Hoàn thiện quy trình nhân giống Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii) bằng phương pháp in vitro tại Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.

§¹i häc Th¸i Nguyªn
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM




BÙI VĂN BÁCH



Tên đề tài:
“HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN
(Anoectochilus roxburghii)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO
TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN”


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC




Hệ đào tạo : Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Khoa : CNSH - CNTP
Khóa học : 2010 - 2014


Giáo viên hướng dẫn: Th.S Nguyễn Thị Tình
Khoa CNSH - CNTP - Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên - 2014
LỜI CẢM ƠN

Qua 6 tháng thực tập tại phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật khoa Công
nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm đến nay em đã hoàn thành đề tài. Để
đạt được kết quả như ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới
Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa cùng toàn thể thầy cô giáo
trong bộ môn đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng kính trọng và gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất
tới Th.S Nguyễn Thị Tình người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ
em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã
động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện về vật chất và tinh thần cho em trong quá
trình học tập và nghiên cứu.
Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài không thể tránh
khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô
và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 29 tháng 05 năm 2014
Sinh viên thực hiện

Bùi Văn Bách
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 4.1.: Kết quả ảnh hưởng của một số hóa chất diệt nấm, vi khuẩn đến khả
năng tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn mẫu chồi Lan Kim Tuyến
(sau 10 ngày nuôi cấy) 29

Bảng 4.2. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch NaClO
1%

kết hợp HgCl
2
0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy
chồi Lan Kim Tuyến (sau 10 ngày nuôi cấy) 31

Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng (BA,
GA3,TDZ) đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 30
ngày nuôi cấy) 34
Bảng 4.4. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Auxin(IAA) đến
khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến
(sau 30 ngày nuôi cấy) 37

Bảng 4.5. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với dung dịch nước
dừa đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến sau (4 tuần
nuôi cấy) 40

Bảng 4.6. Kết quả ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng tới khả năng ra rễ Lan
Kim Tuyến (sau 15 ngày nuôi cấy) 43

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 4.1. Biểu đồ mẫu sống không nhiễm với các hóa chất khử trùng 29

Hình 4.2. Biểu đồ tỷ lệ mẫu sống không nhiễm ứng với các CT thí nghiệm . 31

Hình 4.2. Chồi Lan Kim Tuyến nuôi cấy trên môi trường MS (CT cho tỷ lệ
mẫu sống không nhiễm cao nhất) 32

Hình 4.3. Biểu đồ hệ số nhân chồi Lan Kim Tuyến qua các CT 34

Hình 4.3. Khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến khi bổ sung các chất
kích thích sinh trưởng (BA, GA3,TDZ) 35

Hình 4.4. Hệ số nhân Lan Kim Tuyến ứng với từng CT thí nghiệm 38

Hình 4.4. Chồi Lan Kim Tuyến khi bổ xung IAA 738

Hình 4.5. Biểu đồ khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến ứng với hàm
lượng nước dừa 41

Hình 4.5. Chồi Lan Kim Tuyến trên môi trương MS có bổ xung nước dừa 41

Hình 4.6. Biểu đồ khả năng ra rễ, Lan Kim Tuyến với từng CT thí nghiệm 44

Hình 4.6. Rễ Lan Kim Tuyến ứng với từng cương độ ánh sáng 44


DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

ADN : Acid deoxyribonucleic
B1 : Thiamin
B3 : Nicotinic acid
PP : Acid nicotinic
B6 : Pyridoxine
BA : 6-Benzylaminopurine
CV : Coefficient of Variation
Đ/C : Đối chứng
IAA : Indol axetic acid
Kinetin : 6-Furfurylaminopurine
LSD : Least Significant Difference Test
MS : Murashige and Skoog’s
NAA :
α
- Naphlene axetic acid
TN : Thí nghiệm
CT : Công thức
GA
3
: Acid ascorbic
VW : Vaccine và Went

MỤC LỤC

Trang
PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1. Đặt vấn đề 1

1.2. Mục đích và yêu cầu nghiên cứu 2

1.2.1. Mục đích 2

1.2.2. Yêu cầu 2

1.3. Ý nghĩa của đề tài 2

1.3.1. Ý nghĩa khoa học 2

1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1. Giới thiệu về cây Lan Kim Tuyến 3

2.1.1. Phân loại 3

2.1.2. Đặc điểm hình thái cây trưởng thành 3

2.1.3. Đặc điểm phân bố của Lan Kim Tuyến 4

2.1.4. Số lượng quần thể 5

2.1.5. Giá trị của Lan Kim Tuyến 5

2.2. Tổng quan về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 5

2.2.1. Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 5

2.2.2. Đặc điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vât (TBTV) 6

2.2.3. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV 8

2.2.4. Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV 9

2.2.5. Môi trường nuôi cấy mô TBTV 9

2.2.6. Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật 15

2.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam 18

2.3.1. Tình hình nghiên cứu Lan Kim Tuyến trên thế giới 18

2.3.2. Tình hình nghiên cứu Lan Kim Tuyến ở Việt Nam 19

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 21

3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 21

3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 21

3.1.2. Phạm vi nghiên cứu 21

3.2. Hóa chất và thiết bị 21

3.2.1. Hóa chất 21

3.2.2. Thiết bị 21

3.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu. 22

3.3.1. Nội dung nghiên cứu 22

3.3.2. Phương pháp nghiên cứu 22

3.3.3. Chỉ tiêu theo dõi đánh giá 27

PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28

4.1. Kết quả ảnh hưởng một số chất khử trùng tới tỉ lệ sống của mẫu chồi Lan
Kim Tuyến 28

4.1.1 Nghiên cứu nhằm xác định loại hóa chất khử trùng phù hợp nhất cho vật
liệu nuôi cấy 28

4.1.2 Nghiên cứu hiệu quả của chất khử trùng NaCLO 1% kết hợp HgCl
2
0,1%
đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy chồi Lan Kim Tuyến 31

