiều chức năng khác nhau trong việc
làm màu mỡ cho đất bằng cách tham gia tích cực vào các quá trình chuyển
hóa và phân giải nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp và bền vững nhƣ cellulose,
mùn, kitin, lignin…[18].
Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì
có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [11]. Trong đó có trên 15% có nguồn gốc từ
các xạ khuẩn hiếm nhƣ Actinomadura, Micromonospora, Actinoplanes,
Streptoverticillium, Streptosporangium… Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn
hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học, thú
y học, bảo vệ thực vật nhƣ gentamixin, vancomixin, rosamixin, tetraxicline…
Bên cạnh đó trong quá trình trao đổi chất xạ khuẩn có thể sản sinh ra nhiều
chất hữu cơ. Trong đó điển hình là các enzyme ngoại bào (cellulase,
protease…), vitamin nhóm B (B
1
, B
2
), một số axit hữu cơ (acid lactate, acid
acetate ) [18].
Ngày nay xạ khuẩn còn đƣợc ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp
lên men, chế tạo các sản phẩm enzyme, ứng dụng các chế phẩm này vào đời
sống do một số xạ khuẩn có khả năng sinh ra nhiều enzyme ngoại bào nhƣ
protease, amylase, cellulase, kitinase Một số khác còn có khả năng tạo thành
chất kích thích sinh trƣởng cho thực vật.
1.3. Các phƣơng pháp phân loại xạ khuẩn hiện đại
Cùng với sự phát triển mạnh của sinh học phân tử, hóa sinh học, lí sinh

học nên việc định tên một số loại xạ khuẩn đƣợc tiến hành tƣơng đối nhanh
chóng và chính xác với nhiều phƣơng pháp mới nhƣ phân loại số, nghiên cứu
chủng loại phát sinh Song ngƣời ta vẫn chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình
12

thái, tính chất nuôi cấy, đặc điểm sinh lý – sinh hóa, miễn dịch học và sinh
học phân tử.
1.3.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy
Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những đặc điểm
quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Để làm cho các chủng xạ khuẩn cần định
loại biểu hiện đầy đủ các đặc điểm, ngƣời ta thƣờng xuyên nuôi cấy chúng
trên môi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian
nhất định. Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh và ghi lại những đặc điểm hình
thái và tính chất nuôi cấy của xạ khuẩn, đặc biệt là cơ quan mang bào tử, hình
dạng và bề mặt bào tử.
Dựa vào đặc điểm hình thái ngƣời ta chia xạ khuẩn thành 4 nhóm chính:
Nhóm 1: gồm các xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt, sinh sản bằng bào tử và
phân hóa thành HSKS và HSCC.
Nhóm 2: gồm các xạ khuẩn có bào tử nang, hệ sợi phân chia theo hƣớng
vuông góc với nhau tạo thành các cấu trúc tƣơng tự nang bào tử.
Nhóm 3: gồm các xạ khuẩn có dạng Nocardia, sinh sản bằng cách phân
đốt hệ sợi.
Nhóm 4: gồm các xạ khuẩn có dạng Corynebacter và dạng cầu, tế bào có
dạng chữ V, T thƣờng không có hệ sợi.
Dựa vào nghiên cứu các xạ khuẩn trên các môi trƣơng khác nhau ngƣời
ta chia hình dạng chuỗi bào tử thành 6 kiểu:
+ Kiểu S (Spira): chuỗi bào tử xoắn.
+ Kiểu SRA (Spira Rectinaculum Apertum): chuỗi bào tử xoắn có dạng
móc câu hay xoắn không hoàn toàn.
+ Kiểu SRF (Spira Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử xoắn, cong đến

thẳng.
+ Kiểu RA – RF (Rectinaculum Apertum - Rectus Flexibilis): chuỗi bào
tử có móc hay xoắn không hoàn toàn.
13