4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng, chất hữu
cơ tới khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến 33

4.2.1 Kết quả ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng (BA, GA3,TDZ)
đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến 33

4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của Ba kết hợp với hàm lượng Auxin (IAA) tới
khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến. 37

4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến khả năng nhân
nhanh của Lan Kim Tuyến 40

4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng tới khả năng ra rễ Lan
Kim Tuyến 42

4.9. Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng tới khả năng ra rễ Lan
Kim Tuyến 43

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

5.1. Kết luận 46

5.2. Kiến nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47


1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Họ Lan (danh pháp khoa học: Orchidaceae) là một họ thực vật có hoa,
thuộc bộ Măng tây (Asparagales), lớp thực vật một lá mầm. Đây là một trong
những họ lớn nhất của thực vật, với tổng số 865 loài thuộc 154 chi. Lan Kim
Tuyến-Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl thuộc họ Lan - Orchidaceae, có
phân bố rộng ở hầu hết các tỉnh Việt Nam [2] tên khác Lan Kim Tuyến lông cứng,
Kim Tuyến tơ, Giải thủy tơ, Lan Gấm, Cỏ nhung, Kim cương (Anoectochilus
setaceus Lindl) là một loài thực vật điển hình của chi cùng tên (Anoectochilus).
Đây là một loài lan đất có mặt ở Vân Nam, Lào và Việt Nam. Chúng

sinh sống trên các triền núi đá vôi, dọc theo khe suối, dưới các tán cây to
trong rừng ẩm ở độ cao 500 - 1.600 mét. Chi Lan Kim Tuyến Anoectochilus ở
Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó có loài Lan Kim Tuyến
Anoectochilus setaceus Blume, tên khác Anoectochilus roxburghii Wall. ex
Lind [1] được biết đến nhiều bởi giá trị làm cảnh và giá trị làm thuốc.
Lan Kim Tuyến là loài dược liệu quý, ít gặp thuộc loại hiếm dùng để
điều trị các bệnh về tim mạc [5], bồi bổ sức khỏe cho phụ nữ sau khi sinh
[33]. Đặt biệt dược liệu Lan Kim Tuyến có khả năng tiêu diệt các khối u [6],
[30]. Với đặc tính quý giá về dược liệu. Do số lượng ít, mọc rải rác và còn bị
khai thác quá nhiều (với hình thức khai thác chặt cả cây) nên cây đã được đưa
vào Sách đỏ Việt Nam năm 2007 theo Nghị định 32/2006/NĐ-CP, xếp hạng
EN A1a,c,d [2],[3] và bị cấm khai thác sử dụng mục đích thương mại.
Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật việc ứng
dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống đã trở nên phổ biến.
Nuôi cấy mô tế bào tạo ra những cây trồng sạch bệnh, chất lượng tốt, độ
đồng đều cao, hệ số nhân lớn và giữ được đặc tính di truyền của cây mẹ.
Nhận thức được vấn đề bảo tồn và phát triển loài dược liệu quý - Lan Kim
Tuyến (Anoectochilus roxburghii), chúng tôi tiến hành đề tài: “Hoàn thiện
quy trình nhân giống Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii) bằng
phương pháp in vitro tại Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên”.

2
1.2. Mục đích và yêu cầu nghiên cứu
1.2.1. Mục đích
Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch nấm
và vi khuẩn, nồng độ chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh và
cường độ ánh sáng tới khả năng ra rễ Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii).
1.2.2. Yêu cầu
- Xác định được loại hóa chất khử trùng mẫu đạt hiệu quả tốt nhất đến
khả năng tạo vật liệu vô trùng phục vụ tại chỗ.

- Xác định ảnh hưởng của nồng độ chất kích thích sinh trưởng (BA,
GA3, TDZ, IAA) tới khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến
(Anoectochilus roxburghii).
- Xác định ảnh hưởng của nước dừa tới khả năng nhân nhanh chồi Lan
Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii).
- Xác định ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng tới khả năng ra rễ Lan
Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii).
1.3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hoá lại kiến thức đã học vào
nghiên cứu khoa học.
- Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân
tích số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Nâng cao hiệu quả nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô, hoàn
thiện quy trình nhân nhanh giống Lan Kim Tuyến bằng phương pháp nuôi cấy
in vitro, đảm bảo cung cấp số lượng cây giống có chất lượng tốt đồng đều cho
quá trình sản xuất.
- Bảo tồn nguồn dược liệu quý đang có nguy cơ tuyệt chủng.

3
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về cây Lan Kim Tuyến
2.1.1. Phân loại
Theo hệ thống phân loại thực vật [16] Lan Kim Tuyến được phân
loại như sau:
Giới (regnum) Plantae
Ngành Magnoliophyta
Lớp Liliospida

Bộ (ordo) Asparagales
Họ (familia) Orchidaceae
Phân họ (subfamilia) Orchidoideae
Tông (tribus) Cranichideae
Phân tông (subtribus) Goodyerinae
Chi (genus) Anoectochilus
Loài (species) roxburghii
2.1.2. Đặc điểm hình thái cây trưởng thành
Cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài; thân trên đất mọng nước,
mang các lá mọc xoè sát đất.
- Đặc điểm thân rễ: Thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi
nghiêng, bò dài. Chiều dài thân rễ từ 5-12 cm, trung bình là 7,87 cm. Đường
kính thân rễ từ 3-4 mm, trung bình là 3,17 mm. Số lóng trên thân rễ từ 3-7
lóng, trung bình là 4,03 lóng. Chiều dài của lóng từ 1-6 cm, trung bình là 1,99
cm. Thân rễ thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẵn,
không phủ lông [4].
- Đặc điểm thân khí sinh: Thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên
mặt đất, ít khi mọc nghiêng. Chiều dài thân khí sinh từ 4-8 cm, trung bình 6
cm. Đường kính thân khí sinh từ 3-5 mm, trung bình là 3,08 cm. Thân khí
sinh mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài khác nhau. Số lóng trên thân khí
sinh thay đổi từ 2-4 lóng, trung bình là 2,87. Chiều dài mỗi lóng từ 1-4 cm,
trung bình 2,23 cm. Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủ lông,
thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu hồng nhạt.

4
- Rễ được mọc ra từ các mấu trên thân rễ. Đôi khi rễ cũng được hình
thành từ thân khí sinh. Rễ thường đâm thẳng xuống đất. Thông thường mỗi
mấu chỉ có một rễ, đôi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một mấu trên
thân rễ. Số lượng và kích thước rễ cũng thay đổi tuỳ theo cá thể. Số rễ trên
một cây thường từ 3 - 10 rễ, trung bình là 5,4 rễ. Chiều dài của rễ thay đổi từ

0,5-8cm, rễ dài nhất trung bình là 6,07cm và ngắn nhất trung bình là 1,22cm,
chiều dài trung bình của các rễ trên một cây là 3,82cm [4].
- Lá mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất. Lá hình trứng, gần
tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3 - 4cm, trung bình
là 4,03cm và rộng từ 2 - 3cm, trung bình là 3,12cm. Lá có màu nâu đỏ ở mặt
trên và phủ lông mịn như nhung. Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5
gân gốc. Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ. Đôi khi
gân ở giữa có màu vàng nhạt. Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân
gốc nổi rõ. Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá mặt dưới không rõ.
Cuống lá dài 0,6 - 1,2cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ
tía ở bẹ lá. Bẹ lá nổi rõ và nhẵn. Số lá trên một cây thay đổi từ 2 - 6, thông
thường có 4 lá. Kích thước của lá cũng thay đổi, các lá trên một cây thường
có kích thước khác nhau rõ rệt [4].
- Đặc điểm của hoa, quả: Cụm hoa dài 10 - 20 cm ở ngọn thân, mang 4-
10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình trứng, dài 6 - 10 mm, màu hồng. Các mảnh bao
hoa dài khoảng 6 mm; cánh môi màu trắng, dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc
mang 6-8 dải hẹp, đầu chẻ đôi. Mùa hoa tháng 10 - 12. Mùa quả chín tháng 12
- 3 năm sau [4].

2.1.3. Đặc điểm phân bố của Lan Kim Tuyến
Lan Kim Tuyến thường mọc ở dưới tán rừng nguyên sinh, hầu hết là
nguyên thủy, rậm thường xanh, nhiệt đới, trên sườn núi đá granit, riclit, phiến
sét, ở độ cao 500 - 1600m rải rác thành từng nhóm vài ba cây trên đất ẩm rất
giàu mùn và lá cây rụng [2].
Ở Việt Nam, Lan Kim Tuyến có phổ phân bố khá rộng bao gồm: Lào Cai
(Sa Pa, Liêm Phá), Hà Tĩnh, Quảng Trị, Kom Tum, Lâm Đồng, Đắk Lăk [2].
Thế giới: Ấn Độ, Nhật Bản, Butan, Trung Quốc, Mi-an-ma, Thái Lan,
Lào, Cam-pu-chi-a, Ma-lay-xi-a, In-đô-nê-xi-a [2].

5

2.1.4. Số lượng quần thể
Chi lan Anoectochilus có khoảng 30 - 40 loài phổ biến rộng khắp các
vùng nhiệt đới từ Ấn Độ thông qua dãy Hymalaya tới các dãy núi ở Đông
Nam Á, Nhật Bản, In-đô-nê-xi-a và một số đảo ở Thái Bình Dương bao gồm
cả Đài Loan [30], [31].
2.1.5. Giá trị của Lan Kim Tuyến
2.1.5.1 Giá trị kinh tế
Do tính quý hiếm, tính dược liệu và làm cây cảnh nên giá lan Kim
Tyến tươi được bán trên thị trường thế giới từ 200 - 300 USD/kg, cây khô
có giá 3.200 USD/kg, giá thu hái trong tự nhiên còn cao hơn nữa[22], [23],
[24] nhiều nước đã trồng và xuất khẩu Lan Kim Tuyến mang lại nhiều lợi
nhuận, là cây có nhiều tiềm năng sản xuất và xuất khẩu nếu cần được đầu
tư đúng mức.
2.1.5.2 Giá trị dược liệu
Lan Kim Tuyến là một loại thảo dược có giá trị cao, chứa axit 4-
hydroxycinnamic, β-sitosterol, β-D-glucopyranoside, 3-glucosides butanoic axit,
kinsenoside cho mục đích y tế [23], [24] như có tác dụng giảm huyết áp cao
[30], [32] điều trị chống viêm, xơ vữa động mạch, tiểu đường, chứng rối loạn
gan, lá lách, tim, bệnh phổi [30], [22], [32] bảo vệ gan và sử dụng để chữa
bệnh viêm gan [33], [34] viêm thận [23],

rắn cắn [30],[23], chống khối u,
ung thư và tính chống virus [23],[32], ngoài Lan Kim Tuyến còn có tác dụng
điều trị hen phế quản, chống loãng xương, chống mệt mỏi [35]. Lan Kim
Tuyến chứa các nguyên tố vi lượng (Fe, Co, Cu, Mn, Zn, Cr) đóng vai trò
quan trọng trong nâng cao hiệu quả chống lão hóa, chuỗi polysaccharide nâng
cao hiệu lực của miễn dịch trong cơ thể con người [33].
Hiện nay, rất nhiều người đã trồng loài lan này để làm thuốc sử dụng
cho gia đình và trồng quy mô lớn để bán Lan Kim Tuyến thương phẩm cho
các Công ty sản xuất Dược phẩm và xuất khẩu sang Trung Quốc.