+ Kiểu RF (Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử thẳng lƣợn sóng.
Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là
những dữ liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên nhƣ ta đã biết
xạ khuẩn rất không bền vững về mặt di truyền, thƣờng xuyên xảy ra sự sắp
xếp lại trong phân tử ADN. Trong cùng một loài có thể biểu hiện khác nhau
về hình thái hay những loài khác nhau có thể giống nhau về mặt hình thái. Vì
vậy để phân loại đƣợc chính xác, ngày nay ngƣời ta phải dùng thêm các chỉ
tiêu bổ sung nhƣ các đặc điểm sinh lý – sinh hóa, miễn dịch học hay sinh học
phân tử.
1.3.2. Đặc điểm hóa phân loại
Đặc điểm hóa phân loại đƣợc sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong vòng 20
năm trở lại đây. Đây là phƣơng pháp cơ bản và hiệu quả thông qua việc định
tính và định lƣợng thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật.
Type thành tế bào dựa trên cơ sở phân tích axitamin trong thành phần
peptid và đƣờng trong thành tế bào hay các polysaccarid gắn vào thành tế bào.
Type Peptidoglican (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu trúc
của mạch tetrapeptid của PG cầu nối peptid và các liên kết giữa các mắt xích
của PG.
Axit mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi Nocardia,
Rhodococus, Mycobacterium vàCornebacter. Đây là đặc điểm phân loại cơ
bản cho các chi đó.
Axit béo thƣờng đƣợc sử dụng trong phân loại là axit béo bão hòa mạch
thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu Iso và Entiso metyl hóa ở
nguyên tử cacbon thứ 10. Sự có mặt của axit 10 – metylloctade canoit (axit
tubereulostearinoic) là đặc điểm phân loại đến chi [9].

Photpholipid có 5 type photpholipid (P
I
, P
II
, P
III
, P
IV
, P
V
) có thành phần
đặc trƣng có ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn.
14

Trong phân loại xạ khuẩn thì type thành tế bào là đặc điểm quan trọng
nhất. Khi muốn đƣa ra một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó,
ngƣời ta không thể nào không xác định thành tế bào.
1.3.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Để phân loại xạ khuẩn đến loài, ngƣời ta sử dụng hàng loạt các đặc điểm
sinh lý, sinh hóa khác nhƣ khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu
cầu các chất kích thích sinh trƣởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ
hệ thống enzyme. Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ƣu, khả năng chịu
muối và các yếu tố khác của môi trƣờng, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh
trƣởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất
kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trƣng khác của xạ khuẩn.
Hopwood (1975) khẳng định rằng phần lớn các đặc điểm sinh lý, sinh
hóa cùng các đặc điểm nuôi cấy dễ bị biến động và có giá trị thấp về mặt phân
loại. Do tính không ổn định và biến dị cao của xạ khuẩn mà ngày nay những
nguyên tắc sử dụng các đặc điểm sinh lý, sinh hóa để phân loại xạ khuẩn cũng
phải thay đổi [1].

1.3.4. Phân loại số
Để phát hiện những loài mới trên cơ sở sự khác nhau về đặc điểm sinh
lý, sinh hóa ngƣời ta còn sử dụng các kết quả dựa trên phân loại số. Phƣơng
pháp này dựa trên sự đánh giá về số lƣợng mức độ giống nhau giữa các VSV
theo một số lớn các đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh
hóa.
Để so sánh các chủng xạ khuẩn với nhau từng đôi một, ngƣời ta căn cứ
vào hệ số giống nhau (hệ số S – Similarity).

15

Công thức của Jacard (S
j
):
S
j(AB)
= N
S
* 100 / (N
S
+ N
d
)
Trong đóS
j(AB)
: Mức độ giống nhau giữa hai chủng A, B (%).
N
S
: Tổng số các đặc điểm dương tính (giống nhau) của hai chủng
so sánh.

N
d
: Tổng số các đặc điểm khác nhau (tổng số các đặc điểm dương
tính của chủng này và âm tính của chủng kia).
Kết quả cuối cùng của phân loại số là vẽ đƣợc sơ đồ phân nhánh (kiểu rễ
cây) của các thông số. Ở sơ đồ này những chủng giống nhau nhiều nhất sẽ
đƣợc xếp vào một nhóm.
1.3.5. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces
Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao đƣợc Wakman và
Henrici đặt tên năm 1943 [27]. Đây là chi có số lƣợng loài đƣợc mô tả lớn
nhất. Các đại diện chi này có HSKS và HSCC phát triển phân nhánh. Đƣờng
kính sợi xạ khuẩn khoảng 1 – 10µm, khuẩn lạc thƣờng không lớn có đƣờng
kính khoảng 1 – 5mm. Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất. Bề
mặt khuẩn lạc thƣờng đƣợc phủ bởi HSKS dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi
khi có tính kỵ nƣớc.
Xạ khuẩn Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử. Trên đầu sợi khí
sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử. Cuống sinh bào tử có
những hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lƣợn sóng, có móc, vòng…
Bào tử đƣợc hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phƣơng pháp phân
đoạn và cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu
với đƣờng kính khoảng 1,5µm. Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp
nhăn… tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trƣờng nuôi cấy.
Thƣờng trên môi trƣờng có nguồn đạm vô cơ và glucoza, các bào tử
biểu hiện các đặc điểm rất rõ. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng
rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể thay đổi