2.2. Tổng quan về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.1. Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là thuật ngữ được dùng một cách rộng rãi để
nói về việc mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn,
mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô

6
trùng [5]. Mục đích chung của nuôi cấy mô tế bào thực vật là sử dụng các điều
kiện như: nhiệt độ, ánh sáng, thành phần dinh dưỡng, các chất điều hoà sinh
trưởng thực vật… để điều khiển qúa trình sinh trưởng và phát triển của tế bào,
mô nuôi cấy theo mục tiêu và yêu cầu đặt ra. Nuôi cấy mô tế bào thực vật còn là
một phương pháp nghiên cứu hiệu quả nhất quá trình phát sinh hình thái ở nhiều
loài thực vật. Phương pháp này giúp mở ra những hướng mới trong nghiên cứu
sinh lý và di truyền thực vật như: cơ chế sinh tổng hợp các chất, sinh lý phân tử -
đột biến, sinh lý dinh dưỡng ở tế bào thực vật và nhiều vấn đề sinh học khác…
Tất cả dạng nuôi cấy mô đều được tiến hành qua hai bước:
- Các phần của thực vật hoặc một cơ quan thực vật nào đó được tách ra
khỏi phần còn lại. Đó là sự tách rời tế bào, mô hay cơ quan đang tương tác lẫn
nhau trong một tổ chức thực vật nguyên vẹn.
- Các phần tách ra nói trên phải đặt trong môi trường thích hợp để nó có
thể biểu lộ hết bản chất hoặc khả năng đáp ứng của nó [5].
2.2.2. Đặc điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vât (TBTV)
2.2.2.1. Tính toàn năng của tế bào
Mỗi tế bào đều mang đầy đủ lượng thông tin di truyền của cơ thể và có
khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi.
Gottlibeb Haberlant (1902) - nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng
đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Ông đã đưa ra giả thuyết về tính
toàn năng của tế bào trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy tách rời".
Theo ông: “Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ
lượng thông tin di truyền (DNA) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. Khi gặp

điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn
chỉnh”. Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận
của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật. Cho đến nay, các nhà khoa học
đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một
tế bào riêng rẽ [6].
2.2.2.2. Khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào
Cơ thể thực vật hình thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ
quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy

7
nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp
tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào
phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó, từ các tế bào
phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu
cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau [13].
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô
chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau. Quá trình phân hóa tế bào có thể
biểu thị:
Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên,
chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần
thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân
chia mạnh mẽ, quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân
hóa tế bào.
Phân hóa tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hóa

Phản phân hóa tế bào

Hình 2.1. Sơ đồ quá trình phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật
Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa,
ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có
một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng
mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một
chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào
khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài
hòa. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức
chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích
thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào [13].

8
2.2.2.3. Sự trẻ hoá
Khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần cơ quan thực vật là rất khác
nhau. Vì vậy để chọn mẫu cấy phù hợp phải căn cứ vào trạng thái sinh lý hay
tuổi mẫu. Trong nuôi cấy mô TBTV (hay còn gọi là nuôi cấy in vitro), các
mẫu non trẻ có sự phản ứng với các điều kiện và môi trường nuôi cấy nhanh,
dễ tái sinh, đặc biệt trong nuôi cấy mô sẹo, phôi. Ngoài ra mô non trẻ mới
được hình thành, sinh trưởng mạnh, mức độ nhiễm mầm bệnh ít hơn [6].
2.2.3. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV
Quá trình nuôi cấy mô TBTV có những ưu điểm như sau:
- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp,
công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây sau khi
được nuôi cấy từ 1 đến 2 năm có thể tạo ra hàng triệu cây.
- Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệ
nhân dòng. Nó tạo ra quần thể có độ đồng đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có
kiểu gen dị hợp hay đồng hợp.
- Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng
thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết bên ngoài và các vật liệu khởi đầu
có kích thước nhỏ. Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất

nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp
truyền thống.
- Nâng cao chất lượng cây giống: cây được nuôi cấy đã được loại trừ
các mầm bệnh như virus, nấm, vi khuẩn… nên cấy giống tạo ra hoàn toàn
sạch bệnh. Vì vậy, cây giống tạo ra có sức sinh trưởng và phát triển tốt, năng
suất cây trồng tăng 15-30% so với phương pháp truyền thống.
- Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản phẩm
khác nhau có thể tạo ra từ phương pháp nuôi cấy mô TBTV như cây con in
vitro hoặc trong bầu đất. Các cây giống có thể được bán ở dạng cây, củ bi hay
là thân củ.
- Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển
đi xa dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng
được xác nhận là sạch bệnh. Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các qui định
về vệ sinh thực vật quốc tế.

9
- Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kỳ
thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ [7].

2.2.4. Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV
Bên cạnh những ưu điểm, phương pháp nuôi cấy mô TBTV còn có
những nhược điểm:
- Chi phí sản xuất cao: chi phí hóa chất, trang thiết bị hiện đại, tiêu tốn
nhiều năng lượng… nên giá thành sản xuất của cây giống còn cao so với các
phương pháp truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt.
- Chất lượng cây giống có thể bị biến dị. Hiện tượng biến dị này cần
được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống đồng nhất
về mặt di truyền. [7].
2.2.5. Môi trường nuôi cấy mô TBTV
Môi trường dinh dưỡng phải có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất

cần thiết cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình
thường của cây. Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường
nuôi cấy thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau
được sử dụng cho mục đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được
sử dụng rất phổ biến như MS , LS (Linsmainer và Skoog, 1965)… Môi
trường MS là môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô của tế
bào thực vật, môi trường MS thích hợp cho cả thực vật 1 lá mầm, 2 lá mầm.
Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy mô đóng vai trò quyết định
đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mỗi một
loại vật liệu nuôi cấy hay loại cây khác nhau cần những thành phần môi
trường thích hợp để phù hợp với mục đích việc nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Nhìn chung, môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm các thành phần cơ
bản sau:
+ Các khoáng đa lượng
+ Các khoáng vi lượng
+ Nguồn cacbon
+ Các vitamin
+ Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác

10
+ Các chất điều hòa sinh trưởng.
+ Các chất bổ sung khác: nước dừa; dịch chiết nấm men; than hoạt tính; Agar
2.2.5.1. Khoáng đa lượng
Các khoáng đa lượng bao gồm các nguyên tố khoáng được sử dụng ở
nồng độ trên 30 ppm tức là 30 mg/l. Những nguyên tố đó là: N, Fe, P, K, Ca,
Mo. Riêng Na và Cl cũng được sử dụng trong một vài loại môi trường, nhưng
chưa rõ vai trò của chúng.
- Nitrogen: Mô, tế bào thực vật có thể sử dụng nitrogen khoáng như
ammonium và nitrate. Tỷ lệ ammonium và nitrat thay đổi tùy theo loại cây và
trạng thái phát triển của mô. Nitrogen được cung cấp dưới NO

3
-
, NH
4
+
[5].
- Phospho (P): Phospho là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực
vật. Nó tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid
nucleic và tham gia vào cấu trúc màng. Ngoài ra khi phospho ở dạng H
2
PO
4
-

và HPO
4
2-
còn có tác dụng như một hệ thống đệm (buffer) làm ổn định pH
của môi trường trong quá trình nuôi cấy.
- Kali (K): K
+
là một cation chủ yếu trong cây,giúp cho cây cân bằng
các anion vô cơ và hữu cơ. Ion K
+
được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và
có hai vai trò chính là điều hòa pH và áp suất môi trường nội bào. Sự thiếu
hụt K
+
trong môi trường nuôi cấy mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thừa nước
và làm giảm tốc độ hấp thu photphate. Người ta cung cấp Kali cho mô nuôi

cấy dưới dạng kali nitat (KNO
3
), kali clorua (KCl) và kalihydrophotphat
(KH
2
PO
4
) [5].
- Canxi (Ca): Ca có mặt rất nhiều trong vách tế bào và màng tế bào. Sự
có mặt của Ca
2+
rất quan trong trong khả năng đối kháng với sự nhiễm nấm.
Sự ổn định của màng tế bào chịu ảnh hưởng rất lớn bởi ion Ca
2+
. Sự thiếu hụt
Ca
2+
sẽ làm tăng quá trình giải phóng các hợp chất ra khỏi màng tế bào. Canxi
được cung cấp dưới dạng canxi nitrat (Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O) canxi clorua
(CaCl
2
.6H
2
O)

- Magiê (Mg): Là thành phần cấu trúc của diệp lục tố, có tác dụng đến
quá trình quang hợp, phụ trợ cho nhiều enzyme lien quan trong biến dưỡng
cacbonhydrat sự tổng hợp acid nucleic… Ion Mg có tính linh động cao, hầu
hết ion Mg2+ đều đc sử dụng cho việc điều hòa pH nội bào và ổn đinh cân

11
bằng anion và cation. Nếu thiếu hụt Mg sẽ ngăn cản quá trình tổng hợp RNA.
Kết quả là cấu trúc và chức năng của lục lạp sẽ bị ảnh hưởng nhanh chóng khi
xảy ra thiếu hụt Mg, là yếu tố không thể thiếu trong quá trình trao đổi năng
lượng của thực vật bởi vì nó có vai trò quan trọng trong việc tổng hợp ATP.
Mg được cung cấp dưới dạng magiê sunphat (MgSO
4
.7H
2
O)
- Sắt (Fe): Nhưng môi trường cổ điển thường dùng sắt dưới dạng FeCl
2
,
FeCl
3
.6H
2
O, FeSO
4
.7H
2
O, Fe
2
(SO
4

)
3
, Fe(C
4
H
4
O
6
). Hiện nay hầu hết các
phòng phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelat kết hợp với Na
2
-
Ethylene
Diamine Tetra Acetate (EDTA). Ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải
phóng tư từ ra môi trường theo nhu cầu mô thực vật [5].
2.2.5.2. Khoáng vi lượng
Cu, Zn, Mn, Bo, I, Co là các nguyên tố vi lượng thường được dùng
trong môi trường nuôi cấy in vitro. Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng
trong các hoạt động của enzyme. Chúng được dùng với nồng độ thấp hơn
nhiều so với các nguyên tố đa lượng. Các dung dịch vi lượng thường dùng là:
Nistch (1951), Heller (1953), MS [11].
2.2.5.3. Nguồn cacbon
Trong nuôi cấy mô TBTV, các mẫu nuôi cấy nói chung không thể
quang hợp hoặc quang hợp ở cường độ rất thấp, vì vậy trong môi trường nuôi
cấy cần bổ sung các hợp chất hydratcacbon. Nguồn hydratcacbon được sử
dụng phổ biến là đường saccarozơ với hàm lượng từ 2-6% (W/V). Những loại
đường khác như fructose, glucose, maltose, sorbitol, rất ít dùng [7].
2.2.5.4. Các vitamin
Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng
trưởng và phát triển của chúng. Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình

biến dưỡng khác nhau. Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro một vài
vitamin trở thành yếu tố giới hạn sự phát triển của chúng. Các vitamin thường
được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: B1, PP, B6 và Myo - inositol.
B1 là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào.
B1 thường được sử dụng với nồng độ từ 0,1 - 10 mg/l. PP và B6 thường được
bổ sung vào môi tường nuôi cấy nhưng cũng không cần thiết cho sự tăng

12
trưởng của nhiều loài thực vật. PP được sử dụng với nồng độ từ 0,1 - 5 mg/l.
B6 thường được sử dụng với nồng độ 0,1 - 10 mg/l. Myo-inositol thường
được pha chung với dung dịch mẹ của vitamin. Mặc dù đây là một
cacbonhydrate chứ không phải là vitamin nhưng nó cũng được chứng minh là
kích thích sự tăng trưởng tế bào đa số loài thực vật

[7]. Các vitamin khác như
Biotine, Acid folic, Acid ascorbic, Panthothenic acid, Vitamin E… cũng được
sử dụng trong một số môi trường nuôi cấy. Inositol cũng được đề cập tới như
một loại vitamin có tác dụng kích thich sự sinh trưởng và phát triển của cây
một cách đáng kể [25].
2.2.5.5. Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác
Mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các aminoacid cần thiết
nhưng sự bổ sung các aminoacid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự
tăng trưởng của tế bào. Việc sử dung amino acid đặc biệt quan trọng trong
nuôi cấy tế bào và tế bào trần. Amino acid cung cấp cho thực vật nguồn
amino acid sẵn sàng cho nhu cầu của tế bào và nguồn nitrogen này được tế
bào hấp thu nhanh hơn nitrogen vô cơ [5].Các nguồn nitrogen thường sử dụng
trong nuôi cấy mô TBTV là hỗn hợp amino acid như casein hydrolysate, L-
glutamine, L-asparagine và adnine.
2.2.5.6. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật là các chất hữu cơ có bản chất hóa

học khác nhau được tổng hợp với một lượng rất nhỏ trong các cơ quan, bộ
phận nhất định của cây để điều hòa hoạt động sinh lý cũng như quá trình sinh
trưởng và phát triển của cây nhằm duy trì mối quan hệ hài hòa giữa các cơ
quan, các bộ phận trong cơ thể thực vật. Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
tham gia vào quá trình phân chia tế bào, phân hóa các mô, phát sinh phôi, tác
dụng lên chức năng của DNA và RNA làm ảnh hưởng mạnh đến những quá
trình chủ yếu của hoạt động sống thực vật như quá trình sinh tổng hợp các
enzyme, hô hấp, dinh dưỡng rễ, quang hợp… Chính vì vậy chúng có tác dụng
điều hòa sinh trưởng phát triển của cây. Các chất điều hòa sinh trưởng bao
gồm những chất sau:

13
a. Auxin
Auxin là chất điều hòa sinh trưởng được nghiên cứu đầu tiên với việc
xác định cấu trúc hóa học đầu tiên vào năm 1934. Auxin là chất xúc tác cho
sự sinh trưởng của cây trồng , có phổ hoạt động rộng hơn Gibberellin. Tác
động sinh lý của auxin đối với thực vật rất phức tạp. Các mô thực vật khác
nhau có phản ứng khác nhau đối với tác động của auxin. Hoạt động của auxin
tùy thuộc vào nồng độ và sự tác động tương hỗ giữa chúng với các chất điều
hòa sinh trưởng khác [5]. Auxin kết hợp chặt chễ với các thành phần dinh
dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo,
huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được
sử dụng phối hợp với cytokinine. Khi nồng độ cytokinine cao hơn auxin thì sẽ
có sự tạo chồi từ mẫu cấy, ngược lại hoặc khi chỉ xử lý với auxin thì rễ sẽ
được tạo thành [5], [9]. Auxin đẩy mạnh sự sinh trưởng thông qua sự kéo dài
tế bào. Hiệu quả này là do chúng thúc đẩy các hoạt động của enzyme, làm gia
tăng tính đàn hồi của thành tế bào làm cho sự xâm nhập của nước vào trong tế
bào được dễ dàng, giảm sức đề kháng của thành tế bào và tế bào tự kéo dài ra.
Auxin hoạt hóa các quá trình sinh tổng hợp các chất cao phân tử (protein,
xenluloza, pectin,… ) và ngăn cản sự phân giải chúng. Vì vậy, chúng có tác

dụng làm chậm trễ quá trình già hóa, kích thích ra rễ và xúc tiến sự sắp xếp
của những rễ bất định. Nồng độ sử dụng của auxin liên quan chặt chẽ đến sự
chiếu sáng, nhiệt độ và sự có mặt của chất điều hòa sinh trưởng khác. Năm
1957 Skoog và Miller nuôi cấy mô cây thuốc lá cho thấy khả năng tạo chồi ở
môi trường có nồng độ cytokinine cao và auxin thấp, tạo rễ trong môi trường
có nồng độ cytokinine thấp vào auxin cao. Sau đó một vài năm, sự hình thành
phôi sinh dưỡng bằng cách nuôi cấy trên môi trường có chứa 2,4D vì thế
auxin chỉ được sử dụng trong giai đoạn đầu của sự hình thành rễ bất định và
phát sinh phôi soma, sau đó trở thành chất ức chế của các cơ quan và phôi
mới được hình thành. Các chất điều hòa sinh trưởng trong nhóm auxin được
biết đến như IBA (3- Indolbutyric acid); IAA; NAA; 2,4D (acid 2,4
Dichloropphenoxy acetic).
b. Cytokinine
Cytokine được phát hiện trong quá trình nghiên cứu nuôi cấy mô thực
vật vào năm 1945-1955. Nhưng đến năm 1965, Miller mới tách được chất
hoạt tính sinh học này với tên gọi là kinetin, sau đó mới xác định được cấu

14
trúc hóa học của nó. Cytokine là chất điều hòa sinh trưởng thực vật có tác
dụng đẩy mạnh sự sinh trưởng của cây trồng [8]. Cytokinine có khả năng kích
thích sự phân chia tế bào, tính đặc hiệu của nó là kích thích quá trình phân
bào giảm nhiễm. Bên cạnh đó cytokinine có vai trò quan trọng trong quá trình
phân hóa tế bào và tạo mới các cơ quan. Để thực hiện được quá trình phân
hóa tế bào và tạo mới các cơ quan thì cytokinine phải kết hợp với auxin hoặc
Gibberellin. Nếu vắng mặt auxin hoặc Gibberellin thì quá trình phân hóa tế
bào và tạo mới các cơ quan sẽ không hiệu quả auxin thúc đẩy quá trình nhân
đôi DNA và cytokinine cho phép tách rời các nhiễm sắc thể [8].
Trong nuôi cấy mô tế bào thực, cytokinine đẩy mạnh quá trình hình
thành chồi mầm trong nhiều mô bao gồm mô sẹo. Cytokinine rất có hiêu quả
trong vai trò kích thích tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp trên thực vật nguyên

vẹn cũng như trên mô thực vật nuôi cấy in vitro. Một tỉ lệ thích hợp giữa
auxin và cytokinine sẽ có hiệu quả trên sự phát sinh hình thái mẫu cấy, khi
nồng cytokinine cao hơn nồng độ cytokinine thì kích thích sự tạo chồi và
ngược lại nồng độ auxin cao hơn cytokinine thì kích thích sự tạo rễ. Nồng độ
cytokinine cao thường cản hoặc làm chậm sự tạo rễ đồng thời cũng ngăn cản
sự tăng trưởng của rễ và cản hiệu quả kích thích tạo rễ của auxin. Đại diện
chính của cytokinine là kinetine được phát hiên trong dịch thủy phân nấm
men. Đặc trưng nhất của chất này là ngăn cản sự mất màu của lá trong tối,
tăng cường sự xâm nhập của dòng chất dinh dưỡng và thúc đẩy sự phân chia
tế bào khi nuôi cấy tế bào rời. Trong nhóm cytokinine còn bao gồm các chất
thường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô: BA và TDZ (1-phenyl 3-
(1-2,3 thiadiazol- 5yl) urea); Zeatine
c. Gibberellin
Gibberellin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật gồm hơn 80 hợp
chất khác nhau. Hoạt động của mỗi chất phụ thuộc vào khả năng di chuyển
qua mô hoặc sự biến đổi nó thành một dạng hoạt động khác. Acid gibberellic
(GA3) và hỗn hợp giũa GA3 và GA7 là những Gibberellin duy nhất có giá trị
thương phẩm do chúng thường được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật Khi
bổ sung Gibberellin vào môi trường nuôi cấy mô thực vật thì chúng thường có
tác dụng như auxin tự nhiên, sẽ làm giảm bớt hoặc ngăn cản sự tạo chồi, Acid
gibberellic có ảnh hưởng chủ yếu lên sự phân hóa tế bào in vitro ngoài sự tác

15
động của auxin. Tuy nhiên, sự tăng trưởng của chồi từ đỉnh sinh trưởng và
mẫu cấy chồi cũng có thể tăng thêm khi bổ sung acid gibberellic [5], [25].
2.2.5.7. Các chất bổ sung
a. Nước dừa
Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất
khoáng và chất kích thích sinh trưởng [26]. Nước dừa đã được sử dụng để
kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây. Nước dừa thường

được lấy từ quả dừa để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản. Nước dừa thường sử
dụng với nồng độ 5- 20% thể tích môi trường, kích thích phân hóa và nhân
nhanh chồi [7].
b. Agar
Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm
rắn hoá môi trường. Nồng độ agar sử dụng thường là 0,6- 10%, đây là loại
tinh bột đặc chế từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường
hoặc bị chết vì thiếu O
2
nếu nuôi trong môi trường lỏng và tĩnh
c. Than hoạt tính
Thường được dùng để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các
sản phẩm trao đổi chất thứ cấp Trong trường hợp những chất đó có tác dụng
gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu. Mặt khác, khi bổ sung vào môi
trường, than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng do môi trường trở
nên sẫm vì vậy có thể kích thích quá trình tạo rễ, một số trường hợp còn có
tác dụng thúc đẩy phát sinh phôi vô tính và kích thích sinh trưởng phát sinh
cơ quan ở các loài cây gỗ. Tuy nhiên, than hoạt tính lại làm giảm hiệu quả của
các chất điều hoà sinh trưởng. Nồng độ than hoạt tính thường sử dụng từ 0,2 -
0,3 % (W/V).
2.2.6. Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.6.1. Giai đoạn chuẩn bị
Mục đích chủ yếu của giai đoạn này là phải tạo ra nguồn nguyên liệu
thực vật vô trùng để đưa vào môi trường nuôi cấy. Khâu đầu tiên của giai
đoạn này có thể coi như một bước thuần hoá vật liệu nuôi cấy. Cây giống
được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với môi trường
mới, đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và chủ động
nguồn mẫu trong công tác nhân giống. Trong trường hợp cần thiết có thể làm

16

trẻ hoá vật liệu giống. Khi đã có nguồn nguyên liệu nuôi cấy, tiến hành lấy
mẫu và xử lý mẫu cấy trong những điều kiện vô trùng. Người ta thường sử
dụng một số loại hoá chất như: HgCl
2
0,1 %, H
2
O
2
, Ca(OCl)
2
để khử trùng
mẫu cấy. Tuỳ thuộc vào từng loại vật liệu nuôi cấy mà lựa chọn loại hoá chất,
nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp [6].
2.2.6.2. Giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy
Mục đích của giai đoạn này là tạo ra các chồi mới từ các mẫu vật đã
được khử trùng và nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Về nguyên tắc thì mô
nuôi cấy có thể là bất kỳ bộ phận nào của cây lấy từ các phần non của cây
(thân, rễ, lá,…) nhưng theo Bhatt thì mô nuôi cấy lấy từ các phần non của cây
có khả năng nuôi cấy thành công cao hơn mô lấy từ các bộ phận trưởng thành
khác. Vì vậy, người ta thường lấy chồi đỉnh hay chồi nách để nuôi cấy in
vitro.Ngoài ra, khi lựa chọn mô nuôi cấy cần chú ý tuổi sinh lý của cây mô,
các mô ở thời kỳ sinh trưởng mạnh của cây trong mùa sinh trưởng cho khả
năng tái sinh chồi tốt hơn. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ
nhiễm bệnh thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Giai đoạn này
thường kéo dài trong 4-6 tuần.
2.2.6.3. Giai đoạn nhân nhanh
Một trong những ưu thế lớn nhất của phương pháp nhân giống in vitro
so với các phương pháp nhân giống truyền thống là có hệ số nhân cao. Vì vậy
giai đoạn nhân nhanh được coi là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình
nhân giống. Giai đoạn này sẽ kích thích mô nuôi cấy phát sinh nhiều chồi

mầm cung cấp cho giai đoạn sau bằng cách cắt nhỏ những bộ phận mới sinh ở
giai đoạn 2 và cấy chúng lên môi trường mới theo định kỳ. Phải xác định
được môi trường dinh dưỡng và môi trường vật lý phù hợp để đạt hiệu quả
cao nhất. Trong giai đoạn này thì vai trò của các chất điều hoà sinh trưởng
(auxin, cytokinin, gibberellin…), các chất phụ gia (nước dừa, chuối, khoai
tây…) là cực kỳ quan trọng. Tuỳ vào đối tượng nuôi cấy mà người ta có thể
nhân nhanh theo hướng kích thích sự hình thành cụm chồi hoặc kích thích sự
phát triển của chồi nách
Mặt khác, cũng cần đảm bảo các nhân tố vật lý (nhiệt độ, ánh sáng…)
phù hợp. Trong giai đoạn này cần tăng cường chiếu sáng (16 giờ/ ngày, cường
độ ánh sáng tối thiểu 1000 lux, ánh sáng tím) là yếu tố quan trọng kích thích

17
mô phân hoá mạnh. Bảo đảm chế độ nhiệt 20-30
0
C. Yêu cầu của giai đoạn
này là tạo ra hệ số cao nhất nhưng không ảnh hưởng đến sức sống và bản chất
di truyền của cây.
2.2.6.4. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Đây là giai đoạn các chồi đã đạt kích thước nhất định và được chuyển
từ môi trường ở công đoạn 3 sang môi trường nuôi cấy tạo rễ để hình thành
cây hoàn chỉnh. Thường sau 2-3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện
rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này môi trường cần giảm lượng
cytokinin và tăng lượng auxin để rễ phát triển. Các chất α- NAA, IBA, IAA
thường được sử dụng ở nồng độ 0,1-5 mg/l để tạo rễ cho hầu hết các loài cây
trồng. Lúc này cây con rất nhạy cảm với ẩm độ và bệnh tật do hoạt động của
lá và rễ mới sinh rất yếu, cây chưa chuyển sang giai đoạn tự dưỡng
2.2.6.5. Giai đoạn đưa cây mô ra ngoài vườn ươm
Đây là giai đoạn chuyển dần cây con từ ống nghiệm ra nhà kính rồi ra
ngoài trời để tạo điều kiện cho cây con tự dưỡng hoàn toàn và thích nghi dần

với môi trường tự nhiên. Khi cây đủ tiêu chuẩn cứng cáp (chiều cao, số lá, rễ)
thì mang trồng. Giá thể phải đảm bảo tơi xốp và sạch bệnh. Trong 2- 3 tuần
đầu cần duy trì độ ẩm trên 50%, tránh ánh sáng quá mạnh gây cháy lá, tránh
nhiễm khuẩn và nấm gây hiện tượng thối nhũn. Điều kiện môi trường trong
giai đoạn này là rất quan trọng, cần tạo điều kiện cho bộ rễ phát triển, cứng
cáp và phòng bệnh cho cây. Đây được xem là công đoạn quyết định khả năng
ứng dụng quy trình này trong thực tiễn sản xuất.
2.2.7. Các yếu tố khác ảnh hưởng đến nhân giống nuôi cấy mô TBTV
2.2.7.1. Ánh sáng
Ánh sáng: Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ
các yếu tố như thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh
sáng.Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy.
Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12 - 18 h/ngày.
Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy.
Cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 lux (Morein, 1974),
chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực
vật invitro: ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng

18
trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế sinh trưởng chiều
cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo. Hiện nay trong
các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có
cường độ 2000 - 2500 lux người ta sử dụng các dàn đèn huỳnh quang đặt cách
bình nuôi cấy từ 35- 40 cm.
2.2.7.2. Nhiệt độ
Nhiệt độ: có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của cây nuôi
cấy in vitro. Tùy thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ
cho phù hợp. Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở
nhiều loài cây là 20-25
0

C. Một số loại cây cần có nhiệt độ tối ưu để tạo hình
2.2.7.3. pH môi trường
Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển
trong nuôi cấy. Trong khi chuẩn bị môi trường, pH có thể được điều chỉnh đến
giá trị cần thiết của thí nghiệm. Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng
trực tiếp tới quá trình dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. Vì vậy, đối với
từng loại môi trường nhất định và từng trường hợp cụ thể của các loài cây phải
chỉnh độ pH của môi trường về mức ổn định ban đầu [7]. pH của đa số các môi
trường nuôi cấy được điều chỉnh trong phạm vi 5,5-6,0. pH dưới 5,5 làm agar
khó chuyển sang trạng thái gel, còn pH lớn hơn 6,0 agar có thể rất cứng.
2.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam
2.3.1. Tình hình nghiên cứu Lan Kim Tuyến trên thế giới
Yih-Juh Shiau và cs (2001) [24]. Đã tối ưu hóa một phương pháp bảo
tồn Anoectochilus formosanus Hayata bằng cách tiến hành thụ phấn chéo
và nuôi cấy hạt nảy mầm. Thành công của thụ phấn và đậu quả được tìm
thấy là phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây đực và cây cái. Số quả
đậu được sau thụ phấn đạt 86,7%. Những hạt 7 tuần tuổi được nuôi cấy trên
môi trường ½ MS bổ sung thêm 0,2% than hoạt tính và 8% chuối trong 4
tháng. Cây nảy mầm được nuôi cấy ở môi trường ½ MS chứa BA 2mg/l
trong bình nón 125ml trong thời gian 2 tháng. Trước khi tiến hành thụ phấn
trong ống nghiệm, cây phải có thân rễ phát triển tốt và chồi được nuôi cấy
trên môi trường ½ MS chứa 0,2% than hoạt tính, 8% chuối, BA 2mg/l và
NAA 0,5mg/l.